疏水制剂

本发明涉及物质在不正常溶解的疏水溶剂中的制剂，和得到 这些制剂的方法。具体地，本发明涉及亲水物在疏水溶剂如油类 中的制剂。

本发明具体地用于不正常地溶于油类或其它疏水溶剂的亲水 大分子。

对于许多应用，例如在药学，在食品技术或美容剂工业上， 加工蛋白质和类似大分子存在问题，因为其亲水性和高度极性限 制它们与类脂相相互作用或掺人类脂相的程度。许多天然体系用 类脂障碍物(例如皮肤，细胞膜)以防止亲水分子进入内部空间； 蛋白质在类脂载体中分散的能力将打开一条将这些大分子导入生 物体系的新途径，其中含有蛋白质的类脂介质可与疏水的障碍物 成分结合，而不是被它们排斥。

蛋白质被溶解到油中产生优点的另一领域是酶在有机相的应 用。酶合成与化学方法相比变得越来越重要，因为其低得多的能 量需要，更大的底物和产物专一性，高产率，和许多不能用化学 手段进行的反应被催化的事实。最近关于酶可以在有机环境中保 持活性的发现打开了许多额外的可能性。这样，包括亲脂的底物 和产物的反应可被有效地催化，使它们被有用于如高温的极端条 件下，酶的稳定性经常大大大于在水性环境中。一个很重要的方 面是包括水解酶如脂酶和肽酶的反应可优先在低水环境中在逆反 应中进行，使广泛的工业上重要的化合物的合成成为可能。另一 应用是其中反应复合链被包括在多催化单元需要互相保持最近的 情况中，这类可以是光引发的氧化-还原反应。一个额外的可能 性是用酶通过在有机金属底物上作用诱导矿化而在油相被控制的 纤微粒的生产。在油相预先形成的纤微粒的稳定分散体的制备也 有利于某些表面-催化反应的实施。

亲水物质在油相而不是水相中的分散体提供与增加其温度介 导的变性，水解，光敏等等方面的稳定性有关的优点。油类可选 择那些在比水溶液在更宽的温度范围保持流体的，或那些具有更 高粘度的，导致对物理损害的更大保护。在混合相体系中，蛋白 质被限制在油中可限制与水溶性化合物的共同的有害相互作用- 例如氧化。

已有既含有大分子又含油的制剂的例子，而且一个这类例子 被披露于EP-A-0366277。披露于此文献中的制剂是同时具 有疏水的和亲水相的乳剂。其中疏水相含有形成乳糜微粒的类 脂。然而，大分子被溶于亲水相而不是疏水相。

EP-A-0521994也涉及适于口服输送大分子的组合物，该 组合物包含与卵磷脂或在体内可作为卵磷脂前体的化合物有关的 生物活性物质。所有举例的组合物都是包含亲水和亲脂相的制 剂。而且，在此先有技术文献中，大分子被溶于亲水相而不是亲 脂相。

尽管上述制剂确实含有大分子和油类，但明显地，在所有情 况下，大分子被溶于亲水而不是亲油相。形成大分子和油类真正 溶液的企图只得到有限的成功。

本发明涉及出人意料的发现，即如果亲水物与两亲物在一定 条件下混合，产生的组合物将很容易溶于油类亲脂溶剂中。本发 明的第一个方面提供制备在疏水溶剂中含有亲水物的单相疏水制 剂的方法，该方法包括：

(i)亲水物在一液体介质中与两亲物混合，以使在液体介质 中，在两亲物和亲水物之间没有化学作用：

(ii)除去液体介质以留下一个两亲物分子胶束，其亲水首 基朝向亲水物；且

(iii)在亲水物/两亲物胶束周围提供疏水溶剂。

在本发明的上下文中，术语“化学作用”指诸如共价或离子 键或氢键的相互作用。不包括Van der Waals力和该层次的其它 相互作用。

已被发现，制剂的成分被混合的顺序特别重要。在一个制备 分子分散体的企图中，我们将大分子化合物(亲水物的一个例子) 与疏水溶剂混合，然后加入两亲物，而在另一工艺中，大分子化 合物被加入疏水溶剂和两亲物的混合物中。然而，这两种方法导 致产生大分子化合物在溶剂中的粒状分散体而不是真正的分子分 散体。现已被发现，只有以这样的方式形成胶束，其中两亲物的 亲水首基朝向大分子，然后将此胶束溶于疏水溶剂，才能产生单 相制剂。

如上所述，亲水物和两亲物在液体介质中混合，在许多情况 下，胶束在溶剂被除去之前在液体介质中形成。这发生在两亲物 和液体介质是胶束在液体介质中形成的，甚至没有亲水物存在的 情况。

在本发明中，术语“亲水物”指任何一般溶于水溶剂但不溶 于疏水溶剂的类型。用于本发明的亲水物的范围是多种多样的， 但大分子代表被应用的类型的一个例子。

广泛的大分子适合用于本发明。一般地，大分子化合物因是 亲水的或至少具有亲水区，因为通常将疏水大分子溶于油溶液中 困难较小。合适的大分子类包括蛋白质和糖蛋白，寡和多核酸， 例如DNA和RNA，多糖和任何这些的超分子集合，在某些情况 下包括整个细胞或细胞类脂质。将一个小分子如维生素与一个大 分子，尤其是多糖如环糊精共溶也是适合的，诸如维生素B12的 小分子也可与大分子化学结合并因而被包括在组合物中。

可用本发明的方法成功地溶解的具体蛋白质的例子包括胰岛 素，降血钙素，血红蛋白，细胞色素C，辣根过氧化酶，抑肽酶， 蘑菇酪氨酸酶，促红细胞生成素，生长激素，生长激素，生长激 素释放因子，galanin，尿激酶，因子IX，组织纤维蛋白溶酶原 活化因子，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，过氧化酶，铁蛋白， 干扰素，因子VIII和其片段(上面的所有蛋白质都可从任何合适 的来源得到)。其它可用的大分子是FITC-标记的葡聚糖和从 Torulla酵母的RNA提取物。

看起来大分子的分子量似乎没有上限，因为具有分子量约 1000000的葡聚糖很容易用本发明的方法溶解。

除大分子外，本发明的方法可用于溶解较小的分子。小有机 分子的例子包括葡萄糖，羧基荧光生和药剂，例如抗癌药，当然， 本方法可以同样用于其它小有机分子，例如维生素和药学或生物 学活性剂。另外，诸如氯化钙和磷酸钠的化合物也可用本方法溶 解。确实，本发明对于药学或生物学活性剂特别有利，因为非水 溶液的应用使分子进入体内而变化，例如增加生物效力的途径成 为可能。

可被包括在本发明的疏水组合物中的其它类型是无机物如小 无机分子或胶态物质，例如胶态金属。本发明的方法使胶态金属 如胶态金，钯，铂或铑的某些性质被保留，即使在正常环境下颗 粒将聚集的疏水溶剂中。这将对于催化在有机溶剂中进行的反应 特别有用。

一个与本发明有某些相似的方法在Okahata et al(J.Chem. Soc.Chem.Commun.，1988，1392-1394)中披露。然而，似乎由 该文献的作者生产的蛋白质被两亲物分子包围的胶束与本发明的 方法生产的相当不同。尤其是，作者陈述了两亲物分子与蛋白质 在液体介质中反应通过氢健或静电相互作用形成固体沉淀。相反 地，似乎本发明中亲水物不与两亲物分子在液体介质中发生化学 作用。

有许多可被用于本发明的两亲物和两性离子两亲物如磷脂类 被发现特别合适。具有磷脂酰胆碱首基的磷脂类已被特别成功地 应用，其例子包括磷脂酰胆碱(PC)本身，溶脂酰胆碱(lyso- PC)，鞘磷脂，任何这些的衍生物，例如十六烷基磷酰胆碱或含 磷酰胆碱的两亲聚合物。在本发明中，术语磷脂酰胆碱(PC)和 卵磷脂被互用。合适的天然卵磷脂可从任何适当的来源，例如蛋， 特别是大豆衍生。在更多的情况下，优选地选择与被选定的疏水 溶剂化学上相似的两亲物，这将在下面更详细讨论。

事实上，本发明人已发现诸如磷脂类的两性离子两亲物特别 适合用于本方法，这进一步显示了本发明和Okahata等人的方法 之间的明显区别。明显地，现有技术文献的作者断言阴离子和两 性离子类脂完全不适合用于他们的方法中，并陈述他们用这些类 脂得到了零产率的它们的复合物。

选择的疏水溶剂将取决于组合物的目的，将要溶解的物质类 型和两亲物。合适的溶剂包括长链脂肪酸(不饱和脂肪酸如油酸 亚油酸是优选的)，醇类，特别是中长链醇类如辛醇，和分支的 长链醇类如植醇，单酸甘油酯如甘油单油酸酯(GMO)，双酸 甘油酯和三酸甘油酯，特别是中长链三酸甘油酯和其混合物。

当疏水溶剂和两亲物适当竞争时，一般得到最佳结果。例如， 对于诸如油酸的溶剂，Lyso-PC是比PC更合适的两亲物的选 择，当疏水溶剂是三酸甘油酯时，逆转也成立。

另外，在某些情况下已被发现，在与亲水物/两亲物胶束接触 之前将大量两亲物加到疏水溶剂中是有利的。这确证了两亲物分 子没有被从围绕亲水物的位置剥离，因为两亲物对疏水溶剂具有 高度亲和力。

非常优选地是，本发明的制剂是光学上清亮的，这可以通过 在可见波长测量浊度，在某些情况下，通过检查一定时间的沉淀 而监测。

其中两亲物的亲水首基朝向亲水物的亲水物/两亲物胶束以前 曾被生产过，但从来没有被建议过此类组合物可溶于亲脂溶剂 中。

Kirby et al，在Bio/Technology，1984，11月，979-984和在 Liposome technology，卷I，P19-27，Gregoriadis，Ed.，CRC Press， Inc.，Boca Raton，Florida，USA中描述了制备脂质体制剂的方法， 其中磷脂被悬浮在蒸馏水中形成小的单层囊或多层囊，与被捕集 的物质混合并冻干。混合物然后再水化给出脂质体。

在此现有技术的公开时间，对于脂质体的制备具有世界性的 广泛兴趣，但是生产大分子的单相疏水制剂的想法似乎既从来没 有被想过，或认为不可能或没有价值而不考虑。肯定地，在任何 现有技术中都没有建议中间体胶束除制备脂质体外而作其它用 途。即使单相疏水制剂曾经是一需要的目标，加入疏水的而不是 亲水溶剂的想法也未被严肃的提出过，因为在本领域对亲水分子 的疏水制剂有一种严重的偏见。

两新物分子以其亲水首基面向亲水物部分而向胶束的朝向可 以几种方式实现，特别适合的方法的例子在下面更详细的描述。

在第一种方法中，具有与Kirby等如前文献所述的方法相同 的起点，亲水物与两亲物在亲水溶剂中的分散体混合，以使两亲 物分子形成一组合体，其中亲水首基面朝上地朝向含有亲水物的 亲水相。亲水溶剂然后被除去留下一干燥的组合物，其中两亲物 分子的亲水首基朝向亲水物。

在Okahata等人描述的方法中，蛋白质的溶液也与两亲物在 水中的分散体混合。然而，明显地，该论文的作者相信，必需得 到沉淀，然后将其溶于亲水溶剂中。因为许多本发明优选的两亲 物不形成这类沉淀，Okahata等人断言他们将是没用的。在本发 明的方法中，不需要有沉淀，实际上，一般认为不希望形成沉淀， 因为这将导致所需产品产率的降低。

在此第一方法中，优选的是亲水溶剂是水，尽管其它极性溶 剂也可被使用。

两亲物集合采取的形式可以是胶束，单层囊，优选地是一般 理解为具有约25nm直径的单层囊，多层囊或管状结构，例如蜗状 圆柱体，六方相，立方体相或髓磷脂类结构。适合的形式将取决 于所用两亲物，例如，诸如磷脂酰胆碱(PC)的两亲物倾向形成 小单层囊，而溶脂酰胆碱形成胶束。然而，在所有这些结构中， 两亲物分子的疏水尾部面向内朝向结构的中心，而亲水首基面向 外朝向分散亲水物的溶剂。

两亲物/亲水物的重量比一般在1∶1至100∶1的范围，优 选地从2∶1至20∶1，对PC最优选地为8∶1，对Lyso-PC 最优选地为4∶1。

这些比例只是优选的比例，特别应指出的是，上限由经济方 面的考虑设定，意思是使用最小的可能量的两亲物是优选的。下 限在某种程度上更重要，很可能2∶1或更低的比例只被用于其 中亲水物具有明显的疏水部分或异常大的情况。

当溶剂被迅速除去时得到良好的结果，除去溶剂的合适方法 是冻干，尽管其它方法可被应用。

在某些情况下，在亲水溶液中包括盐将是有用的，尤其是当 亲水物是诸如大蛋白质的大分子化合物时。然而，因为大量无机 盐的存在倾向于增加晶体的形成，因而产生一浑浊的溶液，优选 地是有机盐被使用而不是无机盐如氯化钠。乙酸铵特别适于此目 的，因为它具有额外的优点--容易被冷冻干燥除去。

制备含有其首基指向亲水物部分的两亲物的胶束的组合物的 第二种方法是将亲水物和两亲物共溶于一普通溶剂内接着除去溶 剂。

第二种方法是新颖的，其本身形成本发明的一部分。

因此，在本发明的第二方面，提供了形成其中两亲物分子的 亲水首基朝向亲水物的亲水物/两亲物胶束的方法，该方法包含将 亲水物和两亲物共溶于一普通溶剂中，随后除去普通溶剂。

当此方法被应用时，优选地是两亲物∶亲水物的重量比为1∶ 1至50∶1，优选地为2∶1至10∶1，最优选地约4∶1。

当然，普通溶剂必须同时溶解两亲物和亲水物，并且优选为 极性溶剂如二甲基甲酰胺，二甲亚砜，或最合适地是冰乙酸。

在此方法中，与第一方法相反，胶束未必在除去普通溶剂之 前形成。

似乎很可能的是，由于除去溶剂，两亲物分子倾向于自己排 列成薄片，其首基朝向亲水物而其亲脂尾基远离亲水物。然而， 本发明的效果不取决于此意见的精确度或其它方面。

已被观察到，当溶剂被缓慢除去，例如通过在氮气流中干燥， 得到良好的结果，可能因为这样有更多的时间使两亲物分子自己 重排。

形成亲水物/两亲物胶束的第三种方法包括用亲水物在亲水溶 剂中的溶液乳化两亲物在疏水溶剂中的溶液，给出乳化液，并除 去溶剂。

乳化液既可是油包水也可以是水包油型，但如果小亲水物被 使用而不是大分子，则油包水乳化液更合适。

对于两亲物，任何疏水溶剂都可被使用，但对于用小亲水物 优选的油包水乳化液，低沸点溶剂如乙醚是优选的，因为已被发 现，当疏水溶剂通过缓和的方法如蒸发缓慢除去时得到最好的结 果，很清楚，用低沸点溶剂是最有效的。低沸点溶剂对于油包水 乳化液也是优选的，尽管对于它们来说，冻干是更合适的溶剂除 去法。亲水溶剂优选地是含水的。

两亲物∶亲水物的重量比可能是约1∶1至约50∶1，优选 地为2∶1至10∶1，最优选地为约4∶1。

亲水溶液与疏水溶液的比例不是关键的，但是如果水亲水物 被使用，诸如确证油包水而不是水包油乳化液的形成是优选的。

当油包水乳化液形成时，第三种方法适用于任何类型的亲水 物，但第一和第二种方法已被发现比第三种不太适合于用小分 子。

特别适用于用小亲水物的形成胶束的另一方法是在分散于亲 水溶剂中的闭合的类脂囊如小单层囊(SUVs)中捕集亲水物，然 后除去溶剂。

本发明方法的产物是新的，因为它使包含不正常溶于疏水溶 剂的亲水物的单相疏水制剂的生产成为可能。因此，本发明的第 三方面提供由本发明的方法得到的包含在疏水溶剂中的亲水物的 单相疏水制剂。

另外，本发明也提供包含在疏水溶剂中的亲水物和两亲物的 单相疏水制剂，其特征在于亲水物的部分被两亲物分子包围，两 亲物分子的亲水首基朝向亲水物。

优选的亲水物，两亲物和疏水溶剂是特定于刚刚描述的方法 的。

除亲水物外，在单相疏水制剂内包括其它成分也是理想的， 当亲水物是大分子时，这样常常是特别适合的，并且，在那种情 况下，制剂将包括，例如，胆汁酸盐，维生素类或其它连接或以 其它方式与大分子连接的小分子。

尽管某些大分子/两亲物胶束在Kirby等如前文献中披露过， 但被披露的胶束都是形成脂质体的中间体，并且如上讨论的，没 有对包含这类实体非脂质体或疏水组合物的在先兴趣。因此，其 中两亲物是不形成小单层囊的，且因此不被希望形成脂质体的本 发明的胶束是新的。

本发明的另一方面提供两亲物和亲水物的胶束，其特征在于 两亲物分子的亲水首基朝向亲水物，其中在两亲物和亲水物之间 没有化学作用，条件是两亲物是当水被加入胶束中时不可能形成 脂质体。

不可能形成脂质体的两亲物的一个例子是溶血卵磷脂。在大 部分含水环境中，此两亲物形成胶束而不是小单层囊，因此不适 合用于制备脂质体。然而，它在本发明中极其有用，特别是当与 可共容的疏水溶剂如油酸共用时。

本发明制剂的一个优点是它们基本上无水因此对于水解稳 定。它们也对于冻-熔稳定，并且在高温具有更大的稳定性，可 能因为在蛋白质伸展和变性过程中必须存在水。这意味着它们可 被期望具有比亲水物的含水制剂长得多的货架寿命。

本发明的溶液极其通用并具有许多应用。它们既可单独使 用，也可与水相结合形成乳化液或类似的两相组合物，它形成本 发明的另一方面。

本发明的这一方面提供包含亲水相和疏水相的两相组合物， 疏水相包含由本文所述的方法得到的亲水物在亲脂溶剂中的制 剂。

一般地，在此类组合物中，疏水相将被分散在亲水相中。

出乎意料的是这类稳定的两相组合物可以形成，因为曾经期 望亲水物将保留在疏水相中，但将穿到亲水相中。然而，已被证 明，在许多情况下，这一过程并不发生，疏水相确实保留在分散 的疏水相中，并且不以游离的溶液存在。这可能是一些残留的水 或其它连接到两亲物的亲水首基的残留亲水物的结果。它的一个 优点是亲水物的渗透泄漏不是本发明组合物一问题，这是其它已 知体系，尤其是脂质体体系的问题。

两相组合物根据所需目的，可以是瞬变的或稳定的乳化液。

乳化液颗粒的平均大小将取决于疏水相和水相两者的具体性 质。然而，将在2μm的范围。

疏水制剂在水相的分散体可通过混合，例如或者在短时间例 如10至60秒，通常约15秒剧烈涡旋，或者是例如用一轨道摇动 器缓和混合几小时而实现。

本发明含疏水制剂的乳化液也可用于制备微胶囊。如果乳化 液从含有明胶的水相形成，该明胶可用已知方法通过凝聚而从溶 液中沉淀，并将形成包围含亲水物的疏水相的微滴的膜。通过除 去亲水相，微胶囊将保留。此技术在本专业是已知的，但是与本 发明的制剂结合就被改进得特别有用。

本发明组合物可被使用的一条途径是给哺乳动物类，包括 人，口服输送那些在正常环境将不溶于亲脂溶剂中的物质。这可 以用于输送饮食的补充物如维生素类或输送生物活性物质，尤其 是蛋白质或糖蛋白，包括胰岛素和生长激素。

对于另一应用，可以例如通过上述方法胶囊或微胶囊化如维 生素类的营养物，它们然后不仅可用于人类食物的补充，也可用 于农业和水产养殖，后者的一个例子是作为喂养虾苗的饲料。

另外，此组合物在制备用于非肠道给药的药物或其它制剂， 以及用于局部或眼用方面发现了用途。对于这一应用，使用如上 所述的油溶液和水相的乳化液经常是优选的。

许多治疗和预防倾向于持久或延缓释放或包括两个组分体 系，例如包括立即释放的组分与延缓或持久释放的组分在一起。 由于其高稳定性，本发明的制剂对于持久或延缓释放的大分子的 制剂特别有用。

本发明组合物的更长货架寿命在药学领域特别有利。

油包水制剂可以在药学或遮味工业上找到应用。这在药物工 业上是一个问题，因为许多药物具有不愉快的味道，因此不被患 者，尤其是小孩接受。

进一步的应用是在美容剂工业上，其中，亲水化合物的疏水 制剂可以容易地被掺入美容剂中。可以这种方式应用的大分子的 例子包括一些具有湿润或酶作用的大分子。本发明也可用于将蛋 白质如胶原掺入皮肤用乳剂或洗剂中。

最后，本发明在化学和生物合成，例如非水酶催化合成领域 具有大量用途。

本发明现在将进一步用下列实施例说明。

实施例1

鲑鱼降血钙素如下被溶于油相。所有用于这个或其它实施例 的化学药品都是分析级或化学级的。

溶于氯仿/甲醇，2∶1(V/V)的纯卵磷脂酰胆碱被旋转蒸 发至形成一干膜，加入蒸馏水给出浓度为100mg/ml的类脂。用氮 气彻底冲洗之后，类脂通过剧烈涡旋分散，接着用探针声化总共5 分钟，直到得到小单层囊(SUVs)的乳色分散液。在整个声化步 骤中，容器一直浸没在冰浆浴中，声化在30秒突发进行，夹杂30 秒的冷却间隔。SUVs的悬浮液在1000×g离心10分钟使聚集的 类脂形成小球，上层清液被倾析并在蒸馏水中稀释两倍给每ml/50 mg的浓度。

鲑鱼降血钙素溶液通过将5mg蛋白质溶于1ml蒸馏水而制 备，给出一清亮溶液。等体积(0.5ml)的蛋白质溶液和类脂悬浮 液被一起加到10ml圆底试管中，并混合好。产生的混合物在液氮 中壳式冷冻，并在低于0.1mbar的真空和冷凝器温度-45℃冻干 过夜。

第二天，300mg油酸BP被加到冻干物中，并轻轻混合使所 有的干燥固体与油接触。混合物在偶然混合时室温放置约1至2 小时，在此期间所有的固体都溶于油中形成清亮的单相类脂，它 是光学透明的。

实施例2

浓度为100mg/ml的大豆磷脂酰胆碱SUVs通过在蒸馏水中涡 旋干燥的类脂而制备，然后如实施例1中声化。鲑鱼降血钙素水 溶液以10mg/ml制备，0.8g的等分试样被转移到试管中。1g SUVs被加入，该内容被壳式冷冻并冻干过夜。1.2g 95％油酸被 加到冻干物中，分散如实施例1中进行。含有6.7mg蛋白质/g油 酸的降血钙素制剂是完全清亮的。

实施例3

含抑肽酶的冻干物在与上面实施例2对于鲑鱼降血钙素所述 的相同条件下制备，然后在4℃存放5天，在一干燥器中与五氧 化磷一起，在该条件下基本上所有的水，不管是连接的还是游离 的，都可以除去。随后在油酸中的分散液不被损害，因为加入300 mg油酸给出一光学清亮的油相。

实施例4

浓度为100mg/ml的大豆磷脂酰胆碱SUVs在蒸馏水中如实施 例2制备。20mg/ml鲑鱼降血钙素溶液以通过在1.59g蒸馏水中 溶解3.1mg，0.67g清亮溶液(13.4mg蛋白质)与1.0g SUVs (100mg PC)在试管中混合而制备。混合物被壳式冷冻，冻干， 然后如实施例1(但用200mg油酸)中分散。产生含有42.7mg 降血钙素/g。

实施例5

浓度为100mg PC/ml的卵PC SUVs如实施例1制备。10 mg/ml的胰岛素溶液通过在稍高的浓度以20mg/g所用胰岛素的 比例加入冰乙酸，然后加入足量的水给出所需胰岛素浓度制备水 悬浮液而制造。在混合和放置15分钟之后，形成了清亮的溶液。 在试管中往1.25ml的SUVs中加入1.25ml胰岛素溶液，混合物被 壳式冷冻，并冻干过夜。第二天，0.252g油酸被加入，试管涡旋 至完全“湿润”冻干物。将制剂放置过夜以发生完全分散，此后 出现显示强乳光的黄色光学清亮的分散液。在室温，密封的试管 内氮气储存7周后，在DPLC制剂的外观(例如沉积作用)上没 有明显变化。

实施例6

按实施例2，使用每g100mg大豆磷脂酰胆碱，和如实施例2 制备的胰岛素溶液制备SUVs。在小玻璃瓶中加入50mg SUVs (5mg PC)和47mg胰岛素溶液(0.47mg蛋白质)冷冻，冻干并分 散于100mg二油精中。2小时之后初始的粒状分散液变清。

实施例7

以干燥形式提供的95％纯度的卵磷脂酰胆碱通过涡旋被直接 分散在蒸馏水中，给出带有100mg/g浓度的磷脂的多层囊的悬浮 液。此材料在生产者的指令下，在20000psi压力下挤过Emulsi FlexTM设备3次。产生的乳色分散体用蒸馏水稀释至50mg/ml， 用氮气冲洗，在使用前一直在4℃储存。30mg鲑鱼降血钙素，与 30mg抑肽酶一起被溶于6ml蒸馏水中，然后与如前制备的39.6ml 磷脂分散体混合。该混合物被分散为适当大小的等分试样，壳式 冷冻，冻干，然后加入总共47.52g甘油单油酸酯BP(温热至40 ℃熔化)，如实施例1所述混合产生光学清亮的DPLC乳色分散 体。

实施例8

将合成的二棕榈基磷脂酰胆碱溶于氯仿/甲醇，2∶1 (V/V)混合物中，然后旋转蒸发形成薄膜干燥的类脂以30mg/ml 的浓度分散在蒸馏水中，并声化形成SUVs的乳色分散液。此工艺 与实施例1一般性相似，只是温度保持在约45℃，即高于类脂的 相变温度。10mg/ml浓度的胰岛素溶液如实施例4被制备，将 0.14ml等分试样(1.4mg蛋白质)被转移到小试管中，与0.5g SUVs 等分试样(15mg DPPC)一起。混合物被壳式冷冻并冻干，产生 的冻干物分散于300mg油酸中给出清亮的蛋白质“溶液”。对比 实验显示当分散冻干物时，不需要在高于相变温度操作。

实施例9

以36mg/ml的浓度在水中制备卵磷脂酰胆碱的胶束溶液，将 0.137ml转移到小试管中。如实施例4制备浓度为10mg/ml的胰岛 素溶液，将0.137ml转移到如上试管中。试管内容物被壳式冷冻， 冻干，然后与0.3g油酸混合，产生含有4.6mg胰岛素/g油酸，在 0.023nm有吸收的清亮分散液。

实施例10

如实施例2制备浓度为100mg/ml的大豆磷脂酰胆碱SUVs， 并如实施例4制备含10mg/ml的胰岛素溶液。往5个试管的每个 中加入0.1ml胰岛素溶液(1mg蛋白质)，0.3mg SUVs(30mg PC)，混合物被壳式冷冻并冻干过夜。产生的冻干物各种被分散于 300mg系列的精馏椰子油，viz.Miglyols 810，812，818，829和840 之一中。(Miglyol一词是商标)。除往其中加入Miglyol 829之 外，所有的制剂都迅速形成乳色“溶液”，而后者形成一稠的， 不透明的凝胶。经放置，分散液变清，第二天，Miglyols 812，818 和840完全清亮，而810轻微乳色。Miglyol 829保持为浑浊的凝 胶。

实施例11

如实施例2制备大豆磷脂酰胆碱SUVs，并制备浓度为10mg /ml的鲑鱼降血钙素溶液。将100μL降血钙素溶液(1mg蛋白质) 和300mg SUVs(30mg PC)加到6个小试管的每个中，内容物被壳 式冷冻并冻干。往5个冻干物的每个中加入300mg Miglyols 810， 812，818，829和840。而往第6个中长链三酸甘油酯油(MCT) 油混合后，所有的制剂都是乳色的或浑浊的，但放置之后变得较 清。第二天早晨，在Miglyols 810和840中的分散液是浑浊的， 在MCT油和Miglyols 812中的是乳色的，而在Miglyols 818和 829中的完全清亮，轻微温热后，乳色和浑浊的分散液变清，但在 室温放置过夜后又变为前面的形式。

实施例12

制备浓度为10mg/ml的Candida cylindericae脂酶水溶液，与浓度为 100mg/ml(见实施例2)的大豆磷脂酰胆碱SUVs一起。将50μL 脂酶溶液的等分试样(0.5mg蛋白质)加到几个小试管中，将100 μL SUVs(10mg PC)加到每个试管中。混合物立即冷冻，冻干， 用氮气冲洗，然后用石蜡密封，再储存于冷冻器内。冻干物之一 被熔化并与0.44g亚油酸混合，30分钟后，形成完全清亮的DPLC 分散液。将0.1g胆甾醇溶于油中，试管用氮气冲洗，用石蜡密封， 转移到37℃孵育器中。2天后，混合物用逆向薄层包谱分析，并 显示出，除起始反应物之外，还有一个Rf值与胆甾醇亚油酸酯完 全相同的斑点。这表示溶在油相的酶是催化活性的。此合成的酯 化反应与通常与酯酶活性有关的普通水解过程相反。

实施例13

如实施例2制备浓度为100mg/ml的大豆磷酯酰胆碱SUVs。 两个0.15ml等分试样(15mg PC)被分到小试管中，往每个中加 入浓度为3mg/ml的蘑菇酪氨酸酶水溶液。内容物被壳式冷冻并 冻干。往冻干物之一中加入0.3g油酸，而往另一个中加入0.3g MCT油，之后，试管被涡旋混合。45分钟之后，MCT制剂形成 清亮的棕色分散液，而油酸的需要2小时。

将分散液对2个分开的酶底物，儿茶酚和酪氨酸，进行试验， 其结果与用游离酶水溶液得到的比较。各个反应在脯氨酸存在下 进行。当用游离酶时，各个底物逐渐转化为强颜色的颜料。然而， 在DPLC分散液存在下，对于儿茶酚有颜料形成，而酷氨酸没有。 颜色强度对油酸制剂比MCT油的低，可能是因为酶活性的低pH 作用。当油相被暂时通过涡旋在水相中乳化时，可以见到相同类 型的底物转化。然而，当乳化在Triton X100TM存在下进行时，对 于两个底物都有颜料形成。

对于观察到的结果提出的解释是，儿茶酚能进入油中接近被 包裹的酶，而酪氨酸被限制在水相。酶对儿茶酚作用的醌产物可 以回到水相并与脯氨酸相互作用形成有颜色的产物。此实验证明 酶以活性形式被包裹在油内，在分散时不释放到油中。然而，当 表面活性剂如Triton X100TM被加入时，酶被释放并游离而对各个 底物作用。

实施例14

平均颗粒直径30nm的胶态金被制备并通过加入牛血清蛋白 到0.001％稳定化。0.2g酒红色金溶胶与如实施例1中制备的浓 度为100mg/ml的0.2g卵磷酯酰胆碱SUVs一起被加到小试管中。 混合物被壳式冷冻，冻干，然后与0.3g油酸混合。2小时(偶尔 摇动)后，分散液完全清亮，形成与原始金水溶胶很相似的红色 油相。

实施例15

1mg肽抗生素，Nisin，与用于实施例14的0.2g相同卵磷脂 酰胆碱SUVs混合，并以相似方式处理。在2小时内形成晶状透明 分散体。

实施例16

如实施例13所述将酪氨酸酶掺入油酸中。将1份(重量)此 分散液加到4份温热至50℃的含水明胶中，通过涡漩快速混合， 然后转移到一小烧杯中，在其中用磁力搅拌器继续混合。两份20 ％硫酸钠被均匀地滴加到里面，然后在15℃，磁力搅拌下将混合 物倒入40份7％含水明胶中。混合继续一会，然后将一部分产生 的明胶囊用儿茶酚和酪氨酸作底物进行酶活性试验。如实施例13 所见，对于儿茶酚有颜色形成，而酪氨酸则没有，表明在油的微 胶囊化期间酶/类脂复合物在油相内保持完整。

实施例17

将100mg细胞色素C，血红蛋白和FITC-葡聚糖分别溶于 1ml蒸馏水中。将4.4mg RNA(从Torula酵母提取)溶于1ml磷酸 缓冲的生理盐水中。这些溶液各2×50μL被分到干净玻璃管内， 往一份溶液中加入250μL如实施例1以浓度为40mg/ml蛋黄卵磷 脂(PC)制备的SUVs。

两管都被壳式冷冻并如前冻干过夜。第二天300μL油酸被加 入每管中。样品在室温放置，偶尔涡旋，共1小时直至完全分散， 油类被放置过夜。不同PC制备的样品的浊度比含PC的大。

第二天，没用PC制备的样品有沉淀出现。在不搅动任何样品 的情况下，每个样品的顶部150μL被取出，测量两个被取出物的 吸光度，混合后遗留该物；比较两个读数，计算有或没有PC的样 品的沉淀百分数(测量误差±5％)。得到的数值列在下面。

大分子                24小时后的沉淀百分数

                      +PC              -PC

细胞色素C             3.1              76

血红蛋白              0                44

FITC葡聚糖            0                68

RNA                   0                73

实施例18

如实施例1的过程，所不同的是蛋白质溶液由在乙酸铵(10 mg/ml)中浓度为10mg/ml的铁蛋白或辣根过氧化酶(HRPO) 组成；而SUVs由在乙酸铵(也是10mg/ml)中浓度为50mg/ml 的蛋黄磷脂酰胆碱组成。冻干并分散于油酸中后，得到光学清亮 的溶液(尽管铁蛋白溶液显示一定的乳色，并有很强的颜色)。

将HRPO溶液分成相等的两份，一份进行五次冻-熔循环， 在回到室温前，重复冷却至+4℃，每次都固化油酸。在冻-融 样品和放置不动的样品之间没有观察到光学清亮度的不同。 实施例19

在下列过程中，不同的方法被用于在如前的油相溶解胰岛 素。制备用不同量的磷脂酰胆碱(PC)平行地进行几次。

100mg胰岛素在涡旋下溶于2ml冰乙酸中。500mg PC在涡 旋下溶于5ml冰乙酸中。往5个玻璃2ml旋盖小瓶中分入100μL 胰岛素溶液。将不同体积(100，200，300，400，500μL) 的PC溶液分入每个小瓶内，每个内容物被混匀。

溶液在氮气流中涡旋蒸干，然后最后剩余的溶剂在室温下真 空(8×10-2mbar)除去，在一冻干器中过夜。第二天，将300μL 油酸加到每个小瓶内，小瓶的内容物在轨道摇动器上轻轻混合另 外24小时。

150μL的每种溶液的吸光度在450nm用自动报读数器测量。 结果如下： 管数            1        2       3       4       5 胰岛素(mg)      5        5       5       5       5 油酸(mg)        300      300     300     300     300 PC(mg)          50       40      30      20      10 PC∶胰岛素      10∶1    8∶1    6∶1    4∶1    2∶1 OD450          0.123    0.124   0.116   0.115   0.714

所有得到的溶液者表现为光学清亮的，只有#5例外，它是 浑浊的并强烈地散射光。

实施例20

应用与实施例19相同的过程，所不同的是用牛脑鞘磷脂代替 磷脂酰胆碱，导致胰岛素/鞘磷脂/油酸的重量比为5/50/200。干燥 的固体与油混合1小时后得到完全清亮的溶液。室温放置几天后， 形成不透光的凝胶，它在温热至37℃时再给出清亮的溶液。

实施例21

如实施例1的过程，所不同的是由辣根过氧化酶(HRPO) 构成的蛋白质蒸馏水中浓度为10mg/ml，SUVs由蛋黄磷脂酰胆 碱组成，并用实施例7中所述的方法，用EmulsiflexTM以50mg/ml 的浓度制备。冻干后，固体物被分散于植醇或甘油单油酸酯中。 在各种情况下都得到光学清亮的溶液。

实施例22

将麦胚tRNA以5mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，50μL等分试 样溶液与100μL或50μL由在蒸馏水中浓度为50mg/ml的大豆PC 组成的SUVs混合。PC与tRNA的比例分别为20∶1和10∶1。 混合物在-20℃冷冻并冻干给出干燥的白饼。加入100μL油酸， 接着在轨道摇动器上轻轻混合，对于PC∶RNA比为20∶1的情 况给出光学清亮的溶液，相反地，10∶1PC∶RNA，或没有 PC的tRNA，给出不透明的浑浊悬浮液，已被650nm处的OD读 数证明。 PC∶RNA比        20∶1        10∶1        0 OD450           0.044        0.240        0.657

实施例23

将抑肽酶以10mg/ml的浓度溶于蒸馏水中。将十六烷基磷酰 胆碱(HDPOC)以100mg/ml的浓度溶于蒸馏水中。往100μL 抑肽酶溶液的等分试样中加入体积范围为0至10，20，30，40 至50μL的HDPOC。混合物在-20℃冷冻并冻干过夜。第二天， 往每份样品中加入100μL油酸，并在室温下在轨道摇动器上摇动1 小时。得到类脂∶蛋白质比为4∶1和5∶1的光学清亮溶液， 已被650nm处的读数证明。 类脂∶蛋白质比   0      1∶1     2∶1     3∶1    4∶1    5∶1 OD650           1.117  0.869    0.438    0.207   0.094   0.099

实施例24

将4mg过氧化酶溶于4ml蒸馏水中，100μL等分试样被分到 玻璃旋盖的2ml小瓶中。往每个小瓶中加入100μL声比的DMPC (二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，在蒸馏水中，100mg/ml)，混匀 并冻干。

当混合物被完全干燥时，通过往每个小瓶中加入100μL或者 单独或者在溶液中以3mg/10ml的浓度含OPD(邻苯二胺)的叔 丁醇而分散蛋白质/类脂复合物。对照物通过在不存在酶时往空的 的或含DMPC的管中加入叔丁醇±OPD而制备。制备每种组合的 复制品，往一套管中在混合下加入10μL氢过氧化枯烯底物。室温 放置半小时后，各样品的光学强度在450nm在微板读数器中被读 数。背景消除后得到的结果列于表中。

在有机溶剂中在氢过氧化枯烯存在下过氧化酶对OPD的作用

                酶/DMPC  单独的DMPC  单独溶剂

单独的OPD        0.249     0.032      0.015  OPD+氢过氧化枯烯    2.517     0.075      0.051

实施例25

将辛基葡糖苷溶于蒸馏水中并分到微板的井中给出每井如下 量的两亲物：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，5，7.5和10mg。 将抑肽酶以5mg/ml的浓度溶于蒸馏水中，100μL被分到上面的 每个井内，含0.5mg蛋白质。将板混匀，在-20℃冷冻并冻干过 夜。第二天，100μL油酸被加到各个井中。在室温摇动板，在550 nm用板读数器间隔地测定光学强度。低的吸光度值表明低散射， 对应于蛋白质在油中的有效分散。

用上述方法，证明了加入辛基葡糖苷作为两辛物帮助抑肽酶 在油酸中分散的效果。在不同的时间，加入油酸后，以光学强度 作为辛基葡糖苷浓度(以恒定的蛋白质浓度)的函数的结果给于 表和附图中。   辛基葡糖苷        1hr         4hr         8hr

      0.00      0.548       0.458       0.489

      0.50      0.082       0.043       0.103

      1.00      -0.003      -0.008      -0.008

      1.50      -0.004      -0.015      -0.015

      2.00      -0.007      -0.012      -0.013

      2.50      0.006       -0.004      -0.002

      5.00      0.307       -0.013      -0.014

      7.50      0.65        -0.015      -0.014

      10.00     1.628       0.817       -0.014

实施例26

将1mg黑色素加1ml蒸馏水中，用氢氧化铵溶液升高pH 后溶解。50μl此溶液通过加入950μL蒸馏水稀释20倍。往微板 的两批7个井中加入0，12.5，25，37.5，和50μl稀溶液，和 12.5和25μl浓溶液。往一批的每个井中加入通过在100mg/ml的 浓度冷却下声化10分钟制备的大豆磷脂酰胆碱。另一批不动。将 板混匀，在-2℃冷冻并冻干过夜。第二天，100μl M818被加到 含有黑色素/类脂复合物的那排井中，而100μl蒸馏水被加到只含 黑色素的那排井中。在所有的红棕色溶液完全变清后，在600nm 测定所有浓度黑色素的光学强度。从表和附图可以看出，Beer- Lambert’s定律服从于此浓度范围(即对应曲线是直线)，而黑色 素的行为在油和水溶液中是相同的。黑色素在没有磷脂酰胆碱存 在下通过声化分散于M818中给出一黑色分散液，它沉淀，在离 心后给出清亮的上层清液。黑色素/类脂复合物分散于M818之后 没有这类变化被观察到。 在600nm测量浓度(mg/ml)    Miglyol       水

        0                0          0

        0.0625           0.078      0.072

        0.125            0.157      0.159

        0.187            0.23       0.23

        0.25             0.306      0.333

        1.25             1.565      1.259

        2.5              2.857      2.653

实施例27

在冷却下，通过在蒸馏水中以100mg/ml的浓度探针声化制 备大豆磷脂酰胆碱的分散液。1ml此悬浮液并分到玻璃容器内， 并加入660μl硫酸新霉素溶液(在蒸馏水中5mg/ml)。混合后， 管内容物在液态中壳式冷冻，并冻干过夜。第二天，加入1g Migloyol 818，容器用氮气冲洗，封好并在室温放置过夜。得到一 光学清亮的溶液。

实施例28

用与实施例27相同的过程，只是用后叶加压素代替硫酸新霉 素。

实施例29

用与实施例27相同的过程，只是用5-氟尿嘧啶代替硫酸新 霉素。

实施例30

用与实施例27相同的过程，只是用5-氟脱氧尿苷代替硫酸 新霉素。

实施例31

将0.55ml核糖核酸酶溶液(含10mg RNA se/ml)与如实施 例2中制备的1.6ml大豆PC SUV，在液氮中壳式冷冻并冻干过 夜。冻干物与1.6g Miglyol 818混合，涡旋并放置。几小时后形成 清亮的分散液。

实施例32

往在40μL水溶液中的32μg质粒DNA中加入40μL 0.2nm精 胺溶液；制剂被混合并放置15分钟产生DNA缩合。如实施例2 制备大豆PC SUVs，但含50mg PC/g，并将40μL加到DNA/精 胺混合物中。将制剂冷冻，冻干过夜，将100μL Miglyol 818加到 产生的冻干物中。制剂在1小时的周期分散给出清亮的分散液。

实施例33

两排3个小试管被装好，往第一排的每个试管中加入57μL如 实施例5制备的含10mg胰岛素/ml的溶液。往第二排的每个试 管中加入0.2ml 0.267mM羧基荧光生(CF)。如实施例2制备 含100mg PC/ml的大豆PC SUV，0.2ml被加到每个试管中。将 试管内容物混合，壳式冷冻并冻干过夜。通过将适当的组份加到 一起，加热到78℃直到产生液化然后简短涡旋制备各自含有2％ (Wt/Wt)油酸的高熔点三酸甘油酯三棕榈精(TP)，三(十 七烷酸)甘油酯(TH)和三硬脂精(TS)的熔融物。将冻干物 在炉内加热至相同温度。往含胰岛素冻干物的试管1，2和3中 分别加入150mg TP，TH和TS的熔融物。往含CF冻干物的试 管1，2和3中以相同顺序加入100mg熔融物。加完后，试管加 盖，简短涡旋，然后返回炉内。几分钟后，所有的CF分散液完全 清亮。胰岛素制剂在1至2小时清化以形成几乎清亮的分散液。

实施例34

制备一系列冻干物，各自含有0.3mg葡萄糖(从含1.5mg/ml 的溶液衍生)和6mg大豆PC(从如实施例2制备的SUV衍生)。 往3份冻干物中分别加入辛醇，油酸和Miglyol 818。辛醇制剂在 几分钟内分散，而油酸和Miglyol制剂需2至3小时，形成清亮分 散液。

实施例35

从0.8ml 25mM氯化钙与0.8ml大豆PC SUV(如实施例2 制备)一起衍生制备冻干物。往一个中加入500mg Miglyol 818， 而往另一个中加入500mg油酸。几小时后，油酸制剂形成完全清 亮的分散液，Miglyol制剂则在放置过夜之后。

实施例36

往分开的小玻璃瓶中加入1mg抑肽酶和1mg胰岛素，分别都 为100μl含10mg/ml的溶液形式。胰岛素溶液如实施例5制备。 往每个小瓶中加入0.2ml AOT(以10％(W/V)提供)水溶液。将 混合物壳式冷冻，冻干过夜，往每个中加入200mg辛醇。抑肽酶 制剂迅速变清但24小时后形成乳色分散液。胰岛素制剂分散较 慢，但在放置过夜后清亮。

实施例37

将20μl含0.8mg Mucor mehii脂酶的脂酶溶液加到2个小玻 璃瓶中。往一个小瓶中加入89μl含36mg lyso PC/ml的胶束溶液， 往另一个中加入如实施例2制备的9μl大豆PC SUV。将每瓶的 内容物混合，在液氮中冷冻并冻干过夜。往每个冻干物中加入含 88mg胆甾醇/g和1mg α-生育酸/g的500mg亚油酸。小瓶用氮 气充洗，密封并转移到一辊筒式混合器中2小时。在此期间形成 一清亮的分散液。然后将小瓶在一加热部件中50℃培育。该混合 物与适当的对照一起用薄层色谱分析，发现胆甾醇亚油酸酯在每 个制剂中已被生物合成。

由此可见，本发明提供了将亲水物掺入亲脂溶液的方法和具 有许多不同应用的多功能产品。