一种源于红球菌属微生物的卡那霉素抗性基因

本发明涉及一种源于红球菌属微生物并赋予细菌以卡那霉素抗 性的基因，以及含此基因的质粒载体。

称为细菌催化剂的红球菌属微生物，能水化或水解腈类生成相 应的酰胺类或酸类(日本专利公告号4873/92和日本专利公开号 91189/87、470/90和84198/90)，特别是玫瑰色红球菌种微生物具有 相当高效的水化腈的活性(日本专利公开号470/90)。

鉴于此，本发明的发明人之一从玫瑰色红球菌种的一个菌株中 发现了隐匿的质粒，构建了杂种质粒载体以便建立红球菌属宿主载 体体系(日本专利公开号148685/92、64589/93和68566/93)。

为建立具有较高可靠性的自主克隆体系，也有必要开发源于红 球菌属微生物的标记基因。然而，源于玫瑰色红球菌种微生物的只 有亚砷酸和镉抗性基因才称为所说的抗药性基因(质粒23，242- 247(1990))。

为建立一种红球菌属的自主克隆体系，本发明人广泛研究了源 于红球菌属微生物的抗药性基团，特别是玫瑰色红球菌种的抗药性 基因，结果他们发现了本发明的卡那霉素抗性基因。

本发明涉及源于红球菌属微生物并对宿主菌赋予卡那霉素抗性 的DNA，所说的宿主携带编码SEQ No.1的氨基酸序列或含部分此序 列的多肽的DNA序列。

图1表示质粒pKM001的限制性酶切图谱。

图2表示质粒pKM002、pKM003和pKM004的构建过程。

图3表示质粒pKM011的限制性酶切图谱。

作为本发明的DNA供体，可提到的是，通过玫瑰色红球菌ATCC 12674自发突变获得的卡那霉素突变菌株KM-02(保藏号为FERMBP -5137，国立生物科学和人类技术研究院，工业科技会社，日本)。

作为本发明用于克隆的载体，可提及的是，包括但不限于pTrc 99A、pUC18等大肠杆菌的质粒载体，和如λgt11的噬菌体载体。宿 主微生物包括但不局限于大肠杆菌JM109、大肠杆菌JM105和玫瑰色 红球菌ATCC12674。

由携带能在红球菌属微生物中复制的区域的本发明卡那霉素抗 性基因构建的、用于提供质粒载体的质粒包括但不局限于pRC001、 pRC002、pRC003、和pRC004。质粒pRC001、pRC002、pRC003和 pRC004分别源于玫瑰色红球菌ATCC4276、ATCC14349、ATCC14348和 IF03338，而且这些质粒在上述日本特许专利公开号148685/92、 64589/93和68566/93中分别作了描述。

源于红球菌属微生物的本发明的卡那霉素抗性基因用于构建红 球菌属微生物载体，特别是玫瑰色红球菌自主克隆载体。

                  实施例

下面的实施例详述了本发明，但不是限制本发明范围。

                   实施例1 源于突变菌株KM-02的卡那霉素抗性基因克隆进大肠杆菌JM109中 (1)制备源于KM-02的基因组DNA和DNA文库

在100ml附培养基中(0.5％多蛋白胨、0.3％细菌酵母提取物、 0.3％细菌麦芽提取物)于30℃摇动培养KM-02菌株，按照Saito Miura法(Biochem.Biophys.Acta 72，619(1963))从细菌中制备基 因组DNA。用限制性酶Sau 3AI部分消化提取的一部分DNA，然后插入 到大肠杆菌载体PTrc 99A的BamHI位点，建立重组DNA文库。 (2)转化子的制备和重组DNA的筛选

将步骤(1)制备的重组DNA文库通过CaCl2法转化大肠杆菌JM109， 以下列方式筛选带有卡那霉素抗性的转化子。

上述转化子被涂到含40μg/ml盐酸卡那霉素和1mM IPTG(异丙 基-β-硫代半乳糖苷)的LB培养基上(1％胰蛋白胨、0.5％细菌酵母提 取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)，37℃孵育过夜，移出培养基上长出的 菌落并转接到同样的琼脂培养基上，使其稳定生长。

按Birnboim和Doly法(NuCleic Acid Res.7，1513-1523(1979))， 从得到的转化子制备质粒DNA，命名为pKM001。将这种质粒再次引进 大肠杆菌，结果产生带有卡那霉素抗性的转化子，命名为 JM109/pKM001，保藏号为BP-5138，国立生物科学和人类技术研究院， 工业科技会社。大肠杆菌JM109/pKM001的卡那霉素抗性的表达需 要IPTG。 (3)pKM001的限制性酶谱和卡那霉素抗性基因的定位。

绘制了经步骤(2)获得的质粒pKM001的限制性酶谱(图1)。此后， 用质粒pKM001，制备小片段DNA质粒。以与步骤(2)同样的方法制备 的转化子的卡那霉素抗性的有或无识别含靶基因的区域。此过程构 建了质粒pKM002(图2)。 (4)核苷酸测序

用Pharmacia公司生产的荧光测序仪ALFII测定质粒pKM002的卡 那霉素抗性基因的核苷酸序列(SEQ NO 3)。

                  实施例2 制备源于玫瑰色红球菌的带有卡那霉素抗性基因的杂种(大肠杆菌- 红球菌)质粒载体。

杂种质粒载体pK4先由本发明人之一通过连接源于红球菌属的 质粒pRC004和大肠杆菌载体pHSG299构建的，保藏号为FERMBP-3731， 国立生物科学和人类技术研究院，工业科技会社(日本特许专利公开 号64589/93和68566/93)。此载体用于制备一个含整个PRC004和部 分pHSG299的3.1kb Hind III片段，将结果产生的片段和质粒pKM002 连接起来。

结果，获得了携带插入子方向不同的两个质粒，分别命名为 pKM003和pKM004(图2)。这些质粒不仅在红球菌属中，而且能在大肠 杆菌中复制。经电穿孔法用这些质粒转化玫瑰色红球菌ATCC12674， 获得了能在含75μg/ml卡那霉素的MY培养基上生长的转化子，从转 化子获得的质粒和引进的质粒相同。当红球菌属微生物作为宿主时， 表达卡那霉素抗性不需要IPTG。

                实施例3 红球菌属微生物载体的构建

用限制性酶kpnI切割杂种质粒载体pKM004，产生一4.3kb kpn I片 段，然后自身连接，并通过电穿孔导入玫瑰色红球菌ATCC12674，所 产生的转化子和实施例2产生的转化子的卡那霉素抗性程度相同。 从此转化子获得了一个质粒，命名为pKM011(图3)。 序列表 序列号：1 长度：171 序列类型：氨基酸 拓扑结构：线性 性质：蛋白质 起源

微生物：玫瑰红球菌

菌株：KM-02 序列 Met Ser Asp Asn Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Glu Gly Ala Pro Leu   1               5                  10                  15 Pro Arg Arg Ala Arg Ser Ser Arg Pro Ser Ala Gly Asn Ser Pro Ala

         20                  25                  30 Pro Gly Arg Arg Ala Val Val Ala Lys Ser Arg Arg Arg Leu Ala Ala

     35                  40                  45 Ala Pro Glu Ala Gly Thr Thr His Tyr Ser Ile Phe His Gly Asp Gln

 50                  55                  60 Leu Ile Gly Phe Ile Gln Trp Tyr Glu Ala Glu Asp Asn Pro Asp Phe  65                  70                  75                  80 Arg His Ala Gly Leu Asp Leu Phe Leu Asp Pro Asp Phe His Gly Arg

             85                  90                  95 Gly Phe Gly Arg Glu Ser Ile Arg Val Leu Cys Ala His Leu Ile Asp

        100                 105                 110 Asp Leu Ala Phe His Arg Leu Val Ile Asp Pro Glu Val Asp Asn Ser

    115                 120                 125 Val Ala Ile Ala Cys Tyr Arg Ser Val Gly Phe Lys Asp Val Gly Val

130                 135                 140 序列号：2 长度：516 性质：核酸 链形：双链 拓扑结构：线性 起源

微生物：玫瑰色红球菌

菌株：KM-02 序列： ATG  AGT  GAC  AAC  GGC  TCC  GGA  ACT  ACG  CGG  CCC  GAG  GGT  GCT  CCT  CTC       48 CCC  CGT  CGC  GCC  CGA  TCA  TCA  CGC  CCG  TCT  GCG  GGC  AAT  TCA  CCT  GCA       96 CCC  GGA  CGT  CGT  GCA  GTG  GTG  GCA  AAA  TCC  CGA  CGA  CGA  CTG  GCT  GCG      144 GCG  CCA  GAA  GCC  GGA  ACC  ACG  CAC  TAC  AGC  ATC  TTC  CAC  GGC  GAC  CAA      192 CTG  ATC  GGC  TTC  ATC  CAG  TGG  TAC  GAA  GCG  GAA  GAC  AAC  CCC  GAC  TTC      240 CGC  CAC  GCC  GGG  CTC  GAC  TTG  TTC  CTC  GAT  CCC  GAC  TTC  CAC  GGC  CGA      288 GGG  TTC  GGT  CGC  GAA  TCG  ATT  CGC  GTG  CTG  TGT  GCC  CAC  CTG  ATC  GAC      336 GAC  CTC  GCA  TTC  CAC  CGT  CTG  GTC  ATC  GAC  CCG  GAG  GTC  CAC  AAC  TCC      384 GTC  GCC  ATC  GCG  TGC  TAC  CGA  TCG  GTG  CGG  TTC  AAA  GAC  GTC  GGG  GTG      432 ATG  CGC  GAG  TAT  TCG  CGA  GAT  CGC  CAT  GGT  GTG  TGG  AAG  GAC  GGA  CTG      480 CTG  ATG  GAT  CTG  CTC  GCA  CGG  GAA  TTC  ATC  CGC  TGA                          516 序列号：3 长度：748 序列类型：核酸 链形：双链 拓扑结构：线性 起源

微生物：玫瑰色红球菌

菌株：KM-2 序列： GGATCCGGGG  TCGTCGCCCA  CCAGGATGGT  ACCCAAGCCG  GGTGTGATGC  CCTCTGCCTT       60 CGAGCGCTCA  CCCGCACCTT  CAGGTCTTCG  AAGATTTCGT  CGCGGGTAGC  TTTGCCGTCG      120 AGGATCGTTG  CAGTCACGGC  GACCATTGTT  CCAGGTTAGG  GTCGATGAGT  GACAACGGCT      180 CCGGAACTAC  GCGGCCCGAG  GGTGCTCCTC  TCCCCCGTCG  CGCCCGATCA  TCACGCCCGT      240 CTGCGGGCAA  TTCACCTGCA  CCCGGACGTC  GTGCAGTGGT  GGCAAAATCC  CGACGACGAC      300 TGGCTGCGGC  GCCAGAAGCC  GGAACCACGC  ACTACAGCAT  CTTCCACGGC  GACCAACTGA      360 TCGGCTTCAT  CCAGTGGTAC  GAAGCGGAAG  ACAACCCCGA  CTTCCGCCAC  GCCGGGCTCG      420 ACTTGTTCCT  CGATCCCGAC  TTCCACGGCC  GAGGGTTCGG  TCGCGAATCG  ATTCGCGTGC      480 TGTGTGCCCA  CCTGATCGAC  GACCTCGCAT  TCCACCGTCT  GGTCATCGAC  CCGGAGGTCG      540 ACAACTCCGT  CGCCATCGCG  TGCTACCGAT  CGGTGGGGTT  CAAAGACGTC  GGGGTGATGC      600 GCGAGTATTC  GCGAGATCGC  CATGGTGTGT  GGAAGGACGG  ACTGCTGATG  GATCTGCTCG      660 CACGGGAATT  CATCCGCTGA  TCGACTGGGA  CGAGTTCGAA  AGGACCGACA  TCATGTTGCT      720 GGACAAGGAA  TTCACGGCCA  CCCTGCAG                                            748