蛋白质的分离

本发明涉及一种从蛋白质水溶液中分离蛋白质，尤其是酶的方 法，及回收晶体形式的期望蛋白质。

酶通常以液体或非晶体材料用于工业目的。如不用液体，一般 用非晶体材料，因为通常认为酶晶体化的已知方法太昂贵以致不能 用于工业化规模。由于酶晶体的高纯度，提供一种容易适合于工业 化规模的酶的晶体化的廉价和简便的方法显然是工业上的需要。

关于酶的晶体化的文献很多。难于概括关于具体晶体化方法的 结果。酶晶体化的技术是高度经验主义的，而且对一组酶证实是成 功的方法，对其它酶不一定是成功的。

迄今已知的蛋白质晶体化方法的特性是很纯和很浓的初始浓 度，低产率、很长的结晶时间、高的化学品包括有机溶剂的消耗，和 差的工业适用性。

本发明的目的是提供一种回收晶体蛋白质尤其是酶的方法，此 方法不需要加入大量的盐或有机溶剂，允许短的结晶时间和高的产 率，并且简单、价廉及适于工业要求。

因此，本发明提供了一种从蛋白质含水混合物中分离蛋白质的 方法，此方法包括：

a)提供一种盐浓度为1.5M或低于1.5M，其中加入了水溶性聚 合物的蛋白质含水混合物；

b)回收晶体形式的蛋白质。

本发明通过附图得以进一步说明，其中，

图1说明在不同的PEG4000浓度和不同的CaCl2浓度(■1％ CaCl2；▲2％CaCl2，□2.5％CaCl2)下过氧化物酶的晶体化产率 (％)。

图2说明在不同的pH值条件下过氧化物酶的晶体化产率 (％)。

图3说明在不同的酶和PEG 4000的浓度下(■3％过氧化物酶 和1.4％的其它酶；◆4.8％过氧化物酶和2.3％的其它酶，及▲ 6.7％的过氧化物酶和3.1％的其它酶)过氧化物酶晶体比产率 (％)。

图4说明在不同的CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度下(■ 20％PEG 4000；◆22％PEG4000；▲24％PEG4000；□26％ PEG4000；◇28％PEG4000和△30％PEG4000)过氧化氢酶的晶体 化产率(％)。

图5说明在不同的CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度下(■ 20％PEG 4000和◆25％PEG 4000)过氧化氢酶的晶体化产率(％)。

图6说明在不同的PEG1500浓度和0.2％的CaCl2浓度下过氧 化氢酶的晶体化产率(％)。

图7说明在不同的PEG 4000浓度下蛋白酶的晶体化产率(％)。

图8说明在不同的PEG 4000浓度和1.1％的CaCl2浓度下蛋白 酶的晶体化产率(％)。

本发明提供了一种从含水混合物中分离蛋白质或多肽的方法， 此混合物包括具有不同结晶特性的其它蛋白质。令人惊奇地发现，通 过加入水溶性的聚合物，例如聚乙二醇，可从其混合物中分离蛋白 质，此混合物含其它蛋白质和其它杂质，如碳水化合物，并且蛋白 质能够以晶体形式析出。

用聚乙二醇(PEG)沉淀和结晶蛋白质及用PEG修饰晶体结构 可从文献中获知，然而用PEG结晶纯化蛋白质是新的。PEG已单独 用于获得衍射分析的晶体，参见A.Mcpherson in Eur.J.Biochem. 189，1990，pp.1—23；R.N.Haire et al.in Biopolymers Vol.23 (12)，1984，pp.2761—2779；and J.C.Lee et a1.in J.Biol.Chem. 256(2)，1981，pp.625—631。

一般认为，PEG借此发挥作用的部分机制，象用盐和有机溶剂 诱导的结晶一样，结合降低溶液的等电特性，进行盐析作用。除此 之外，在某些情况下，PEG似乎能通过增加蛋白质的热力学活性使 蛋白质从溶液中析出，结果产生一种非结晶的PEG次级相，非结晶 的蛋白质沉淀能从此次级相有效地转变成蛋白质晶体，参见 K.N.Haire et al.in Biopolymers Vol.23(12)，1984，pp.2761一2779。

通过使用PEG和高盐浓度，另一种用于蛋白质结晶的PEG含 水双相体系已经产生，其中用PEG相浓缩了蛋白质，在界面处晶核 产生了，在高盐浓度的驱动下在水相中生成了晶体，参见Eur.J. Biochem.189.1990.PP.123。

根据本发明的研究，一种不同的令人惊奇的机理似乎解释了结 晶过程，基本的差别是在相当低的盐浓度下，通过PEG分子和蛋白 质之间的亲和力动结晶。其结果是相分离在此蛋白质以水溶性形式 浓缩成微滴，其中如下所述晶核和晶体产生了：

当将PEG(以自身不产生双相体系的浓度)加至蛋白质溶液中 时，对PEG具有亲和力的蛋白质与PEG分子缔合产生非均质溶液， 在恰当的PEG分子量、PEG浓渡、盐浓度和蛋白质浓度下，非均质 溶液能产生一种体系，此体系含有降低了的蛋白质浓度的水相和很 高蛋白质浓度的微滴。此体系似乎和正常的含水双相体系完全不同， 因为不能通过传统低速离心分开相；但是，用超速离心(如实施例 11所述)，可能看到两相。

在具有高蛋白质浓度和可除去一些杂质的小滴中，产生了晶体 形成的最适条件。晶体此时显然在小滴中形成，直至它们达到一定 大小，它们可以崩出小滴产生一种正常的单相含水体系，此体系在 结晶完毕含有固态晶体。然而，依赖于要探究的蛋白质，此体系也 能以双相体系终止，在小滴相中的带有大部分晶体。出现在小滴相 中和从周围浓液小滴表面崩出的晶体生长的实例也已被观察到。

在一双相含蛋白质的小滴体系中通过纯化和浓缩的形式结晶蛋 白质的这种假定机制通过在水溶性聚合物和蛋白质之间的亲和力而 产生，证实此技术甚至对低浓度和不纯蛋白质溶液也是非常有利的。

本发明的方法可用于从蛋白质混合物中分离蛋白质，特别是从 蛋白质的混合物中分离酶。在优选的实施例中，含酶溶液是通过培 养产酶的微生物获取的培养肉汤。优选地本发明的方法用于培养肉 汤，此肉汤首先接受固/液分离技术，例如经絮状沉淀、离心、过滤 或微过滤处理。在结晶前经沉淀或用层析方法纯化也可能是有用的。

在更具体的实施例中，本发明的方法包括通过本身已知的方法 浓缩合酶溶液。此方法包括经超速离心、透析过滤、透析或蒸发浓 缩。

含蛋白质的水溶液的浓缩，虽然对进行结晶不必要，但是便于 操作和产生理想产率。由于实际原因，含酶溶液可被浓缩至酶蛋白 的含量为0.1—25％W/W，优选0.5—15％W/W，最优选1—10％ W/W。

在优选的实施例中，本方法用于分离氧化还原酶、蛋白酶、脂 酶、淀粉酶和纤维素酶。氧化还原酶已在“Enzyme Nomenclature 1992， Academic Press，Inc.，San Diego”，中定义并叙述过，属于一类催化 电子从一种物质变成另一种物质(氧化—还原)的酶。氧化还原酶 包括脱氢酶、还原酶、氧化酶、转氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶 和加氧酶。

更具体的实例包括辣根过氧化物酶、木质素酶和其它过氧化物 酶，和如漆酶的氧化酶。这些酶优选地来源于微生物。

可用于产生合适的氧化还原酶的微生物属的实例为：栓菌属 ((Trametes)、丝核菌属(Rhizoctonia)假单胞菌属(Pseudomonas)芽 孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomvces)，蜡伞属(Hygrophorus)、 鬼伞属(Coprinus)、多孔菌属(Polyporus)、假丝酵母属(Candida)、变 孢属(Curvularia)、尾孢属(Cercospora)、Mycoliophtora、曲霉属(As- pergillus)、和Scytalidium。然而，本发明不限于源于上述分类单位的 酶。所有产生具有期望特性的氧化还原酶的微生物都可用于本发明。

氧化还原酶优选为漆酶(EC 1.10.3.3)，过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)、过氧化物酶(EC 1.11.1.7)或氧化酶。

在优选的实施例中，本发明方法用于含过氧化物酶的溶液和含 过氧化氢酶的溶液。

适合的过氧化物酶由植物产生(例如辣根过氧化物酶)或由微 生物如真菌或细菌产生。在一个优选的实施例中，过氧化物酶源于 鬼伞属(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinereus)或长根鬼伞(C.- macrorhizus)、或源于芽孢杆菌属(bacillus)，例如短小芽孢杆菌(B.- Pumilus))，特别是根据国际专利申请WO 91/05858的过氧化物酶。

而且酶可以是通过一种包括培养宿主细胞的方法产生的，此宿 主细胞是用重组DNA载体转化的，此DNA载体携带有编码所述酶 的DNA序列及编码功能的DNA序列，此编码功能序列允许编码酶 的DNA序列在培养基中表达，条件为，允许酶的表达和从培养物中 回收酶。

特别地，重组产生的过氧化物酶是源于鬼伞菌种(Coprinus sp.)的过氧化物酶，特别是长根鬼伞(C.macrorhizus)或根据WO 92/16634的灰盖鬼伞(C.cinereus)。

过氧化氢酶已知源于动物(例如母牛肝脏)，和源于许多不同微 生物。JP专利申请2—76579公开了一种来自黑曲霉(Aspergillus niger)菌株NFAG一2的过氧化氢酶。GB专利号2,216,149公开 了一种来自青霉属(Penicillium)的过氧化氢酶。在水发明的一个优 选实施例中，如WO 92/17571所述过氧化氢酶从Scytalidium和腐质 霉属(Humicola)菌株获得。

在根据本发明方法的另一优选的实施例中，酶是蛋白酶。合适 的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。微生物来源的是 优选的。化学上或遗传上修饰的突变体包括在内。可以是丝氨酸蛋 白酶、优选为碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶 的例子是枯草杆菌蛋白酶，特别是源于芽孢杆菌属(Bacillus)的蛋白 酶，如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberz、枯草杆菌 蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(叙述于 WO 89/06279—。市售芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的例子是Alcalase R、SavinaseR、EsperaseR和DurazynTM产品。胰蛋白酶样蛋白酶的 例子是胰蛋白酶(如豪猪或小牛来源的)和WO 89/06270中所述的 镰孢属蛋白酶。

在根据本发明方法的另一个优选的实施例中，酶是脂酶。合适 的脂酶包括细菌或真菌来源的化学上或遗传上修饰的突变体包括在 内。特别优选的脂酶获自于：假单胞菌属(Pseudomonas)、假丝酵母 属(Candida)和毛霉属(Mucor)、特别是洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepaciae)，如EP 021436l所述，或通过克隆来自Humicola lanuginosa 的基因和在米曲霉(Aspergillus oryzae)中表达基因获得的脂酶，如 EP 0258068所述，可以LipolaseR商标购自Novo Nordisk A/S。

在根据本发明方法的另一优选的实施例中，酶为淀粉酶，合适 的淀粉酶包括细菌和真菌来源的。化学上和遗传上修饰的突变体包 括在内。淀粉酶包括，如α—淀粉酶，获自芽孢杆菌，例如地衣芽孢 杆菌(B.licheniforms)，详述于英国专利说明书No.1,296,839。

在根据本发明方法的另一优选的实施例中，酶为纤维素酶。合 适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的，特别是源于真菌的纤维素酶 为优选。化学上和遗传上修饰的突变体包括在内。可用于生产合适 纤维素酶的真菌的例子为：木霉属(Trichoderma)、Phanerochaete、腐 质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)和毁丝霉属(Myceliopthora)。

本发明的方法进一步包括加入水溶性聚合物。

优选的水溶性聚合物是乙二醇和胺，例如多胺。更优选为聚乙 二醇和聚丙二醇。最优选为分子量200—10000的聚乙二醇。

加入水溶性聚合物的浓度可为1—50％W/W优选为2—40％ W/W。

根据本发明，此方法还包括加入盐，其浓度达到1.5M，优选浓 度达到1.0M。

优选的盐为镁盐、钙盐、钠盐、钾盐和铝盐。最优选的盐为其 阴离子选自氯化物、甲酸盐、乙酸盐和硫酸盐。

根据本发明的方法，浓缩水溶液中已加入水溶性聚合物，将其 pH调至结晶的最适pH。在某些情况下，结晶的最适pH水平在酶的 PI左右。在优选的实施例4，pH调至pH＝pI±1的水平。

为了有效地调节pH，可以使用任何酸或碱。酸可以是有机的，也 可以是无机的。一些例子为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、柠檬 酸和甲酸。优选的酸为甲酸、柠檬酸和乙酸。优选的碱为氢氧化钠。

在本发明的特定实施例中，将盐加入蛋白质含水混合物中，其 浓度达到1.5M，优选浓度达到1.0M，溶液的pH调至结晶的最适 pH。

本发明的方法产生蛋白质，特别是酶，以结晶形式析出。可经 常规方法进行回收晶体蛋白，例如经过滤和接普干燥、或通过晶体 的重溶生产液体蛋白质产物。

下列实施例可进一步说明本发明，而且无论如何它们也不限制 本发明的范围。

实施例1

水溶性聚合物的作用

一种含灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)过氧化物酶的培养肉汤，如 EP专利申请号505,311所述获得的，接受本发明的方法。

起初，培养肉汤经离心进行固/液分离。得到一种含5.5％W/ W DS(干燥物)过氧化物酶和2.4％W/W DS其它酶的超滤物。

以不同的量(参见图1)加入聚乙二醇(PEG 4000)和 CaCl2·2H20，并通过加入甲酸调pH至4.0。在28℃搅拌溶液24小时。

在不同的PEG和盐浓度T.(■1％CaCl2；▲2％CaCl2和□ 2.5％CaCl2)结晶产率显示于附图1。

实施例2

pH的作用

一种含灰盖鬼伞过氧化物酶的培养肉汤，如EP专利申请号 505,311所述获得的，接受本发明的方法。

起初培养肉汤通过离心进行固/液分离。得到一种含5.5％W/ W DS(干燥物)过氧化物酶蛋白质和2.4％W/W DS其它酶的超滤 物。

向此溶液中加入20％W/W聚乙二醇(PEG4000)和1.5％W/ W的CaCl22H2O，而且用甲酸调pH到不同的pH值。在28℃搅拌溶 液28小时。

在不同的pH下，结晶产率显示于附图2。

实施例3

浓度的作用

一种含灰盖鬼伞过氧化物酶，如EP专利申请号505,311所述 获得的培养肉汤经受本发明的方法。

起初，培养肉汤通过离心进行固/液分离，得到含不同浓度过氧 化物酶蛋白质和其它酶的超滤物。

加入1.5％W/W的CaCl22H2O至每种此溶液中。以不同量加入 聚乙二醇(PEG 4000)。用甲酸调pH至4.0，在28℃搅拌溶液28小 时。

附图3显示了在不同酶和PEG浓度(■3％过氧化物酶和 1.4％其它酶、◆4.8％过氧化物酶和2.3％其它酶和▲6.7％过氧 化物酶和3.1％其它酶下的结晶产率。

实施例4

过氧化氢酶的结晶

一种培养肉汤，含Scytalidiun ther mofilun过氧化物酶，如WO 92/17571所示获得的，经受本发明的方法。

起初，培养肉汤通过絮状沉淀和过滤法进行固/液分离，接着经 蒸发和超滤/透滤浓缩滤液。浓缩物含1.2％W/W DS(干燥物)过 氧化氢酶蛋白质和5.5％W/W总干燥物。

附图4显示了在不同CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度(■ 20％PEG 4000，◆22％PEG 4000，▲24％PEG 4000，□26％PEG 4000，◇28％PEG 4000和△30％PEG 4000)下的结晶产率。

实施例5

过氧化物酶的结晶

一种培养肉汤，含Scytalidium thermoffilum过氧化氢酶，如WO 92/17571所述获取的，经受本发明的方法。

起初，培养肉汤通过絮状沉淀和过滤法进行固/液分离。接着通 过蒸发浓缩滤液。浓缩物含0.28％W/W DS(干燥物)过氧化氢酶 蛋白质和9.2％W/W总干燥物。

以不同的量(参见图5)加入聚乙二醇(PEG 4000)和 CaCl2·2H2O，并且将pH调至6.0—6.5。在28℃搅拌溶液48小时。

附图5显示了在不同的CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度(■ 20％PEG 4000和◆25％PEG 4000)下的结晶产率。

实施例6

过氧化氢酶的结晶

一种培养肉汤，含Scytalidium thermofilum过氧化氢酶，如WO 92/17571所述获得的，经受本发明方法。

起初，培养肉汤通过絮状沉淀和过滤法进行固/液分离。接着通 过蒸发浓缩滤液。浓缩物含0.28％W/W DS(干燥物)过氧化氢酶 蛋白质和9.2％W/W总干燥物。

以不同量(参见图6)加入聚乙二醇(PEG 1500)和CaCl22H2O， 调pH至6.5—7.0。在28℃搅拌溶液48小时。

附图6显示了在不同PEG 1500浓度和0.2％的CaCl2浓度下的 结晶产率。

实施例7 蛋白酶的结晶

一种培养肉汤，包含来自迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)的蛋白 酶(SavinaseR)，(美国专利号3,723,250)经受本发明的方法。

起初，培养肉汤通过絮状沉淀和离心法进行固/液分离。接着经 超滤浓缩上清液。浓缩液含有9.2％W/W DS(干燥物)蛋白酶蛋白 质和19.6％总干燥物。传导率为1.55 ms/cm。

以不同的量(参见图7)加入聚乙二醇(PEG 4000)，调pH至 5.6。在28℃搅拌溶液24小时。

附图7显示不同PEG浓度下的晶体产率。

实施例8 蛋白酶的结晶

一种培养肉汤，包括来自迟缓芽孢杆菌(Bacillu lentus)的蛋白酶 (SavinaseR)，(美国专利号3,723,250)经受本发明方法。

起初，通过絮状沉淀和离心法进行固/液分离，接着经超滤浓缩 上清液。浓缩物含有9.2％W/W DS(干燥物)蛋白酶蛋白质和 19.6％J W/W总干燥。传导率为1.55ms/cm。

以不同量连同1.1％W/W CaCl2·2H2O一起加入聚乙二醇 (PEG 4000)并调pH至5.6。在28℃搅拌浓液24小时。

附图8显示了在不同的PEG浓度下的结晶产率。

实施例9 脂酶的结晶

一种含来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepaciae)的脂酶的浓缩 物，如EP O214761所述获取的，经受本发明的方法。

将31％PEG 4000在pH为7.8的条件下加至含2.1％W/W DS脂酶蛋白质和20％W/W总DS的浓缩物中。在28℃搅拌溶液24 小时。

此后结晶产率为47％。

实施例10 纤维素酶的结晶

如WO 91/17244所述获得的Humicola insolens纤维素酶，经发酵 产生和经过滤、超波和用离子交换水透析过滤回收。

浓缩的纤维素溶液，酶浓度为105g/l，酶纯度为干物质含量的 58％，蛋白质纯度为88％。pH为7.0，传导率为607μS。

在搅拌下每100g纤维素酶溶液中加入39.6g PEG 300。温度为 27℃。20小时后，通过离心收获晶体，并重溶于0.5％的NaCl溶液 中。按酶活性确定的晶体产率为83％，纤维素酶蛋白质纯度为 100％。

实施例11 PEG/酶体系的表征

将PEG和盐加入至酶浓缩物时，富含酶的微滴形成，结晶发生 于这些小滴内。通过超速离心分离双相。

一种培养肉汤，含灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)过氧化物酶，如 EP 505311所述获得的，经受本发明方法。

首先，通过离心进行培养肉汤固/液分离，得到一种含5.1％W/ W DS(干物质)过氧化物酶蛋白质的超滤物。在浓缩物中加入20％ PEG 4000和1.5％W/W CaCl2·2H20，调pH至4.0。混合后立即使 用显微镜在液体中观察到微滴。经超离(27000g，15分)两相分开。 过氧化物酶含量测定为A405，与之相比的总蛋白含量测定为A280。 结果见表1。可以看出，，在这些微滴内过氧化物酶被浓缩和纯化。

表1     A405     A405/A280  KPOXU*/g 底相 上相 加入PEG和盐前浓缩物 重溶的晶体     388     31     169      -     1.35     0.82     1.16     2.0     472     33     172

*过氧化物酶活性(POXU)仍确定：一单位过氧化物酶 (POXU)是在下列分析条件下每分钟催化1μM过氧华氢转化的酶 量：2.0mM过氧化氢、0.46mM 2，2’—过氮基—二(3—乙基苯并 噻唑啉—6—磺酸酯)、0.086M磷酸盐缓冲液(pH7.0)，在40℃温 育，然后测418nm处的光度。1 KPOXU＝1000POXU。