DON降解酶的提取分离纯化方法 |
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| 申请号 | CN201610571673.1 | 申请日 | 2016-07-19 | 公开(公告)号 | CN106190994A | 公开(公告)日 | 2016-12-07 |
| 申请人 | 上海红马饲料有限公司; | 发明人 | 刘国庆; 赵肖; 钱晓勇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及DON降解酶的提取分离纯化方法，包括a.利用DON作为唯一 碳 源初筛能够利用DON的菌株，b.以环 氧 化合物为底物，筛选步骤a所得菌株的 发酵 液、菌悬液和胞内液产还氧化合物降解酶中酶活 力 最强的菌种，c.将步骤b所得菌种进行培养发酵，从菌种中分离出DON降解酶，d.纯化DON降解酶。本发明通过从筛选的 微 生物 中分离纯化DON的降解酶，能够用于降解DON。相比于其他去除DON毒素的方法，利用DON的降解酶来降解DON，能够用于食物、 饲料 的加工和生产。因此，该提取分离纯化方法为食物、饲料的加工和生产过程中DON的去除提供了新的思路，具有广阔的前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种DON降解酶的提取分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | DON降解酶的提取分离纯化方法[技术领域] [0001] 本发明涉及酶的分离提纯方法，具体涉及DON降解酶的提取分离纯化方法。[背景技术] [0002] 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(deoxynivalennol,DON)，又称呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族化合物，其主要来源为镰刀菌属，其中禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌是主要的产毒菌株。DON毒素对粮食的污染情况非常严重，诸如小麦、玉米、燕麦和大麦都会受到DON毒素的污染。其中，小麦被污染后容易引发小麦赤霉病，导致谷物的活力及其农产品的营养价值很大程度上得到降低，农业经济遭受严重的损失。此外，一些畜禽摄入DON量过高，会表现为拒食、呕吐、免疫力下降、母畜不孕或流产死亡等，慢性蓄积则会导致畜禽食欲减弱、生长缓慢、营养不良、神经内分泌发生改变、免疫力遭到抑制等。特别是因DON非中毒剂量的长期摄入引起的畜禽免疫抑制，会导致畜牧业经济每年蒙受巨大的损失。因此，对DON降解的研究具有非常重要的意义。 [0003] DON毒素结构性质非常稳定，其结构中12,13-环氧键是主要的致毒基团，若能将DON结构当中的环氧结构破坏，对DON的解毒具有明显作用。一般的食品、饲料生产加工过程很难破坏其毒性，现在较为普遍的去除DON毒素的方法主要有物理吸附、化学处理和生物转化。物理吸附主要是吸附一些有极性的真菌毒素；化学处理能够破坏大多数真菌毒素，但是很容易破坏食品、饲料的营养成分和带来新的化学污染。而生物转化或酶降解作用由于其有效性、针对性和环境友好性，将是未来真菌毒素脱毒的一种趋势。目前，利用生物转化的方法降解DON已有一定的报道研究；但是通过从微生物中筛选DON降解酶产生菌的报道很少。此外，通过从筛选的微生物中分离纯化该功能酶并用于降解DON效果的研究，尚未见报道。[发明内容] [0004] 本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供一种能够从微生物中筛选DON降解酶产生菌方法并对DON降解酶的提取分离纯化方法。 [0005] 该方法包括如下步骤： [0008] c.将步骤b所得菌种进行培养发酵，从菌种中分离出DON降解酶， [0009] d.纯化DON降解酶。 [0010] 该方法还具有如下优化工艺步骤： [0012] 步骤b中采用苯基环氧乙烷作为底物。 [0014] 步骤d中，DON降解酶的纯化分别经DEAE-52纤维素离子交换柱层析，Sephadex G-100凝胶过滤层析，洗脱缓冲液中含0-1.0mol/L不同梯度浓度的NaCl溶液，使不同的蛋白洗脱出来，测定洗脱得到的蛋白的酶活力和蛋白含量，确定酶活力和蛋白含量较高的位置，合并酶活峰，透析除盐，冷冻干燥，得到纯化的DON降解酶。 [0015] 本发明通过从筛选的微生物中分离纯化DON的降解酶，能够用于降解DON。相比于其他去除DON毒素的方法，利用DON的降解酶来降解DON，能够用于食物、饲料的加工和生产。因此，该提取分离纯化方法为食物、饲料的加工和生产过程中DON的去除提供了新的思路，具有广阔的前景。 [具体实施方式] [0016] 以下结合实施例对于本发明做进一步说明，实施例仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。 [0017] (1)菌种初筛：利用DON作为唯一碳源初筛能够利用DON的菌株，步骤如下： [0018] 采集长期堆放塑料橡胶区域土样(塑料橡胶有腐蚀迹象区域的土样为最佳)、环氧树脂跑道下层土样、汽油站附近有废弃汽油区域的土样、食堂下水道附近土样，称取1g土样溶于100ml的无菌水中，充分震荡后静置10min，移取上层1mL悬浊液转移至30ml富集培养基中，混合均匀。于30℃，200r/min振荡培养48h，中间补给一次DON溶液，之后取1mL培养液至新鲜的富集培养基中，按上述方法再培养48h后，吸取少量经过无菌水稀释的培养液在表面涂有一定量DON的平板培养基上涂布，然后倒置平板，于30℃培养箱中培养直至长出菌落后挑取单一菌落转接到斜面培养基上，在相同条件下培养72h后置于4℃冰箱中。 [0019] 富集培养基配方为：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，ZnSO4·7H2O 0.001g，酵母膏0.1g，玉米浆0.1g。 蒸馏水定容至lL，调pH值为6.0，分装后121℃高压灭菌20min，再分别加入0.2％(v/v)的DON。 [0020] 中间补给DON溶液浓度为富集培养液的0.2％(v/v)。 [0021] 涂在平板培养基上DON溶液质量浓度为0.1％。 [0022] 平板培养基配方为：富集培养基(不加DON)中加入15-20g琼脂 [0023] (2)菌种复筛：以环氧化合物为底物，筛选步骤a所得菌株的发酵液、菌悬液和胞内液产还氧化合物降解酶中酶活力最强的菌种。 [0024] 取单一菌落划线于平板上，经种子培养，摇瓶发酵后，将发酵液12000r/min离心，分离发酵液和菌体。菌体用0.1mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液洗涤两次，破碎菌体提取菌体胞内液，用磷酸盐缓冲液制成菌悬液。 [0025] 以苯基环氧乙烷为底物，用酶标仪分别测定发酵液、菌悬液、菌体胞内液所产酶降解环氧化合物的酶活力，挑选酶活力最高的一株菌种进行后续试验。酶活力的测定方法为：取135μL菌体悬浮液加至1.5ml离心管中，30℃预保温5min，加入15μL苯基环氧乙烷(0.2mol/L),30℃保温10min，立即加入150μL丙酮，充分振荡后，取200μL加至微孔板中，然后加入三甘醇二甲醚、三乙胺、0.23mol/L 4-对硝基苄基吡啶各50μL，于39℃保温45min后，测定其在580nm处的吸光度。同时以15μL丙酮代替苯基环氧乙烷溶液作对照。定义在上述条件下，每分钟水解1μmol苯基环氧乙烷所需的酶量为一个酶活力单位。 [0027] 细菌用种子、发酵培养基配方为：葡萄糖10g，牛肉膏10g，NaCl 10g，调pH为7.0，30ml分装于250ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20min。 [0028] 细胞破碎仪参数为：输出功率400w，间隔时间10sec，每次裂解时间30sec，裂解总时间30min。 [0029] (3)DON降解酶的分离：将所得菌种进行培养发酵，从菌种中分离出DON降解酶。 [0030] 发酵液12000r/min离心15min去上清液，得菌体，用去离子水洗涤菌体2次再加入一定体积的0.1mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液即得菌悬液，菌悬液经超声波细胞破碎仪破碎，再低温高速离心去上清液，加入硫酸铵为30％饱和度，静置上清液后12000r/min离心20min，冷冻离心，除去杂蛋白，吸取上清液，加硫酸铵直至80％饱和度，离心收集沉淀，用去离子水溶解蛋白沉淀置于透析袋中透析48小时，收集粗酶液，进行冷冻干燥。 [0031] 细胞破碎仪参数为：输出功率400w，间隔时间10sec，每次裂解时间30sec，裂解总时间30min。 [0032] (4)DON降解酶的纯化。 [0033] 纯酶冻干后，用5mL 0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液溶解后，上预先采用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液进行平衡DEAE-52阴离子交换柱(1.8×100cm)，，上样后使用含有0-1.0mol/L的NaCl的同样缓冲液进行梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，收集60管洗脱液，每管5ml，测定每管的酶活力和蛋白含量，合并酶活峰，用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液透析24h后，冷冻干燥，备用。 [0034] 将过DEAE-52阴离子交换柱收集的酶用5mL 0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液溶解，上预先经0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液平衡好的Sephadex G-100层析柱(1.6×80cm)进行洗脱，洗脱速度1mL/min，收集60管洗脱液，每管5ml，测定每管的酶活力和蛋白含量，合并酶活峰，用0.05mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液透析24h后，冷冻干燥，得到了纯化的酶。 [0035] 缓冲液中NaCl的浓度分别为0.2mol/L，0.4mol/L，0.6mol/L，0.8mol/L，1.0mol/L。 [0036] 蛋白浓度的测定方法为Bradford法。 |
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