[0001] 本发明涉及微生物基因工程领域中的基因敲除技术，特别涉及一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法。

[0002] 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是感染胃部的最常见的病原性细菌，幽门螺杆菌感染是慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等胃肠道疾病发生的重要病因，并与胃癌、胃粘膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发生密切相关。幽门螺杆菌的全世界感染率为50%-80%，高发地区集中在东亚，包括中国、日本和韩国。我国是胃癌发病率和病死率较高的地区，每年全球新发100余万胃癌患者中，我国占42%，约80万死亡胃癌患者中，我国占35%，发病率和病死率均超过世界平均水平两倍多。目前一般认为，幽门螺杆菌通过黏附定植于胃黏膜，释放毒力因子，与宿主细胞相互作用产生一系列炎症反应，最终导致慢性炎症、溃疡、癌症等临床结果。多种致病因子参于了幽门螺杆菌的致病过程，对致病因子的深入研究大大促进了我们对幽门螺杆菌致病机制的了解。然而迄今为止，幽门螺杆菌的致病机理仍不完全明确，而幽门螺杆菌感染导致的多样化感染结局更不清楚。一些潜在的致病因子或功能基因仍有待于进一步发掘来不断完善对幽门螺杆菌致病机制的认识。

[0003] 基因操作是研究基因功能最直接和最有效的技术手段，经过多年技术积累，幽门螺杆菌的基因操作技术得到深入发展。转座子插入突变技术被应用在幽门螺杆菌致病因子的早期研究中。由于转座子插入突变具有随机性和极性效应的劣势，逐渐被基于同源重组的基因敲除方法所取代。幽门螺杆菌中大量致病因子的功能借助同源重组基因敲除的方法得以阐明。

[0004] 本发明构建了一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，与普通的同源重组基因敲除方法相比，在实现目的基因敲除的同时不引入外源基因，使得对目的基因的功能分析更为准确。

[0005] 本发明一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，包括如下步骤：（a）构建适用于幽门螺杆菌的带有FRT位点的卡那霉素抗性敲除模板质粒和表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒；
（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到带有FRT位点和卡那霉素抗性的基因敲除突变株；
（c）将表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒转入上步骤得到的基因敲除突变株中，去除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因，得到携带辅助质粒的无痕基因敲除突变株；
（d）辅助质粒通过无抗生素传代培养消除，最终获得无痕基因敲除突变株。

[0006] 本发明，实现了幽门螺杆菌中无痕基因敲除突变株的构建，相比普通的基因敲除，该方法在实现目的基因敲除的同时不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。此方法不仅可以用于幽门螺杆菌的基因敲除，而且可以用于适用此基因敲除原理的其它微生物基因敲除的构建。
附图说明

[0007] 图1：pTSKHP质粒图；图2：pCHFHP质粒图；
图3：pTSKHP-0788质粒图；
图4：hp0788无痕基因敲除步骤。

[0008] 实施例一一般性说明
PCR反应使用的DNA聚合酶是北京全式金生物技术有限公司的高保真PfuDNA聚合酶。质粒构建过程中酶切连接使用的各种限制性内切酶为Fermentas公司产品，T4DNA连接酶使用的是Takala公司产品。用于连接产物转化的大肠杆菌DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司。细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

[0009] 结合图1至图4，做如下具体说明：1、在幽门螺杆菌中构建FLP-FRT重组系统原件
（1）包含FRT位点的同源重组双交换敲除模板质粒的构建
在实验室构建的同源重组双交换敲除模板质粒pSJHK的基础上，构建包含FRT位点的敲除模板质粒。以pKD3为模板，以FRT-1（CTTAGAGCTCATCAAGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG）和FRT-2（CGGAGGTACCGAATTAGCCATGGTCCATATG）为引物扩增包含FRT的基因片段，得到的基因片段经SacI和KpnI酶切后连入实验室构建的同源重组双交换敲除模板质粒pSJHK中，得到pSJHK-FRT。利用引物BssHII-KmF（CTAGCTGCGCGCTGCCGCAAGCACTCA）和BssHII-KmR（GCCTTCGCGCGCGATACCCCTCGAATTGA）以pSJHK为模板扩增卡那霉素抗性基因（aphA），经BssHII酶切后重新连入pSJHK-FRT质粒中，得到包含FRT位点的同源重组双交换敲除模板质粒pTSKHP。图1显示质粒pSJHK-FRT的模式图，在卡那霉素抗性基因的两端分别有一个FRT位点，再向外是两组多克隆位点，用于连入同源重组双交换的同源臂。

[0010] （2）幽门螺杆菌中FLP重组酶表达质粒的构建利用在Cytophaga hutchinsonii中表达FLP重组酶的质粒pCHF为模板构建用于幽门螺杆菌中FLP重组酶的表达质粒pCHFHP。以幽门螺杆菌中的内源质粒pHel1作为复制起始子，以pHel1-1（CTTGATGAGCTCGAAGCTTGTCCGTTAG）和pHel1-2（CGTCTTGGTCGACTAGAAAGGGAAATG）为引物扩增pHel1质粒序列，得到的扩增片段经SacI和SalI酶切后连入到质粒pCHF上的相应位点，构建质粒pCHF-p。氯霉素抗性基因（cat-GC）以cm-1（TCCGATGTCGACCCGGTTTTTGTTAATCC）和cm-2（CACCAGGCATGCGTAACTCCTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC）为引物，以质粒pTnMax9为模板扩增，得到的扩增片段经SalI和SphI酶切后连入到质粒pCHF-p上的相应位点，构建质粒pCHFHP，如图2所示。

[0011] 2、利用FLP-FRT重组系统实现幽门螺杆菌中基因无痕敲除以基因hp0788为例说明利用FLP-FRT重组系统实现幽门螺杆菌中基因无痕敲除的步骤（图4）。

[0012] hp0788含有1500个核苷酸，有研究报道发现hp0788对于H. pylori在胃中的定植是不可缺少的，生物信息学分析预测hp0788编码一个外膜蛋白（HP0788，499个氨基酸）。对于这个外膜蛋白的功能研究目前还不清楚，推测它可能作为一个粘附因子，类似于其他已知的粘附因子（AlpAB，BabA，HopZ）在H. pylori的定植中发挥粘附作用；也可能作为一个表面蛋白，在菌体与胃黏液相互作用中起到稳定细胞外膜、保护菌体的作用。

[0013] 本研究中获得的hp0788基因敲除突变株为深入研究hp0788基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析H. pylori的致病机制，同时可能作为疫苗开发的潜在靶位点。

[0014] （1）同源重组双交换敲除质粒pTSKHP-0788的构建根据hp0788基因上下游核苷酸序列及引物设计原则设计并合成如下引物：
0788-1：GAACGGTGGATCCGAACAGGCGTAAAGAAATCG；
0788-2：TAAGCCAGGTACCTCATAAAGGTTTCGGTAGG；
0788-3：TAGACGGTCGACCCGCCACCGATCAAGACA；
0788-4：GGACTGGAGCTCTATTAACCAAAGCCACAAAGAC；
以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，利用上述引物0788-1/0788-2进行PCR扩增，得到0.8 kbp的核苷酸片段作为同源重组的上游同源臂（H1），经BamHI和KpnI酶切后连入pTSKHP中；
下游同源臂（H2）是以引物0788-3/0788-4进行PCR扩增得到的1.1 kbp的核苷酸片段，经SalI和SacI酶切后再连入该质粒中。由此构建hp0788的同源重组双交换敲除质粒pTSKHP-
0788，如图3所示。

[0015] （2）敲除质粒电击转化幽门螺杆菌制备幽门螺杆菌电击转化感受态，将敲除质粒pTSKHP-0788通过电击转化的方法转入到幽门螺杆菌中，电击后的感受态细胞先涂布于无抗生素的空肠弯曲菌血琼脂上复苏，然后利用15 μg/ml卡那霉素筛选阳性转化子。

[0016] 设计同源重组验证引物test1/kt2，kt3/test4。如图3所示，test1位于同源臂扩增引物0788-1的5，端，test4位于同源臂扩增引物0788-4的3，端，kt2和kt3位于卡那霉素抗性基因内部。以转化子基因组为模板分别利用验证引物test1/kt2和kt3/test4进行基因扩增，野生型基因组为模板作为对照。若以转化子基因组为模板分别能够扩增出理论大小的PCR产物，而以野生型基因组为模板无法扩增出理论大小的PCR产物，则证明上、下游同源臂均发生同源重组。此时hp0788基因区域被卡那霉素抗性基因取代，在抗生素基因的两端分别有FRT位点。

[0017] （3）辅助质粒电击转化卡那霉素抗性阳性突变株取上步骤中的阳性敲除株制备电击转化感受态，将辅助质粒pCHFHP通过电击转化的方法转入到突变株中，同理，电击后的感受态细胞先涂布于无抗生素的空肠弯曲菌血琼脂上复苏，然后利用10μg/ml氯霉素筛选阳性转化子。

[0018] 经过10-15天的培养，挑取转化子菌落，提取基因组，利用PCR验证FRT位点之间序列是否被剪切，引物使用test1和test4。未转化辅助质粒的突变株基因组作为对照，若氯霉素阳性突变株扩增出的基因片段较卡那霉素突变株扩增出的基因片段小卡那霉素抗性基因的大小，说明FRT位点之间的核苷酸序列被剪切。

[0019] （4）辅助质粒的消除取上步骤中的阳性敲除株在无抗生素的血琼脂平板上培养，传代3次后挑取菌落同时转接无抗生素血平板，氯霉素血平板和卡那霉素血平板，菌落仅能在无抗生素血平板上生长，而不能在氯霉素血平板和卡那霉素血平板上生长说明菌株丢失辅助质粒。该菌株即为hp0788无痕基因敲除突变株。