[0001] 本发明涉及一种组合酶，特别涉及一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的组合酶，以及使用该组合酶高效分离小鼠动脉血管平滑肌的方法。

[0002] 高血压、冠心病是目前世界范围内发病率高、致死致残率高的心血管疾病。其病理特点主要表现为大动脉及外周小动脉血管中层平滑肌增生，管腔狭窄，或同时伴随脂质沉积和粥样斑块，增加血流阻力，最终可出现不可逆的进行性血压升高、脑卒中、心梗等严重并发症。

[0003] 血管平滑肌不仅是血管壁中层的主要细胞结构，维持和形成血管壁张力。此外，血管平滑肌还主动参与动脉粥样硬化及高血压进程并表现出多种不同功能的表型（如合成型和收缩型）和分泌炎症性细胞因子。因此，对于血管平滑肌功能及其相关分子机制的研究显的尤为重要。

[0004] 目前有大量文献报道多种分离和培养大鼠大/小动脉血管平滑肌的方法如组织块贴壁法1-5和胶原酶法及胰消化法酶等6-10对大鼠主动脉血管平滑肌的分离效果都较好，细胞传代增殖力较高。

[0005] 但随着研究深入的需要，更多相关分子机制研究需要在转基因小鼠来源的组织细胞上进行，如何快速分离和培养高活性小鼠的大/小动脉血管平滑肌一直有争议。文献报道的针对小鼠的血管平滑肌分离培养方法主要沿用大鼠血管平滑肌分离方法：1）组织块贴壁法11, 12；无菌条件下取出胸主动脉，用镊子轻轻刮除血管内膜，并分离血管中膜（血管平滑肌层），用眼科剪将中膜剪成1×1mm3组织块，小心将组织块用吸管置于培养瓶底部均匀分布，倒置培养瓶并放入培养液，培养箱中静置40min左右，待组织块贴壁牢固后，小心翻转培养瓶，静置培养5天，观察是否有血管平滑肌从组织块中爬出。该方法缺点在于不是所有组织块都能贴壁成功和有细胞爬出，细胞爬出至贴壁所需时间长，且操作过程技术要求较高。细胞生长缓慢，数量少，不能很快的进入对数增长阶段从而影响实验进程；2）胶原酶消化法：文献报道的小鼠分离采用的胶原酶浓度不一，大部分采用胶原酶I13或胰酶12用于去除血管壁内皮等其他细胞，再进行组织块贴壁法操作，但我们实际操作发现分离的原代细胞活性差，贴壁慢。因此，非常迫切需要进一步找到能快速分离和稳定传代的小鼠动脉血管平滑肌分离培养方法。

[0006] 本发明的目的在于提供一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的组合酶及方法。

[0007] 本发明所采取的技术方案是：一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的组合酶，组合酶由罗氏胶原混合酶和弹性蛋白酶组成，其混合比例为罗氏胶原混合酶0.5～0.7U、弹性蛋白酶 40～70μg。

[0008] 罗氏胶原混合酶型号为Liberase TM Research，货号为05401119001。

[0009] 弹性蛋白酶为Sigma公司的猪弹性蛋白酶。

[0010] 组合酶由罗氏胶原混合酶为Liberase TM Research和Sigma猪弹性蛋白酶按0.6U：50μg的比例混合而成。

[0011] 一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的方法，包括如下步骤：1)将分离得到的小鼠动脉血管中膜剪成小块，置于组合酶液中消化；
2)消化结束后，将酶液离心，弃上清，得到小鼠动脉血管平滑肌细胞；
其中，组合酶如上所述。

[0012] 组合酶液中，罗氏胶原混合酶为Liberase TM Research的浓度为0.6 U/ml，Sigma猪弹性蛋白酶的浓度为50μg/ml。

[0013] 本发明的有益效果是：本发明的组合酶，可以快速地将血管组织分离为较多的单细胞及疏松的小组织块，处理得到的细胞具有很高的活力，常规条件下培养2～3天几乎所有细胞和疏松的小组织块都牢固贴壁生长，开始呈现放射状生长和增殖，5天后细胞呈现典型峰谷样生长模式，可进行传代操作。

[0014] 本发明的组合酶无论对于小鼠胸主动脉还是肠系膜等不同部位血管平滑肌分离效果都非常好。操作方法简单，不需要再翻转瓶，组织块贴壁，对操作人员技术要求不高，且细胞贴壁快，增殖力强。附图说明

[0015] 图1是分离得到的平滑肌细胞培养5d后的显微照片；图2和图3分别是平滑肌细胞传代培养至第二代和第4代的显微照片；
图4和图5：传统胶原酶和胰酶组合后接种培养结果。

[0016] 一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的组合酶，组合酶由罗氏胶原混合酶和弹性蛋白酶组成，其混合比例为罗氏胶原混合酶0.5～0.7U、弹性蛋白酶 40～70μg。

[0017] 罗氏胶原混合酶型号为Liberase TM Research，货号为05401119001。

[0018] 弹性蛋白酶为Sigma公司的猪弹性蛋白酶。

[0019] 组合酶由罗氏胶原混合酶为Liberase TM Research和Sigma猪弹性蛋白酶按0.6U：50μg的比例混合而成。

[0020] 一种高效分离小鼠动脉血管平滑肌的方法，包括如下步骤：1)将分离得到的小鼠动脉血管中膜剪成小块，置于组合酶液中消化；
2)消化结束后，将酶液离心，弃上清，得到小鼠动脉血管平滑肌细胞；
其中，组合酶如上所述。

[0021] 组合酶液中，罗氏胶原混合酶为Liberase TM Research的浓度为0.6 U/ml，Sigma猪弹性蛋白酶的浓度为50μg/ml。

[0022] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

[0023] 以下实施例使用的罗氏胶原混合酶的货号为05401119001。

[0024] 实施例1：1)配制混合酶：取罗氏的胶原混合酶（Liberase TM Research，0.6unit）+猪弹性蛋白酶（Sigma，50ug）加入到1ml的PBS中，混匀后置于冰上备用；
2)取6-8周龄小鼠2只，脱臼法处死后，快速浸没入70%乙醇溶液约2min中；
3)取出小鼠后，置于超净台的手术操作台上，用灭菌眼科剪小心打开胸腔，分离胸主动脉，置于冰预冷的PBS中；
4)在体式显微镜下，用显微镊去除动脉周围脂肪组织，体式显微镜下快速分离血管中膜， PBS冲洗两次后，转入EP管内，加入配制好的混合消化酶500ul，用显微剪剪碎动脉中层
3
成约1×1mm组织块，放入37℃孵箱中消化45min，期间每隔10-15分钟取出振摇10s-20s；
5)消化结束后，4℃ 1400rpm离心10分钟。弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基轻轻吹打混匀成细胞悬液及疏松的组织小块。

[0025] 6)将消化得到的细胞悬液及疏松的组织小块接种于35mm培养皿中，约2天后可见细胞贴壁生长，疏松组织块周围大量血管平滑肌呈放射状生长；4天后可出现典型的峰谷样生长表现，5-6天后即可以传代，2-8代细胞可满足随后的大量细胞实验需求。

[0026] 接种培养5d后的细胞如图1所示，第二代和第四代细胞分别如图2和3所示。

[0027] 从图中可以看出，图1（接种第五天）即可见到消化的单细胞及微小组织块贴壁，且组织块周围有大量平滑肌爬出呈放射状生长，说明此混合酶作用温和，对细胞/组织块的生长没有影响，细胞已经开始增殖；图2（传代后第二天）代表接种第6天即传代后第二天原代细胞经常规胰酶消化后24小时内即可贴壁生长，增殖力良好；图3代表第四次传代后原代细胞仍然保持长梭形的细胞形态，且呈现峰谷样生长方式，提示本发明的混合酶消化后，原代细胞增殖及传代不受影响且生长旺盛。

[0028] 对比例：为了进一步比较传统的胶原酶混合胰酶消化法与本申请所采用的新型胶原酶和猪弹力蛋白酶消化法分离肠系膜血管平滑肌及原代培养的效果，我们采用既往文献报道的方法：利用胶原酶/分散剂（2g/L）组合胰酶(25ug/ml)，采用上述同样的操作方法进行同基因型小鼠肠系膜平滑肌细胞原代培养。

[0029] 结果如图3和图4显示，消化接种5d后，显微镜下可见散在零星分布的贴壁血管平滑肌细胞，镜下同样可见散在多数未贴壁的细胞呈圆形具有较高折光性。

[0030] 本申请采用的新型组合酶消化静置贴壁3天后，视野内即可见大量贴壁及增殖的平滑肌细胞围绕在组织块周围，且开始呈现峰谷样生长趋势。与对比例的组合酶消化和培养的结果对比，本发明新型的组合酶消化效果好，细胞活力强，易贴壁，且接种5天后即可传代消化生长。而传统组合酶消化虽然可以得到单个分离的原代平滑肌细胞，但接种5天后才有散在少量细胞贴壁，其余消化的细胞不贴壁。说明传统组合酶对血管平滑肌消化时有较大的损伤效果，分离的细胞活力差，贴壁慢，且大量细胞尚未贴壁。因此，对比结果显示新型组合酶对小鼠肠系膜血管平滑肌具有很好的分离及保护细胞活力的作用，非常适合小鼠原代血管平滑肌培养及传代。

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