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一种降解西维因的菌株及其酶制剂
申请号	CN201510152786.3	申请日	2015-04-01	公开(公告)号	CN104805039A	公开(公告)日	2015-07-29
申请人	南京农业大学;			发明人	洪青; 徐剑宏; 闫新; 何健; 蒋建东; 黄星; 朱子薇;
摘要	本发明公开了一种降解西维因的菌株及其酶制剂。一种西维因的降解菌XWY-3，分类命名为新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2015060，保藏日期为2015年1月22日。一种降解西维因的酶制剂，由降解菌XWY-3 发酵液经冷冻破碎后的上清制得。利用该菌株及其酶制剂可以有效地降解农药西维因，在解决农药西维因污染的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全。
权利要求	1.一种西维因的降解菌XWY-3，分类命名为新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No： M 2015060，保藏日期为2015年1月 22日。 2.权利要求1所述的降解菌XWY-3在降解西维因和/或制备降解西维因的酶制剂中的应用。 3.一种降解西维因的菌剂，由权利要求1所述的降解菌XWY-3经发酵制备。 4.一种降解西维因的酶制剂，其特征在于对权利要求1所述的降解菌XWY-3进行发酵，发酵液经冷冻破碎后的上清加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂；向液体酶制剂中加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固体酶制剂。 5.权利要求4所述的降解西维因的酶制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1)将所述的降解菌XWY-3试管种置于含有培养基的摇瓶中振荡培养至对数期，获得菌种； (2)将上述培养好的菌种接种入含种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；其中，种子培养基为LB培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl1.0％，pH为7.0～ 7.2； (3)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产罐发酵培养，出罐形成能对西维因降解的液体菌剂，其中发酵培养基为：葡萄糖1.0％，(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.2％，MgSO40.02％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母粉0.05％，蛋白胨0.1％，pH值7.2～7.5； (4)将获得的发酵液离心,弃上清液，重悬于磷酸盐缓冲后，经2～3次冻溶后，离心获得的上清液加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂； (5)将液体酶制剂中加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固体酶制剂。 6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的种子培养基需要121℃高压湿热灭菌后冷28～32℃使用；所述的菌种按种子罐中种子培养基体积的10％接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中发酵培养基体积的10％接种量接种入生产罐；在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1：0.8～1.0(v/v)，搅拌速度为200～260转/分，培养温度为28～32℃，培养时间为48～55小时，发酵结束后获得 9 液体菌剂，液体菌剂中菌体数量至少达到10个/ml。 7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于将步骤(3)所得的液体菌剂于4℃， 5000r/min,离心10min，弃上清液，加入原液体菌剂体积1/5的pH 7.0、0.5M的磷酸盐缓冲重悬后放置于-20℃冷冻，12小时候取出后室温溶解，再重复冻融1～2次，4℃，5000r/min,离心10min，获得的上清液加入0.3％(w/v)的山梨酸钾，20％的甘油(v/v)得到降解西维因的液体酶制剂；将所述的液体酶制剂按照1:1质量比加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后制备获得能够降解西维因的固体酶制剂。 8.权利要求4所述的降解西维因的酶制剂在降解水果或土壤中西维因的应用。 9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将所述的降解西维因的液体酶制剂稀释后喷施到含有西维因的果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因；稀释后的液 7 体菌剂中菌体数量至少达到10个/ml；优选将所述的降解西维因的液体酶制剂按照1:50体积比加入到清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因。 10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将所述的降解西维因的固体酶制剂溶解于清水中后喷施到含有西维因的果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因； 7 溶解后的菌剂中菌体数量至少达到10个/ml；优选将所述的降解西维因的固体酶制剂按照1:100重量/体积比加入到清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因。
说明书全文	一种降解西维因的菌株及其酶制剂技术领域 [0001] 本发明属于微生物制剂领域，涉及一种降解西维因的菌株及其酶制剂。背景技术 [0002] 西维因作为一种重要的氨基甲酸酯类杀虫剂，是继有机磷、有机氯之后使用非常广泛的第三大类杀剂。西维因被广泛使用于控制玉米、马铃薯、草莓种植中的害虫。在农作物栽培过程中，特别在种子处理上，西维因得到广泛的应用。由于其不正确的保存、生产和使用，造成土壤和地下水的污染。 [0003] 西维因与乙酰胆碱争夺乙酰胆碱酯酶的活性部位，是胆碱酯酶的抑制剂。西维因是神经性毒物，对大多数的哺乳动物急性毒性都很大。因此，西维因对环境和人类健康存在潜在的威胁。 [0004] 西维因对动物表现出了不同的毒性，如对蜜蜂的毒性，由于大多数植物是依靠蜜蜂传播花粉的，而蜜蜂对西维因的LD50仅为1.5μg/每头蜜蜂，因此植物中高残留的西维因会对蜜蜂有很大的影响，从而影响植物的正常繁殖。西维因也会影响动物的神经中枢，从而-1损伤动物的活动能力。暴露于32.5mg·kg 的浓度的西维因的环境中24小时，鲶鱼的致死-1 率达100％，当浓度低于12.5mg·kg 时，虽然不会导致鲶鱼死亡，但会影响其脑功能。 [0005] 同时由于西维因具有雌激素的特征，因而被列入环境激素类物质(EDs)行列。它会干扰生物体内正常的激素分泌，破坏体内环境，对生物体产生危害。西维因影响女性颗粒黄体细胞合成孕激素的变化，扰乱体内原环境，导致受害者心理、智力、行为等方面的错位，并影响人类的生育能力。因此，西维因对非靶标生物的毒性引起了广泛关注，2008年联合国环境规划署和联合国粮食及农业组织明确定西维因是一种第三类致癌物质。 [0006] 因此，为了确保人们的食品安全和身体健康，减轻农药西维因使用以后给人类带来的危害和威胁，有必要分离筛选能够高效降解西维因的菌株，研究其生物学特性和降解特性，制备西维因降解菌剂，以及能够降解西维因的酶制剂，使其用于土壤中西维因的生物修复以及水果蔬菜中农药降解处理，以保证农产品的安全生产和安全食用，保障人类的身体健康。 [0007] 通过微生物来修复氨基甲酸酯杀虫剂的污染的环境，具有成本低、无二次污染、生态恢复性好等优点，因此，一直受到国内外研究人员的关注。发明内容 [0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的西维因降解菌。 [0009] 本发明的又一目的是提供又该菌株制备的降解西维因的酶制剂。 [0010] 本发明的目的可通过如下技术方案实现： [0011] 一种西维因的降解菌XWY-3，分类命名为新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015060，保藏日期为2015年1月22日。 [0012] 该菌株形态学特征如下：革兰氏阴性细菌，无芽孢短杆状，无鞭毛；在LB固体培养基上菌落呈黄色、圆形、表面湿润、边缘整齐、半透明，菌落大小为0.5～0.8cm×1.5～2.0cm；生理生化检测结果如下：氧化酶阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，不能水解淀粉和明胶，V-P反应阳性，甲基红阴性，亚硝酸盐还原阴性，苯丙氨酸脱氢酶阳性，3-酮基乳糖阴性，脲酶阴性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为KP704262，经鉴定为新鞘氨醇菌(Novosphingobium sp.)。 [0013] 本发明所述的降解菌XWY-3在降解西维因和/或制备降解西维因的酶制剂中的应用。 [0014] 一种降解西维因的菌剂，由权利要求1所述的降解菌XWY-3经发酵制备。 [0015] 一种降解西维因的酶制剂，对所述的降解菌XWY-3进行发酵，发酵液经冷冻破碎后的上清加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂；向液体酶制剂中加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固体酶制剂。 [0016] 本发明所述的降解西维因的酶制剂的制备方法，包括以下步骤： [0017] (1)将所述的降解菌XWY-3试管种置于含有培养基的摇瓶中振荡培养至对数期，获得菌种； [0018] (2)将上述培养好的菌种接种入含种子培养基的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；其中，种子培养基为LB培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl 1.0％，pH为7.0～7.2； [0019] (3)将获得的种子液接种入含有发酵培养基的生产罐发酵培养，出罐形成能对西维因降解的液体菌剂，其中发酵培养基为：葡萄糖1.0％，(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.2％，MgSO40.02％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母粉0.05％，蛋白胨0.1％，pH值7.2～7.5； [0020] (4)将获得的发酵液离心,弃上清液，重悬于磷酸盐缓冲后，经2～3次冻溶后，离心获得的上清液加入山梨酸钾和甘油，得到降解西维因的液体酶制剂； [0021] (5)将液体酶制剂中加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后获得降解西维因的固体酶制剂。 [0022] 其中，所述的种子培养基需要121℃高压湿热灭菌后冷28～32℃使用；所述的菌种按种子罐中种子培养基体积的10％接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中发酵培养基体积的10％接种量接种入生产罐；在种子罐的种子培养和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1：0.8～1.0(v/v)，搅拌速度为200～260转/分，培养温度为28～32℃，培养时间为48～55小时，发酵结束后获得液体菌剂，液体菌剂中菌体数量至少 9 达到10个/ml。 [0023] 所述的制备方法，优选将步骤(3)所得的液体菌剂于4℃，5000r/min,离心10min，弃上清液，加入原液体菌剂体积1/5的pH 7.0、0.5M的磷酸盐缓冲重悬后放置于-20℃冷冻，12小时候取出后室温溶解，再重复冻融1～2次，4℃，5000r/min,离心10min，获得的上清液加入0.3％(w/v)的山梨酸钾，20％的甘油(v/v)得到降解西维因的液体酶制剂；将所述的液体酶制剂按照1:1质量比加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后制备获得能够降解西维因的固体酶制剂。 [0024] 本发明所述的降解西维因的酶制剂在降解水果或土壤中西维因的应用。 [0025] 所述的应用优选将所述的降解西维因的液体酶制剂稀释后喷施到含有西维因的果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因；稀释后的液体菌剂中菌体数量至7 少达到10个/ml；进一步优选将所述的降解西维因的液体酶制剂按照1:50体积比加入到清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因。 [0026] 所述的应用优选将所述的降解西维因的固体酶制剂溶解于清水中后喷施到含有西维因的果蔬或土壤中，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因；溶解后的菌剂中菌体数7 量至少达到10个/ml；进一步优选将所述的降解西维因的固体酶制剂按照1:100重量/体积比加入到清水中，喷施到含有西维因的果蔬或土壤，能够降解蔬菜水果中或土壤中的西维因。 [0027] 本发明的有益效果在于： [0028] 1)本发明从生产西维因的农药厂活性污泥中筛选到一株西维因降解菌XWY-3(CCTCC NO：M 2015060)，利用该菌株可以有效地降解农药西维因，在解决农药西维因污染的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全； [0029] 2)使用保藏号为CCTCC NO：M 2015060的菌株XWY-3生产降解西维因的降解菌剂，液体降解酶制剂以及固体降解酶制剂，具有生产使用成本低，使用安全，无毒副作用； [0030] 3)本发明的酶制剂与常规使用的清水，洗涤剂浸泡等性比，效果更好，对水果蔬菜中西维因的降解效率达到75％以上。附图说明 [0031] 图1 XWY-3液体菌剂对培养液中西维因的降解液相色谱图 [0032] 生物材料保藏信息 [0033] XWY-3，分类命名为Novosphingobium sp.XWY-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015060，保藏日期为2015年1月22日。具体实施方式 [0034] 实施例1 Novosphingobium sp.XWY-3的获得 [0035] 从生产西维因的农药厂采集的活性污泥，在实验室用西维因作为唯一碳源进行多次传代富集培养(30℃，每7天传代一次)，得到能够降解西维因的菌悬液，把菌悬液在LB培养基上进行涂布培养(30℃，3天)，在平板上挑取不同的菌落，一一验证对西维因的降解效果，最终获得能够降解西维因的菌株，并将它命名为XWY-3，加入甘油，在-70℃冰箱保存。 [0036] 通过测定XWY-3的生理生化特性，克隆XWY-3的16SrDNA序列并对该16SrDNA序列进行测序，把测序结果在Genbank进行BLAST比较，确定了XWY-3的系统发育进化地位。通过XWY-3的生理生化特征结果和系统发育进化地位等鉴定结果，最终把XWY-3鉴定为新鞘氨醇菌株(Novosphingobium sp.)(以下简称为XWY-3)，并于将XWY-3的16S rDNA登陆到Genbank，登陆号为KP704262。 [0037] 2015年1月22日我们将XWY-3寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015060，主要生物学特性为革兰氏阴性细菌，无芽孢短杆状，无鞭毛；在0908固体培养基上菌落呈黄色、圆形、表面湿润、边缘整齐、半透明，菌落大小为0.5～ 0.8cm×1.5～2.0cm；生理生化检测结果如下：氧化酶阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原阳性，不能水解淀粉和明胶，V-P反应阳性，甲基红阴性，亚硝酸盐还原阴性，苯丙氨酸脱氢酶阳性，3-酮基乳糖阴性，脲酶阴性。 [0038] 实施例2液体菌剂的制备 [0039] 种子培养基(LB)为：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl 1.0％，种子培养基的pH为7.0～7.2。 [0040] 发酵培养基为：1.0％，(NH4)2SO40.1％，K2HPO40.2％，MgSO40.02％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母粉0.05％，蛋白胨0.1％，pH值7.2～7.5。 [0041] 将XWY-3菌株在LB培养基上活化，并测定其对西维因的降解性能，接种于试管斜面上获得试管种备用。 [0042] 将试管种接种于含200mL种子培养基的1000mL摇瓶中，28～32℃振荡培养至对数期，获得菌种。 [0043] 采用500升的种子罐，种子培养基投料量400升，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的菌种按种子罐中种子培养基的10％接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液，期间：搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：1.0，培养温度为30℃，培养时间为48小时。 [0044] 生产罐容量为5吨，发酵培养基投料量4.0吨。投料后的生产罐在.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至33℃以下，将种子液按生产罐中发酵培养基的10％接种量接种入生产罐发酵培养，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：1.0，搅拌速度为220转/分，培养时间约48小时，出罐后形成能对西维因具有降解作用的液体菌剂。 [0045] 实施例3降解西维因的液体酶制剂的制备 [0046] 将实施例2生产出来的XWY-3液体菌剂于4℃,5000r/min,离心10min,弃上清液，加入原液体菌剂体积1/5pH 7.0,0.5M的磷酸盐缓冲重悬后放置于-20℃冷冻，12小时候取出后室温溶解后，重新放置于-20℃冷冻，12小时候取出后室温溶解，4℃,5000r/min,离心10min,获得的上清液加入0.3％(质量体积百分比)的山梨酸钾，20％的甘油制成降解西维因的液体酶制剂。 [0047] 实施例4降解西维因的固体酶制剂的制备 [0048] 将实施例2生产出来的XWY-3液体酶制剂按照1:1(质量比)的比例加入灭菌的脱脂奶粉，进行喷雾干燥后制备获得能够降解西维因的固体酶制剂。 [0049] 实施例5XWY-3液体菌剂对培养液中西维因的降解效果 [0050] 含有西维因培养基为：(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L,MgSO40.02g/L，NaCl 0.5g/L，西维因50mg/L(从Sigma公司购买)，蒸馏水适量；培养基的pH值7.0。 [0051] 将含有西维因的培养基分成对照组和试验组进行平行试验，将实施例2获得的液体菌剂按照1％的接种量接入试验组中含有西维因的培养基中，将实施例2提供的无菌的发酵培养基按照1％的接种量接入对照组中含有西维因的培养基中；对照组和试验组均置于30℃，180r/min，摇床培养48小时后分别取样，把不同处理的液体加入原体积5倍的二氯甲烷后，剧烈震荡5分钟，静止分层后，取上清液用氮吹吹干后，用色谱纯甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，按照采用高效液相色谱检测培养液中西维因的含量，检测结果如图1，对照组的液体培养基中仍然存在大量的西维因残留，而试验组的液体培养基中西维因的残留量已经很低，表明经过XWY-3能很好地降解液体培养基中的西维因。 [0052] 实施例6 XWY-3液体菌剂对土壤中西维因的降解效果 [0053] 将含有西维因的土壤样品平均分成对照组1、对照组2和试验组，将实施例2获得的液体菌剂按照1％的接种量加入试验组的土壤中，将实施例2提供的无菌的发酵培养基按照1％的接种量接入对照组2，对照组2和试验组均置于30℃，培养48小时，对照组1不作任何处理，把不同处理的土壤样品混匀后，每个处理取10g土壤，加入100mL正己烷/甲醇(体积比为4/1)在振荡器在混匀2小时后，离心，取上清用氮吹吹干后，用色谱纯甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，采用高效液相色谱检测不同处理土壤中西维因的含量，检测结果表1，对照组2土壤中仍然存在大量的西维因残留，而试验组的土壤中西维因的残留量明显降解低，降解率可以达到79.33％，表明经过XWY-3能很好地降解土壤中的西维因。 [0054] 表1 XWY-3液体菌剂对土壤中西维因的降解效果 [0055]处理方式西维因含量(mg/L) 降解率(％) 对照组1(未处理) 4.79 ― 对照组2(培养液) 4.68 2.29 试验组(菌剂) 0.99 79.33 [0056] 实施例7 XWY-3液体酶制剂对草莓中西维因的降解效果 [0057] 将含有西维因残留的草莓平均分成对照组1、对照组2、对照组3和试验组，将实施例3制成的液体酶制剂2％的体积比加入到清水中，放入试验组的草莓，对照组2的草莓直接放于清水中，把洗洁精按2％的体积比加入到清水中，放入对照组3的草莓，把三种不同处理的草莓在室温下浸泡1小时后，用清水冲洗后晾干，对照组1的草莓不作处理。把不同处理的草莓匀浆后，各取10g，加入20mL丙酮，摇床震荡1小时后，加入3g无水氯化钠摇匀，加入20m二氯甲烷，摇床震荡30分钟后，取上清用氮吹吹干后，用色谱纯甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，用液相色谱检测不同处理处理草莓中西维因的含量。结果见表2，经过液体酶制剂处理的草莓中西维因的含量要比其他处理都要低，对西维因的降解率可达87.94％说明XWY-3液体酶制剂能很好地降解草莓中的西维因。 [0058] 表2 XWY-3液体酶制剂对草莓中西维因的降解效果 [0059]处理方式西维因含量(mg/L) 降解率(％) 对照组1(未处理) 4.56 ― 对照组2(清水) 4.23 7.24 对照组3(洗洁精) 3.42 25 试验组(液体酶制剂) 0.55 87.94 [0060] 实施例8 XWY-3固体酶制剂对黄瓜中西维因的降解效果 [0061] 将含有西维因残留的黄瓜平均分成对照组1、对照组2、对照组3和试验组，将实施例4制成的固体酶制剂按照1:100(重量/体积比)加入到清水中，放入试验组黄瓜；对照组2的黄瓜直接放于清水中；把洗洁精按按照1:100(重量/体积比)加入到清水中，放入对照组3的黄瓜；把三种不同处理的黄瓜在室温下浸泡1小时后，用清水冲洗后晾干，对照组1的黄瓜不作处理；把不同处理的黄瓜匀浆后，各取10g，加入20mL丙酮，摇床震荡1小时后，加入3g无水氯化钠摇匀，加入20m二氯甲烷，摇床震荡30分钟后，取上清用氮吹吹干后，用色谱纯甲醇溶解，过0.45μm的滤膜，用液相色谱检测不同处理处理黄瓜中西维因的含量。结果见表3，经过固体酶制剂处理的黄瓜中西维因的含量要比其他的处理低，降解率可达77.46％，说明XWY-3固体酶制剂能很好地降解黄瓜中的西维因。 [0062] 表3 XWY-3固体酶制剂对黄瓜中西维因的降解效果 [0063]处理方式西维因含量(mg/L) 降解率(％) 对照组1(未处理) 3.46 ― 对照组2(清水) 3.14 9.25 对照组3(洗洁精) 2.54 26.59 试验组(固体酶制剂) 0.78 77.46 [0064] 以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要根据权利要求的描述，结合本领域的基本常识，利用所述菌株降解土壤、水体、蔬菜、水果中的西维因，都应该属于本发明的保护范畴。

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