一种从啤酒酵母中提取的奥古蛋白 |
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| 申请号 | CN201410854458.3 | 申请日 | 2014-12-31 | 公开(公告)号 | CN104593337A | 公开(公告)日 | 2015-05-06 |
| 申请人 | 唯美度科技(北京)有限公司; | 发明人 | 陈光; 胡少雄; 马爱莹; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种从 啤酒 酵母 中提取的奥古蛋白。 啤酒酵母 是生产啤酒过程中的关键原料，在工业领域应用广泛，且啤酒酵母或废啤酒酵母中奥古蛋白含量丰富。本发明所述奥古蛋白以啤酒酵母为原料，选择6.5～6.7，浓度为0.04～0.06mol/L 磷酸 盐 缓冲液作为均质 溶剂 ，高压均质得到富含奥古蛋白的粗提液；在对奥古蛋白进行进一步处理的过程中，依次选用pH值为6.5～6.7、浓度为0.02～0.03mol/L磷酸盐缓冲液和pH值为4.5～6.0、浓度为0.02～0.03mol/L 柠檬酸 缓冲液对奥古蛋白进行洗脱、纯化，经浓缩、 冷冻干燥 后，得到奥古蛋白产品。本发明进一步涉及了所述奥古蛋白的应用，本发明提供奥古蛋白纯度高，具有优异的抗 氧 化活性，在 化妆品 领域具有良好的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种从啤酒酵母中提取的奥古蛋白，其特征在于，所述奥古蛋白由包括以下步骤的方法制备而成： |
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| 说明书全文 | 一种从啤酒酵母中提取的奥古蛋白技术领域背景技术[0002] 奥古蛋白(Orgotein)是由猪、牛、羊的肝和红细胞等组织为原料分离提取而制得的一种水溶性蛋白质，为一种肽链大分子金属酶。在生物学领域，具有消炎等功效，目前，正被越来越多地应用到化妆品领域。奥古蛋白多存在于生物体中，人工合成具有很大难度，因此，选择适合的提取原料和相应的提取方法，获得奥古蛋白，从而解决奥古蛋白的来源问题以适应对其大量的需求，是本领域目前需要解决的问题。 [0003] 啤酒酵母是生产啤酒过程中的关键原料，其中含有大量的奥古蛋白成分。并且，在啤酒的生产过程中会产生大量废啤酒酵母，目前有很多生产企业对啤酒生产过程中产生的废啤酒酵母进行再利用，将啤酒废啤酒酵母进行提纯、复壮、扩大培养后，作为原料用于提取各种活性物质。综上所述，啤酒酵母或废啤酒酵母中奥古蛋白含量丰富，且具有大量的资源，是用来提取奥古蛋白的理想原料。 [0004] 专利文献CN1800377A公开了一种用酿酒酵母菌体提取纯化得到铜/锌超氧化物歧化酶的方法。所述的用酿酒酵母菌体提取纯化铜/锌超氧化物歧化酶的生产工艺过程是：将酿酒酵母菌体经过破壁提酶，丙酮二次沉淀，DEAE-32纤维素柱层析得到纯化精制的酶。经比较和研究可知，现有技术提供的从酵母中提取奥古蛋白的工艺中，丙酮沉淀仍是其中的关键环节。如本领域技术人员所熟知的，作为有机溶剂的丙酮，有着一定的毒性，不符合目前环保趋势，并且丙酮在一定程度上还会引起蛋白质活性丢失。 发明内容[0006] 本发明提供了一种从啤酒酵母中提取的奥古蛋白，所述奥古蛋白由包括以下步骤的方法制备而成： [0007] 1)将啤酒酵母溶解于磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5～6.7，浓度为0.04～0.06mol/L；在1000～2000bar条件下高压均质，循环5～10次，离心，取上清液；加入硫酸铵静置、离心、收集沉淀； [0008] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5～6.7，浓度为0.02～0.03mol/L，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液； [0009] 3)在步骤2)所得浓缩液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用柠檬酸缓冲液进行洗脱，所述柠檬酸缓冲液的pH值为4.5～6.0，浓度为0.02～0.03mol/L；收集含有蛋白质的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得奥古蛋白。 [0010] 本发明步骤1)中所述啤酒酵母作为提取奥古蛋白的原料，具有来源广泛、生物安全性高的特点；并且啤酒酵母中奥古蛋白含量较高，适于规模化生产奥古蛋白。所述啤酒酵母可以是新鲜的啤酒酵母，也可以对啤酒生产过程中产生的废啤酒酵母进行再利用，按照常规方法将啤酒废啤酒酵母进行提纯、复壮、扩大培养后，作为原料用于提取奥古蛋白。 [0011] 本发明所述步骤1)中：所述高压均质的压力为1000～2000bar，优选为1500bar，高压均质应循环进行多次，以保证提取率，循环次数为5～10次，优选为8次；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，该缓冲液的浓度优选为0.05mol/L，pH值优选为6.6；啤酒酵母与磷酸盐缓冲液的质量体积比为1：2～8，优选为1：4，此处啤酒酵母的质量单位为g，磷酸盐缓冲液的体积单位为ml；所述离心的温度为2～4℃，优选为3℃，离心速度为1000～5000rpm，优选为3000rpm，离心时间为5～15min，优选为10min。 [0012] 该步骤获得上清液后，加入硫酸铵后对蛋白进行沉淀；具体采用两次分级硫酸铵沉淀，步骤为：将硫酸铵以质量体积比0.3～0.5:1溶解于上清液中，静置30～60min，在2～4℃、8000～9000rpm条件下离心15～30min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸铵以质量体积比0.7～0.9:1加入所得上清液中，静置15～45min，在2～4℃、8000～9000条件下离心15～30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并；此处硫酸铵的质量单位为g，粗提液的体积单位为ml。 [0013] 本发明所述步骤2)采用凝胶层析法除去硫酸铵，能快速获得不含硫酸铵的蛋白溶液，避免了常规透析除盐方法的繁冗过程和可能造成的目标产物损失。具体的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为0.025mol/L，pH值优选为6.6；步骤3)所得沉淀以质量体积比1:1～5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀的质量单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml；葡聚糖凝胶柱选用Sephadex G-25，凝胶柱的平衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000，浓缩步骤为常规操作。 [0014] 本发明所述步骤2)采用奈氏试剂比色法鉴定洗脱液中的硫酸铵；该方法具体为：取1滴洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。按照上述标准，步骤2)收集的目标洗脱液进行该检测后，不应出现棕黄色沉淀。 [0015] 本发明所述步骤2)和步骤3)中，采用磺基水杨酸比色法鉴定洗脱液中的蛋白质；该方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20％磺基水杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。按照上述标准，步骤2)收集的目标洗脱液进行该检测后，应出现白色絮状沉淀。 [0016] 本发明所述步骤3)通过金属亲和层析法进行蛋白纯化，能够快速获得纯化后的奥古蛋白，能够避免奥古蛋白的活性损失，且安全性更高，更环保；具体而言，为了提高纯化效率，在步骤2)所得浓缩液中，加入0.5～0.8mol/L NaCl，再加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端；本步骤中金属螯合亲和柱所螯合的金属离子选自铜、锌、铁、镍离子等金属螯合亲和层析中常用的螯合用金属离子；柠檬酸缓冲液的浓度优选为0.025mol/L，pH值优选为5.2；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000，浓缩步骤为常规操作。 [0017] 作为本发明的最优选方案，所述奥古蛋白由包括以下步骤的方法制备而成： [0018] 1)将啤酒酵母以质量体积比1:4溶解于磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.6，浓度为0.05mol/L；在1500bar条件下高压均质，循环8次，在3℃、3000rpm条件下离心10min，取上清液；将硫酸铵以质量体积比0.4:1溶解于上清液中，静置45min，在3℃、8500rpm条件下离心20min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸铵以质量体积比0.8:1加入所得上清液中，静置30min，在3℃、8500条件下离心20min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并； [0019] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.6，浓度为0.025mol/L，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液； [0020] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入0.6mol/L NaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用柠檬酸缓冲液进行洗脱，所述柠檬酸缓冲液的pH值为5.2，浓度为0.025mol/L；收集含有蛋白质的洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得奥古蛋白。 [0021] 本发明所述磷酸盐缓冲液均为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。 [0022] 为了保证制备得到的奥古蛋白的活性，本发明各个步骤的操作温度均优选为0～4℃。 [0023] 本发明提供的奥古蛋白呈蓝色或蓝绿色。 [0024] 本发明进一步保护所述从啤酒酵母中提取的奥古蛋白在制备化妆品中的应用。由于本发明提供的奥古蛋白具有优异的抗氧化活性，因此可以作为制备化妆品的理想原料。 [0025] 与现有技术相比，发明提供的奥古蛋白产率高、纯度高、活性好，可以用于制备化妆品，具有良好的应用前景。且该奥古蛋白的制备工艺安全、环保，原料来源丰富，适于工业化大规模生产。 具体实施方式[0026] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0027] 本发明各实施例中，洗脱液中硫酸铵的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵；洗脱液中蛋白质的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20％磺基水杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。 [0028] 实施例1 [0029] 奥古蛋白由以下步骤制备而成： [0030] 1)将100g啤酒酵母溶解于400ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.6，浓度为0.05mol/L；在1500bar条件下高压均质，循环8次，在3℃、3000rpm条件下离心 10min，取上清液；在上清液中加入187.6g硫酸铵，静置45min，在3℃、8500rpm条件下离心 20min，分离上清液，收集沉淀；在上清液中加入300g硫酸铵，静置30min，在3℃、8500条件下离心20min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀5.17g； [0031] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于15ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.6，浓度为0.025mol/L，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液17ml； [0032] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入0.6mol/L NaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用柠檬酸缓冲液进行洗脱，所述柠檬酸缓冲液的pH值为5.2，浓度为0.025mol/L；收集含有蛋白质的洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得蓝绿色粉末18.62mg。 [0033] 经蛋白凝胶电泳SDS-PAGE检测，所得产品分子量与市售的奥古蛋白标准品相同。 [0034] 实施例2 [0035] 奥古蛋白由以下步骤制备而成： [0036] 1)将100g啤酒酵母溶解于800ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.7，浓度为0.06mol/L；在2000bar条件下高压均质，循环10次，在4℃、5000rpm条件下离心15min，取上清液；在上清液中加入300g硫酸铵，静置60min，在4℃、9000rpm条件下离心 30min，分离上清液，收集沉淀；在上清液中加入405g硫酸铵，静置45min，在4℃、9000条件下离心30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀4.76g； [0037] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于23ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.7，浓度为0.03mol/L，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液 25ml； [0038] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入0.8mol/L NaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用柠檬酸缓冲液进行洗脱，所述柠檬酸缓冲液的pH值为6.0，浓度为0.03mol/L；收集含有蛋白质的洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得蓝绿色粉末15.22mg。 [0039] 实施例3 [0040] 奥古蛋白由以下步骤制备而成： [0041] 1)将100g啤酒酵母溶解于200ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5，浓度为0.04mol/L；在1000bar条件下高压均质，循环5次，在2℃、1000rpm条件下离心5min，取上清液；在上清液中加入105g硫酸铵，静置30min，在2℃、8000rpm条件下离心 15min，分离上清液，收集沉淀；在上清液中加入175g硫酸铵，静置15min，在2℃、8000条件下离心15min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀4.49g； [0042] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于8ml磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.5，浓度为0.02mol/L，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液 5ml； [0043] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入0.5mol/L NaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用柠檬酸缓冲液进行洗脱，所述柠檬酸缓冲液的pH值为4.5，浓度为0.02mol/L；收集含有蛋白质的洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得蓝绿色粉末13.87mg。 [0044] 对比例1 [0045] 与实施例1相比，区别仅在于，所述步骤2)用以下操作代替：将步骤3)所得沉淀溶解于pH6.6、0.025mol/L磷酸盐缓冲液15ml中，置于透析袋中，按照常规方法透析去除硫酸铵，每隔5小时更换一次透析缓冲液，50小时后，溶液中不含有硫酸铵，用PEG4000浓缩，得浓缩液。 [0046] 所得产物为蓝绿色粉末8.67mg。 [0047] 对比例2 [0048] 与实施例1相比，区别仅在于，步骤3)所述柠檬酸缓冲液用pH6.6、0.025mol/L磷酸盐缓冲液代替。 [0049] 所得产物为白色粉末15.98mg。 [0050] 实验例：奥古蛋白检测 [0051] 1、检测样品：实施例1～3和对比例1、2所得产物，市售的奥古蛋白标准品。 [0052] 2、纯度检测：以C18柱为固定相，以含有0.3％三氟乙酸的乙腈-水为流动相，采用反相高效液相色谱法，按照常规操作，参考标准品的出峰情况，确定样品的目标吸收峰，采用峰面积法计算产品纯度。 [0053] 3、活性检测：由于奥古蛋白可以清除超氧阴离子，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在560nm处有强吸收，奥古蛋白可以抑制甲臜的形成；反应液蓝色愈深，说明奥古蛋白的活性愈低，反之则活性愈高，据此通过比色分析就可以计算出奥古蛋白的活性水平。具体操作步骤，详见超氧化物歧化酶试剂盒检测(总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(NBT法)，海门市碧云天生物技术研究所，产品编号S0109)该试剂盒的说明书。 [0054] 4、奥古蛋白的纯度和酶活性的检测结果见表1；此处奥古蛋白的活性用比活(U/mg)表示。 [0055] 表1：奥古蛋白检测结果 [0056]样品 纯度(％) 比活(U/mg) 实施例1 90.36 5013.8 实施例2 88.76 4937.5 实施例3 89.03 4956.8 对比例1 85.15 4683.5 对比例2 61.3 4068.9 标准品 -- 4967.4 [0057] 由以上检测结果可知，本发明提供的方法制备得到的奥古蛋白的纯度均大于88％，且显著优于对比例2，对比例1虽然与各实施例纯度接近但产品收率(产物与原料啤酒酵母的质量比)较各实施例偏低；本发明提供的奥古蛋白比活均大于4900U/mg，且不低 |
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