用稀有气体调节酶活性的方法

本发明涉及用稀有气体调节酶活性的方法。

稀有气体氦(He)、氖(Ne)、氩(Ar)、氪(Kr)、 氙(Xe)和氡(Ra)进入化学物质中与其他原子结合的能力是极 其有限的。总地说来，只有氪、氙和氡已被诱导与其他原子如氟和氧 反应，且如此生成的化合物极不稳定(参见Advanced I Inorganic Chemistry，F.A.Cotton and G。 Wilkinson(Wiley，Third Edition))。虽然稀有 气一般在化学上是无反应性的，但已知氙表现有某些生理学效应，如 麻醉作用。也已观察到了其他惰性气体如氮的其他生理效应，例如， 已经知道在深海潜水的强大压力下使用氮时其可引起麻醉效应。

Schreiner的美国专利US3,183,171中已报导了 氩和其他惰性气体可影响真菌的生长速度，并且已知氩可改善鱼或其 他海产品的防腐保鲜(Schvester的美国专利4,946,326 以及日本专利JP5105232、JP80002271和JP 77027699)。然而，由于对所观察的现象缺乏根本的了解， 所以很难清楚地解释这些结果。另外，由于在这些研究中使用了包括 氧在内的许多气体的混合物，所述使得这些观察结果的含意更加模 糊。再者。其中某些研究工作是在高气压和冷冻温度下进行的。在这 样高压力下，所观察到的结果很可能是由于压力对细胞成分或酶本身 的损伤引起的。

例如，从1964到1966年，Schreiner在有关适当抑 制深海潜水、潜水艇及宇宙飞船的大气压力的研究中，提出了惰性气 体之生理学效应特别与麻醉作用有关的报告。这一研究结果总结成了 三篇报告，为Office of Naval Research，Department of the Navy准备的报告的题目是“Technical Report。 The physiologicecl Effects of Argon，Helium and the Rare Gases”(Contract Nonr 4115 (00)，NR：102-597)。后来出版了这项研究的三篇综 述和摘要。

一篇摘要(“Inert Gas Znteractions and Effects on Enzymatically Active Proteins”， Fed，proc.26：650(1967))重甲了有关稀有和其 他惰性气体在升高的分压下对整体动物(麻醉)和微生物及哺乳动物 细胞系统(生长抑制)产生生理学作用的观察结果。

第二篇摘要(“ APossible Molecular Mechanism for the Biological Activify of Chcemically Inert Gases”，Intern.Congr.physiol.Sci.， 23rd，Tokyo)再次提出了惰性气体在高压下对各种水平之细胞 组织表现的生理学活性的观察结果。

另外，Schreiner发表了稀有气体之一般性生理学效应的综 述，其中再次阐述了他的早期研究的主要结果(“General Biological Effects of the Helium-Xenon Serier of Elements”，Fed，proc.27：872- 878(1968))。

然而，在1969年，Behnke等人提出反对Schreiner 的主要结论。Behnke等人得出的结论是， Schreiner的早期 报导的结果是不能再现的，而且只是因高气压造成的，即不能证明 稀有气体对酶的影响(“Enzyme-Catalyzed Reactions as Influeced bYInert Gases at High Pressures” J.Food Sci，34：370-375)。

实质上，Schreiner的研究工作是基于这种的假设，即化学 上惰性气体与氧分子竞争细胞位点，并且氧置换取决于氧对惰性气体 浓度的比例。这一假设从未作为用一氧化二氮观察到最大效应(只观 察了抑制效应)得以证实，而且发现这种效应是不依赖于氧分压的。 此外，所观察到的抑制作用为每大气压所加一氧化二氮只产生1.9％ 抑制。

为了反驳Schreiner的早期工作，Behnke等人单独试验了 高气压对酶的影响，并试图再现Schreiner所得到的结果。 Behnke等人发现，与Scgreiner的完全相反，过高增加氮和氩 的气体压力肯定可观察到胰凝乳蛋白酶、转化酶和酪氨酸酶的轻度抑 制，但不会引起抑制作用的进一步增加。

Behnke等人的发现可用简单的初始水静压抑制作用来解释， 在压力稳定后这一抑制作用即解除。很清楚。Schreiner提出的 化学O2/惰性气体相互依赖性来解释。Behnke等人的结论是，

高压惰性气体通过降低氧利用率抑制了非流体(如凝胶体)中的 酪氨酸酶，而不是在物理上改变酶。这一结论正与Schreiner的 发现相反。

除了Behnke等人的反对意见外，Schreiner报导的结果 也难以对其他一些事实作出解释。

首先，所有分析都是在很高压力下进行的，并且针对水静压效应 控制分析条件。

第二，在许多例子中，没有观察到各种稀有气体和氮气之间有明 显差异。

第三，在进行这些研究时，对酶作用及抑制的方式了解很少，所 用酶的纯度也不够。不可能肯定不存在混淆的酶活性，而且不能肯定 所作检测的分辨程度是以区分开不同气体的效力。再者，任何特异作 用方式都只能是作为一种不可检验的推测提出的。

第四，没有控制各种气体间溶解度的差异，没有考虑到这一差异 对结果的影响。

第五，所有试验均使用高于1个大气压的高惰性气体压力进行， 故不能充分地控制氧气压。

第六，报导的所有效应只是抑制作用。

第七，文章中没有充分描述所有方法，并且可能也没有作实验对 照，另外，在酶反应开始后长时间脱延而妨碍了继后的整个反应过 程，以致没有记录到可读的最高改变速率。

第八，基于小数目的观察，而使报告的数据范围变化很大，从而 影响了结果的统计学意义。

第九，即使在高压力所观察到的抑制水平也是很小的。

第十，有关依赖于酶浓度的研究并没有得出有意义的可用数据。

第十一，惰性气体在低气压下之抑制潜能的所有报告都是基于从 高气压测定值作曲线外延后推断的，而不是真实数据。

最后，值得再次指出的是，Behnke等人的结果在几个关键方

面明确地反驳了Schreiner的结论。其中主要是高压力影响很 小，而且Schreiner没有控制的静水压效应是这些研究中得出错误结 论的主要原因。

因此，虽然Sandhoff等人(FEBS Letters，Vol.62，No，3 (March，1976))报导了氙、一氧化二氮和氟烷可提高颗粒唾液酸酶的 活性，但由于研究中所用的酶纯度很差，而且可能在颗粒中存在抑制 性氧化酶，所以结果是有问题的。

为了总结上述专利和出版物，进一步列出下面一些相关的现有技 术。

Behnke等人公开了高压力惰性气体对酶催化的反应的影响 (J.Food Sci.34：370-375)。

Schreiner等人(1967)描述了惰性气体相互作用以及对酶促活 性蛋白质的影响(Abstact No.2209.Fed.Proc.26：650)。

Schreiner，H，R，1964年在Technical Report中描述了氩、氦 及其他稀有气体的生理学效应(Contract Nonr 4115(00)，NR：102- 597。Office of Naval Research，Washington，D.C)。

Schreiner，H。R。 1965年在Technical Report中描述了氩、氦 等稀有气体的生理学效应(Contract Nonr 4115(00)，NR：102-597。 Office of Naval Research，Washington，D.C)。

关键的是，上述研究均没有作出所研究的气体与酶活性部位相互 反应的明确结论。

不过最近已经知道可以几种方式抑制酶活性。例如，许多酶可被 在结构上与其正常底物相关的特定毒物抑制。另外，已知许多不同的 试剂是靶酶的特异性失活剂。这些试剂一般可在酶的活性部位造成化 学修饰以诱导催化活性丧失，即造成活性部位特异性不可逆失活或亲 合标记(参见Enzymatic Reaction Mechanisms，C。 Walsh(W.H.Frecman & Co.，1979))，另外，某些 多酶系列受到所谓调节或变构酶等特殊酶的调节(参见 Bioenergetics，A.L.Leninger(Benjamin/ Cummings publishing Co.，1973)。

然而，如果能够得到一种以可预言和可控制的方式调节酶活性的 更简单的手段，将是极其有利的。此外，如果能找到一种以可预言和 可控制的方式选择性地抑制或提高酶活性的方法也将是极为有利的。

因此，本发明的一个目的是提供一种以简单和直接的方式调节酶 活性的方法。

本发明的另一个目的是提供一种不使用按结构设计的失活靶酶的 试剂即可调节酶活性的方法。

本发明的再一个目的是提供一种不使用结构上与正常酶底物相关 的酶毒物即可调节酶活性的方法。

再者，本发明还提供了转移最适相关酶一底物浓度以及修饰与物 理参数相关之最适反应条件的方法。

基于下面的详细描述，对有关通过使一种或多种酶与包括一种或 多种稀有气体的气体相接触而完成的调节酶活性的方法，及由之提供 的上述及其他发明目的将会更显而易见。

图1显示酪氨酸酶的吸收光谱。

图2显示L-酪氨酸的吸收光谱。

图3显示用L＇-酪氨酸封闭的酪氨酸酶与L-酪氨酸的吸收光 谱。

图4显示用各种不同浓度酪氨酸酶进行的反应之结合的迭加，显 示了直接线性一级酪氨酸酶浓度依赖性。

图5证明相等W/W氙气对酪氨酸酶的抑制作用。

图6证明于26℃时氙气对酪氨酸酶的很大抑制作用。

图7显示在15℃时，氩轻度抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的 平衡关系；氙具有较小但明显的抑制作用，氖和氪则表现出很大的抑 制作用。

图8显示氙、氪、氖和氩在20℃时对酪氨酸酶-L-酪氨酸反 应的抑制作用。

图9显示氧在20℃下没有提高对酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的 影响。

图10显示氖、氩、氪和氙在25℃时对酪氨酸酶-L-酪氨酸 反应的影响。

图11显示在25℃下氧没有提高对酪氨酸酶-L-酪氨酸反应 的影响。

图12显示30℃下氖、氩、氪和氙对酪氨酸酶-L酪氨酸反 应的影响。

图13显示30℃下氧没有提高对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的影 响。

图14显示在不同温度下在空气中的标准曲线，并证明速率改变 与氧溶解度差异直接相关。

图15显示氖对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制作用是正温度依 赖性的。

图16显示氪抑制酪氨酸酶的能力与温度间的直接反(付)相关 性。

图17显示氙对酪氨酸酶-L酪氨酸平衡的抑制作用与温度间有 反相关性。

图18显示在20℃时，氧并不加速酪氨酸酶-L酪氨酸反应， 而氩、氙和氖均可显著抑制该反应。

图19显示25℃时，氩和氮对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制 程度小于稀有气体，且氧可加速该反应。

图20显示于30℃时，氧因减小了溶解度而不再加速酪氮酸酶 -L酪氨酸反应。

图21显示氖在不同温度时对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制， 且显示在20℃和25℃之间有一个跃迁。

图22显示氩在不同温度时对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制作 用。

图23显示氪在不同温度时对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制作 用。

图24显示氙在不同温度时对酪氨酸酶-L酪氨酸反应的抑制作 用。

图25显示单纯由参予从溶液中置换氧之溶解度机制对酪氨酸酶 -L酪氨酸反应的抑制作用。

图26显示氮对酪氨酸酶活性的抑制作用。

图27显示在20℃和25℃间氙活的明显不同。

图28显示氪、氙、氩、氮和氖对葡萄糖氧化酶的抑制作用。

图29显示氪、氙、氩和氪与氙的混合物对α-容氨酰转肽酶的 抑制作用。

图30显示氪、氙、氩和氪与氙的混合物对天冬氨酸基转移酶的 抑制作用。

图31显示氮、氖、和氧增强α-D-葡糖苷酶活性。

图32显示氖、氧和氮增强苯丙氨酸解氨酶活性。

图33显示氙和氪增强柠檬酸合酶活性，而氩则对其有抑制作 用。

图34显示氙、氪、氩和氪与氙的混合物在10℃下增强磷酸葡 萄糖异构酶活性。

图35显示25℃时氖和氮增强磷酸葡萄糖异构酶活性，氧则对 其有抑制作用。

图36显示在25℃时氪和氪与氙的混合物增强S-乙酰CoA 合成酶活性。

图37显示在100个大气压和25℃下，空气和氮对β-葡糖 苷酶的抑制作用。

图38显示在30个大气压下空气和氮对β-葡糖苷酶的抑制作 用。

图39显示在30个大气压下空气、氙和氮对酪氨酸酶的抑制作 用。

图40显示在100个大气压下空气、氙和氮对酪氨酸酶的抑制 作用。

图41显示酶一底物浓度影响稀有气体增强/抑制作用的结果。

图42显示氙和氖例如在10℃下在分别增强，然后抑制乳酸脱 氢酶中的不同作用。

图43显示即使在60℃下，稀有气体仍表现出对酶的增强或抑 制作用。

图44显示氙在增强固相化β-葡糖苷酶活性上的作用。

图45显示在五个不同底物浓度下，β-葡糖苷酶在空气下的紫 外/可见光(UV/Vis)吸收率曲线。

图46显示在五个不同底物浓度下，β-葡糖苷酶在氙气下的 UV/Vis吸收率曲线。

图47显示β-葡糖苷酶—空气充气反应的一级反应动力曲线回 归速率线性变换。

图48显示β-葡糖苷酶—氙气充气反应的一级反应动力曲线回 归速率线性变换。

图49和50显示本实验中研究的所有气体的同样一级反应速率 近似回归线性化关系。

图51和52显示单—酪氨酸酶实验的前160秒所得数据，表 示为空气、再充氙气后的反应动力曲线。

根据本发明，现已令人惊奇地发现，可通过使一种或多种酶与含 一种或多种稀有气体的气体接触，以一种受控制和可预言的方式调节 酶活性。特别是发现即使在低气压下和宽的温度范围内，稀有气体可 表现出对酶有显著影响。

基于下列几个原因可知本发明确实是令人惊异的。首先，根据本 发明，可在低气压下调节酶活性。但也可使用高气压。第二，用稀有 气体，包括其他气体如氮、氧、二氧化碳、一氧化碳和一氧化二碳的 混合物也可得到极好的结果。一般说来，除提到的稀有气体外，其他 任何气体均可用于气体混合物中。但这些其他气体中最典型的包括 氧、氮和二氧化碳。

本文所用的术语“稀有气体”是指选自氦、氖、氩、氪、氙和氡 的任何一种气体。但因为氦的溶解度低而且反应速率对于实用系统来 说显得过高，另外氡有危险的放射活性，所以一般最好是使用氖、 氩、氪或氙。

根据本发明，可使用单一的、纯的稀有气体，或可使用稀有气体 的混合物。例如，可使用含有大约90％Kr和10％Ne(基于总 气体体积)的廉价生产的工厂侧馏气体。但也可使用一种或多种稀有 气体与其他气体如氮、六氟化硫、二氧化碳或氧的混合物。

根据本发明，已发现可在水或无机溶液、分散剂、悬浮剂或其他 型式基质如凝胶中观察到一种或多种希有气体对酶活性的作用。此 外，被调节的酶可结合或不结合到载体上。稀有气体本身可以是溶 液、大气或结合形式的。

本发明是基于这样的基本发现而预言的，即按照国际生化联合会 和国际纯化学与应用化学联合会的生化命名委员会的统一分类，所有 六大类中的酶均可通过在低气压下与纯惰性气体或它们的混合物，甚 至与其他气体的混合物接触，可重复地提高或抑制它们的活性。

根据本发明，已发现本发明的气体或气体混合物可在动力学和热 力学控制两方向影响酶促活性。即是说，现在有可能控制酶促反应的 速率和产率。

虽然反应混合物中存在的气体和气体混合物的溶解度影响气体和 气体混合物的测得的效应，但溶解度并不能完全决定这一效应。效应 主要是归因于极化性、电离性、范德华力及原子半径等分子效应，一 般说来，根据本发明增加温度将限制气体可利用性，这是由于降低了 溶解度进而降低了这些效应。然而，这种效应的降低可随着增加温度进 而提高极化性而得到补偿。因此，在大约30℃或更高温度下，增加 气体和气体混合物的极化性对于气体和气体混合物的效应要比溶解度 特性有更为显著的影响。

一般说来，在高于标准温度和压力(STP)的条件下增加惰性 气体和其混合物的摩尔浓度，可观察到对酶效应的增加。此外，这些 效应可能是基于气体分子与酶的相互作用，这种相互作用是独立的， 但可因其他气体之混合物的存在而得以改善或增强。值得注意的是， 惰性气体混合物的行为与单纯惰性气体相同，而且发现几种气体的混 合物可拟似、倒转或改善用单一希有气体观察到的效应。

另外，根据本发明，已发现特定希有气体或其混合物可抑制或提 高作为温度的函数的酶促活性。

再者，根据本发明，已发现一般在适当的PH、温度、压力、 〔E〕和〔S〕条件下，所有的酶都可受到本发明各惰性气体的特异 性抑制。

可在任何使用酶的实际应用中，利用本发明来调节酶活性。例 如，本发明可有利地用于抗生素如青霉素生产中、用于乙醇和乙酸生 产中、用于制造诊断药盒、用于制造发酵产品如啤酒、白酒和干酪， 以及用于大规模酶促转化中。

如上面提到的，本发明可有利地应用于调节已鉴定的六大类酶中 的任何一种酶的活性。这些酶的例子可以是但不只限于下列一些酶。

本发明特别可用于调节氧化还原酶类，如包括脱氢酶、氧化酶、 过氧化酶、羟化酶及加氧酶。氧化还原酶的特定例子是酪氨酸酶、葡 萄糖氧化酶、3-羟基丁酮脱氢酶、牛磺酸脱氢酶、章鱼碱脱氢酶、 偶氮苯还原酶、乙酰吲哚氧基氧化酶、亚牛磺酸脱氢酶、假单胞菌细 胞色素氧化酶、3-羟基邻氨基苯甲酸氧化酶、氯过氧化物酶、细胞 色素C3加氢酶、邻羟苯丙酸3-单加氧酶、CDP-4-酮-6- 脱氧-二葡萄糖还原酶及红氧还蛋白NaD+还原酶和氯酸盐还原 酶。但可使用任何一种氧化还原酶。

可按照本发明进行调节的第二类酶是转移酶。转移酶特定例子是 肌肽N-甲基转移酶、3-氧酰基酰基载体蛋白合酶、海带糖磷酸转 移酶、半乳糖6-硫酸化酶、二碘酪氨酸氨基转移酶、景天庚酮糖基 激酶和鞘氨醇半乳糖苷硫酸转移酶、8-谷氨酰转肽酶和天冬氨酸氨 基转移酶。但任何转移酶均可使用。

可按照本发明调节的第三类酶是水解酶，如包括酯酶、磷酸酶、 葡糖苷酶和肽酶。

水解酶的特定例子是二氢香豆素水解酶、β-D-葡糖苷酶、α -葡糖苷酶、核糖同型半胱氨酸酶、酰基胞壁酰丙氨酸羧基肽酶、脲 基琥珀酸酶、根皮素水解酶及2-卤酸脱卤酶。但可以使用任何一种 水解酶。

可按照本发明调节的第四类酶是裂解酶，如包括脱羧酶、醛缩酶 和脱水酶。裂解酶的特定例子是苯丙氨酸解氨酶、柠檬酸合成酶、甲 基乙醛酰合酶、脲基甘醇酸酯裂解酶、蒜氨酸裂解酶、分支酸合酶及 烷基汞裂解酶。但任何裂解酶均可使用。

可按照本发明调节的第五类酶是异构酶，如包括消旋酶、表异构 酶、顺一反异构酶、分子内氧化还原酶和分子内转移酶。其特定例子 可以是磷酸葡萄糖异构酶、UDP阿拉伯糖4-表异构酶、马来酰乙 酰乙酸异构酶、分支酸变位酶和己二烯二酸环异构酶。但任何异构酶 均可使用。

可按照本发明调节的第六类酶是连接酶，如包括氨基酸-RNA 连接酶、酸-硫醇连接酶、酰胺合成酶、肽合成酶和环化连接酶。可 特别提到的连接酶例如有乙酰胆碱合酶、丝氨酰-2-RNA合成 酶、肌肽合成酶和甲基豆酰CoA羧基酶。但任何一种连接酶均可使 用。

虽然总的说来本发明提供了一种调节酶活性的方法，但也提供了 其他几种特定方法。

第一，本发明还提供了使一种或多种酶与包括一种或多种稀有气 体或其混合物的气体接触以提高酶活性的方法。

第二，本发明还提供了使一种或多种酶与包括一种或多种稀有气 体或其混合物的气体接触以抑制酶活性的方法。

第三，本发明提供了通过使一种或多种酶与包含一种或多种稀有 气体或其混合物的气体接触以转移其最适PH和/或温度的方法。

第四，本发明提供了通过使一种或多种氧化还原酶与包含一种或 多种稀有气体或其混合物的气体接触以调节氧化还原酶活性的特定方 法。

第五，本发明还提供了通过使一种或多种水解酶与包括一种或多 种稀有气体或其混合物的气体接触以调节水解酶酶促活性的特定方 法。

第六，本发明还提供了通过使一种或多种裂解酶与包括一种或多 种稀有气体或其混合物的气体与接触以特异性调节裂解酶酶促活性的 方法。

第七，本发明还提供了通过使一种或多种异构酶与包括一种或多 种稀有气体或其混合物的气体接触以特异性调节异构酶酶促活性的方 法。

第八，本发明还提供了通过使一种或多种连接酶与包括一种或多 种稀有气体或其混合物的气体接触以特异性调节连接酶酶促活性的方 法。

第九，本发明还提供了通过使一种或多种转移酶与包括一种或多 种稀有气体或其混合物的气体接触以特异性调节转移酶酶促活性的方 法。

第十，本发明还提供了通过使一种或多种酶与包括一种或多种稀 有气体或其混合物的气体接触以改变最适相对酶一底物的浓度的方 法。

第十一，本发明还提供了选择性调节两种或多种酶混合物中之一 种酶的方法。

应强调指出的是，上面列出的六大类酶中个别酶的例子只是作为 举例说明而不是只限于这些酶。根据本发明，任何酶都可使用本发明 的气体或气体混合物进行调节。例如，可按照本发明调节 Enzymesby M：Dixon and E.C.Webb，Third Edition(Adademic Press)中所述的酶。

一般说来，如上所述的含有一种或多种惰性气体的气体可以是单 一的、纯的惰性气体或惰性气体的混合物。所说的气体也可以是一种 或多种气体与上述其他气体的混合物。

酶可以是任何形式的。例如，被调节的酶可以是含水、水基或无 机溶液。酶也可以是在其他基质如凝胶中。另外，酶可以是结合或未 结合形式的，甚至是在细胞或活细胞或植物或其他组织中呈结合形式 的。

例如，在使用本发明调节结合的酶时，可以许多应用形式使用本 发明。例如，可在分批反应器、连续流动的搅拌罐式反应器、柱状反 应器，如充填床反应器或流化床反应器中使用。

此外，当酶提供的成本太多或不能纯化时，或者当酶从其天然环 境中除去后不稳定时，使在细胞中的结合酶是有利的。例如，可使用 假单胞菌(Pseudomonas putida)的固相化细胞制备L-瓜氨酸，并可 使用

(Achromobacter liguidium)的固相化细胞制备尿刊酸。

此外，本发明还可用于调节与酶电极结合之酶的活性，如用于使 用葡萄糖氧化酶检测葡萄糖的电极。

本发明可有利地用于以可控制和可预见的方式调节酶活性。

为了进一步描述本发明，下面将对六大酶类中的每一类逐一进行 更详细地讨论。

I.氧化还原酶

一般说来，氧化还原酶可受到惰性气体的强烈抑制。但对于不同 的惰性气体或不同的惰性气体混合物来说，抑制程度可有所不同。

氙对氧化还原酶反应的速率表现有最大抑制作用，并可抑制反应 的终平衡。其他稀有气体也都抑制此反应速率并压低反应平衡到一较 低程度，这一程度则取决于它们的溶解度和分子特性。氪比氙的作用 稍小，且氩在低温度下很活泼。因此，根据本发明，可依据使用的是 室温还是冷冻温度，用不同的气体混合物将氧化还原酶活性调节到最 佳程度。

孰苍诘臀度下很活泼。因此，根据本发明，可依据使用的是室温 还是冷冻温度，用不同的气体混合物将氧化还原酶活性调节到最佳程 度。

使用一种或多种稀有气体或其混合物时，可依据所使用的确切气 体或混合物、底物、温度及气体压力获得可变程度的氧化还原酶抑制 作用。

II.转移酶

一般说来，转移都可被抑制。例如，氨基转移酶和转肽酶可被稀 有气体或其混合物抑制。

一般氪表现有最大抑制作用，或者依据被调节之转移酶的亚类不 同而存在某些变异。相反，氖则根据转移酶的不同亚类表现有较低的 抑制作用或提高作用。

III.水解酶

稀有气体或其混合物可强烈提高所有水解酶的活性。

特别是氙表现有最大增强效应，而氪则表现有很小的效应。

但必要时也可抑制水解酶。

IV.裂解酶

一般说来，稀有气体或其混合物可强烈或中度提高裂解酶活性。

但有些气体则在亚最适条件下抑制裂解酶酶促活性。

氙表现有最大增强效应，而氩则表现最小增强效应。

V.异构酶

一般说来，稀有气体或其混合物可强烈或中度提高异构酶活性。

然而，氩和含有氩的混合物可被诱导以在较高温度下抑制酶活 性。

VI.连接酶(合成酶)

一般说来，稀有气体或其混合物可强烈提高连接酶活性。

为了更清楚地了解用于检测本发明一种或多种稀有气体对酶促活 性之效应的方法，现对一种典型的和举例说明的实验方法作如下描 述：

一般方法

溶液制备：在适当缓冲液(对于酶有最适pH和摩尔浓度)中稀 释酶(单位/ml)和底物(μg/ml)以制备最佳化W/V溶液。溶 液在气体实验中只用一次，以避免活性丧失。可利用各种不同的酶和 底物浓度及抑制剂。必要时可改变物理参数。

分光光度装置：使用温度控制的、接有IBMPS/230个人计算 机的Perkin-Elmer J，ambda 6UV/Vis分光光度计进行实验分析。 IBM装有两个软盘(PECSS或UVDM用于记录和评阅光谱，改良 的ENZFITTER和Grafit用于作动力学研究)。

全量程光谱：取得酶和底物以及完成之反应混合物的全量程光 谱，以便确定在确切时间追踪酶促反应的适当波长(相当于主吸收峰 的波长)。测定吸收的波长并制成空白对照。可使用显色底物，在某 些情况下，可将显色反应与正在研究的酶反应偶联起来。

稀释系列：在气体实验前进行系列稀释以找出最适酶/底物比 例。在最适条件下进行反应，然后用超最适和亚最适底物范围，继之 再用各种抑制剂进行反应。

硅封口小池的制备：用硅橡胶密封层封闭1cm光程丙烯酸或石 英小池。硅须固化48小时以得到密封的小池。用空气吹除任何可用 GC/MS检测到的化学气体污染物，并进行漏气试验。

样品的制备：借助气密注射器在小池内充入2ml底物溶液。在 密封的血清小瓶中充入酶和溶剂。在小池和血清小瓶中连续吹入足够 气体，且在注射至气体达到最大平衡间间隔/小时，在充入适当气体 之前，所有注射器和死空间都要吹除气体污染物。检测所用气体的量 以足够饱和所需溶液。

对照组：所有可能的干扰参数均须严加控制，包括T、P、其他 气体、空气漏失、材料、气体和试剂质量变化、pH。重复进行以达 到有效位数。

分光光度定时推进、反应速率及动力学分析；分析前各小池和血 清管用气体饱和40分钟。用充气注射器回收0.5ml酶溶液以避免空 气接触。同时用注射器注射0.5ml酶，以使各样品均在同一时间开始 分析。在不同温度(0℃至60℃)分析各7种气体(空气、O2、 N2、Ne、Ar、Kr、Xe)。记录反应速率或终反应平衡对环境空气的 改变。同时对加氧和脱氧合条件进行比较。还在加压下制备某些样 品。

完整实验方案

在完整实验中，使有最适pH和缓冲盐浓度的酶与5种浓度的底 物在有1个大气压下稀有气体的溶液(饱和溶液)中，以10％和 50％饱和度，并在1.5和2个大气压下及至少一个更高压力下，同时 添加相当于在1和2个大气压总压力下之占总气体10％、20％和 50％氧的条件下进行反应，其中各温度由0-65℃以5℃之差递增， 使用N2、O2、Ar、Ne、Kr、Xe、空气，有时使用其他气体，以及 使用上述气体的十分位数混合物，同时使酶在控制静水压条件下接触 到很高的压力。在真空抽空溶液后还进行对照实验。在快速扫描分光 光度仪中以比色法监测反应，并对信号进行术学处理以得到速率和产 率差值。样品数是恒定的并足以保证结果的 显著性。所有参数都独立控制并测定，有时还进行更为复杂的实验。

数据以真实时间产物生成曲线图(标准速率曲线)的形式得到， 每个样品小池有一个数据，其在标准程序下重迭，以便对每6-12 个小池实验产生一个重复占位。这样一个占位数据被附加上去。也产 生出构成这些曲线外加所有机械参数的X-Y数据点表格。这些数据 可进一步转化为曲线间的计算差值，产率间差值、速率间差值或其他 逻辑比较值。使用n个单独的软件程序计算这些数据，所说的程序利 用了简单或复杂的普通数学表达法、线性和非线性回归曲线拟合、对 数正常转化、酶促速率计算(Michaelis-Menten，Eadie- Hofstee，Lineweaver-Burk)以及时间依赖性多变量分 析。

为了更完整地描述本发明，现提供下列一些实施例以进一步举例 说明，这些实施例并不限制本发明的范围。

第I类.氧化还原酶(EC1)

实施例1

酪氨酸酶；25℃和最适反应条件，用体简单饱和溶液：

       稀有气体或混合物          效应

            Xe                  -73％(抑制)

            Kr                  -73％

            Ar                  -60％

            Ne                  -46.7％

            90：10Xe：Krmix     -50％

            Ar：Xe99：1         -70％ 实施例2 葡萄糖氧化酶

稀有气体或混合物                 效应

     Xe                        -91.6％(抑制)

     Kr                        -92.7％

     Ar                        -85.8％

     Ne                        -61.7％ 类的畸蜂

     Xe                        -95％(抑制)

     Kr                        -91％

     Ar                        -91％

     Ne                        -85％ 应注意的是，上述结果是依赖于温度和底物浓度的。 第II类。转移酶(EC2) 实施例3 r-谷氨酰转肽酶：

稀有气体或混合物                效应

    Xe                          -7％(抑制)

    Kr                          -8％

    Ar                          -5％

    Ne                          -3％

实施例4

天冬氨酸氨基转移酶

    稀有气体或混合物    效应

       Xe             -17％(抑制)

       Kr             -82％

       Ar             -17％

       Ne             -12％

第III类.水解酶

实施例5

β-D-葡糖苷酶

    稀有气体或混合物    效应

       Xe             +40％(增强)

       Kr             +14％

       Ar             +16％

       90：10Xe：Kr   +18％

            混合物

上述结果取决于温度、底物浓度及底物类型。在加入不同的竟争 底物后，使用氙得到高达200％的增强作用。

第四类。裂解酶(EC4)

实施例6

结果随温度和〔E/S〕的不同而变化。对于柠檬酸合成酶复合 反应：

          35℃   25℃    10℃

Xe        +32    0       +18

Kr        +32    +6      +37

90：10    0      +16     -32

Ar        -15    -10     +25

Ne        -14    +9      +11

N2       -17    -25     -6

实施例7

    对于具有最适酶浓度的苯丙氨酸解氨酶：

Xe        +18    +3      +5

Kr        +7     +4      +4

90：10    +5     +2      +1

Ar        +6     +1      +3

Ne        -2     +6      -6 

N2       +19     0      +6 实施例8

对亚最适酶浓度的苯丙氨酸解氨酶：

Xe        +14    +8      +11

Kr        +3     +18     +14

90：10    +5     +8      +6 Ar        -1      +1    +6.5 Ne        +15     0     +6 N2       0       0     +12 第V类.异构酶(EC5) 实施例9 磷酸丙糖异构酶，10℃：

稀有气体或混合物    效应

Xe                 +24％(增强)

Kr                 +12

Ar                 +8％(但在25℃时产生

                   -37％抑制)

90：10 Xe：Kr      +6.3％ 实施例10 磷酸葡萄糖异构酶

稀有气体或混合物    效应

Xe                 +186％(下延-61％)

Kr                 +206.4％

Ar                 +232.5％

Ne                 +107％(下延-45％) 下延值是指在正最适底物浓度或温度条件下出现的。

第VI类。连接酶(合成酶)(EC6)

这些酶的活性均提高，但变异很大；有极活跃的位点特点性。

观察到的最大增强作用对观察到最大抑制作用(依赖于温度)：

实施例11

乙酰S-CoA合成酶

在包括水解酶反应的偶联的复合反应系列中：

        Xe         +18.3％/-25.0％

        Kr         +16.1％/-34.6％

        Ar         +67.7％/+34.6％

        Ne         +2.3％/-21.9％

        90/10      +16.1％/-38.5％

        N2        +31.2％/-39.5％

实施例12

作为孤立的反应：

       Xe          +15.4％/-39.5％

       Kr          +5.0％/-52.6％

       Ar          +75.4％/-27.6％

       90/10       +5.0％/-57.9％

       N2         +35.7％/-118.7％

一般在较高温度下发生抑制作用，在低温度发生增强作用。通常 氮在超最适温度时比稀有气体有更小的效应。我们注意到在对于该反 应来说为超最适的条件下，增进这一反应的稀有气体趋向于使反应有 最佳产率和速率。同时在最造条件下得到的混合结果取决于所用的气 体。

下面将参照其他实施例进一步描述本发明，这些实施例只是为了 举例说明之目的，而无意限制本发明。

酪氨酸酶催化的反应：

酪氨酸酶(一元酚，二羟苯丙氨酸：氧，氧化还原酶；EC1. 14.18.1)是一种一元酚单加氧酶，它催化邻-二酚生成邻一 苯醌的反应。

酪氨酸酶在果实褐变和食品腐败中起重要作用。

1.实验方案

1).溶液制备：

在磷酸钠缓冲液(pH6.85，酶的最适pH)中稀释酶(单位 /ml)和底物(μg/ml)以制备10％(W/V)溶液。在水 箱(0-5℃)中保存该溶液，并在2或3天内使用以避免活性丧 失。

2).分光光度装置：用接有IBM  PS/2 30个人电脑 的Perkin-Elmer Lambda 6UV/ViS分光光度仪进行实验 检测。IBM装有两个软件组合(PECSS用于记录和评阅光谱， ENZFIJTER用于动力学研究)。

3).全量程光谱：取得E、S及E+S的全量程光谱以确定追 踪酶促反应的适当波长(相当于主吸收峰的波长)。

4).系列稀释：对E/S、S/E进行系列稀释、以在气体实 验前找出最佳〔E〕/〔S〕比例。根据吸光率读数，选择最好的两 个空白(缓冲液+E或缓冲液+S)。

5).硅密封之小池的制备：用清彻的硅橡胶密封剂封闭1Cm光 程聚乙烯一次性小池。为了得到气密小池，硅应固化48小时。

6).分析样品的制备：借助气密注射器在聚乙烯小池内装入 2ml底物溶液。气密血清瓶内装入酶。在小池和血清瓶内连续吹入 3×10cc气体，两次注射间间隔1小时。将死体积重复置换10 次，以使气体达到最大平衡。在充入适当气体之前，应吹洗所有注射 器和死空间。第3次注射10cc后，将小池和血清瓶在0-5℃水 箱中在两个装有适当气体的cc注射器下放置过夜。

7).对照组：所有可能的干扰参数，包括T、P、其他气体、空 气漏失、材料、气体和试剂质量变异、pH等均须控制。重复进行到 有效位数。

8).分光光度分析：分析前40分钟在小池和血清瓶中充入 10cc气体。用充气的注射器回收0.5ml酶溶液以避免空气接 触。对各样品均同时用注射器注射0.5ml酶，以使反应都在to 时间开始。各在5个不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、 35℃)分析七种气体(空气、O2、N2、Ne、Ar、Kr、 Xe)。记录反应速率和反应终平衡对环境空气的改变。

2.试剂

酪氨酸酶(Sigma Chemical Co.，St.  Louis，Mo)：

商品目录编号。T-7755(批号48F-9610)

·一元酚单加氧酶；多酚氧化酶；儿萘酚氧化酶；一元酚二羟苯 丙氨酸：氧氧化还原酶；EC1、14、18、1)

·得自蘑菇

·25,000单位

12mg固体

2,200单位/mg固体(酪氨酸酶活性)

·酪氨酸酶单位定义：使用L酪氨酸作底物时，在pH6.5、 25℃条件下1单位酶每分钟将使A280增加0.001。反应体 积3ml(1Cm光程)

·在0℃下干燥保存

L-酪氨酸(Sigma Chemical Co.，St Louis，Mo)：

·产品目录编号No、T-3754(批号48F-0833)

·L-3-〔 4-羟苯基〕丙氨酸

·游离碱(pfs)结晶

·无水分子量181.2

·在室温下保存(25℃)

磷酸二氢钾(E K Industies，Addison，IL)

·商品目录编号No.8680

·NaH2 Po4·H2O

·结晶试剂

·FW137.99

磷酸氢二钠(E  K  Industies，Addison，IL)

·商品目录编号No.8720

·Na2HPo4

·无水的

·FW141.96

去离子水H2O(Barnstead NANopureII)

3.溶液制备

磷酸钠缓冲液pH6.85(25℃)：

·138gNaH2pO4·H2O

·142gNa2HPO4

·在20L D.I H2O中

·储存于室温(25℃)下塑料桶内

酪氨酸酶溶液(100μg/ml；208单位/ml，

2.08单位/μg)：

·10％(W/V)，在磷酸钠缓冲液中

·反复颠倒混合几次以溶解内容物

·放在放有铝箔的125mlHDPE瓶中于冰箱(0-5℃) 内保存(以避免光降解)L-酪氨酸溶液(100μg/ml)：

·10％(W/V)，在磷酸钠缓冲液中

·磁力搅拌(25℃，30分钟)

·在250ml琥珀色玻璃瓶中于冰箱(0-5℃)中保存

4.气体：

空气(环境)

氩(Alphagaz，分析纯)

氪(Alphagaz，分析纯，最低纯度99.995％〔ppm〕)

氖(Alphagaz，分析纯，最低纯度99.999％〔ppm〕)

氮(Alphagaz，分析纯，最低纯度99.9995％〔ppm〕)

氧(Alphagaz，分析纯，最低纯度99.997％〔ppm〕)

氙(Alphagaz，分析纯，最低纯度99.995％〔ppm〕)

5.仪器和材料：

5.1仪器

装有自动传输热电的5小池夹持器(5×5样品和参考池储存罐、 参考小池夹持器，C005-0515型)的Perkin-Elmer Lambda 6UV/VIS分光光度仪(窄波带宽度分光光度仪)

Perkin-Elmer Lambda附件连接装置

(691-0000型)

Perkin-Elmer数字控制器(C570-0701型)

Perkin-Elmer温度程序器(C570-0710型)

IBM PS/2 30个人计算机

Epson EX800打印机

软件：   ·IBM DOS(光盘操作系统变型3.30，Boca Raton

FL)

·PECSS(Perkin-Elmer计算机化光谱学软件， Norwalk，CT)

·ENZFITTER(非线性回归数据分析程序，Elsevier- BIOSOFT，Cambridge，UV)

·PIZAZZ PLUS(打印增强软件，APTEC， Repperell，MA)

Mettler AE100天平 ·称重范围：0…109g ·可读性：0.1mg

Barnstead NANopureII柱体去离子化系统，Toky Rikakikai  Co. Micro Tubing pump Mp-3(用于 Perkin-Elmer水冷却测定池)

5.2  材料

100、200ml量瓶

FISHERbrand丙烯酸塑小池(标准型/异丁烯酸酯/UV 级/一次性)：1Cm光程，能够装3ml溶液的正方形小池

100％硅橡胶粘封剂(透明的)

3ml加橡胶盖的血清瓶

1ml一次性血清学移液管(1/100ml)

1cc一次性结核菌素注射器(1/100ml)

10cc一次性注射器

20G11/2，-次性针头 6.技术设计

6.1最初观察：

对酪氨酸酶、L-酪氨酸和酶促反应的终产物进行全量程扫描 (900-190nm)

6.1.1实验构成：

PARAN：吸收率

       缝隙1nm

       扫描速度1,500nm/分钟

       反应时间1秒

       自动储存(Asave)(+)

AZERO：本底校正(900-190nm)

SCAN：数据间隔1.0nm

    温度：室温(26℃)，温度程序控制

    6.1.2全量程扫描：

    〔900-190nm〕扫描酪蛋白酶(图1)：

    样品＝2.5ml酪蛋白酶(100μg/ml)

    空白＝2.5ml磷酸钠缓冲液，

    存储信息名称：T775501.SP

    〔900-190nm〕扫描L-酪氨酸(图2)：

    样品＝2.5mlL-酪氨酸(100μg/ml)

    空白＝2.5ml磷酸钠缓冲液

    存储信息名称：T375401.SP

    〔900-190nm〕扫描终产物(图3)

    样品＝2mlL-酪氨酸(100μg/ml)+0.5ml酪

氨酸酶(100μg/ml)

    20分钟反应后

    空白＝2mlL-酪氨酸(100μg/ml)+0.5ml

磷酸钠缓冲液

    存储信息名称：TCEB0)081.SP

    6.1.3主吸收峰的确定

    为此目的，使用自动记录游标

    酪氨酸酶：吸收峰在275nm(蛋白质)

    L-酪氨酸：吸收峰在275nm

    反应终产物：吸收峰在480nm和305nm

    6.1.4.确定适当波长以进行反应

    重迭三个全程光谱(图5)提示在480和305nm处可得到

L-酪氨酸之酶促氧化还原作用的最适观察结果。

6.1.5.确定适当的〔 E〕/〔S〕比例：

   T-3754        T-7755     磷酸钠    最终

  (100μg/ml)  (100μg/ml)  缓冲液    〔E〕

    (ml)         (ml)       (ml)     (100μg/ml) 样品5    2           0.1         0.4       20 样品4    2           0.2         0.3       40 样品3    2           0.3         0.2       60 样品2    2           0.4         0.1       80 样品1    2           0.5         0.0       100

使用测定池程度器(CPRG)指令进行定时驱动，其可同时记 录多达5个小池的定时驱动(Time-Drive)数据。 

波长480nm：重迭(图6)

          45个点，60秒间隔进行45分钟 TCEB0091.SP    [enz.]＝100μg/ml    小室1 ： TCEB0092.SP    [enz.)＝80μg/ml     小室2 ： TCEB0093.SP    [enz.]＝60μg/ml     小室3 ： TCEB0094.SP    [enz.]＝40μg/ml     小室4 ：

波长305nm：重迭(图7)

          60个点，60秒间隔进行1小时

TCEB010I.SP    [enz.]＝100μg/ml   小室1：

TCEB0102.SP    [enz.]＝80μg/ml    小室2：

TCED0103.SP    [enz.]＝60μg/ml    小室3：

TCEB0104.SP    [enz.]＝40μg/ml    小室4：

TCEB0105.SP    [enz.]＝20μg/ml    小室5：

结论：最适条件是〔E〕/〔S〕(100μg/ml)/ (100μg/ml)，在305nm观察吸光率改变。

6.2预备实验：

6.2.1.样品和参比池的制备：

氙饱和的样品(参见加样步骤)

空气样本：用1ml吸管在丙烯酸小池内加入2ml底物T- 3754，并加盖塑料盖。

其后该步骤由使用塑料盖改为使用硅密封的小池。未见有明显差 异。

参比样品(空白)：丙烯酸小池加盖塑料盖。

·B1：2mlT-3754(100μg/ml)+0.5ml 磷酸钠缓冲液   ·B2：2ml磷酸钠缓冲液+0.5mlT-7755 (100μg/ml)。

6.2.2.于305nm定时驱动

空白B1：

·空气样品：归档名称：TCEBO114.SP

·氙样品：归档名称＝TCEBO115.SP

  空白B2：

·空气样品：归档名称＝TCEBO116.SP

  氙样品：归档名称＝TCEBO117.SP

  发现L-酪氨酸空白(B1)降低吸光率读数，所以优先使用酪

氮酸酶作空白的实验(B2)。

这4个定时驱动(time-drie)实验显示氙的最适抑制曲 线。在继后检测(6.3.7.和7.2.)L-酪氨酸溶液不断消 耗，从而导致吸光率读数衰减。

6.3.技术设计

6.3.1.步骤1：硅密封小池的制备

用干净的硅橡胶密封器密闭一次性丙烯酸小池。使硅干燥24小 时。24小时后，得到气密的丙烯酸小池，用在水下充气试验。

6.3.2.步骤2：底物加样程序

借助1cc注射器(1/100cc)在硅密封的丙烯酸小池内 充入2ml底物

为了得以准确加样，放出注射器内液体并排空空气(其可干扰底 物溶液体积)。

将充满的小池保存在冰箱(0-5℃)中。

在加塑料盖的小池内制备空白B1(2mlT-3754+0.5 ml磷酸钠缓冲液)。其后改为使用硅密封的小池。

6.3.3.步骤3：酶加样程序

借助1ml吸管(1/100ml)在血清瓶内加入2ml酶， 用橡胶隔膜盖住并用铝盖卷曲密封。血清小瓶是不透气的。

充满的血清瓶保存在冰箱(0-5℃)中。

6.3.4.步骤4：气体饱和步骤(氩、氪、氖、氧、氙)

将3×10cc气体连续鼓泡注入硅密封的小池和血清瓶(T- 3754，T-7755)中，注射间等候1小时。此代表了10次 置换气体积，同时达到气体的最大平衡。

在充入适当气体之前弄空所有注射器和死空间。第三次注射10 cc后，在0-5℃冰箱中于两个充有适当气体的10cc注射器 下，将硅密封的小池和血清瓶放置过夜。

6.3.5.附注：

空气样品(酶和底物)不能遭受任何吹泡处理。用普通乙烯盖 (非气密的)封盖丙烯酸小池。再后改为使用硅密封的小池。与密封 的吹入空气的处理多次比较明显两种方法间没有差异。

6.3.6.步骤5：分光光度检测

a.从冰箱中取出硅密封的小池、血清瓶和塑料盖小池。这一步 后来作了改变(见7.1.5.)

b.在硅密封小池和血清瓶内充入10cc气体并在两个10cc 注射器下室温(26°)放置。

c.将小池放在小室储气罐中并使其温度与小室储气罐平衡10 分钟。

d.1cc注射器充入适当气体并用以从血清瓶中抽回0.5 ml酶溶液，以避免在加样(酶)时在小池内引入空气。

e.检测

从小室5至小室1尽可能快地用0.5ml注射器连续向小池内 注入酶(延迟X＝2秒)。该步骤其后改为同时注射。

6.3.7.分光光度检测：在305nm处定时驱动60个 点，60秒间隔检测1小时 检测1：T1＝15℃(Ts＝TR＝15.1℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1TIG2.SP        氖     小室2 B1T1G3.SP        氩     小室3 B1T1G4.SP        氪     小室4 B1T1G5.SP        氙     小室5 检测2：T1＝15℃(Ts＝TR＝15.1℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T1G6.SP       空气    小室1 B1T1G7.SP        氧     小室2 检测3：T2＝20℃(Ts＝TR＝20℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T2G1.SP       空气    小室1 P1T2G2.SP        氖     小室2 B1T2G3.SP        氩     小室3 B1T2G4.SP        氪     小室4 B1T2G5.SP        氙     小室5 检测4：T2＝20℃(Ts＝TR＝20℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B2T2G6.SP        氧     小室1 检测5：T3＝25℃(Ts＝TR＝24.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T3G1.SP       空气    小室1 BIT3G2.SP        氖     小室2 B1T3G3.SP        氩     小室3 B1T3G4.SP        氪     小室4 B1T3G5.SP        氙     小室5 检测6：T3＝25℃(Ts＝TR24.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T3G6.SP        氧     小室1 检测7：T4＝30℃(Ts＝TR＝29.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 BIT4G1.SP       空气    小室1 B1T4G2.SP        氖     小室2 B1T4G3.SP        氩     小室3 B1T4G4.SP        氪     小室4 B1T4G5.SP        氙     小室5 检测8：T4＝30℃(Ts＝TR＝29.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T4G6.SP        氧     小室1 检测9：T5＝35℃(Ts＝TR＝34.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T5G1.SP       空气    小室1 B1T5G2.SP        氖     小室2 B1T5G3.SP        氩     小室3 B1T5G4.SP        氪     小室4 B1T5G5.SP        氙     小室5 检测10：T5＝35℃(Ts＝TR＝34.9℃) 存储资料名称    气体    小室1号 B1T5G6.SP        氧     小室1 7.3.图解结果：

定时驱动重迭/温度——附页

时间驱动重迭/气体——附页 7.最后程序 7.1.最后实验方案： 7.1.1.步骤1：硅密封小池的制备

同6.3.1.，但使硅固化48小时，以除去乙酸蒸气，后者 可干扰对酶的抑制作用。这一点已经过试验证实。 7.1.2.步骤2：底物加样步骤

图6.3.2。

按同样方法(在硅密封的小池中)制备空白B2(2ml磷酸钠 缓冲液+0.5mlT-7755)，但不经过气体饱和步骤(7. 1.4.)。

对照检查显示在工作吸收率范围内任何气体都没有吸收。 7.1.3.步骤3：酶加样步骤

同6.3.3。 7.1.4.步骤4：气体饱和步骤(空气、氩、氪、氮、氧、氙)

在硅密封的小池和血清瓶(T-3754，T-7755)中注 射吹入3×10cc气体，每次气体注射间隔20分钟。

第三次10cc注射后，在0-5℃冰箱中于装有适当气体的两 个10cc注射器下放置过夜。 7.1.5.步骤5：分光光度检测

a.实验检测前40分钟从冰箱内取出硅密封的小池，充入10 cc气体并在两个10cc注射器下室温(26℃)放置。

b.实验检测前25分钟从冰箱内取出血清瓶，充入10cc气 体并在两个10cc注射器下放回冰箱内。

c.检测前15分钟，从硅密封的小室内取出10cc注射器 (及针头)。将小池放入小室夹持器内并使之与小室夹持器温度平衡 10分钟。

d.检测前5分钟，在1cc注射器内充入气体并用于回收血清 瓶中的0.5ml酶溶液，以避免加酶样品时在瓶内引入空气。

e.检测：

从小室气中取出硅密封的小池并开口以排出可能形成的气泡，同 时将小池加温(特别定在30和35℃)，并重新放在小室夹持器 中。

同时用注射器注射0.5ml酶，以使各样同在to时间开始反 应。

7.2分光光度检测：于305nm处定时驱动200个点，18秒 间隔 测1小时 7.2/.检测1：T1＝15℃(Ts＝TR＝15.1℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T1G1.SP       空气    小室1

B2T1G2.SP        氖     小室2

B2TIG3.SP        氩     小室3

B2TIG4.SP        氪     小室4

B2T1G5.SP        氙     小室5 7.22检测2：T1＝15℃(Ts＝TR＝15.1℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T1G6.SP       空气    小室1

B2T1G7.SP        氧     小室2

B2T1G8.SP        氮     小室3 7.2.3.检测3：T2＝20℃(Ts＝TR＝19.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T2G1.SP       空气    小室1

B2T2G2.SP        氖     小室2

B2T2G3.SP        氩     小室3

B2T2G4.SP        氪     小室4

B2T2G5.SP        氙     小室5 7.24 检测4：T2＝20℃(Ts＝TR＝19.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T2G6.SP       空气    小室1

B2T2G7.SP        氧     小室2

B2T2G8.SP        氮     小室3 7.25.检测5：T3＝25℃(Ts＝TR＝24.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T3G1.SP       空气    小室1

B2T3G2.SP        氖     小室2

B2T3G3.SP        氩     小室3

B2T3G4.SP        氪     小室4

B2T3G5.SP        氙     小室5 7.2.6.检测6：T3＝25℃(Ts＝TR＝24.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T3G6.SP       空气    小室1

B2T3G7.SP        氧     小室2

B2T3G8.SP        氮     小室3 7.2.7.检测7：T4＝30℃(Ts＝TR＝29.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T4G1.SP       空气    小室1

B2T4G2.SP        氖     小室2

B2T4G3.SP        氩     小室3

B2T4G4.SP        氪     小室4

B2T4G5.SP        氙     小室5 7.2.8.检测8：T4＝30℃(Ts＝TR＝29.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T4G7.SP       空气    小室2

B2T4G8.SP        氧     小室3

B2T4G9.SP        氮     小室4 7.2.9.检测9：T5＝35℃(Ts＝TR＝34.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T5G1.Sp       空气    小室1

B2T5G2.Sp        氖     小室2

B2T5G3.Sp        氩     小室3

B2T5G4.Sp        氪     小室4

B2T5G5.Sp        氙     小室5 7.2.1.0检测10：T5＝35℃(Ts＝TR＝34.9℃)

存储资料名称    气体    小室1号

B2T5G6.SP       空气    小室1

B2T5G7.SP        氧     小室2

B2T5G8.SP        氮     小室3 7.3.图解结果

时间驱动重迭/温度——附页

时间驱动重迭/气体——附页 7.4.酶动力学：ENZFITTER

根据上述由酪氨酸酶-L-酪氨酸反应得到的结果，可获得下列 结论。

氙可显著抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的速率并抑制反应终平 衡。此外，其他稀有气体则依据它们的溶解度和分子特性以较小程度 抑制反应速率和阻抑终平衡。一般氪的效力与氙相似，但较小，而氩 在低温度下表现有令人惊奇的活性。

另外，可通过使用氮控制氧消耗的效应。当与氩相比较时，发现 氮缺乏与活性部位相互作用的能力。相对氮，氩似乎更活跃。这一点 对于其酶类似乎也是同样的。

因此溶解度差异只能解释这种抑制作用的一部分原因，所以肯定 发生了活性位点相互作用或诱导了蛋白质构象的改变。

动力学实验包括下述内容。

高压实验：

在实际时间中于2个大气压或3个大气压下使溶液饱合后，或在 30.6个大气压及100个大气压在1升气缸中加压1小时或 -24小时后，在用附加试验气体加压的压力小室中进行实验。

使用下列实验设计。

内容：高压对酶的影响

理论：我们将向高压环境引入酶并确定它们的活性。高压应抑制

      酶的活性。 酶：酪氨酸酶(Sigma №.T-7755)(一元酚单加氧

酶；多酚氧化酶；儿茶酚氧化酶；一元酚二羟苯丙氨酸：氧

氧化还原酶；EC1.14.18.1)；得自蘑菇中。 酪氨酸酶单位定义：在3ml含L-酪氨酸的反应混合物中，于

PH6.5和25℃条件下，1单位酶每分钟将使A280增加

0.001。 酪氨酸酶活性：3870U/mg固体； 7.1mg固体 27.440单位 干燥储存于0℃以下。 底物：L-酪氨酸(SIGMA №.T-3754)

L-3-〔4-羟苯基〕丙氨酸

游离碱(pfs)结晶

无水分子量181.2

储存于室温下(25℃) 酶：β-D-葡糖苷酶(SIGMA №.G-4511)

(苦杏仁酶；β-D-葡糖苷葡糖水解酶EC3.2.

1.21)

提取自苦杏仁

单位定义：在PH50和37℃条件下，1单位酶每分钟将

从水杨苷中释放出1.0μmole葡萄糖。

活性：22U/mg固体 12mg固体 264单位 干燥储存于0-5℃ 批号49F-4021

底物：对-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA №.

      N-7006)

      结晶

      含有2.4％溶剂

      无水分子量301.3

      干燥储存于0℃以下

      批号129°F-5057

试验1：1/10/91-4/11/91

气体：1.空气；2.N2

压力：1.30.6大气压(450psi)；2.100.0大

      气压(1470psi)

对照：对照A：酶未经加压并不放在气缸内。

      对照B：酶未经加压但放在气缸1中。

             用气体1(空气)的对照组。

      对照C：酶未经加压但放在气缸2中。

             用于气体2(N2)的对照组。

溶液制备：4/10/91

      溶液A：磷酸钠缓冲液(PH6.6，25℃)，1L去离子

             水

      141.96×0.2×187.5×1/1000＝

      5.3gNa2HPO4

      119.96×0.2×312.5×1/1000＝

      7.5gNaH2PO4

      测得的PH：6.502

溶液B：酪氨酸酶溶液，在磷酸钠缓冲液中(228U/ml)

14.2mgT-7755稀释到240mL磷酸缓冲液(PH

6.6，25℃)中

溶液C：50μg/mlL-酪氨酸溶液。在磷酸钠缓冲液

       中

10mgT-3754稀释到200ml磷酸钠缓冲液(PH

6.6，25℃)中

溶液D：磷酸钠缓冲液(PH6.8，25°)；

2L去离子水

2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g

Na2HPO4

2×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g

NaH2PO4

测得的PH：6.719

溶液E ：100μg/mlβ-D-吡喃葡糖苷溶液，在磷

        酸钠缓冲液中

25mgN-7006稀释到250ml磷酸钠缓冲液(PH

6.8，25℃)

液体F：β-D-葡糖苷溶液，在磷酸钠缓冲液(PH6.8，

       25℃)中，(2.18U/ml)24mgG-

       4511稀释到242ml磷酸钠缓冲液(PH6.8，

       25℃)中。 方法：酪氨酸酶：4/11/91 将100ml等份的酶溶液放入各2个气缸中。在气缸内将气 体摇动数分钟，然后取5ml用于对照B和对照C的样品。将 气缸移向装料台，用适当气体充气；使压力慢慢达到30.6 大气压。使其在所需压力下放置60分钟。使压力缓慢降至 2psi，然后送到实验室。 从各气缸转移约10ml酶，同时放入量杯中使其保持在气体 中并立即在酶/底物混合物上进行TDrive/CPRG分析。 酶1，气体1，压力1，重复1 酶1，气体2，压力1，重复1 将气缸送回装料台并用适当气体再加压到200大气压。使其 在所需压力下放置60分钟。缓慢降低压力至2psi，然后 送入实验室。 从各气缸中转移大约10ml酶，同时将其保持在进入不同烧 瓶的气体下并立刻在酶/底物混合物上进行TDrive/CPRG 分新。 酶1，气体1，压力2，重复1 酶1，气体2，压力2，重复1 β-葡糖苷酶： 用去离子水冲洗气缸。然后用第二酶溶液(葡糖苷酶)冲洗气 缸。在每两个-次性气体气缸中放入25ml等分的酶溶液。将 各气缸中酶摇动数分钟，然后取5ml样品用于对照B和对照C。 将气缸移向装料台，用适当气体充气；使压力慢慢升高到30，6 大气压，在所需压力下搁置60分钟。再缓慢降低压力至2psi，

然后送入实验室。

从各气缸转移约10ml酶，同时放入烧杯中保留在气体下和立

即对酶/底物进行TDrive/CPRG分析。

酶2，气体1，压力1，重复1

酶2，气体2，压力1，重复1

将气缸放回装料台并用适当气体加压至100大气压。

使之在所需压力下搁置60分钟。缓慢降低压力至2psi，然

后送入实验室。

由各气缸转移约10ml酶，同时放入烧杯中继续保留在气体

下，并立即就酶/底物混合物进行TDrive/CPRG分析。

酶2，气体2，压力2，重复1

酶2，气体2，压力2，重复1 分光光度研究：25℃ 小池：最少34个 RARAM：缝隙1

速度1500

Asave  Y

Aprint N CPRG：酪氨酸酶：

305nm

80pts 测20分钟

间隔16秒

Ymin＝0.0

Ymax＝2.0

β-葡糖苷酶：

400nm

40pts

测10分钟

    16移间隔

    Ymin＝0.0

    Ymax＝1.5 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液D 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 小室传送装置：小室1：对照A

          小室2：对照B

          小室3：对照C

          小室4：气体1(空气)

          小室5：气体2(N2) 存储资料：酪氨酸酶： X1P1G1C1…5.SP X1P1G1C1…5.SP也定 名为X1P1E1C1…5.SP至DOS X1P2E1C1…5.SP …5.SP以较高压力开始， 所以我们放出气泡并对所有5个小室进行 全量程扫描： 全量程扫描900-190nm： 存储资料：X1SCAN1…5.SP 10个存储数据 β-葡糖苷酶：X2P1E2C1…5.SP

         X2P2E2C1…5.SP

         10个存储数据 试验2：4/15/91

本试验中我们只作酪氨酸酶的压力试验。

气体： 1.空气；2.N2

压力： 1.30.6大气压(450psi)；

       2.100.0大气压(1470psi)

对照： 对照A：酶未加压力且没有放入气缸中

       对照B：酶未加压力但放入气缸1中。

       用于气体1(空气)。

对照C：酶未加压力但放入气缸2中。

       用于气体2(N2)。 溶液制备：1/10/91

溶液A：磷酸钠缓冲液，在25℃时PH6.6，

1L去离子水

141.96×0.2×187.5×1/1000＝ 5.3gNa2HP4

119.96×0.2×312.5×1/1000 ＝7.5gNaH2PO4

测得PH：6.502

溶液B：在磷酸钠缓冲液中的酪氨酸酶溶液(228U/ml)

14.2mgT-7755稀释到PH6.6(25℃)的磷酸钠缓冲液

中

溶液C：在磷酸钠缓冲液中的50μg/mL L-酪氨酸溶液

10mgT-3754稀释到200mlPH66(25℃)的磷酸

钠缓冲液中。 方法：酪氨酸酶：

将25ml等分的酶溶液分别放入2个一次性气缸中。将各气

缸中的酶摇动几分钟，然后除去5ml样品用于对照B和对照

C。

将气缸移到装料台上，用适当气体充气.将气缸加压并降压几

次以除去液面上气体/残留气体。使压力慢慢升高到30.6

大气压，在所需压力下搁置60分钟。缓慢降低压力至40

psi，然后送入实验室。

从各气缸转移约5ml酶，同时在进入不同烧瓶之气体下保持

之，并立即对酶/底物混合物进行TDrive/CPRG分析。

酶1，气体1，压力1，重复1

酶1，气体2，压力1，重复1

酶1，气体2，压力2，重复2 分光光度研究：25℃ 小池：最少10个 PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint  N CPRG：酪氨酸酶：

  305nm

80pts 测20分钟

    16秒间隔

    Ymin＝0.0

    Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B 试验观察溶液C是否仍然可以使用：

TDrive：305nm，80pts，16移间隔

    S＝2.0mlC+0.5mlB

    R＝2.0mlA+0.5mlD

外存储资料：TYTRL1，SP 小室传输装置：

检测1：100大气压

    小室1：对照A

    小室2：对照B

    小室3：对照C

    小室4：气体1(空气)

    小室5：气体2(N2)

检测2：30大气压

    小室1：对照A

    小室2：对照B

    小室3：对照C

    小室4：气体1(空气)

    小室5：气体2(N2) 存储资料：酪氨酸酶：

      X7P2E1C1…5.SP

      X7P1E1C1…5.SP

      10个存储数据： 试验3：4/24/91(溶液制备和最始加压)，

   4/25/91，4/26/91

本试验中我们作酪氨酸酶的压力试验。

气体：1.空气

      2.N2

      3.Xe：1大气压/N2至压力

压力：1.30.6大气压(450psi)

      2.100.0大气压(1470psi)

对照组：对照A：酶未受高压且不放在气缸中。

溶液制备：H/24/91

    溶液A：磷酸钠缓冲液，在25℃下PH6.8    

    2L去离子水

2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO4

2×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4

    测得PH：6.740

    溶液B：酪氨酸酶溶液，在磷酸钠缓冲液中(228U/ml)

    14.2mgT-7755稀释到240ml磷酸钠缓冲液

           (25℃下PH6.8)中

    溶液C：50μg/mlL-酪氨酸溶液，在磷酸钠缓冲

           液中

    10mgT-3754稀释到200ml磷酸钠缓冲液(在

           25℃PH6.8)中。 方法：酪氨酸酶：4/24/91

气缸制备：当注射50cc去离子水时将气缸(3)放在真空

下，并在放在达60psi的压力下：气缸1充空气，气缸2

充N2，气缸3充N2，摇动、上下颠倒并使释放的压力吹出

气缸内的液体。用50cc磷酸钠缓冲液重复此过程。按上面

所述方法对气缸加压3次以除去其中的所有液体。

注入酶：再次将气缸放在真空下并利用真空注射60cc酪氨

酸酶，以将酶吸入气缸中。气缸按上述方法加压。释放气缸压

力并再反复加压10次以除去其中的O2。

最后加压：用相应气体对气缸1(空气)和2(N2)加压到

30.6大气压。气缸3用Xe加压到1个大气压，然后用

N2加压到30.6个大气压以保存Xe。

时间表：到91年4月14日下午1时气缸加压到30大气

压.因事实上在91年4月25日决定于5℃使用分光光度计

对样品进行不同的实验，所以这一天结束。所以当分光光度计

得以利用时气缸是在25℃下。加压后，加样进行28小时。

直接对这样样品进行光谱/气体分析。 4/25/91重新加压：于91年4月25日下午6时再次对气缸

加压力到100大气压。这些气缸将于91年4月26日2时

加样(再次加压力后20小时)。 分光光度研究：4/25/91，25℃ 小池：最少10个 PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N CPRG：酪氨酸酶：

  305nm

  80pts 测20分钟

    16秒间隔

    Ymin＝0.0

    Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2mL溶液A+0.5mL溶液B 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B 小室传输装置：

检测1：30大气压

    小室1：对照A

    小室2：气体1(空气)

    小室3：气体2(N2)

    小室4：气体3(Xe∶1大气压/N2∶29大气压) 存储信息：酪氨酸酶：

    Y30G1…4.SP

          4个存储信息： 分光光度研究：4/26/91 25℃

   小池：最少10个

  PARAM：缝隙1

         速度1500

         Asave  Y

         Aprint N

   CPRM：酪氨酸酶

         305nm 80pts 进行20分钟

     16秒间隙

      Ymin＝0.0

      Ymax＝2.0

    空白：酪氨酸酶：2mL溶液A+0.5ml溶液B

样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

小室传输装置：

    检测1：100大气压

    小室1：对照A

    小室2：体1(空气)

    小室3：气体2(N2)

    小室4：气体3(Xe∶1大气压/N2∶29大气压) 存储信息：酪氨酸酶：

    Y100G1…4.SP

    4存储信息： 方案：压力对酶的影响   酶：酪氨酸酶(SIGMA№.T-7755)

  (一元酚单加氧酶；多酚氧化酶；儿茶酚氧化酶；一元酚，

  二羟苯丙氨酸：氧氧化还原酶；EC1.14.18.1)

  自蘑菇中得到

  酪氨酸酶单位定义：在3ml含L-酪氨酸的反应混合物

  中，于25℃，PH6.5条件下，每分钟一单位将引起A280

  增加0.001。

  酪氨酸酶活性：3870U/mg固体

  7.1mg固体27.440单位

  干燥储存于0℃以下 底物：L-酪氨酸(SIGMA №.T-3754)

  L-3-〔4-羟苯基〕丙氨酸

  游离碱(pfs)结晶

  无水分子量181.2

  于室温(25℃)储存   酶：β-D-葡糖苷酶(SIGMA№.G-4511)

(苦杏仁酶；β-D-葡糖苷葡糖水解酶EC3.2.1.

21)

得自苦杏仁

单位定义：于PH5.0，37℃下，1单位酶每分钟从水杨

苷中释放1.0μmole葡萄糖。

活性：22U/mg固体 12mg固体 264单位

  干燥储存于0-5℃ 底物：N-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA №.

  N-7006)

  结晶

  含2.4％溶剂

  无水分子量301.3

  干燥储存于0℃以下 试验1：

气体：1.空气

      2.N2

      3.空气

      4.O2

压力：1.2个大气压(30psi) 溶液制备：4/29/91

制备：4/26/91，

      溶液A：磷酸钠缓冲液，PH6.8，25℃

      2L去离子水

2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO4

2×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4

    测得PH：

    溶液B：溶于磷酸钠缓冲液的酪氨酸酶溶液(228U/ml)

    14.2mgT-7755稀释到240mL磷酸钠缓冲液

    (PH6.8，25℃)中

    溶液C：溶于磷酸钠缓冲液的50μg/mL  L-酪氨酸

           溶液

    10mgT-3754稀释到200ml磷酸钠缓冲液(PH

    6.8，25℃)中。

    溶液E：溶于磷酸钠缓冲液的100μg/mL β-D-

           吡喃葡糖苷溶液

    25mgN-7006稀释到250ml磷酸钠缓冲液(PH

    6.8，25℃)中

    溶液F：溶在PH6.8(25℃)磷酸钠缓冲液中的β-D

           -葡糖苷溶液(2.18单位/ml)

    24mgG-4511稀释到242ml磷酸钠缓冲液(PH

    6.8，25℃)中

方法：从分光光度仪中取出小室传输器并装配混合的小室。

      制备丙烯酸小池，首先固定兰色硅塞蕊、针头，然后用通常

      使用的硅氧烷硅化小池的顶部和侧面。使用前放置固化48

      小时。当硅固化时对小池垂直开孔，然后用捆扎胶带环绕塞

      蕊。

      样品制备：4/29/91

      小池内注入两种酶以进行2大气压实验。各小池用适当气体

      充气10×10cc并在冰箱中冷却15分钟，然后进行实

      验。血清瓶内注入5cc相应的酶并在实验前用适当气体充

      气10×10cc。装配分光光度仪以便在所有时间内使各

      气体的连续流发出光谱。安装100psimax压力量计以

      读出小池压力，并安装开/关阀以便能在第二次重复期间对

参考小室加压。在气缸/室管和压力量计之间安装球阀，以

便在分光光度计上直接控制气球。在各管路中放入止回阀以

确保造成反向压力污染小室管或气缸。在实验期间小池保留

2个针头。一个针头接到气体管路上，而第二个则用于引入

酶，然后加塞。由于组装起来太大，所以不可能使用安装好

的分光光度仪的门，而须将它们去掉。对每次光谱分析均制

备一4层厚的黑色毡罩以尽可能减少进入系统的光量。

虽然小池平衡到分光光度计内的温度，但保留在小池中的两

针头仍与10cc注射器相接。在引入酶之前，除去一个注

射器同时将气体管路接到针头上。小气流流过管路时如此安

装以确保没有气体污染。针头保留在液体水平上方。除去第

二个注射器以便恒流通过小池。使用1cc注射器通过第二

个针头注射酶。然后塞住针头，对小池加压并开始实验。 4/29/91 2大气压 参考小室不加压 酪氨酸酶：1.未经空气加压的参考小室或样品。

      2.重复1(参考小室未加压)

        4种气体 葡糖苷酶：1.非经空气加压的参考小室或样品

      2.重复1(参考小室未加压)

        4种气体 分光光度研究：室温 小池：10个 PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N TDrive：酪氨酸酶：新分光光度仪(B)

    305nm 60pts 测15分钟 16秒间隔 Ymin＝0.0 Ymax＝1.6 β-葡糖苷酶：旧分光光度仪(A) 400nm 60pts 测15分钟

    16秒间隔

    Ymin＝0.0

    Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2mL溶液A+0.5mL溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液A 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 外存储信息：4/29/91

酪氨酸酶：

空气参考(非经加压的)：429TYTRL.SP

2大气压(未加压的参考小室)：Y4E1P1G1…7.SP

      葡糖苷酶：

      空气参考(非经加压的)：429GLUTR.SP

      2大气压(未加压的参考小室)：Y4E2P1G1…7.SP

附注：固定之样品小室内的温度没有保持恒定，而直接影响到我们

      的实验结果。我们将除去两个分光光度仪上的固定的小室夹

      持器并换成小室传输装置。

试验2：4/30/91

气体：1.空气；2.N2；

      3.空气；4.O2；

压力：1.2大气压(30psi)

样品制备：重新使用于4/29/91制备的溶液。

方法：按试验1所述组装用于连续气流的分光光度仪。将固定的小

      室夹持器换成小室传输装置以便使用Fisher循环器和数字

      控制器保持温度恒定。我继续便用黑色毡罩以提供适当的光

      线保护。对每种酶均使用四种气体进行非加压气体分析。用

      10×10cc相应气体对小池充气并在冰箱中冷却15分

      钟。当小池放入分光光度仪中时除去用于充气的2个针头。

      使用带有20G11/2针头的1cc注射器将酶引入小

      池。通过硅氧烷塞将针头置入小池但不浸入液体中。以此确

      保如加压气体实验那样将酶引入小池。

      血清瓶内加入5cc相应的酶并在实验分析前充入10×

      10cc适当气体。

小池：酪氨酸酶：对于这种酶使用常用的兰色硅氧烷和捆扎带封闭

      小池。

葡糖苷酶：对于这种酶只使用带兰色硅氧烷的小池。

使用前所有小池均试验加压到32psi。 分光光度研究： 小池：26 PARAN：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N TDrive：酪氨酸酶：新分光光度仪(B)25℃

    305nm

    60Pts 进行13分钟

16移同隔

Ymin＝0.0

Ymax＝1.6

β-葡糖苷酶：旧分光光度仪(A)35℃

400nm 60pts 进行15分钟

16秒间隔

Ymin＝0.0

Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液A 样品：酪氨酸酶2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 存储信息：1/30/91

酪氨酸酶：

    气体分析(未加压的)：Y6E1RSG1…4.SP

    2大气压(参考，未加压的)：Y6E1P1G1…4.SP

    2大气压(参考，加压的)：  Y7E1P1G1…4.SP

葡糖苷酶：

    气体分析(未加压的)：Y6E2RSG1…4.SP

    2大气压(参考，未加压的)：Y6E2P1G1…4.SP

    2大气压(参考加压的)：Y7E2P1G1…4.SP 附注：我们决定使用带兰色硅氧烷塞的小池进行其他压力试验。附

  加常规使用的硅氧烷和捆扎带似乎可降低有兰色硅氧烷之小

  池的气密封口牢固性。 试验3：5/1/91 气体： 1.空气；2.N2；

   3.空气；4.O2； 压力：1.3大气压(45psi) 样品制备：重新使用于4/29/91制备的溶液。 方法：本试验中使用于4/30/91进行之试验2的同样方法。 分光光度研究： 小池：31个 PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N TDrive：酪氨酸酶：新分光光度仪(B)25℃

    305nm

    60pts 测15分钟 16秒间隔 Ymin＝0.0 Ymax＝1.6 β-葡糖苷酶：旧分光光度仪(A)35℃ 400nm 60pts 测15分钟

  16秒间隙

  Ymin＝0.0

  Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液A 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 存储信息：5/1/91

酪氨酸酶：

    气体分析(未加压的)：Y6E1SRG1…4.SP

    气体分析(未加压的)：Y7E1SRG1…4.SP

    3大气压(参考，未加压的)：Y6E1P2G1…4.SP

    3大气压(参考，加压的)：Y7E1P2G1…4.SP

葡糖苷酶：

    气体分析(未加压的)：Y6E2SRG1…4.SP

3大气压(参考，未加压的)：Y6E2P2G1…4.SP

     (使用了新的空白)

3大气压(参考，加压的)：Y7E2P2G1…4.SP 试验4：5/3/91 气体：5.空气；6.Ne；

  7.Kr；  8.Xe； 压力：1.2大气压(30psi) 溶液制备：5/2/91 制剂：4/26/91

      溶液A：PH6.8(25℃)磷酸钠缓冲液

      2L去离子水

2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g Na2HPO4

2×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g NaH2PO4

    测得的PH：

    溶液B：溶在磷酸钠缓冲液中的酪氨酸酶溶液(228U/ml)

    7.1mgT-7755稀释到120ml磷酸钠缓冲液

    (PH6.8，25℃)中

    溶液C：溶在磷酸钠缓冲液中的50Pg/ml L-酪

           氨酸

    10mgT-3754稀释到200ml磷酸钠缓冲液

    (PH6.8，25℃)中

   溶液E：溶在磷酸钠缓冲液的100μg/mlβ-D-

          吡喃葡糖苷溶液

   12.5mgN-7006稀释到125ml磷酸钠缓冲液

    (PH6.8，25℃)中

     溶液F：溶在磷酸钠缓冲液(PH6.8，25℃)中的β-

            D-葡糖苷溶液(2.18U/ml)

    12mgG-4511稀释到121mL磷酸钠缓冲液(PH

    6.8，25℃)中 方法：与试验2和3中使用的方法基本相同，但有两处另外。在将注

  入小池内之后将针头浸入小池中的液体内，并将-般常规使用

  的硅氧烷加在针头周围以防气体从小池内漏出。 分光光度研究： 小池：20个 PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N TDrive：酪氨酸酶：新分光光度仪(B)25℃

    305nm

    40pts 测10分钟 16秒间隔 Ymin＝0.0 Ymax＝1.6 β-葡糖苷酶：旧分光光度计(A)35℃ 400nm 40Pts 测10分钟 16秒间隔

  Ymin＝0.0

  Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液A 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 存储信息：5/1/91

定时驱动(TDrive)以核对浸没的针头并没有造成影响吸

光率的问题。

Drive：40pts，16秒间隔，305nm：

       TYRONEE1.SP

Drive：40pts，16秒间隔，400nm：

       GLUCNEE1，SP

酪氨酸酶：

气体分析(未加压力的)：   Y6E1SRG5…8.SP

2大气压(参考，未加压的)：Y6E1P1G5…8.SP

葡糖苷酶：

气体分析(非加压的)：Y6E2SRG5…8.SP

2大气压(参考，未加压的)：Y6E2P1G5…8.SP 附注：如果针头进入光程，须将它们移到液面以上。这可通过关闭

室内灯光并将毡罩放在分光光度仪中工作的位置中达到。 结果：结果以相对于1个大气压之气体的％抑制率/相对加压后1

个大气体的抑制率来表示。

    对于酪氨酸酶：

    2大气压  3大气压  30.6大气压      100大气压

                      (24小时)(1小时)(-24小时)(1小时) 空气-7.0 & -15.4 -11.6     -37.0   -4.9    -65.8   -11.1 Xe  -76.0/-86.2            -87.0           -85.7 Kr  -84.5/-93.1 Ar  -76.9/-90.4-55.8/-72.1 Ne  -69.0/-84.5 N2 -71.2/-88.5-72.1/-82.6-78.8    -15.4   -84.7   -20.0

     相对效应的变化是很大的。例如，Xe为75％。此明显地说明

单靠压力即可显著抑制酪氨酸酶。

     对于β-葡糖苷酶：

     在3个大气压时，所观察到的增强之程度的改变是：

     空气   0(增强)＞-1 2.5(抑制)

     Xe     +3.1＞    -15.7

     Kr     +2.0＞    -6.2

     Ar     +1.0＞    -13.2

     Ne     +1.0＞    -12.5

     N2    0   ＞    -5.0

从上述结果清楚表明，现有技术报导的稀有气体对水解酶及其他 酶的抑制作用是由于水静压效应。

加氧实验：

向酪氨酸酶中加入氧减小了整个氮的效应。加入氧明显地降低稀 有气体的效应，这显然是因为稀有气体通过上述分子特性影响酶并单 纯地置换溶液中的氧。这一证据可将稀有气体的效应同氮的效应区分 开。另外，加入小量氧可稍微提高酪氨酸酶的活性(如需氧反应所期 望的)，但进一步加入氧不会产生更大效应。因此，氧分压和酶活性 间严格线性关系的报导是有缺陷的，因为它们只说明氧之限制作用的 条件。

向空气中加入氧使酪氨酸酶的活性最大增加6％。

向氙饱和的溶液中加入多达饱和量的氧可使氙的效应从85％抑 制改变为50％抑制。

如上所述向氩饱和的溶液中加入氧，可使氩的效应从82％抑制 改变为12％抑制。

如上所述向氮饱和的溶液中加入氧，可使氮的抑制作用完全消 除，即从84％降到0。

如对于不依赖氧的反应所预略的，向葡糖苷酶反应中加入氧未见 有何影响。加氧没有影响任何一种稀有气体对酶的作用，再次表明稀 有气体对酶的效应取决于它们的分子特性。

气体混合物实验

除试验稀有气体与氮和氧的混合物后，还试验了Kr和Xe的混 合物、Ar与Ar和Xe或Kr的混合物。

对酪氨酸酶所作实验的结果用抑制率对空气对照的比例表示。 混合物＝空气中的％Xe  ％抑制  ＝空气中的％Kr  ％抑制

0                 -75          0           -75

0.1               -72

1.0               -73

5.0               -83

10.0              -81          10.0        -80

50.0              -78          50.0        -78

100.0             -86          100.0       -77

用β-葡糖苷酶得到了相似的结果，其中所有混合物均测得增强 作用，而且这些混合物与Xe、Kr或Ar的结果相同，后者取决于 混合物与纯气体的接近程度。

实验设计：气体混合物

理论：气体混合物将改变酶活性

气体混合物：1.Ar/Xe

            2.Ar/Kr

            1.0.1％

            2.1.0％

            3.5.0％

            4.10.0％

            5.50.0％

酶：酪氨酸酶(SIGMA №.T-7755)

    (一元酶单加氧酶；多酚氧化酶；儿茶酚氧化酶；一元酚二羟

    苯丙氨酸：氧氧化还原酶；ECl.14.18.1)

得自蘑菇

酪氨酸酶定义：在3ml含L-酪氨酸的反应混合物中，于PH

6.5和25℃条件下1单位酶每分钟使A280提高0-001。

酪氨酸酶活性：3870U/ml固体

7.1mg固体     27.440单位

干燥后储存于0℃以下

批号80H9615 底物：L-酪氨酸(SIGMA№.T-3754)

L-3-〔-羟苯基〕丙氨酸

游离碱(pfs)结晶

无水分子量181.2

于室温(25°)下保存

批号59F-0478  酶：β-D-葡糖苷酶(SIGMA №.G-4511)

(苦杏仁酶；β-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC3.2.1.

21)

得自苦杏仁

单位定义：在PH5.0，37℃条件下1单位酶从水杨苷中每

分钟释放1.0μmole葡萄糖。

活性：22U/mg固体

12mg固体  264单位

干燥储存于0-5℃下

批号49F-402 底物：对-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(SIGMA №.

  N-7006)

  结晶体

  含有2.4％溶剂

  无水分子量301.3

  干燥储存于0℃以下

  批号129F-5057 溶液制备： 制备：4/15/91溶液A：磷酸钠缓冲液(PH6.6，25℃)

     1L去离子水

141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3g Na2HPO4

119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5g NaH2PO4制备：4/17/91溶液B：溶于磷酸钠缓冲液的酪氨酸酶溶液

     (228U/ml)

     14.2mgT-7755稀释到240ml

     磷酸钠缓冲液(PH6.6，25℃)中 制备：4/17/91溶液C：溶于磷酸钠缓冲液中的50μg/ml

     L-酪氨酸

     10mgT-3754稀释到200ml磷酸

     钠缓冲液(PH6.6，25℃)中 制备：4/10/91溶液D：磷酸钠缓冲液，25℃下PH6.6

     2L去离子水

    2×141.96×0.2×245×1/1000＝13.91g

    Na2HPO4

    2×119.96×0.2×255×1/1000＝12.20g

    NaH2PO4制备：4/15/91  溶液E：溶于磷酸钠缓冲液的100μg/ml

           β-D-吡喃葡糖苷溶液

           25mgN-7006稀释到250ml磷酸

           钠缓冲液(PH6.8，25℃)中 制备：4/17/91  溶液F：溶于磷酸钠缓冲液(PH6.8，

           25℃)的β-D-葡糖苷酶溶液

           (2.18U/ml)

           24mgG-4511稀释到242ml磷酸

           钠缓冲液(PH6.8，25℃)中 方法：

4/17/91：制备溶液，确认小池不透气后用空气吹净、充填

         小池并置入冰箱保存，制备加酶血清瓶并制备充

         气瓶。

4/18/91：气体混合物制备：在120cc血清瓶内混合充

         入的气体。以真空吹洗这些小瓶，此时瓶中保留

         1大气压的氩。以此方法将小瓶吹洗20秒钟。

         小瓶在稍高压力下以通过针头释放压力。这样被

         认为有120cc氩。然后使用30cc注射器 和针头将必需体积的氩和待与之混合的气体(Xe或Kr) 引入瓶内。   ％      氩     Xe/Kr 0.1％    120cc   0.2cc 1.0％    118cc   2.4Cc 5.0％    108cc   12cc 10％     96cc    24cc 50％     0cc     120Cc 试验1：

我们通过排出8×10cc小瓶气体使用1瓶气体混合物对酶进

行充气。我们通过排出8×10cc小瓶气体使用第二瓶气体混

合物对小池/底物充气。

我们以下列气体充填酶加样注射器：

酶          气体

Ar           Ar 

Xe           Xe

0.1％A/Xe    Ar

1.0％Ar/Xe   Ar

5.0％Ar/Xe   Ar 小室传输装置： 气体混合物：Ar/Xe，1次重复 检测1：小室1：Ar

   小室2：Xe

   小室3：Ar/Xe 0.1％

   小室4：Ar/Xe 1.0％

   小室5：Ar/Xe 5.0％

   (重复1：R1) PARAN：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N CPRG：酪氨酸酶：25℃

  305nm

  80Pts 测20分钟 16秒间隔 Ymin＝0.0 Ymax＝2.0 β-葡糖苷酶：35℃ 400nm 60Pts 测15分钟 16sint Ymin＝0.0 Ymax＝1.5 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液D 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 存储信息：酪氨酸酶：X9R1G1M1…5.SP

      葡糖苷酶：X0R1G1M1…5.SP 试验1的结果：

我们发现在我们酪氨酸酶试验中有空气污染并推测葡糖苷酶也

这样的。我们确定将不能从1个瓶中回收8×10cc气体混

合物。因此我们决定每小池制备2瓶用于充气的气体混合物，

并且每种酶用2瓶气体混合物，这样我们就能够对每小池/瓶

提供10×10cc气体混合物。 试验2：对人对每小池使用2瓶气体混合物进行第二次充气，且对

每种酶充2瓶混合气体。然后继续使用后两种气体混合物

(10％和50％)进行充气。

气体混合物：Ar/Xe，1次重复 小室传输装置：

检测2：小室1：空气

       小室2：Xe

       小室3：Ar/Xe 10.0％

       小室4：Ar/Xe 50.0％

       小室5：空气

       (重复1：R1) PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N CPRG：酪氨酸酶：25℃

  305nm

  80Pts 20分钟 16s   int Ymin＝0.0 Ymax＝2.0 β-葡糖苷酶：35℃ 400nm 60Pts 15分钟

16s    int

Ymin＝0.0

Ymax＝1.5 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液D 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B

  β-葡糖苷酶：2ml溶液E+0.5ml溶液F 试验2的结果：

酪氨酸酶试验给出了一个我们预期的离散的结果，因此推断

我们的新充气方法是恰当的，并且将继续这种方式充气。葡

糖苷酶并没有出现大的分离，因此因时间紧迫而将重点放在特

定使用10％和50％气体混合物的酪氨酸酶实验分析上。 检测3：小室1：空气

   小室2：Xe

   小室3：Ar/Xe 10.0％

   小室4：Ar/Xe 50.0％

   小室5：空气(重复2，R2) 存储资料：酪氨酸酶：X9R2G1M6…0.SP

我们制备了如上所述的Ar/Kr混合物并2次重复试验

10％和50％混合物。 检测4/5：小室1：空气

     小室2：Kr

     小室3：Ar/Kr 10.0％

     小室4：Ar/Kr 50.0％

     小室5：空气

     (重复1，2：R1，R2) 存储资料：酪氨酸酶：

      X9R1G2M6…0.SP

      X9R2G2M6…0.SP 结果：用Ar/Xe所得结果看上去要比用Ar/Kr所得结果

  好。我们将继续使用10％和50％混合物进行两种混合物

  的重复试验。时间允许我们只对酪氨酸酶进行两种气体之

  0.1％、1％和5％混合物的重复试验。 4/19/91：对酪氨酸酶在一个分光光度仪上进行2次Ar/

     Xe重复试验，并在另一个分光光度仪上进行

     Ar/Kr试验。 新分光光度仪： 检测1：小室1：空气

   小室2：Xe

   小室3：Ar/Xe 10.0％

   小室4：Ar/Xe 50.0％

   小室5：空气

   (重复3：R3) 检测2：小室1：空气

   小室2：Xe

   小室3：Ar/Xe 10.0％

   小室4：Ar/Xe 50.0％

   小室5：空气

   (重复4：R4) 旧分光光度仪： 检测1：小室1：空气

   小室2：Kr

   小室3：Ar/Kr 10.0％

   小室4：Ar/Kr 50.0％

   小室5：空气

   (重复3：R3) 检测2：小室1：空气

   小室2：Kr

   小室3：Ar/Kr 10.0％

   小室4：Ar/Kr5 0.0％

   小室5：空气

   (重复4：R4) PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asare  Y

   Aprint N CPRM：酪氨酸酶：25℃

  305nm 80Pts 进行20分钟

16s   int

Ymin＝0.0

Ymax＝2.0 空白：酪氨酸酶：2ml溶液A+0.5ml溶液B 样品：酪氨酸酶：2ml溶液C+0.5ml溶液B 存储资料：Ar/Xe：

      X9R3G1M6…0.SP

      X9R4G1M6…0.SP 10份存储资料 Ar/Kr： X9R3G2M6…0.SP X9R4G2M6…0.SP 10份存储资料 时间允许我们只能进行下列检测：

新分光光度仪：

检测3：小室1：空气

       小室2：Xe

       小室3：Ar/Xe 0.1％

       小室4：Ar/Xe 1.0％

       小室5：Ar/Xe 5.0％

       (重复3：R3) 存储资料：Ar/Xe

      X9R2G1M1…5.SP

      X9R3G1M1…5.SP

      10份存储资料

因此可见，本发明总地提供了通过使-种或多种酶与含有一种或 多种稀有气体或其混合物的气体接触以调节酶活性的方法。

根据本发明，被调节的酶可以是单一的、分离的酶，或者是包括 混合物的一种或多种酶。例如，根据本发明，可通过选择性地抑制一 种或多种酶的活性及选择性地提高一种或多种酶的活性来调节酶的混 合物。

再者，可根据本发明在从液氮沸点(约-200℃)到大约 120℃的温度范围内调节酶促活性。

根据本发明，任何酶可使用本发明的稀有气体进行调节。然而， 通过选择适当的PH、温度、压力、〔E〕和〔S〕等条件，可用本发 明的任何一种希有气体调节所有的酶。另外，本领域的技术人员可利 用上文公开的技术内容及原则来确定适合于任何所研究之特定酶体系 或混合酶体系的最适PH、温度、压力、〔E〕及〔S〕。

以下更详细地讨论本说明书的附图。

图1显示2.5ml酪氨酸酶(100μg/ml)对2.5ml 磷酸钠缓冲液(PH6.85)的吸收光谱。

图2显示2.5mlL-酪氨酸(100μg/ml)对2.5ml 磷酸钠缓冲液(PH6.85)的吸收光谱。

图3显示在所指定的浓度和PH下，用L-酪氨酸作空白的酪氨酸 酶和L-酪氨酸的吸收光谱。

图4显示随着酪氨酸酶浓度的变化(40、60、80和100 μg/ml)，反应进行结果的交迭，表明直接线性一级酪氨酸酶浓 度依赖性。

图5显示使用所指出的浓度和PH，等量(W/W)氙对酪氨酸酶 的抑制。

图6显示在26℃时氙对酪氨酸酶的很大抑制作用，并给出约略 的估计(空气面积变动曲线＝11217μ，氙＝3037μ，总计 ＝14254μ，％总空气面积＝78.69％，氙＝21.31， 氙总面积＝空气面积的27.08％，氙对空气速度的抑制＝ 72.92％)。相对于其他常规酶抑制剂这一抑制率是很大的。

图7显示在15℃时，氙轻度抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的 平衡；氙具有较小但明显的抑制作用，氖和氪则表现出很大的抑制作 用。氧和空气差不多有同样效应。

图8显示在20℃时，氙强烈抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反应， 而其他气体氖、氪和氩都是有效的抑制剂。

图9显示氧对酪氨酸酶-L-酪氨酸反应只有中度抑制作用。

图10显示在20℃时氩对酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的强抑制 作用，同时氩也有几乎相等的效应。但所指出的其他气体也是有效的 抑制物。

图11显示氧对25℃时的酪氨酸酶-L-酪氨酸反应只有轻度 抑制作用。

图12显示在30℃时氖、氩、氪和氙对酪氨酸酶活性的抑制作 用。

图13显示30℃时氧对酪氨酸酶-L-酪氨酸反应的抑制效 应。

图14显示在空气中进行的标准酪氨酸酶-L-酪氨酸反应，表 明速率反应直接归因于氧溶解度差异。用氧代替空气所得曲线完全相 同。

图15说明氖的抑制效应是温度依赖性的。

图16显示氪抑制酪氨酸酶的能力与温度之间是直接反(付)相 关的。

图17显示氙比其他气体能更强地抑制酪氨酸酶-L-酪氨酸反 应的平衡，但只与氪和氩一样抑制该反应的速率。另外，曲线形状的 变异性高，此提示直接活性位点与酪氨酸酶的相互作用。氙与温度有 相反的相互作用，且在20℃和25℃间共有效应的动态转换。

图18显示在20℃时氩、氙和氖均显著地抑制酪氨酸酶活性， 而氪具有较小效应。氮也可很有力地抑制该反应，但氧的抑制作用很 小。

图19显示在25℃时氩以比其他稀有气体较小的水平发挥抑制 作用，而氧则提高反应速率。由于范德华排斥力和氧稀释的可能的相 对影响，而使氪-氙和氖-氩曲线对间的小的曲线差异有很高显著 性。

图20显示在30℃时，氧因为减小了溶解度而不再提高酪氨酸 酶活性。氙比其他气体更好地抑制反应，但所有这些气体都是有效 的。

图21显示氙对酪氨酸酶活性的抑制作用，同时在20℃和 25℃间有活性转换。

图22显示氩对酪氨酸酶活性的抑制，表明在20℃时氩比氖有 更大抑制作用，但在25℃时则比氖的抑制作用小。这些差异被认为 直接归因于溶解度/氧扩散能力。

图23显示氪对酪氨酸酶活性的抑制作用，同时可见在20℃和 25℃间有活性转换。这一点为气体和酶活性位点间的直接相互作用 提供了强有力的证据。

图24显示氙在对酪氨酸酶活性的抑制中至少存在两次活性转换。 第一次活性转换是在25℃和30℃之间，第二次是在30℃和35℃ 间。在20℃和25℃间可能存在第三次活性转换。这些转换为气体 与酶活性位点间的直接相互作用提供了强有力的证据。

图25显示单纯由参予从溶液中置换氧之溶解度机制对酪氨酸酶 的抑制。空气显示出期望的解离一驱动速度图形，而氧在30℃即饱 和。

图26显示氮对酪氨酸酶活性的抑制。氮只能通过参予从溶液中 置换氧的溶解度机制抑制酶，但在抑制酪氨酸酶活性中是有效的。在 20℃后出现转换最大值。氮曲线和稀有气体曲线间的差异代表了潜 在的活性位点抑制作用。在大多数情况下，这些差异对每种气体至少 在一个温度下是有意义的。

图27显示氙在20℃和25℃间的活性有很大差异。这些差异 与酶活性位点之最适温度相对应。

图28显示氪、氙、氩和氪与氙的混合物对α-谷氨酰转肽酶的 抑制作用。

图30显示氪、氙、氩和氪与氙的混合物对天冬氨酸氨基转移酶 的抑制作用。

图31显示SF6、氩、氮、氖和氧对α-D-葡糖苷酶活性的 增强作用。

图32显示氖、氧和氮对苯丙氨酸解氨酶的增强作用。

图33显示氙和氪对柠檬酸合酶活性的增强作用以及氩对该酶的 抑制作用。

图34显示氙、氪、氩和氪与氙的混合物在10℃下对磷酸葡萄 糖异构酶活性的增强作用。

图35显示氖和氮在25℃下对磷酸葡萄糖异构酶活性的增强作 用，以及氧对该酶的抑制作用。

图36显示在25℃下氪和氪与氙的混合物对S-乙酰CoA合 成酶活性的增强作用。

图37显示在100大气压下空气和氮对β-葡糖苷酶的抑制作 用。这种作用主要是因于高压力对酶的损伤。

图38显示在30大气压下空气和氮对β-葡糖苷酶的抑制作 用。这种效应同样是因高压力对酶的损伤。

图39显示在30大气压下空气、氙和氮对β-葡糖苷酶活性的 抑制作用。这种效应是由于高压力对酶的损伤。

图40显示在100大气压下空气、氙和氮对酪氨酸酶的抑制作 用。这种效应是由于高压力对酶的损伤。

图41显示酶-底物浓度影响稀有气体之增强和抑制作用的结 果，如以β-D-葡糖苷酶活性为例所证实的。S1、S2和S3代 表三个不同的和递增的底物浓度。这一结果是有利的，因为它意味着 可改变已有的生物工艺方法以降低酶和/或底物的成本，甚或可有利 于发生目前不可能的反应。

图42显示在10℃下氙和氖分别在增强然后抑制乳酸脱氢酶中 的不同效应。这一结果是有利的，因为它意味着可根据所选用的气体 增强或抑制已知酶的活性。

图43显示即使在高温度下仍可观察到本发明方法的效力。特别 是在60℃下，氩、氮和氙可增强而氪则抑制α-葡糖苷酶活性。很 显然，在60℃下氩是这种酶的强有力增强剂。

图44显示氙在25℃下在增强固相化β-葡糖苷酶之酶促活性 中的作用。

如上面提到的，可根据本发明在从液氮之低温度(约-200℃) 到大约120℃的宽温度范围内调节酶促活性。另外，所使用的气体 或气体混合物的压力可从大约10-8大气压的超真空低压高至大约 100大气压。但也可望能使甚至更低或更高的压力。一般多使用从 大约10-3和3大气压的气体压力。且最常用的从大约10-2至 2大气压的气体压力。

如上所述，不管所选择的酶和酶的形式怎样，本发明在调节酶促 活性中都是有效的。提供下列实施例以举例说明本发明在调节固相化 酶之酶促活性中的效能。

设计：固相化酶

理论：同样气体可作用于游离的或固相化的酶。

气体：1.空气；2.氙

酶：β-D-葡糖苷酶(SIGMA №.G-0898)

      (β-D-葡糖苷葡糖水解酶E(3.2.1.21)得

      自Caldocellum sacharolyticum ：在大肠杆菌中

      表达的重组体(pfs)

      冻干粉末

      热稳定性酶，70℃下半寿期为38小时

      单位定义：在PH50，37℃下1单位酶每分钟从水杨苷

      释放1.0μmole葡萄糖

      活性：46U/g固体

      10.87g固体 500单位

      干燥储存于0-5℃下

      批号50H0251 底物：对位硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷酶(SIGNA №.

  N-7006)

  结晶体

  含有2.4％溶剂

  无水分子量301.3

  干燥储存于0℃以下

  批号129F-5057 溶液制备： 制备：5/21/91，溶液A：磷酸钠缓冲液(PH6.6，25℃)

  1L去离子水

  141.96×0.2×187.5×1/1000＝5.3g Na2HPO4

  119.96×0.2×312.5×1/1000＝7.5g NaH2PO4制备：5/21/91；溶液B：溶于磷酸钠缓冲液的100μg/ml

                  β-D-吡喃葡糖苷溶液

  25mgN-7006稀释到250ml磷

  酸钠缓冲液(PH6.6，25℃)中 制备：5/21/91，溶液C1：溶于PH6.6(25℃)磷酸

                   钠缓冲液中的β-D-葡糖苷

                   酶溶液(2.18U/ml)

  1gG-0898溶解在21ml磷酸钠

  缓冲液(PH6.6，25℃)中

  (对于不溶性酶冻干粉末，按SIGMA推荐

  的方法以所需量悬浮于水中(5-10mg

  固体/ml水)，以使之简单水合)。

  我们得以进行简单水合作用(直到溶液显

  现)

  400nm

  80Pts

  160s    int

  Ymin＝0.0

  Ymax＝3.0 空白：2ml溶液A+0.5ml溶液C1 样品：2ml溶液B+0.5ml溶液C1 存储资料：G0898G1…4.SP *试验2：5/22/91 小室传输装置：

2次重复

检测操作：小室1：空气

          小室2：空气(重复)

          小室3：Xe

          小室4：Xe(重复) PARAM：缝隙1

   速度1500

   Asave  Y

   Aprint N CPRG：β-葡糖苷酶：25℃

  400nm

  120Pts

  16s    int

  Ymin＝0.0

  Ymax＝1.0 空白：2ml溶液A+0.5ml溶液C2 样品：2ml溶液B+0.5ml溶液C2 存储资料：2G0898G1…4.SP

为了进一步说明本发明及由之获得效应，进行下述动力学分析。

动力学分析

如前面举例说明的吸光率曲线数据，揭示了在不同气压下酶促活 性在产率和速率两个方面的差异。可在达到平衡后通过比较曲线差异 来计算产率，但也可使用计算速率所需的外形线性化和计算法计算。 使市场上出售的计算机程序(ENZFITTER，GRAFIT， ENZPACK，PEAKFIT)〔用于将初始Uv/vis吸光 率数据曲线(在这些例子中为动力曲线)转化成直线(动力曲线的线 性回归)〕计算速率差异。这些线可表达为一个数学方程式，其中斜 率接近于速率，极限Y轴截距为近似产率。这些数据可在进一步处理 后推导出Michaelis-Menten或其他标准生物化学关系式(以 图解或数学式表示)，进而可由之准确地推导出速率和产率。下面所 述的实例和附图将以举例形式说明这些步骤。

图45图解说明在空气下，有5个不同的底物浓度时β-葡糖苷 酶的Uv/vis吸光率动力曲线。

表1说明米-曼氏(Michaelis-Menten)酶动力学方程的 Vmax和Km计算值，以及各反应的速率。Vmax是极限速率，Km 是米-曼氏常数。

图16和表2说明与图45和表1相同的结论，但它们针对氙反 应的。从中很容易看出，氙的Vmax和Km更大。

图47、表3、图48和表4图解说明上述空气和氙充气反应的 一级动力曲线回归速率线性转化，显示其近似于米-曼氏方程数据， 其中Xe/空气速率关系式有如上所述的同样比例。

图49、图50和表5图解说明该实验中研究的所述气体均有同 样的一级速率近似回归线性化特征。在此情况下，只有氙在动力曲线 分析中显示了明显的增强作用，但线性化处理后则清楚地表明其他气 体也增强反应。

图51、表6、图52和表7图解说明得自单一酪氨酸酶实验中 前160秒钟的数据，这些数据均作为以空气然后以氙充气所得到的 动力曲线来表示。线性化速率回归表明，而且经米-曼氏方程式计算 进一步证实，氙强烈地抑制酪氨酸酶活性。

        表    1 气体1：空气 酶动力学 样品称重 拆算×平方＝0.0000 变量            数值    标准误 Vmax           0.0025   0.0002 Km             -3.1783  2.6341

    X        Y

  〔S〕    速率G1   计算值 1    20.0000   0.0029   0.0029 2    40.0000   0.0028   0.0027 3    60.0000   0.0025   0.0026 4    80.0000   0.0030   0.0026 5    100.0000  0.0022   0.0026 其余各组数据在上述附图中以图解方式给出。

表    2 气体5：氙 酶动力学 样品称重 拆算×平方(Reduced Chi squared＝0.0000) 变量             数值    标准误 Vmax            0.0028   0.0001 Km              -2.4539  1.3570

   X          Y

 〔S]       速率G5   计算值 1    20.0000    0.0032   0.0032 2    40.0000    0.0029   0.0029 3    60.0000    0.0027   0.0029 4    80.0000    0.0030   0.0029 5    100.0000   0.0029   0.0028

       表    3 〔S〕＝60微克/ml 一级速率方程 样品称重 折算×平方＝0.0002 变量               数值    标准误 极限              0.8021    0.0146 速度常数          0.0032    0.0001

   X            Y

  时间        吸光率    计算值  1    0.0000      0.0471    0.0000  2    15.0000     0.0777    0.0377  3    30.0000     0.1071    0.0737  4    45.0000     0.1346    0.1080  5    60.0000     0.1626    0.1406  6    75.0000     0.1890    0.1717  7    90.0000     0.2136    0.2014  8    105.0000    0.2386    0.2296  9    120.0000    0.2623    0.2566 10    135.0000    0.2849    0.2822 11    150.0000    0.3067    0.3067 12    165.0000    0.3287    0.3300 13    180.0000    0.3485    0.3522 14    195.0000    0.3691    0.3734 15    210.0000    0.3881    0.3935 16    225.0000    0.4066    0.4128 17    240.0000    0.4244    0.4311 18    255.0000    0.4414    0.4485 19    270.0000    0.4579    0.4652 20    285.0000    0.4741    0.4810 21    300.0000    0.4897    0.4961 22    315.0000    0.5044    0.5105 23    330.0000    0.5190    0.5242 24    345.0000    0.5325    0.5373 25    360.0000    0.5448    0.5498 26    375.0000    0.5569    0.5616 27    390.0000    0.5687    0.5730

                    表    4 〔S〕＝60μg/ml 一级速率方程 样品称重 折算×平方＝0.0014 变量             数值            标准误 极限             0.8382          0.0228 速度常数         0.0045          0.0003   X    Y

  (时间)    (吸光率〔S3〕)   计算值  1    0.0000     0.1261          0.0000  2    1.5.0000   0.1590          0.0544  3    30.0000    0.1928          0.1053  4    45.0000    0.2217          0.1529  5    60.0000    0.2514          0.1974  6    75.0000    0.2811          0.2390  7    90.0000    0.3085          0.2779  8    105.0000   0.3349          0.3143  9    120.0000   0.3608          0.3483 10    135.0000   0.3831          0.3801 11    150.0000   0.4065          0.4099 12    165.0000   0.4300          0.4377 13    180.0000   0.4511          0.4637 14    195.0000   0.4719          0.4880 15    210.0000   0.4940          0.5108 16    225.0000   0.5112          0.5320 17    240.0000   0.5311          0.5519 18    255.0000   0.5503          0.5705 19    270.0000   0.5675          0.5879 20    285.0000   0.5842          0.6042 21    300.0000   0.6011          0.6194 22    315.0000   0.6165          0.6336 23    330.0000   0.6313          0.6469 24    345.0000   0.6460          0.6593 25    360.0000   0.6588          0.6709 26    375.0000   0.6711          0.6818 27    390.0000   0.6834          0.6919

       表    5 气体1：空气 1级速率方程 样品称重 折算×平方＝0.0002 变量              数  值    标准误 极限              0.8021    0.0146 速度常数          0.0032    0.0001

   X            Y

  时间       吸光率G1   计算值  1    0.0000      0.0471    0.0000  2    15.0000     0.0777    0.0377  3    30.0000     0.1071    0.0737  4    45.0000     0.1346    0.1080  5    60.0000     0.1626    0.1406  6    75.0000     0.1890    0.1717  7    90.0000     0.2136    0.2014  8    105.0000    0.2386    0.2296  9    120.0000    0.2623    0.2566 10    135.0000    0.2849    0.2822 11    150.0000    0.3067    0.3067 12    165.0000    0.3287    0.3300 13    180.0000    0.3485    0.3522 14    195.0000    0.3691    0.3734 15    210.0000    0.3881    0.3935 16    225.0000    0.4066    0.4128 17    240.0000    0.4244    0.4311 18    255.0000    0.4414    0.4485 19    270.0000    0.4579    0.4652 20    285.0000    0.4741    0.4810 21    300.0000    0.4897    0.4961 22    315.0000    0.5044    0.5105 23    330.0000    0.5190    0.5242 24    345.0000    0.5325    0.5373 25    360.0000    0.5448    0.5498 26    375.0000    0.5569    0.5616 27    390.0000    0.5687    0.5730

                表    6 气体1：空气 酶动力学 样品称重 折算×平方＝0.0000 变量              数值    标准误 Vmax            0.0003    0.0003 Km              -17.0661  3.5059

   X          Y

 〔S〕    气体1：空气 计算值 1    10.0000    0.0018    -0.0004 2    20.0000    0.0019    0.0021 3    30.0000    0.0011    0.0007 4    40.0000    0.0018    0.0005 5    50.0000    0.0018    0.0005

        表    7 气体5：氙 酶动力学 样品称重 折算×平方＝0.0000 变量               数值         标准误 Vmax               0.0001       0.0003 Km                 -27.9623     6.3527

    X             Y

  〔S〕        气体5：氙    计算值 1    10.0000       0.0007       -0.0001 2    20.0000       0.0019       -0.0003 3    30.0000       0.0019       0.0017 4    40.0000       0.0019       0.0004 5    50.0000       0.0004       0.0003

因此，本发明提供了一种调节任何形式的任何一种酶之酶促活性 的方法。另外，这种调节作用可在所指出的宽温度和压力范围内进 行。

如前面已提到的，用本发明方法调节的酶例如可以是在含水或有 机溶液中，呈固相化形式、在分散剂中或在任何一种有机基质(如凝 胶)中。这样的溶液、固相化形式、分散剂或有机基质是本领域技术 人员已知的。

再者，根据本发明，可通过抑制其中一种或多种酶或增强其中一 种或多种酶活性来调节酶的混合物。还有可能同时抑制混合物中的一 种或多种酶和增强一种或多种酶来进行调节。

另外，本领域技术人员可根据上文中提到的本发明内容及原则来 确定用于调节所研究之特定酶体系或混合酶体系的最适PH、温度、 压力、〔E〕和〔S〕水平。

例如，当购买酶并使用已知的参考手册时，可针对所研究的特定 酶体系或混合酶体系来确定最适PH、压力、温度、〔E〕和〔S〕 的最适条件。例如参见Sigma Chemical Company1990和 1991年的商品目录，以及Dixon和Webb的Enzymes(第三 版，Willey，1979)。本领域技术人员可基于上述知识，然 后利用本发明公开的技术内容确定最佳气体混合物、温度及压力， 以便按照本发明得到预期效果。

基于已公开的上述内容，本领域技术人员虽然可在不违背本发明 之精神和范围的前提下进行许多改动和改进。