[0001] 本发明涉及用多顺反子基因共表达的生物合成β-胡萝卜素的融合多核苷酸以及用其生产β-胡萝卜素的方法。更具体地，它涉及一种编码八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的融合多核苷酸，以及用该方法生产β-胡萝卜素的方法。

[0002] 随着分子生物学技术的发展，已经开发了多种基因工程方法以生产有用的代谢物质并且将所述物质修饰为有效形式。在实践中，已完成了许多有关植物代谢工程和植物分子农事的研究。所述植物代谢工程利用植物作为媒介，所述植物分子农事生产来自非植物的高附加值非植物可食用疫苗和来自植物用于药用等的重组蛋白。然而，存在各种技术困难并且研究结果也不成功。

[0003] 尤其为了调控代谢过程，可在一定条件下同时表达若干基因。目前，在本领域中刚开始尝试使用烟草报告子基因的模型研究。与原核生物相比，调控真核生物如植物和动物中的多顺反子基因表达较为困难。真核生物具有通过单顺反子mRNA机制从一个启动子只表达一个基因的特性。

[0004] 通常，农杆菌(Agrobacterium)用于通过插入T-DNA来转化植物。在这种情况下，通常进行(1)在一个T-DNA中引入多个盒；(2)农杆菌的共转化；(3)转化体之间的有性杂交；和(4)将多顺反子基因插入到盒中，以同时引入和表达多顺反子基因。

[0005] 精确地，在一个T-DNA中引入多个盒的方法被普遍使用。不幸的是，用一个T-DNA载体很难表达两个以上的不包括选择性标记基因的目标基因，因为用于转化的盒的总数仅限于3或4。此外，当进行所述农杆菌介导的共转化时，每个T-DNA均应具有不同的选择性标记以选择转化体。在这种情况下，所述选择性标记可为一种阻碍植物转化的限制性因素。因此，这种方法对应用领域进行了不利的限制。

[0006] 通过使用转化体之间的有性杂交堆积基因的方法可将每个个体的有用性状收集到一株植物中。然而，这种方法需要消耗很长时间并且难以精确控制结果。

[0007] 此外，在进行代谢工程研究之前已经尝试了将多顺反子基因引入盒并获得对抗应激或疾病的复合抗性的方法。在这种方法中，应用了蛋白表达的真核生物机制从而将真核细胞的特异识别位点引入目标基因之间。

[0008] 技术问题

[0009] 本发明的发明人已经尝试了开发遗传工程植物。发明人已经通过使用多顺反子基因表达技术生产了可表达具有生物活性的β-胡萝卜素的融合多核苷酸和含有该融合基因的重组载体。通过使用所述融合多核苷酸和所述重组载体，发明人还在水稻中开发了生产营养β-胡萝卜素的植物转化体，尽管天然条件下水稻根本不能表达类胡萝卜素，并且成功地完成了本发明。

[0010] 因此，鉴于上述问题进行了本发明，本发明的一个目标就是提供用于生物合成β-胡萝卜素的融合多核苷酸及其应用。

[0011] 技术方案

[0012] 为达成本发明的一个目标，本发明提供一种表达八氢番茄红素合酶和胡萝卜素去饱和酶的融合多核苷酸来进行生物合成。

[0013] 为达成本发明的另一个目标，本发明提供一种用于植物转化的包含融合多核苷酸的重组载体。

[0014] 为达成本发明的另一个目标，本发明提供一种被所述重组载体转化的细胞。

[0015] 为达成本发明的另一个目标，本发明提供一种用所述重组载体转化的植物细胞或转化体来生物合成β-胡萝卜素。

[0016] 为达成本发明的另一个目标，本发明提供一种通过使用用所述重组载体转化的植物细胞或者转化体生产β-胡萝卜素的方法来生物合成β-胡萝卜素。

[0017] 以下将更清楚地解释本发明。

[0018] 依照本发明的一个方面，可通过提供编码八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的融合多核苷酸来达成上述和其他目标。

[0019] 优选地，本发明的融合多核苷酸可为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：42的DNA或RNA。当所述多核苷酸为RNA时，胸腺嘧啶(T)可被替换为尿嘧啶(U)。本发明的多核苷酸可通过任何现有技术公开的化学合成方法生产。

[0020] 本发明的另一个方面提供含有包含编码八氢番茄红素合酶的多核苷酸、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和编码胡萝卜素去饱和酶的多核苷酸的融合多核苷酸的重组载体。

[0021] 通常，β-胡萝卜素是通过图2所述的方法合成的。在一株植物中，类胡罗卜素的基本合成路径包括下列步骤：利用八氢番茄红素合酶(PSY)将2分子的GGPP(焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯(geranylgeranylpyrophosphate))聚合成包含40个碳(3个共轭双键)的八氢番茄红素；利用八氢番茄红素去饱和酶(PDS)经过两步去饱和生成ζ-胡萝卜素(7个共轭双键)；然后使用ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)再经过两步去饱和反应；最后经链孢红素(9个共轭双键)生成番茄红素(11个共轭双键)。番茄红素是一种非环状类胡萝卜素的终产物并转化为两种环状胡萝卜素。一种胡萝卜素是使用番茄红素-β-环化酶(β-LCY)经过两步反应从γ-胡萝卜素合成的β-胡萝卜素。另一种胡萝卜素是使用番茄红素-ε-环化酶(ε-LCY)和β-LCY经过合作反应(cooperative reaction)分别从γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素合成的α-胡萝卜素。然而由于水稻不表达类胡萝卜素生物合成的一种起始酶--八氢番茄红素合酶(PSY)，因此根本不产生任何种类的胡萝卜素。因此，本发明人构建了重组载体，其含有一个启动子，以及与所述启动子可操作地连接的编码八氢番茄红素合酶的多核苷酸、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和编码胡萝卜素去饱和酶的多核苷酸。然后，发明人表达了该酶以使用所述重组载体从水稻中大规模生产β-胡萝卜素。

[0022] 八氢番茄红素合酶为一种聚合2分子GGPP(焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯)来产生八氢番茄红素的生物合成酶。在本发明中，公开的任何种类的八氢番茄红素合酶或任何种类的编码该酶的多核苷酸都可被使用。优选地，它们可源自胡椒、番茄、拟南芥(Arabidopsis)、土豆等，更优选地，八氢番茄红素合酶的多核苷酸可为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

[0023] FMDV(口蹄疫病毒)源的2A序列在翻译过程中通过内核糖体“跳跃”机制自加工[Donnelly et al.，1991，J.Gen.Virol.，78，13-21；Ryanet al.，1991，J.Gen.Virol.，72，2727-2732]。优选地，所述FMDV源的2A序列可含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列并且编码所述FMDV源的2A序列的多核苷酸可含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。本发明的氨基酸序列和核苷酸序列是对水稻优化的。

[0024] 所述内部核糖体进入位点(IRES)是一种在mRNA中间起始翻译的核苷酸序列。优选地，所述IRES可具有SEQ ID NO：31的核苷酸序列并对应源自CrTMV(感染十字花科植物的烟草花叶病毒)的衣壳蛋白上游的150bp。

[0025] 胡萝卜素去饱和酶(CrtI)是一种源自噬夏孢欧文菌(Erwiniauredovora)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的去饱和酶并且起到两种去饱和酶PDS和ZDS的作用以将八氢番茄红素转化成番茄红素。在本发明中，现有技术公开的任何种类的胡萝卜素去饱和酶或编码该酶的多核苷酸都可被使用。优选地，所述胡萝卜素去饱和酶可具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列并且所述多核苷酸可具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

[0026] 在本发明中，含有八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的融合蛋白可包括所述蛋白的功能等价物。这种功能等价物被定义为一种具有与八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶基本相似的生理活性的多肽。所述“基本相似的生理活性”是以下的生物活性：通过聚合两分子的GGPP(焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯)生成八氢番茄红素；通过一种非蛋白水解机制自加工；以及进入内核糖体并通过PDS和ZDS将八氢番茄红素转化成番茄红素。

[0027] 优选地，所述功能等价物可为一种多肽，其与分别对应八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有任意的序列同源性(同一性)。优选地，所述序列同源性为至少70％，更优选至少80％，最优选至少90％。精确地，所述功能等价物可包括一种具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性的多肽。

[0028] 所述功能等价物可通过部分添加、取代或删除八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的氨基酸序列来制备。优选地，所述氨基酸取代是一种保守性取代。例如，氨基酸的保守性取代可在脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Pro)、疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(His、Lys、Arg、Gln、Asn)和含硫氨基酸(Cys、Met)中实现。此外，氨基酸的删除可包括部分删除八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的氨基酸序列的修饰。优选地，氨基酸的删除和取代可位于不直接受影响的区域。此外，氨基酸的添加可包括在八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的氨基酸序列的两端或者内部添加一个以上氨基酸的修饰。所述功能等价物还包括保持了骨架和生理活性但在化学结构上被部分修饰的多肽衍生物。例如，所述功能等价物包括一种用于改变其稳定性、储存性、挥发性、可溶性或纯度的结构修饰。

[0029] 在本发明中，可通过使用现有技术公开的任何用于植物转化的基本载体构建含有编码八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的融合多核苷酸的重组载体。优选地，可使用二元载体或者共整合载体。多种二元载体被广泛用于植物转化且几乎所有二元载体都是商品化的。它们可从国际组织和大学研究机构如CAMBIA(The Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture，GPO Box 3200，Canberra ACT2601，Australia)获得。二元载体的基本结构源自Ti质粒并用外源基因、启动子和终止子等在左边界和右边界进行了改造。

[0030] 在本发明中，所述重组载体可采用现有技术公开的可在植物中行使功能的任何启动子。编码八氢番茄红素合酶、FMDV源2A序列或内部核糖体进入位点(IRES)的连接序列和胡萝卜素去饱和酶的融合多核苷酸可操作地连接于启动子的下游。所述启动子是一种在特定宿主细胞中调控其下游的基因表达的DNA序列。所述可操作的连接是一种当核酸结合时它们相互影响以行使功能或表达其的连接。所述重组载体还可包括任何用于转录调控的操作子序列，编码mRNA核糖体结合位点的正确序列和转录及翻译的终止子。

[0031] 优选地，所述启动子可选自水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子、谷蛋白(GT、Glt或Glu)启动子、玉米泛素(Ubi)启动子、花椰菜花叶病病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病病毒35S启动子、甘蔗杆菌病毒启动子、鸭跖草黄化斑驳病毒启动子、源自核酮糖-1，5-双-磷酸羧化酶亚基(ssRUBISCO)的光诱导启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子、源自拟南芥的腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。更优选地，其可为水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子。

[0032] 优选地，选择性标记基因可选自但不限于抗生素抗性基因、除草剂抗性基因、代谢相关基因、发光基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、β-半乳糖苷酶(GAL)基因等。更优选地，其可选自除草剂抗性Bar基因、新霉素磷酸转移酶II(NPT II)基因、潮霉素磷酸转移酶基因、草铵膦乙酰基转移酶(phosphinothricine acetyltransferase)基因或去氢叶酸还原酶基因等，并且最优选地，其可为除草剂抗性Bar基因。

[0033] 优选地，本发明用于植物转化的重组载体可为图1所示的pGlb-PAC载体或图9所示的pGlb-PIC载体。具体地，所述pGlb-PAC载体是通过使用pMJ-103载体(从右边界到左边界由SEQ ID：57表示)作为骨架构建，其中attB1序列、编码胡椒八氢番茄红素合酶的多核苷酸、FMDV源2A序列的连接序列、编码细菌胡萝卜素去饱和酶的多核苷酸以及attB2序列被顺序连接到水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子和土豆蛋白酶抑制剂II(Pin II)的终止子之间。此外，通过将FMDV源的2A序列替换为内部核糖体进入位点而从pGlb-PAC载体构建pGlb-PIC载体。在这种情况下，通过使用pSB11载体(Genbank Acession No.AB027256)--一种含有壮观霉素抗性基因的超二元质粒--作为骨架生成pMJ-103载体。pMJ-103载体是一种整合水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子和土豆蛋白酶抑制剂II(Pin II)终止子的通道载体，并且在35S启动子的下游区域含有除草剂抗性Bar基因作为植物选择性标记。

[0034] 上述标准重组DNA和分子克隆技术在本领域内是广为人知的，并在以下文献中被描述(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY 1989；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY，1984；和 Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology，published by GreenePublishing Assoc，and Wiley-interscience，1987)。

[0035] 同时，在本发明的一个实施方案中，将本发明的重组载体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacience)LBA4404中，并将本发明的基因通过所述转化的根癌农杆菌引入植物细胞中。

[0036] 因此，本发明提供一种被本发明的用于植物细胞转化的载体转化的细胞。所转化的细胞可为但不限于原核宿主细胞，如农杆菌属(Agrobacterium spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus)；低等真核细胞如真菌(例如曲霉菌(Aspergillus)和酵母(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))；以及高等真核生物源细胞，包括昆虫细胞、植物细胞和哺乳细胞，优选根癌农杆菌或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

[0037] 此外，本发明提供了一种被引入所述载体并产生β-胡萝卜素的转化的植物细胞。

[0038] 转化的植物细胞可通过现有技术公开的植物转化方法制备。例如，但不限于，通过使用农杆菌属、基因枪轰击、碳化硅晶须、超声处理、电穿孔和PEG(聚乙二醇)沉淀的转化。优选地，可使用农杆菌介导的转化(Horsch et al.，Science 227：1229-1231，1985)。例如，现有技术公开了农杆菌介导的水稻转化(An et al.，EMBO J.，4：227-288，1985)。

[0039] 本发明的植物细胞可根据任何传统方法培育，包括肉汤培养的细胞、愈伤组织细胞、培养的原生质体以及分化后的植物组织或植物。精确地，可通过使用现有技术公开的标准技术将用所述重组载体转化的植物诱导为愈伤组织、在土壤中生根和分离(refine)，从而再分化为一株植物。所得植物可通过无性和有性生殖两种方法生产。所述无性生殖方法包括插扦、嫁接等，所述有性生殖方法包括播种。

[0040] 所述植物细胞在从母体植物的一部分中分离后在无菌条件下进行培养，然后进行繁殖。此过程可通过现有技术公开的任何方法实现，包括组织片段的肉汤培养、组织片段的愈伤组织培养、原生质体培养等。这种培养条件和方法可由本领域技术人员确定。

[0041] 所述植物细胞的分化在可诱导所培养愈伤组织或原生质体分化的合适条件下进行。所得愈伤组织和原生质体可生成植物组织或植物。这种分化条件和方法可由本领域技术人员确定。

[0042] 本发明的另一个方面提供用所述重组载体转化的重组植物或蘑菇来生成β-胡萝卜素。

[0043] 上述植物可包括整株植物、植物的一部分、愈伤组织、植物组织、植物细胞和植物种子。本发明的植物可包括单子叶植物和双子叶植物。所述单子叶植物不限于，但优选地为水稻、小麦、大麦、竹笋、玉米、芋头、芦笋、洋葱、大蒜、大葱、韭葱、野胡蒜、甘薯(yam)和生姜。所述双子叶植物不限于，但优选地为拟南芥、茄子、烟草、胡椒、番茄、牛蒡、苘蒿、莴苣、风铃草、菠菜、菾菜、番薯(sweet potato)、旱芹、胡萝卜、欧合叶子、西芹、白菜、卷心菜、小萝卜、西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、葫芦、草莓、大豆、绿豆、四季豆、百脉根、土豆、浮萍、青紫苏、木豆、水仙、金盏花和青豆。

[0044] 本发明的另一个方面提供一种生产β-胡萝卜素的方法，其包括下列步骤：(a)将含有本发明的融合多核苷酸的重组载体引入到细胞中；(b)培养所述细胞或从所述细胞中分化的植物；和(c)从培养后的细胞或植物中分离β-胡萝卜素。

[0045] 以上清楚地描述了所述重组载体和细胞转化。用所述重组载体转化的细胞分化为一个完整细胞或细胞团如愈伤组织。然后，对其进行培养或者培育以表达整合到所述重组载体中的八氢番茄红素合酶和胡萝卜素去饱和酶。可通过现有技术中公开的任何常规方法，优选地通过使用有机溶剂的萃取方法，从培养的细胞或植物中纯化β-胡萝卜素。

[0046] 在本发明的一个实施方案中，分离胡椒八氢番茄红素合酶基因和细菌胡萝卜素去饱和酶基因以进行克隆并且通过使用密码子将编码FMDV源2A序列的核苷酸序列针对水稻进行优化。然后，构造本发明的融合多核苷酸。

[0047] 在本发明的另一个实施方案中，将重组序列(如attB1和attB2)连接到所述融合多核苷酸上并且将其插入到pDONR201载体中。然后用pMJ-103载体转化所述融合多肽以构建pGlb-PAC载体，其中pMJ-103载体由作为骨架的pSB11载体、水稻内胚芽特异的球蛋白(Glb)启动子和土豆蛋白酶抑制剂II(PinII)终止子构成。将pGlb-PAC载体引入农杆菌以进行转化。

[0048] 在本发明的另一个实施方案中，将源自CrTMV(感染十字花科植物的烟草花叶病毒)并对应衣壳蛋白上游的150bp的内部核糖体进入位点插入所述胡椒八氢番茄红素合酶基因和细菌胡萝卜素去饱和酶基因之间以构建所述融合多核苷酸。

[0049] 在本发明的另一个实施方案中，将重组序列(如attB1和attB2)连接到所述融合多核苷酸上并且将其插入pDONR201载体中。然后，用pMJ-103载体转化所述融合多肽以构建pGlb-PIC载体，其中所述pMJ-103载体由作为骨架的pSB11载体、Glb启动子和PinII终止子构成。将pGlb-PIC载体引入农杆菌以进行转化。

[0050] 在本发明的另一个实施方案中，使用由pGlb-PAC载体或pGlb-PIC载体转化的农杆菌转化水稻。然后，选择会向单个植物分化的水稻。裸眼观察到所述植物转化体表现出比完整植物的对照组更深的黄色。

[0051] 在本发明的另一个实施方案中，检查了所述植物转化体是否引入了所述融合多核苷酸以及是否合成了类胡萝卜素，并进一步测量了表达的RNA水平和蛋白水平。因此，证实了所述融合多核苷酸被正确插入所述转化体，并且在RNA和蛋白水平上活跃地表达，从而大量产生类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素。

[0052] 有益效果

[0053] 本发明提供在细胞转化体、重组载体、用所述重组载体转化的重组细胞和植物转化体内稳定表达八氢番茄红素合酶基因和细菌胡萝卜素去饱和酶基因的融合多核苷酸。本发明的融合多核苷酸可用于调控植物生产的β-胡萝卜素的生物合成代谢。此外，其还可用于有效增加--一种有用的代谢物--β-胡萝卜素的含量。附图说明

[0054] 参考下面附图所示的某些示例性实施方案详细描述本发明的上述和其他特性，所述示例性实施方案仅出于说明的目的，因此并非对本发明进行限制，并且其中：

[0055] 图1是pGlb-PAC载体的示意图(LB：左边界；RB：右边界；Glb：水稻内胚芽特异的球蛋白启动子；Psy：源自韩国胡椒栽培品种NocKwang的八氢番茄红素合酶基因；st2A：对水稻优化的2A序列；Tp：叶绿体靶向导肽；CrtI：细菌胡萝卜素去饱和酶基因；PinII：土豆蛋白酶抑制剂II终止子；P35S：CaMV 35S启动子；Bar：草铵膦乙酰转移酶基因；NOS：胭脂碱合成酶终止子；和MAR：基质附着区域)；

[0056] 图2是类胡萝卜素包括β-胡萝卜素的一种植物代谢过程(GGPS：焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯合酶；PSY：八氢番茄红素合酶；PDS：八氢番茄红素去饱和酶；ZDS：ζ-胡萝卜素去饱和酶；β-LCY：番茄红素-β-环化酶；ε-LCY：番茄红素-ε-环化酶；β-CH：β-胡萝卜素羟化酶；ε-CH：ε-胡萝卜素羟化酶；ZE：玉米黄质环氧酶；VDE：紫黄质去环氧酶；NXS：新黄质合酶；CCS：辣椒黄素-辣椒玉红素合酶)；

[0057] 图3是从水稻内胚芽收集的T1、T2和T3-代成熟种子，所述内胚芽被多顺反子pGlb-PAC载体转化以产生β-胡萝卜素并呈现黄色。

[0058] 图4是通过进行PCR(A)和DNA印迹(B)识别的植物的细胞转化(M，1kb梯形DNA大小标记；PC，pGlb-PAC质粒DNA；NC，非转基因对照水稻(洛东(Nakdong)稻)；9、10、11、2-1、2-2、4-2、4-3，pGlb-PAC水稻转化体)。

[0059] 图5是通过进行RT-PCR识别的本发明植物中的基因表达。

[0060] 图6是通过进行蛋白质印迹识别的本发明植物中的蛋白表达(GF：胡椒的青果；RF：胡椒的红果)；

[0061] 图7是通过HPLC分析识别的本发明植物中的β-胡萝卜素的产生(L，叶黄素；Z，玉米黄质；B-C，β-胡萝卜素)；

[0062] 图8是由内部核糖体进入位点启动子的两个独立基因的共表达示意图；

[0063] 图9是用于产生β-胡萝卜素的含有多顺反子PIC基因的水稻内胚芽特异的pGlb-PIC载体的详细构建(基因图谱)(LB：左边界；RB：右边界；Glb：水稻内胚芽特异的球蛋白启动子；Psy：源自韩国胡椒NocKwang的八氢番茄红素合酶基因；IRES：内部核糖体进入位点；Tp：叶绿体靶向导肽；CrtI：细菌胡萝卜素去饱和酶基因；PinII：土豆蛋白酶抑制剂II终止子；P35S：CaMV 35S启动子；Bar：草铵膦乙酰转移酶基因；NOS：胭脂碱合成酶终止子；和MAR：基质附着区域)；

[0064] 图10是从水稻内胚芽收集的T1和T2代成熟种子，所述内胚芽被本发明的多顺反子pGlb-PIC载体转化以产生β-胡萝卜素并呈现黄色；

[0065] 图11是通过进行凝胶电泳识别的水稻的基因插入(M，1kb梯形DNA大小标记；PC，pGlb-PAC质粒DNA；NC，非转基因对照水稻(洛东稻)；4、5、β、7、8：用pGlb-PIC载体转化的水稻T1代)；

[0066] 图12是通过使用水稻染色体DNA进行基因组DNA印迹识别的基因插入和基因拷贝数(M，1kb梯形DNA大小标记；PC，pGlb-PAC质粒DNA；NC，非转基因对照水稻(洛东稻)；4-2、5-1、6-1、7-1、8-2、8-3：用pGlb-PIC载体转化的水稻T2代)；

[0067] 图13是使用从用多顺反子pGlb-PIC载体转化的水稻种子中分离的总RNA进行RT-PCR后，转录体的基因表达模式的比较(M，1kb梯形DNA大小标记；NC，非转基因对照水稻(洛东稻)的成熟种子；4、5、6、7、8：用pGlb-PIC载体转化的水稻种子)；

[0068] 图14是用多顺反子pGlb-PIC载体转化以产生β-胡萝卜素并呈现黄色的水稻成熟种子(Glb：水稻内胚芽特异的球蛋白启动子；Tp：叶绿体靶向导肽基因；Psy：源自韩国胡椒NocKwang的八氢番茄红素合酶基因；st2A：在水稻中优化的2A序列；IRES：内部核糖体进入位点；CrtI：细菌胡萝卜素去饱和酶基因；PinII：土豆蛋白酶抑制剂II终止子)。

[0069] 应理解，附图不必是按比例尺缩放的，而是表示对说明本发明基本原理的多种优选特性的某种程度的简化描述。本文公开的本发明的具体设计特性，包括例如具体尺寸、方向、位置和形状，可部分地由具体的计划应用和使用环境确定。实施例

[0070] 以下，将详细给出本发明的多种实施方案，其中的实施例在附图中图示并在下面描述。尽管本发明连同示范实施方案一起被描述，然而应理解这种描述并不意图将本发明限制为那些示范实施方案。相反，本发明不仅意图涵盖示范实施方案，还意图涵盖属于如所附权利要求定义的本发明的精神和范围内的各种替代、改造、等价或其他实施方案。

[0071] <实施例1>对水稻优化的FMDV源2A序列(st2A基因)的合成

[0072] 已知FMDV(口蹄疫病毒)源2A序列在氨基酸的特定C-末端处(G↓P)自加工。在FMDV源2A序列内，SEQ ID NO：2的氨基酸序列被用来设计对水稻优化的多核苷酸。精确地，水稻密码子使用数据被用来确定60bp的最优核苷酸序列。在核苷酸序列的两个末端，连接3bp核苷酸作为限制性内切酶PstI和Smal的识别位点来设计SEQ ID NO：3的多核苷酸(st2A-正义ssDNA)。然后，再设计与SEQ ID NO：3的多核苷酸互补的SEQ ID NO：4的多核苷酸(st2A-反义ssDNA)。

[0073] 从商业公司合成了上面设计的SEQ ID NO：3的多核苷酸和SEQ ID NO：4的多核苷酸。然后，将这些序列从65℃缓慢退火至室温以转化为双链DNA(dsDNA)。用限制性内切酶PstI和Smal消化所述dsDNA并将其连接到经相同酶消化的质粒pKS+载体(stratagene)中。从而构建了pBS-st2A载体。

[0074] <实施例2>胡椒PSY基因和细菌CrtI基因的分离

[0075] (2-1)胡椒PSY基因的分离

[0076] 为克隆源自韩国胡椒--辣椒栽培品种NocKwang的SEQ ID NO：6的八氢番茄红素合酶基因(PSY)，从胡椒根中提取总RNA。具体地，每个样品取约1g在液氮下的混合碗中进行超声处理，再转移到2mL试管中，用500μL的RNA提取缓冲液(pH 5.5的50mM乙酸钠、150mM LiCl、5mM EDTA、0.5％SDS)和500μL苯酚萃取。将所述混合物在65℃下加热10分钟，然后用旋转振荡器在室温下搅拌15分钟。然后，以10000rpm在4℃下离心10分钟，将上清液收集到一个新试管中，再加入500μL的氯仿。再次萃取此上清液，再离心以收集上清液。然后加入0.6倍体积的8M氯化锂(LiCl)，在-20℃下反应2小时以上。将反应产物在
4℃下以12000rpm离心20分钟以沉淀RNA沉淀，并用4M LiCl和80％EtOH洗涤一次。将所述RNA沉淀溶解到50μL的蒸馏水中。通过在使用前用UV分光光度计在A260/A280下测量光密度来对所述RNA洗出液进行定量。将此RNA用作模板并加入对胡椒PSY基因特异的引物对SEQ ID NO：9(Psy-Fw引物)和SEQ ID NO：10(Psy-Rv引物)。然后，通过进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增所述胡椒PSY基因。具体地，大约2μg的总RNA与50μM的寡聚dT引物在以下条件下反应：55℃20分钟，99℃5分钟，并在冰上冷却。然后，用1μLTM
的核糖核酸酶H与10xRT缓冲液(25mM MgCl2、0.1M DTT、RNase OUT、Superscript RT)在
37℃下处理20分钟来合成cDNA。将所合成的cDNA用作模板并加入每种引物各10pmol。然后，用10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Ex-Taq聚合酶(Takara))与其反应以将总体积调节到20μL，反应条件为：在94℃ 3分钟、94℃ 30秒、60℃ 30秒、
72℃ 1分钟，重复反应30个循环，然后为75℃ 5分钟。

[0077] 将上面扩增的PCR产物连接到用于PCR克隆的pCR2.1载体(Invitrogen)中，从而构建了pCR2.1-Psy载体。

[0078] (2-2)细菌CrtI基因的分离

[0079] 为克隆源自噬夏孢欧文菌20D3的SEQ ID NO：8的胡萝卜素去饱和酶基因(CrtI)，从KACC(韩国农用微生物保存中心)获得细菌ATCC 19321菌株。通过使用常规分子克隆方法提取细菌基因组DNA。将此基因组DNA用作模板并加入对细菌CrtI基因特异的引物对SEQ ID NO：11(CrtI-Fw引物)和SEQ ID NO：12(CrtI-Rv引物)各10pmol。然后，将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Ex-Taq聚合酶(Takara))混合以将总体积调节到20μL，反应条件为：在94℃ 3分钟、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分钟，重复反应30个循环，然后为75℃ 5分钟。

[0080] 结果分离到细菌CrtI基因。然后，将上面扩增的PCR产物克隆到pGEM-T easy载体(Promega)中，构建了pGEM-CrtI载体。

[0081] <实施例3>用于β-胡萝卜素生产的PAC基因的制备

[0082] (3-1)八氢番茄红素合酶基因和2A序列的连接

[0083] 为制备β-胡萝卜素诱导的PSY和CrtI基因的多顺反子PAC基因，首先将限制性内切酶HindIII和PstI的识别位点连接到PSY基因的末端。具体地，将在实施例2-1中制备的pCR2.1-Psy载体用作模板并加入引物对SEQ ID NO：13(5H-Psy引物)和SEQ ID NO：14(3P-Psy引物)各10pmol。然后，将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Ex-Taq聚合酶(Takara))反应以将总体积调节到50μL，反应条件为：在94℃
3分钟、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分钟，重复反应30个循环，然后为75℃下5分钟。
结果，用限制性内切酶HindIII和PstI消化所得PCR产物，然后克隆到经相同酶消化的质粒pBS-st2A(见实施例1)中st2A序列的5′-上游区域。从而构建了pBS-Psy-st2A载体。

[0084] (3-2)TP序列的克隆

[0085] 所述细菌CrtI基因需与一个可将PSY酶移向β-胡萝卜素(合成位点叶绿体、淀粉体等)的额外导肽(Tp)连接，尽管植物源PSY基因天然具有Tp信号。因此，将rbcS-Tp(150bp)基因--一种从rbcS(核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基)基因分离的水稻Tp--按照下述方式克隆到CrtI基因的5′-上游区域。

[0086] 将含有水稻rbcS基因的pSK-RTG载体用作模板(Jang et al.，1999，Mol.Breeding，5：453-461)并加入在Tp序列的两端含有限制性内切酶PstI和NcoI的识别位点的引物对SEQ ID NO：15(5P-Tp引物)和SEQ IDNO：16(3Nc-Tp引物)。然后，在94℃ 10秒、60℃ 10秒、72℃ 10秒、72℃ 1分钟的条件下简单进行PCR反应。

[0087] 结果，用限制性内切酶PstI和NcoI消化上面扩增的160bp PCR产物，然后克隆到经相同酶消化的pGEM-T easy载体中。从而构建了pGEM-Tp载体。

[0088] (3-3)TP序列和CrtI基因的连接

[0089] 为将CrtI基因克隆到Tp序列的上游区域，在CrtI基因的两端连接限制性内切酶NcoI和ApaI的识别位点并且将其连接到pGEM-CrtI载体中。将pGEM-CrtI载体用作模板并加入引物对SEQ ID NO：17(5Nc-CrtI引物)和SEQ ID NO：18(3Ap-CrtI引物)。然后，在与CrtI基因扩增的条件相同的条件下进行PCR反应。

[0090] 用限制性内切酶NcoI和ApaI消化1.5kb的所述PCR产物，然后将其克隆到经相同酶消化的pGEM-Tp载体中Tp序列的3′-下游区域。从而构建了pGEM-Tp-CrtI载体。

[0091] (3-4)氢番茄红素合酶基因、2A序列和胡萝卜素去饱和酶基因的连接

[0092] 将pGEM-Tp-CrtI载体包含的Tp-CrtI基因插入到pBS-Psy-st2A载体包含的Psy-st2基因的3′-下游区域，并使两个基因的编码框一致。首先，在Tp-CrtI基因的两端引入限制性内切酶SmaI和XbaI的识别位点。将所述Tp-CrtI基因克隆到pBS-Psy-st2A载体中。具体地，将pGEM-Tp-CrtI载体用做模板并加入引物对SEQ ID NO：19(5Sm-TpCrtI引物)与SEQ ID NO：20(3Xb-TpCrtI引物)。然后，在与CrtI基因扩增的条件相同的条件下进行PCR反应。

[0093] 用限制性内切酶SmaI和XbaI消化1.642kb的所述PCR产物，然后将其克隆到经相同酶消化后的pBS-Psy-st2A载体中Psy-st2A序列的3′-下游区域。从而构建了pBS-Psy-st2A-Tp-CrtI，即pBS-PAC载体。最终，通过再一次对总核苷酸序列进行测序分析将最终的PAC融合基因鉴定为具有2,952bp的总核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

[0094] <实施例4>用于水稻转化的重组载体的构建和农杆菌转化

[0095] (4-1)用于水稻转化的重组载体的构建

[0096] 为构建用于水稻转化以诱导水稻胚乳特异性表达的重组载体，将在实施例3中制备的pBS-PAC载体用作模板并加入引物对SEQ ID NO：21(PAC-B1引物)和SEQ ID NO：13(PAC-B2引物)各10pmol。然后，将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以将总体积调节到50μL，在以下条件下进行PCR扩增反应：在94℃ 3分钟、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分钟，重复反应30个循环，再在68℃下10分钟。在这种情况下，为在两端包含部分细菌特异的核苷酸序列(attB1和attB2)(各为12bp)，设计了引物对SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：13。因此，当噬菌体感染细菌时，可特异地扩增PAC基因。

[0097] 将上面扩增的PCR产物(2,976bp)用作模板并加入引物对SEQ IDNO：25(attB1引物)与SEQ ID NO：26(attB2引物)各2pmol。然后，将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以将总体积调节到50μL，并在95℃ 3分钟、94℃ 30秒、45℃ 30秒、68℃ 2分钟，重复反应5个循环；然后在94℃ 30秒、
55℃ 30秒、68℃ 2分钟，重复反应20个循环；然后在68℃下放置10分钟。在这种情况下，为在重组噬菌体感染细菌后在两端包含整个细菌特异的核苷酸序列(attB1和attB2)(各为29bp)，设计了引物对SEQID NO：23和SEQ ID NO：24。

[0098] 加入BP克隆酶(Invitrogen)后，在重组噬菌体感染细菌后在两端含有细菌特异的核苷酸序列(attB1和attB2)的PCR产物首先与在重组噬菌体感染细菌后在两端含有细菌特异的核苷酸序列(attP1和attP2)的pDONR201载体(Invitrogen)在25℃下反应1小时。通过此BP反应，构建了pENTR-PAC载体。

[0099] 为将pENTR-PAC载体中包含的PAC基因克隆到用于水稻转化的最终载体中，加入LR克隆酶(Invitrogen)后，用Myungji University生产的pMJ-103载体(Green Gene Bio)在25℃下进行第二步反应1小时。通过此所谓的LR反应，构建了用于水稻转化的pGlb-PAC载体(见图1)。在这种情况下，pMJ-103载体为一种含有水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子、土豆蛋白酶抑制剂II(Pin II)终止子和在35S启动子下游作为植物选择性标记的除草剂抗性Bar基因的通道载体，而其骨干为pSB11载体，一种含有作为选择性标记的壮观霉素抗性基因的超二元质粒。

[0100] (4-2)农杆菌转化

[0101] 使用一种常规方法(三亲交配)将pGlb-PAC载体引入用于水稻转化的农杆菌中。具体地，将用含有超二元质粒的pSB1载体转化的根癌农杆菌LBA4404在添加有四环素(10mg/L)的AB培养平板上在28℃下培养2-3天，其中所述超二元质粒包括vir基因，并将含有一种夫妻辅助质粒(conjugal helper plasmid)pRK201的大肠杆菌HB101和含有pGlb-PAC载体的大肠杆菌DH-5α分别在添加有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB培养平板上在37℃下过夜培养，从而收集全部3种菌落。

[0102] 将这3种菌落混合并在营养琼脂平板(Difco)上在28℃下过夜培养。将所得细菌用培养肉汤(或水)稀释10倍，在添加有壮观霉素(50mg/L)和四环素(10mg/L)的AB培养平板(AB-st)上划线以分离单个细胞，然后在28℃下培养3天。将AB培养平板(AB-st)上出现的单个菌落再次划线并在28℃下培养3天以选择最终的单个菌落(根癌农杆菌LBA4404pGlb-PAC)。将所得农杆菌接种到添加有壮观霉素(50mg/L)和四环素(10mg/L)的YEP培养肉汤(YEP-st)中并在28℃下振荡培养2天。然后，分离质粒以分析限制性消化模式。结果，再次确定了农杆菌被pGlb-PAC基因转化。接着，使用根癌农杆菌LBA4404 pGlb-PAC来转化水稻。

[0103] <实施例5>使用农杆菌转化水稻

[0104] 为了转化水稻，使用成熟的种子。首先，将水稻(洛东稻)的种子去皮，在70％的乙醇中浸泡1分钟，用蒸馏水洗涤2-3次，然后用2％的次氯酸钠(商品″ROX″)溶液消毒表面，同时搅拌20分钟。然后，将所得种子用蒸馏水消毒4-5分钟，用滤纸干燥并置于愈伤组织诱导平板(N6基础培养基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3％蔗糖、2mg/L 2，4-D、0.25％植物凝胶，pH 5.8)上。将所得种子在黑暗条件下在28℃下培养4-5周以生成愈伤组织。然后，只选择胚胎发生的愈伤组织，使其再分化为一株转化植物。

[0105] 将被pGlb-PAC载体转化的根癌农杆菌LBA4404 pGlb-PAC培养30小时并用AAM培养肉汤(含100mM乙酰丁香酮)稀释至OD600值为1.0-1.2的细胞浓度。然后，将所述农杆菌与所述胚胎发生的愈伤组织孵育15分钟。将所得愈伤组织在消毒的滤纸上干燥并在共培养平板(N6基础培养基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3％蔗糖、2mg/L 2，4-D、100mM乙酰丁香酮、0.25％植物凝胶)上在24℃下黑暗共培养2-3天。

[0106] 为除去残留在表面上的农杆菌，将所述共培养愈伤组织用含有头孢噻肟(250mg/L)的AAM培养肉汤洗涤，用消毒的滤纸覆盖而除去水分，并转移至选择性培养基(N6基础培养基、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、3％蔗糖、2mg/L 2，4-D、0.25％植物凝胶、6mg/L草铵膦、250mg/L头孢噻肟，pH 5.8)以只收集转化的愈伤组织。然后，每两周用新鲜的选择培养基将所得愈伤组织进行传代培养，并在5周后使用用于植物再分化的培养基(MS基础培养基、3％蔗糖、0.5mg/L NAA(萘乙酸)、2mg/L激动素、250mg/L头孢噻肟、3mg/L草铵膦、0.3％植物凝胶，pH 5.8)再培养。诱导后，在通气条件下在MS培养基上纯化所得植物。

[0107] 每步中所用的培养基条件示于下表1中。

[0108] <表1>

[0109]

[0110] 从培养瓶中收集上面培养的植物。将所述根用水洗涤，转移到装满稻田土壤的新塑料瓶中并在温室中培育。

[0111] <实施例6>对从转化水稻收获的种子的鉴定

[0112] 根据种子的黄色比较被上面获得的pGlb-PAC基因(PAC2-1、2-2、4-2、4-3、5、7、8、9、10和11)转化的10株再分化的水稻，这是由于它们在不同的阶段再分化--PAC2-1、2-2、
4-2和4-3系在T3种子中产生β-胡萝卜素，PAC9、10和11系在T2种子中产生β-胡萝卜素，而PAC5、7和8系在T1种子中产生β-胡萝卜素。

[0113] 收获每系的成熟种子后，用水稻脱壳机(TR-200电动水稻脱壳机，Kett产品)去壳，然后用精米机(Pearlest精米机，Kett)精制1分钟以去除糊粉层。将这些精制的大米相互比较。

[0114] 结果，观察到不管是T2还是T3代，PAC10、11、2-1、2-2和4-2(4-3)系都呈现相似的黄色，如图3所示。在T2代中，PAC9呈现比PAC10和11更淡的黄色。此外，T1代的PAC5、7和8趋于呈现淡黄色。

[0115] <实施例7>植物转化的分析

[0116] (7-1)通过PCR分析转化

[0117] 在转化的水稻中，收集带有叶组织的PAC9、10、11、2-1、2-2、4-2和4-3。然后，使用基因组DNA纯化试剂盒(I.J.BIO DNA System)分离并纯化基因组DNA。通过用UV分光光度计在A260/A280下测量光密度来对所得DNA洗出液进行定量。将100ng的基因组DNA用作模板并加入引物对SEQ ID NO：25(Psy-CT-Fw引物)和SEQ ID NO：26(CrtI-NT-Rv引物)以进行PCR反应(94℃ 2分钟、95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒，重复30个循环，再在72℃下放置5分钟)。

[0118] 结果，在本发明的转化水稻中观察到370bp的PCR产物。从而鉴定出每系都被完全地转化。

[0119] (7-2)通过DNA印迹的转化分析

[0120] 将5μg在实施例(7-1)中提取的基因组DNA用限制性内切酶XbaI消化并进行琼脂凝胶电泳，通过常规DNA印迹方法分析。然后，将其通过毛细管反应转移到NC(硝酸纤维32
素)膜上并用1.5kb的 P-标记的CrtI基因作为探针进行印迹。

[0121] 结果，如图4B(左)所示，除PAC 2-2以外，在PAC 9、10、11、2-1、4-2和4-3中都观察到了4.1kb的插入基因。

[0122] 此外，为通过进行DNA印迹计算基因拷贝数，将5μg相同的基因组DNA用限制性32
内切酶EcoRI消化，进行琼脂凝胶电泳分析，再转移到NC膜上并使用1.5kb的 P-标记的CrtI基因作为探针进行印迹。

[0123] 结果，如图4B(右)所示，由于PAC4-2和PAC4-3具有相同的信号模式，因此证明它们为相同的系。此外，PAC10和11清晰地显示出两个Mar信号带(左边：1.3kb的Mar信号带；右边：由于水稻基因组DNA在未知位点被限制性内切酶EcoRI消化，因此根据插入位点不同而大小不同的Mar信号带)。通过使用Mar基因作为探针，此结果证明插入了一个基因拷贝。此外，PAC9、2-1和2-2分别显示出1、2和1个Mar信号带，并被估计具有一个拷贝插入。否则，据猜测，当转化水稻的基因组DNA时，它们可引发插入基因的重排。

[0124] <实施例8>植物转化体的基因表达分析

[0125] 从由转化植物收获的水稻中提取总RNA并通过进行RT-PCR分析以根据多顺反子位点检测PAC基因的表达。具体地，为提取总RNA，每系取1g水稻样品浸泡约2小时，在液氮下用混合碗充分粉碎并与5mL RNA提取缓冲液[200mM Tris-HCl(pH 9.0)、400mM LiCl、25mM EDTA(pH 8.2)、1％SDS]以及5mL苯酚混合。将所述混合物转移到15mL的试管中，以
3000rpm离心10分钟，将上清液层小心地转移到一个新试管中。然后，加入1mL氯仿和1mL苯酚，振荡混合并再次以3000rpm离心10分钟以收集上清液。然后，小心地将所述上清液转移到一个新试管中，在加入2mL氯仿后充分振荡混合以萃取所述溶液。将此过程重复两次。将所得上清液转移到一个新试管中，并在加入2.5倍体积等量的乙醇和0.1倍体积等量的3M(乙酸钠，pH 5.2)后在-20℃下储存1小时。然后，以12,000rpm在4℃下离心10分钟以收集DNA和RNA沉淀，溶解于2M氯化锂(LiCl)溶液中并在-20℃下孵育2小时以上以沉淀RNA。将所得RNA沉淀用80％EtOH洗涤一次并溶解于80-100μL的DEPC溶液。
通过用UV在A260/A280处测量光密度来对所述RNA提取物进行定量，以进行mRNA选择性RT-PCR。

[0126] 将1μg的总RNA用作模板并使用商品试剂盒(TAKARA mRNA选择性RT-PCR试剂盒[1xRT缓冲液、5mM MgCl2、1mM dNTP、50μM Oligo dT引物、核糖核酸酶抑制剂(0.8单位/μL)、AMV RTase XL(0.1单位/μL)]Takara，日本)进行扩增。为合成cDNA，将其在30℃下反应10分钟，在42℃下反应30分钟，然后在4℃下冷却。所合成的cDNA与下列引物对反应。精确地，加入PST基因特异的引物对SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；Tp-CrtI基因特异的引物对SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；对PAC基因的st2A序列的SL(小长度)特异的引物对SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；扩增PAC基因全长(PAIC-F1和PAIC-R1引物)的引物对SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；以及确认RNA的固定相对量的水稻谷蛋白特异的引物对SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30各10pmol。然后，将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μM MgCl2、100μM dNTP、1单位Pyrobest聚合酶(Takara))混合以将总体积调节到50μL，在以下条件下进行PCR扩增反应：94℃ 3分钟、94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 1分钟，重复反应30个循环，再在68℃下放置10分钟。特别地，根据合成基因的长度控制72℃下的扩增步骤，调节为对Psy基因1分钟，对Tp-CrtI基因1.5分钟，对PAC_SL基因30秒，对PAC_FL 3分钟和对谷蛋白30秒。

[0127] 结果，如图5所示，Psy基因、CrtI基因、PAC_SL基因、PAC_FL基因的全部转录物都未在完整水稻种子(洛东稻)中检测到，但所述全部转录物都在各自的转化水稻种子中以所估计的大小被清楚地检测到。当使用谷蛋白作为对照组时，在PIC转化体的4个位点比较基因表达的程度。尽管有些差异，但观察到以10＞2-1＞4-2＞9＞11系顺序降低。

[0128] <实施例9>植物种子的分离和蛋白质印迹分析

[0129] 从由转化水稻收获的水稻中提取粗蛋白并分析测量外源PAC蛋白的翻译和积聚程度。具体地，为了提取种子蛋白，用水浸泡每个水稻系的2个谷粒约2个小时，粉碎并与200μL的尿素样品缓冲液[0.025M Tris(pH 8.8)、4.0％(W/V)SDS、4.0M Urea、5％(v/v)2-巯基乙醇]混合。将所得溶液充分振荡30分钟，以13,000rpm在4℃下离心60分钟并小心地转移到一个新试管中。

[0130] 使用7.5％Gradi-GelTM II(ElpisBio)PAGE将上面提取的蛋白进行定量并且离心为20μg，通过半干法将其转移到硝化纤维膜上以进行蛋白质印迹。然后，将获得的膜用5％的脱脂奶粉包覆，并在加入1000∶1稀释的抗PSY多克隆抗体(来自Dr.Bile Camara，France)后，在含有1％Tween-20的TBS缓冲液[20mM Tris-HCl(pH 7.5)，137mM NaCl]中反应4小时。反应后，用TBS缓冲液洗涤10分钟并重复洗涤4次。将获得的膜与6,000∶1稀释的碱性磷酸酶(AP)-共轭二抗反应1小时，然后用TBS缓冲液洗涤4次并转移到塑料袋中以显色。使产色底物混合物(加有33μL的NBT、16.5μL BCIP的5mL碱性磷酸酶缓冲液；Promega)均匀包覆在膜上并观察着色程度。达到合适的着色时，加入终止溶液[加有200μL的0.5M EDTA(pH 8.0)的50mL TBS]并在室温下干燥。

[0131] 结果，如图6所示，PSY蛋白的表达在约110kDa的估计区域被检测到，并以相当近似的量积聚，尽管在PAC2-1系中稍高。

[0132] <实施例10>植物种子中的类胡萝卜素含量的测量

[0133] (10-1)植物种子I中的类胡萝卜素含量的测量

[0134] 通过改造Minguez-Mosquera et al.[Minguez-Mosquera et al.r J.Agric.Food Chem.，41，1616，1993]的方法完成了类胡萝卜素的提取，HPLC定量等。

[0135] 为提取类胡萝卜素和类胡萝卜素酯，用搅拌器分别粉碎从普通水稻(洛东稻)和转化水稻PAC4-2收获的3g水稻。搅拌加入200mL氯仿、250mL三蒸水、1mL 1％BHT(丁基化羟基甲苯的MeOH溶液)溶液和1mL的标准物质(苏丹II)并过滤。重复此过程2-3次来收集萃取的溶液。然后，将无水硫酸钠加入萃取的溶液中以除去水分。将所得溶液用旋转蒸发器浓缩，用50mL的乙醚重悬浮，然后加入2.5mL的饱和KOH溶液在室温下皂化16小时。为了除去碱，用50mL的蒸馏水分馏溶剂并用无水硫酸钠处理乙醚层以除去水分。然后，将反应产物浓缩，溶于含有1％BHT的1mL的MeOH∶TBME(叔丁基甲醚)(1∶1，v/v)溶液中，再用0.45μm的过滤器过滤。将样品储存在小瓶中以待HPLC分析。

[0136] 在装有Shimadzu 10Avp泵和控制器的PDA(SPD-M10Avp)和YMC(3μm-C30-反相，250x4.6mm)柱和前置柱(Delta-pak C185μm Waters)上进行HPLC。使用溶剂A(MeOH-MTBE-水-三乙基胺，90∶6∶4∶0.1，v/v/v)和溶剂B(MeOH-MTBE-水-三乙基胺，6∶90∶4∶0.1，v/v/v)作为流动相。等强度溶剂A在梯度条件下流动直至15分钟后达到100％，40分钟后更换为100％溶剂B，45分钟后再换为溶液A，50分钟后达到稳定。
在450nm的波长和0.8mL/min的流速下，上样30μL的样品并使用以下公式测量分析数据。

[0137] 含量(单位：μg/100g)＝(样品面积x内标使用量(0.5mg)x转化因子(100000))/(内标面积x使用样品量(3g))

[0138] 在这种情况下，除苏丹II、α-和β-胡萝卜素(Sigma)以外的大部分标准物都是从Extrasynthese获得的。这些步骤在黑暗条件下进行并在所有溶剂中加入1％BHT以防止酸化。将所述溶液用铝箔包裹并储存在-20℃下备用。

[0139] 结果，当检测标准类胡萝卜素(叶黄素、玉米黄质、β-胡萝卜素等)时，观察到PAC4-2系含有相当多的总类胡萝卜素(548μg/100g)，尤其是β-胡萝卜素(403μg/100g)。

[0140] (10-2)植物种子II中的类胡萝卜素含量的测量

[0141] 为获得更客观的含量数据，首先请求食品分析的权威组织韩国食品研究所(Korea Food Research Institute)对3种转化水稻样品(普通洛东稻、PAC2-1和PAC4-2)进行了β-胡萝卜素分析。然后，又请求韩国食品研究所对4种转化水稻样品(普通洛东稻、PAC4-2、PAC10-3和PAC11-2)进行了β-胡萝卜素分析[Food Code(2006)，Analysis of TraceNutrients]。

[0142] 结果，在首次分析中观察到PAC2-1和PAC2-1系分别包括0.474mg/100g和0.536mg/100g的β-胡萝卜素水平，但在普通水稻(洛东稻)中根本未检测到β-胡萝卜素。在第二次分析中，检测到PAC4-2、PAC10-3和PAC11-2分别包括1.271mg/100g、
1.000mg/100g和0.910mg/100g的β-胡萝卜素水平。因此，确定了当引入本发明的多顺反子重组PAC基因时，每100g水稻中生成约0.5-1.3mg的β-胡萝卜素。

[0143] <实施例11>源自CrTMV(感染十字花科植物的烟草花叶病毒)的内部核糖体结合位点的合成

[0144] 内部核糖体结合位点是一种取代帽结构的机制，一种常见的真核生物翻译机制，见于病毒、昆虫、动物等。CrTMV-IRES序列(SEQ ID NO：31)源自一种植物病毒CrTMV(感染十字花科植物的烟草花叶病毒)，并对应衣壳蛋白上游的150bp。为合成CrTMV-IRES序列，设计了由分别在21、20和25mer重叠的53、53、54和56mer构成的4种引物(1F，SEQ ID NO：32；2R，SEQ ID NO：33；3F，SEQ ID NO：32；4R，SEQ ID NO：32)。

[0145] 1F (5′-ACGAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGA-3′：SEQ ID NO：32)，

[0146] 2R (5′-ACTACACCCTTTTCTTCAACCTTCTTTTTCCTTCTTTTAAAGTTGTCAACCGC-3′：SEQ ID NO：33)，

[0147] 3F (5′-GTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCC-3′：SEQ ID NO：34)，and

[0148] 4R (5′-TTTCTTCTTTCAAATTAAACGAATCAGGACCGGCGTACTTCTCCGGTCTGTACTTA-3′：SEQ ID NO：35)

[0149] 将每种合成引物稀释至40pmole/μL。然后，制备含有1F和4R引物各1μL以及2R和3F引物各2μL的反应混合物作为底物和引物，并在下列条件下进行PCR扩增反应：95℃ 10秒、58℃ 10秒、72℃ 10秒，重复35个循环。将所得150bp的PCR产物连接到pGEM-T easy载体(Promega)中并通过进行核苷酸测序来分析。构建了pCrTMV-IRES载体并用于以下实验。

[0150] <实施例12>克隆多顺反子PIC基因以生产β-胡萝卜素

[0151] 为了制备生产β-胡萝卜素的PSY和CrtI的多顺反子PIC基因，需要再将导肽(Tp)--一种对将CrtI酶蛋白移向β-胡萝卜素生物合成位点(质体如叶绿体和淀粉体)必需的转移信号--连接到细菌CrtI基因上。因此，将源自水稻核酮糖二磷酸羧化酶/氧合酶小亚基(rbcS-Tp)的150bp的Tp基因连接在CrtI基因的5′-上游区域。为此，将包含水稻rbcS基因的pSK-RTG载体用作模板并加入在两端含有限制性内切酶PstI和NcoI的识别位点的引物对SEQ ID NO：36(5PTp引物)和SEQ ID NO：37(3Nc-Tp引物)来进行PCR。然后，将160bp的PCR产物用限制性内切酶PstI和NcoI消化并连接到pGEM-T easy载体中。从而构建了pGEM-Tp载体。

[0152] 为在Tp序列的下游连接CrtI基因，在CrtI基因的两端加入限制性内切酶NcoI和ApaI的识别位点。具体地，将pGEM-CrtI载体用作模板并加入引物对SEQ ID NO：38(5Nc-CrtI引物)与SEQ ID NO：20(3Ap-CrtI引物)来进行PCR。然后，将1.5kb的PCR产物用限制性内切酶NcoI和ApaI消化并连接到经相同酶消化的pGEM-Tp载体中Tp序列的3′-下游区域。从而构建了pGEM-Tp-CrtI载体。

[0153] 为在CrTMV-IRES基因的末端引入限制性内切酶SacI和BamHI的识别位点，将pCrTMV-IRES载体用作模板并加入引物对SEQ ID NO：40(5SacIRES引物)和SEQ ID NO：41(3SacBamIRES引物)来进行PCR。然后，将所得的PCR产物用限制性内切酶SacI消化并连接到经相同酶消化的pGEM-Tp-CrtI戴体中。从而构建了pGEM-IRES-TpCrtI载体。

[0154] 为将Psy基因克隆到CrTMV-IRES基因的上游，用限制性内切酶EcoRI消化pCR2.1-Psy载体以分离1,257bp的Psy基因并将其连接到经相同酶消
化的pGEM-IRES-TpCrtI载体上。然后，分析所述核苷酸 序列。从而构建了
pGEM-Psy-IRES-TpCrtI(或pGEM-PIC载体)。整个PIC基因的核苷酸序列由3,077bp组成(SEQ ID NO：42)。

[0155] <实施例13>用于水稻转化的质粒的构建

[0156] 为构建用于水稻转化的诱导水稻内胚乳特异表达的质粒载体，将pGEM-PIC载体用作模板并设计引物对SEQ ID NO：43(PIC-B1引物)和SEQID NO：44(PIC-B2引物)以在两端含有部分细菌特异性核苷酸序列(attB1和attB2)(各为12bp)。因此，当噬菌体感染细菌时，可特异地扩增PIC基因。进行PCR反应以扩增3101bp的PIC基因。

[0157] 当噬菌体感染细菌时，通过使用被设计为含有整个细菌特异性序列(各为29bp)的引物对SEQ ID NO：45(attB1引物)和SEQ ID NO：46(attB2引物)，使用引物对(PIC-B1和PIC-B2引物)扩增PIC基因的PCR产物再次反应。

[0158] 当噬菌体感染细菌时，将所得PCR产物克隆到含有噬菌体特异性序列(attP1和attP2)的pDONR221载体(Invitrogen)中。通过此BP反应，构建了pENTR-PIC载体。

[0159] 为将pENTR-PIC载体中包含的PIC基因转移到用于水稻转化的最后载体中，pMJ-103载体通过LR反应进行反应以构建用于植物转化的pGlb-PIC载体(见图9)。在这种情况下，pMJ-103载体为一种含有水稻内胚乳特异的球蛋白(Glb)启动子、土豆蛋白酶抑制剂II(Pin II)终止子和在35S启动子下游作为植物选择性标记的除草剂抗性Bar基因的通道载体，而其骨干为pSB11载体，一种含有作为选择性标记的壮观霉素抗性基因的超二元质粒。

[0160] 使用一种常规方法(三亲交配)将pGlb-PIC载体引入用于水稻转化的农杆菌中。具体地，将用含有超二元质粒的pSB1载体转化的根癌农杆菌LBA4404在添加有四环素(10mg/L)的AB培养平板(AB-t)上在28℃下培养2-3天，其中所述超二元质粒包括vir基因。2天后，将含有一种夫妻辅助质粒pRK201的大肠杆菌HB101和含有pGlb-PIC载体的大肠杆菌DH-5α分别在添加有卡那霉素(50mg/L)和壮观霉素(50mg/L)的LB培养平板上在37℃下过夜培养，从而收集全部3种菌落。将这3种菌落与注射环混合，并且在营养琼脂平板(Difco)上在28℃下过夜培养。将所得细菌用培养肉汤(或水)稀释10倍，在添加有壮观霉素(50mg/L)和四环素(10mg/L)的AB培养平板(AB-st)上划线以分离单个细胞，然后在28℃下培养3天。将AB培养平板(AB-st)上出现的单个菌落再次划线并在28℃下培养
3天，以当再次出现时选择最终的单个菌落(根癌农杆菌LBA4404pGlb-PAC)。将所得农杆菌接种到添加有壮观霉素(50mg/L)和四环素(10mg/L)的YEP培养肉汤(YEP-st)中并振荡培养2天。然后，提取质粒以分析限制性消化模式。结果，再次确定了农杆菌被pGlb-PIC基因转化。。接着，使用根癌农杆菌LBA4404 pGlb-PIC来转化水稻。。

[0161] <实施例14>农杆菌植物转化和收获水稻转化体后种子的颜色

[0162] 如实施例5所述完成相同的程序，但使用pGlb-PIC载体替代pGlb-PAC载体来转化水稻。

[0163] 结果，根据种子的黄色深度比较7株上述获得的pGlb-PIC基因(PIC-3、4、5、6、7、8和9)转化的再分化水稻。由于它们分别在不同的阶段再分化，因此检测在T2种子中产生β-胡萝卜素的PIC4、5、6、7和8系以及在T1种子中产生β-胡萝卜素的PIC3和9系以比较在产生β-胡萝卜素后呈现的黄色深度。收获后，将每系的成熟种子用水稻脱壳机(TR-200电动水稻脱壳机，Kett产品)去壳，然后用精米机(Pearlest精米机，Kett)精制
1分钟以去除糊粉层。将这些精制的水稻相互比较。

[0164] 因此，用裸眼观察到PIC8呈现最深的黄色而PIC4、5、6和7呈现相似的比PIC8淡的黄色。对于PIC3和9系，T1代种子趋于呈现比T2代种子浅的黄色(见图10)。

[0165] <实施例15>植物转化体的分离、PCR分析和DNA印迹分析

[0166] 在转化的水稻中，选择PIC4、5、6、7和8来收集叶组织。然后，使用基因组DNA纯化试剂盒(I.J.BIO DNA System)提取并纯化基因组DNA。。通过用UV分光光度计在A260/A280下测量光密度来对所得DNA洗出液进行定量。将100ng的基因组DNA用作模板并加入10pmol的含有CrTMV-IRES的引物对以进行PCR反应。所述引物对由含有Psy基因C-末端的SEQ ID NO：47的Psy-CT-Fw引物和含有CrtI基因N-末端的SEQ IDNO：48的CrtI-NT-Rv引物组成。将其与10xTaq聚合酶缓冲液(250μMMgCl2、100μM dNTP、1单位Pyrobest聚合酶(Takara))以将总体积调节到20μL，并在以下条件下进行PCR扩增反应：95℃ 30秒、
55℃ 30秒、72℃ 30秒，重复30个循环，再在72℃下延伸10分钟。结果，如预期的发现了
460bp的PCR产物(见图11)。

[0167] 每系取5μg上面分离的基因组DNA，用限制性内切酶BamHI和XbaI消化并通过32
琼脂糖凝胶电泳进行分析。然后，使用207bp的 P-标记的Psy基因和420bp的CrtI基因作为探针来识别插入基因。在除PIC8以外的PIC4、5、6和7中发现了1.4kb和4.1kb的插入基因。但在PIC8中，在用限制性内切酶XbaI消化DNA后，当用CrtI探针进行DNA印迹时检测到了至少3个信号带。因此，据猜测它们可引发CrtI基因周围的插入基因的重排。
然后，为计算基因拷贝数，将5μg相同的基因组DNA用限制性内切酶EcoRI消化，通过琼脂
32
凝胶电泳分析，并使用1.3kb的 P-标记的Mar基因作为探针进行印迹。结果，PIC5、6和7清晰地显示出两个Mar信号带(左边：1.3kb的Mar信号带；右边：由于水稻基因组DNA在未知位点被限制性内切酶EcoRI消化，因此根据插入位点不同而大小不同的Mar信号带)。
通过使用Mar基因作为探针，此结果证明插入了一个基因拷贝。此外，PIC4显示出了2个基因拷贝的情况下期望的信号模式。PIC8显示出了3个以上基因拷贝的情况下期望的信号模式(见图12)。

[0168] <实施例16>植物转化体的RT-PCR分析

[0169] 从在转化植物中收获的水稻中提取总RNA，并分析以根据多顺反子位点检测PIC基因的表达。具体地，为提取总RNA，每系取1g水稻样品浸泡约2小时，在液氮下用混合碗充分粉碎并与5mL RNA提取缓冲液[200mMTris-HCl(pH 9.0)、400mM LiCl、25mM EDTA(pH8.2)、1％SDS]以及5mL苯酚剧烈混合。将所述混合物转移到一个15mL的试管中，以
3,000rpm离心10分钟并将上清液小心地转移到一个新试管中。然后，加入1mL氯仿和1mL苯酚，振荡并再次以3000rpm离心10分钟以收集上清液。然后，小心地将所述上清液转移到一个新试管中，并在加入2mL氯仿后充分振荡以萃取所述溶液。将此过程重复两次。将所得上清液转移到一个新试管中，加入2.5倍体积的乙醇和0.1倍体积等量的3M乙酸钠(pH
5.2)，然后在-20℃下储存1小时。然后，以12000rpm在4℃下离心10分钟以收集DNA和RNA沉淀，溶解于2M氯化锂(LiCl)溶液中并在-20℃下孵育2小时以上以沉淀RNA。将所得RNA沉淀用80％EtOH洗涤一次并溶解于80-100μL的DEPC溶液。通过用UV在A260/A280处测量光密度来对所述RNA提取物进行定量，以进行mRNA选择性RT-PCR。

[0170] 将1μg的总RNA用作模板并使用商品试剂盒(TAKARA mRNA选择性RT-PCR试剂盒[1xRT缓冲液、5mM MgCl2、1mM dNTP、50μM Oligo dT引物、核糖核酸酶抑制剂(0.1单位/μL)、AMV RTase XL(0.1单位/μL)]，Takara，日本)进行扩增。为合成cDNA，将其在30℃下反应10分钟，在42℃下反应30分钟，然后在4℃下冷却。。所合成的cDNA与下列引物对反应。精确地，使用以下引物对进行PCR，即PST基因特异的引物对SEQ IDNO：49和SEQ ID NO：50；Tp-CrtI基因特异的引物对SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52；对PIC基因的460bp SL(小长度)的CrTMV-IRES序列特异的引物对SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48；扩增PIC基因全长的引物对SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54；以及确认RNA的固定相对量的水稻谷蛋白特异的引物对SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：56。

[0171] 结果，Psy基因、CrtI基因、PAC_SL基因、PAC_FL基因的全部转录物都未在完整水稻种子(洛东稻)中检测到，但所述全部转录物都在各自的转化水稻种子中以估计大小被清楚地检测到。当使用谷蛋白作为对照组时，在PIC转化体的4个位点比较基因表达的程度。据鉴定，所述表达在除PIC8以外的所有系中都是相似的(见图13)。

[0172] <实施例17>植物转化体的种子的HPLC分析

[0173] 请求食品分析的权威组织韩国食品研究所(Korea Food ResearchInstitute)对转化水稻样品进行了β-胡萝卜素分析[Food Code(2006)，Analysis of Trace Nutrients]。结果，如预期的，观察到PIC4、5、6和7系分别以相似的水平包括183μg/100g、171μg/100g、195μg/100g和206μg/100g的β-胡萝卜素，但在普通水稻(洛东稻)中未检测到β-胡萝卜素。因此，确定了当引入本发明的多顺反子重组PIC基因时，每100g水稻中生成约0.2mg的β-胡萝卜素。

[0174] 工业实用性

[0175] 如从前述可见的，本发明的融合多核苷酸和使用其的重组载体对八氢番茄红素合酶基因和胡萝卜素去饱和酶基因在细胞转化体中的表达有作用。因此，本发明的融合多核苷酸可用于调控生产β-胡萝卜素的植物的生物合成代谢。此外，其还可用于有效增加一种有用的代谢产物β-胡萝卜素的含量。