[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请根据USC 119(e)要求2012年8月22日提交的美国临时申请第61/692,170号的权益，其通过引用其全文纳入本文用于所有目的。

[0003] 联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明

[0004] 本申请是在国家健康研究院奖金号R01 AI042801、R01HL 105770、R56AI08953和R01HL105704的政府支持下完成。政府对本发明拥有某些权利。

[0005] 本发明涉及如下发明：新型多瘤病毒(暂定名为MX多瘤病毒(MXPyV))及其核酸、蛋白质、疫苗、组合物、试剂盒、用于检测和诊断MXPyV感染的方法、用于治疗或预防MXPyV感染的方法，以及用于鉴定抗MXPyV化合物的方法。

[0006] 多瘤病毒是小型环状DNA病毒，其可导致动物和人类的持续感染，还可能具有致瘤性(21)。在人体中，多瘤病毒还与多种疾病相关：从进行性多灶性白质脑病(PML)(JCV，JC病毒)到肾病(BKV，BK病毒)到梅克尔(Merkel)细胞癌(MCV，梅克尔细胞病毒)(9,23,31,32)。目前对于新型多瘤病毒的鉴定和表征所作努力是重要的，因为这能为确定潜伏感染和病毒致癌作用带来有价值的理解。

[0007] 最初描述于1971年(25,41)的人多瘤病毒JCV和BKV彼此在遗传上紧密相关，并且在成人中显示70-80％的血清阳性率(37)。BKV能够在肾中建立慢性感染(47)，并导致移植患者中的肾病和出血性膀胱炎(9)，但在来自健康个体的尿液中也能检出该病毒(37)。JCV也可能潜伏性地感染肾(44)，但在免疫功能不全的个体中，尤其是在HIV患者中，其能够入侵中枢神经系统并导致PML，与头痛、记忆力丧失和神经功能缺陷相关联的致命性脱髓鞘疾病(31)。直至2007，仅已知感染人类的两种多瘤病毒JCV和BKV，但此后的测序技术的近期发展导致发现了七种其它的人多瘤病毒。WU和KI多瘤病毒最初在2007年描述于患有急性呼吸疾病的儿童中(4，26)，但对于这些病毒在呼吸疾病中的具体致病作用仍然存在争议(6)。已发现这些病毒感染多至7％的儿童的呼吸道(1，4，8，26，30，45，58，59)，伴随或不伴随呼吸道症状，并且，正如BCV和JCV，儿童和成人中的血清阳性率较高，超过50％(36)。
MCV首先描述于2008年，其与罕见但侵袭型的皮肤癌(称为梅克尔细胞癌(MCC))相关联(23)。在肿瘤细胞中，MCV整合进入宿主基因组，但因病毒T抗原中的截短突变而无法复制(51)。MCV在肿瘤发生中的直接病因作用由敲减病毒T抗原之后的细胞死亡和MCC肿瘤消退得到证明(32)。自从发现了MCV，发现了感染皮肤的三种新型多瘤病毒，HPyV6、HPyV7和TSV(刺型毛发发育异常(trichodysplasia spinulosa)相关多瘤病毒)(49，54)，和来自免疫抑制患者血液的第九种多瘤病毒，HPyV9(50)。迄今为止，这四种新发现的病毒，除了TSV及其相关的增殖性皮肤疾病(称为刺型毛发发育异常)(35)的可能例外，均尚未与人类疾病相联系。

[0008] 无偏差DNA测序正快速成为病原体发现的上选方法，因为对临床样品的高通量或“深度”测序有助于鉴定新型、高度差异化的病原体，而所述病原体会避开传统PCR试验的检测(18，53)。先前已显示，对于已知病毒和候选新型病毒而言，通过鸟枪测序约一百万读数/临床样品，能获得的检测灵敏度与PCR相当(<100个拷贝/mL)(28)。

[0009] 本发明基于申请人对新型多瘤病毒(暂定名为MX多瘤病毒(MXPyV))的发现，其最初分离自墨西哥一名儿童的腹泻粪便。后续的粪便样品的PCR筛选显示MXPyV具有广泛地理流行性。该多瘤病毒的检测可用于诊断、监测或预后确定某些癌或胃肠疾病例如胃肠癌、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻，协助治疗免疫功能不全的个体，以及鉴定患有GI疾病或癌的患者和提高对此类GI疾病或癌的敏感性的遗传疾病的带病者。

[0010] 因此，所要求保护的主题提供能用于检测、治疗和预防以及调节MXPyV感染的组合物和方法。

[0011] 在一个方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含长为至少100个核苷酸的核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:1或其互补体中的相同长度的部分具有至少90％的序列相同性，其中所述序列排除多瘤病毒MWPyV(St.Louis毒株)和HPyV10的序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列在其长度上与SEQ ID NO:1具有至少95％的相同性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的全长具有至少90％的相同性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的全长具有至少95％的相同性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:1。

[0012] 在另一个方面，本发明提供包含本文所述核酸的分离的表达载体。

[0013] 在另一个方面，本发明提供包含本文所述的表达载体的分离的宿主细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞不是MXPyV的天然宿主细胞。而在其它实施方式中，所述宿主细胞是重组宿主细胞。在其它实施方式中，所述宿主细胞是非人宿主细胞。

[0014] 在另一个方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含长度为至少100个核苷酸的核苷酸序列，所述序列与选自SEQ ID NO:2-7的开放阅读框具有至少90％的序列相同性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO:2-7的开放阅读框具有至少95％的相同性。在一些实施方式中，所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:2-7的开放阅读框。

[0015] 在另一个方面，本发明提供由本文所述核酸序列编码的分离的肽。

[0016] 在另一个方面，本发明提供与本文所述的肽特异性结合的分离的抗体。在一些实施方式中，所述抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。

[0017] 在另一个方面，本发明提供用于检测生物样品中的多瘤病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

[0018] (a)使所述生物样品与引物接触，所述引物与选自SEQ ID NO:1-7的核苷酸序列杂交；

[0019] (b)进行核酸扩增反应以生成扩增子；和

[0020] (c)用探针检测所述扩增子，所述探针在严谨杂交条件下与SEQ ID NO:1-7杂交。

[0021] 在另一个方面，本发明提供用于检测生物样品中的多瘤病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

[0022] (a)使所述生物样品与本文所述的抗体接触；和

[0023] (b)检测所述抗体与所述生物样品中的该抗体的靶抗原的结合，其中所述抗体被固定在固相上，而所述结合的存在指示所述生物样品中有多瘤病毒。

[0024] 在另一个方面，本发明提供一种检测人体生物样品中的抗MXPyV抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

[0025] (a)使疑似包含抗MXPyV抗体的样品与本文所述的固定的肽接触，所述接触在足以允许形成抗MXPyV抗体和所述肽的复合物的时间和条件下进行；

[0026] (b)添加偶联物，保持足以允许所述偶联物结合所述复合物中抗MXPyV抗体的时间和条件，该偶联物包含抗人抗体，其连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物；和[0027] (c)通过检测由信号生成化合物产生的信号来检测所述样品中抗MXPyV抗体的存在。

[0028] 而在另一个方面，本发明提供一种检测人体生物样品中的抗MXPyV抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

[0029] (a)将疑似包含抗MXPyV抗体的样品与固定的抗人抗体接触，所述接触在足以允许所述抗MXPyV抗体与所述固定抗体形成复合物的时间和条件下进行；

[0030] (b)添加偶联物，保持足以允许所述偶联物与所述复合物的抗MXPyV抗体结合的时间和条件，该偶联物包含本文所述的肽，其连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物连接；和

[0031] (c)通过检测由信号生成化合物产生的信号来检测所述样品中抗MXPyV抗体的存在。

[0032] 而在另一个方面，本发明提供一种检测人体生物样品中的抗MXPyV抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

[0033] (a)将疑似包含抗MXPyV抗体的样品与固定的抗人抗体接触，所述接触在足以允许所述抗MXPyV抗体与所述固定抗体形成复合物的时间和条件下进行；

[0034] (b)添加本文所述的肽，保持足以允许所述肽结合至所述复合物的抗MXPyV抗体的时间和条件；

[0035] (c)添加偶联物，保持足以允许所述偶联物结合所述复合物的抗MXPyV抗体所结合肽的时间和条件，该偶联物包含重组抗MXPyV抗体，其连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物连接；和

[0036] (d)通过检测由所述信号生成化合物产生的信号来检测所述样品中抗MXPyV的存在。

[0037] 在另一个方面，本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本文所述的分离的肽。

[0038] 在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含引物，该引物能杂交含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

[0039] 在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的抗体。

[0040] 而在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的MXPyV抗原。附图说明

[0041] 图1显示MXPyV的基因组组成。MXPyV的4,939-nt的环状基因组(A)包含VP1、VP2、VP3、ST-Ag和LT-Ag的编码区(黄色箭头)。C1、C2和C3(灰色)表示从深度测序数据重新组装的毗连群。(B)MXPyV的剪接的LT-Ag和ST Ag中存在的结构域和结合基序。

[0042] 图2显示MXPyV相对于其它多瘤病毒的氨基酸进化分析。(A)VP1，(B)VP2，(C)ST-Ag，(D)LT-Ag。贝叶斯(Bayesian)支持水平在各分枝点处指示。缩写：AGM，非洲绿猴；SV40，猿猴病毒40；SV12，猿猴病毒12；SqMPy，松鼠猴；CaliSeaLion，加利福尼亚海狮。其它缩写在文字中有描述。请注意，梅克尔细胞病毒(MCV)不包括在LT-Ag进化系中，这归因于截短突变的存在。

[0043] 图3是MXPyV序列。提供鉴定了开放阅读框的完整MXPyV序列。

[0044] 图4显示MXPyV相对于其它近期描述的肠相关多瘤病毒HPyV10和MWPyV的全基因组序列比对。

[0045] 发明详述

[0046] 本文描述了通过深度测序腹泻样品来对高度分化的新型多瘤病毒的完整基因组进行鉴定和测序。按照人多瘤病毒的双字母命名法，该病毒被暂定名为MX多瘤病毒(MXPyV)，按照所鉴定的初始分离物的来源国家命名。该约5.0kb的病毒基因组显示与已知多瘤病毒很弱的总体同源性(<46％的氨基酸相同性)，并且因为其个体蛋白质之间的进化变异，无法将其归类于任何现有的分类学分组中。

[0047] MXPyV的基因组组成和氨基酸序列同源性，以及T抗原中已知蛋白质基序的保守性，指示该病毒确实是多瘤病毒。MXPyV广泛分布，并已回收自两个大陆的腹泻样品。此外，来自不同个体的MXPyV分离物显示0–4.3％的序列差异，并且在新生到6岁的儿童中检测到该病毒。总之，这些发现强烈指示人类是天然宿主，但还需要所述病毒在培养中的生长和血清学研究来最终确定。

[0048] 根据进化分析，MxPyV并不与任何其它多瘤病毒分类学组成簇，并且事实上，反而是编码VP1的MXPyV ORF和大T抗原能与一些近期发现的人多瘤病毒(WU、KI、HPyV6和HPyV7)成簇，VP2、MXPyV似乎能与啮齿类动物多瘤病毒更好归类。相反，MXPyV的小T抗原似乎不与任何已知多瘤病毒组成簇。这些观察结果，以及MXPyV的蛋白质与其它多瘤病毒的那些蛋白质的13-44％的低氨基酸相同性(表1)，说明MXPyV的原始毒株可能在进化通路早期已分化，并形成了多瘤病毒基因重组的可能性。尽管多瘤病毒中的重组仍存在争议，但其似乎至少并未出现在JC病毒中(16)。通过重排分析(bootscanning analysis)并未检测到个体基因中重组的证据(数据未显示)，但可根据MXPyV的高度序列分散性和缺乏紧密相关的进化邻居而预计到这点。因为多瘤病毒的进化树目前较为稀疏，只有不到30个成员，所以位于高度分化枝上的MXPyV可能代表多瘤病毒新子进化枝的首位成员。

[0049] 不像近期在呼吸分泌物或皮肤组织中发现的其它多瘤病毒，MXPyV的检测看来很大程度上局限于粪便，其中在收集自加利福尼亚、墨西哥和智利的粪便样品中有3.4％的流行度(表2)，尽管136例呼吸样品中有一例样品(0.74％)也检测为阳性。SV40、BKV、JCV和MCV在人粪便中也有检出(38，55，56)，尽管其病理学原发位置是人体内的其它位置，多瘤病毒WU和KI也有检出(4，5，46)。因此，尽管MXPyV在粪便中检出且罕在呼吸分泌物中检出(表2)的情形与多瘤病毒传播的一般粪-口途径的假设(55)相一致，但胃肠道可能不是MXPyV的原始组织蓄积位置。在来自高度免疫功能不全的移植受者的480例血浆/尿液样品未检出MXPyV，指示这些并不是MXPyV感染的蓄积位置，如同JC和BK病毒的情况。需要对健康和患病个体中的MXPyV进行进一步研究，以确定在人体中是否确实存在MXPyV的组织蓄积处。

[0050] 在加利福尼亚和智利胃肠炎研究(有可用对照)中未检出MXPyV感染和腹泻之间的关联(表2和3)。事实上，在来自智利的样品中，该趋势是相反的，在96例无症状对照个体间有4例MXPyV367阳性样品，而在96例腹泻儿童中无阳性样品(表1)。然而，鉴于粪便样品中3.4％的低流行率以及腹泻病毒感染中较大比例无症状的事实(7，39)，这些结果并不排除MXPyV是腹泻的病原物质的可能性。值得注意的是，来自墨西哥的12例MXPyV372阳性腹泻样品经过针对全部已知腹泻病毒(补充表1)的广谱病毒微阵列和特异性PCR试验检出其中有6例呈阴性，表明MXPyV仍然可能是胃肠炎的一种病因。在腹泻发作之前和之后的血清学测试将有利于研究该可能性，如同人类心病毒(cardiovirus)和克拉斯病毒(klassevirus)/赛利病毒(salivirus)所先前显示的那样(13，29)。

[0051] 在加利福尼亚SIFT研究中，相对于男孩，在女孩中观察到显著增加的MXPyV感染数(13位女性相对4位男性，p＝0.012)(表4)。考虑到对于梅克尔细胞病毒(MCV)于儿童时期初始感染的血清学研究中已经描述的明显性别差异(11)，该观察结果十分具有吸引力。在上述血清学研究中，就MCV而言，男性比女性显示更高的血清转化率和血清阳性率。对于成人中的MCV血清阳性率而言并没有观察到该明显性别差异(36)，尽管性别似乎显著影响着与梅克尔细胞癌相关联的发病率和存活率(2，3)。获得MXPyV的年龄、儿童生理学或病毒特征方面的差异是否对本文观察到的性别差异起到作用仍然未知，并值得进一步研究。

[0052] 仍然需要阐明与MXPyV相关联的全部病理学。鉴于在粪便中发现并检测到MxPyV，以及在免疫功能不全个体中潜伏性多瘤病毒感染的较高发生率，值得继续在出现原因不明的腹泻或其它胃肠疾病的移植患者中探究MXPyV。此外，由于MXPyV保留了先前证明在病毒诱导的细胞转化中起作用的保守的CR1、DnaJ、pRB1结合和PP2A结构域(图2A)(17，42，43，57)，MXPyV似乎可能涉及肿瘤发生，现在可通过针对癌组织中的该病毒进行特异性分子测试来正式研究其可能性。在儿童急性胃肠炎发病期间和3个月之后的MXPyV检测表明，与其它人多瘤病毒(27)相似，可能发生MXPyV的持续感染，因而其可能在慢性疾病(例如癌症)发展中起作用。

[0053] 新型多瘤病毒MXPyV的发现进一步确立深度测序是鉴定临床样品中的已知和新型候选病原体的一项有力方法。值得注意的是，尽管MXPyV相对于已知多瘤病毒的低总体氨基酸序列相同性，从100-bp的短深度测序读取仍可鉴定出MxPyV的三个分开区域，包括与LT-Ag的保守起点结合结构域准确重叠的回收的毗连群(图1A，“C3”和1B，“起始结合结构域”)。随着对于新型病原体鉴定具有重要性的甚至更长的深度测序读取长度以及超过每次运行十亿读取的常规产出的出现，现在能够以空前的深度探索健康和患病状态的人体病毒组(virome)。

[0054] 提供用于鉴定、分离、表达、纯化、检测、治疗、预防和调节MXPyV的组合物和方法。

[0055] 定义

[0056] 除非另有说明，本文所用的技术术语均如本领域技术人员按照其传统用法所理解。分子生物学中常用术语的定义可查询标准教科书(例如，Benjamin Lewin,Genes V(《基因V》)，由牛津大学出版社(Oxford University Press)出版，1994(ISBN 0-19854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology(《分子生物学百科全书》)，由布莱克威尔科学有限公司(Blackwell Science Ltd)出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；
以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(《分子生物学和生物技术：全面案头参考书》)，由VCH出版社公司出版，
1995(ISBN1-56081-569-8))。

[0057] 术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物，及其互补物。除非另有说明，具体核酸序列也隐含包括其保守取代变体(如，简并密码子取代形式)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。除非另有说明，具体的核苷酸序列还可涵盖“剪接变体”，其正如名称所指是基因的可变剪接的产物。转录后，前体mRNA可被剪接，从而该前体mRNA的外显子以不同组合剪接在一起，由单一前体mRNA产生两种或更多种不同的成熟mRNA，其随后可编码不同的多肽。

[0058] 本文关于核酸(例如DNA或RNA)所用的术语“分离的”，指的是分别与该大分子的天然来源中存在的其它DNA或RNA相分离的分子。分离的，意在包括不作为片段天然出现的核酸片段。本文所用的术语分离的还指核酸或肽在通过重组DNA技术生成时基本不含细胞物质、病毒物质或培养基质，或在化学合成产生时基本不含化学前体，或其它化学品。

[0059] 关于两条氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(合适时)的"序列相同性百分比"、"氨基酸序列相同性的百分比"、"基因序列相同性的百分比"和/或"核酸/多
核苷酸序列相同性的百分比"，指的是当序列最优对齐时该两条序列中相同残基的百分比。因此，80％的氨基酸序列相同性指的是在两条最优对齐的多肽序列中有80％的氨基酸相同。序列相同性采用本领域已知的标准技术测定(参见例如，Smith和Waterman,Adv Appl Math,2:482,1981；Needleman 和 Wunsch,J Mol Biol,48:443,1970；Pearson 和Lipman,Proc Natl Acad Sci USA,85:2444,1988；程序，例如威斯康星遗传学软件包中的BLAST、ALIGN、CLUSTAL、GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机工作组，威斯康星州的麦迪逊；以及Devereux等,Nucl Acid Res,12:387-395,1984)。

[0060] 因此，就两条核酸或多肽而言，短语"基本相同"指的是采用标准参数操作的程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)算得，相比参照序列包含至少70％的序列相同性，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％，优选至少98％和优选至少99％的序列相同性的多核苷酸或多肽。指示两条多肽基本相同的一项指示是，第一多肽与第二多肽具有免疫学交叉反应性。通常而言，彼此相差保守氨基酸取代的多肽是具有免疫学交叉反应性的。因此，例如当某一多肽与第二多肽仅相差保守取代时，这两种多肽基本相同。指示两条核酸序列基本相同的另一指示是，严谨条件下(例如，在中至高严谨性范围内)两条分子彼此杂交。

[0061] 对于序列比较，一般将一种序列用作与测试序列比较的参比序列。使用序列比较算法时，测试和参照序列均输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认的程序参数，或者可指定另外的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参照序列的序列相同性百分数。比较窗包括参考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150数量的毗连位置的区段，对两个序列进行最优比对后，可将该区段的序列与相同数量的毗连位置的参比序列作比较。使序列对齐以供比较的方法是本领域熟知的。可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482(1981)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48:443(1970)，通过Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)，通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊科学大道第575号，或通过手工比对和目测(参见例如，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1995增刊))进行最优序列比对以便比较。

[0062] 适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，分别参见Altschul等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。采用BLAST和BLAST 2.0和本文所述的参数来确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得(http://ncbi.nlm.nih.gov/)。.此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累积比对评分，该字命中在沿各序列的两个方向上延伸。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。
BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速率。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，和比较两条链。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用的默认值为：字长3，期望值(E)10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M＝
5，N＝-4，以及比较两条链。

[0063] “MX多瘤病毒”或“MXPyV”既指该病毒的遗传组分，例如，其DNA和RNA转录本、由该基因组编码的蛋白质(包括结构和非结构蛋白质)，又指病毒颗粒。

[0064] 本发明的蛋白质或“MXPyV抗原”将满足如下特征中的一项或多项：(1)由核酸编码的结构和非结构MX多瘤病毒蛋白质，所述核酸所具有的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的至少约25、50、100、200、500、1000或更多个核酸的区域直至其全长序列具有大于约60％的核苷酸序列相同性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的序列相同性；(2)特异性结合至抗体如多克隆或单克隆抗体的蛋白质及其保守修饰的变体，所述抗体针对包含由SEQ ID NO:2-7的开放阅读框编码的蛋白质的氨基酸序列的免疫原产生；(3)由在严谨杂交条件下与对应于SEQ ID NO:2-7的核酸序列的反义链特异性杂交的核酸编码的蛋白质；和(4)与由SEQ ID NO:2-7的开放阅读框编码的蛋白质(优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域)具有大于约60％的氨基酸序列相同性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或或更高氨基酸序列相同性的蛋白质。

[0065] 术语“开放阅读框”或“ORF”指的是一般位于起始或初始信号和终止信号之间的能够被翻译成肽的一定长度的DNA或RNA序列。

[0066] 术语“表达载体”指的是本领域已知的质粒、病毒或其它媒介，可向其中插入或导入用于编码所需蛋白质的核酸序列。

[0067] 术语“宿主细胞”是易于用核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、偶联等的细胞。宿主细胞可源自植物、细菌、酵母、真菌、昆虫、动物等。

[0068] 术语“多肽”或“肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可应用于一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。大分子结构例如多肽结构能以多个构成水平的形式描述。对于该组成的一般讨论(参见例如，Alberts等,Molecular Biology of the Cell(《细胞分子生物学》)(第3版，1994)，和Cantor和Schimmel,Biophysical Chemistry Part I:The Conformation of Biological Macromolecules(《生物物理化学第I部分：生物大分子的构象》)(1980))。“初级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指多肽内的局部有序、三维结构。这些结构通常被称为结构域，例如，酶促结构域、胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和胞质尾结构域。结构域是形成多肽的紧凑型单元的多肽部分，其长度通常为15-350个氨基酸。示例性结构域包括具有酶促活性的结构域。典型的结构域由较少组成的部分(例如a-螺旋和3-折叠的伸展)构成。“三级结构”指的是多肽单体的完整三维结构。“四级结构”指的是由独立三级单元非共价联合形成的三维结构。各向异性(anisotropic)的术语也已知是能量术语。

[0069] 术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的那些。本文中氨基酸可由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知三字母符号或单字母符号表示。同样，核苷酸可按其普遍接受的单字母代码指称。编码的序列中的个体或小部分氨基酸的氨基酸取代、缺失或添加是保守修饰的变体，其中所述的变化导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充且并不排除它们。以下八组各自含有可互相保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(《蛋白质》)(1984))。

[0070] 术语“抗体”指的是一种多肽，该多肽包含来自免疫球蛋白基因或其特异性结合并识别抗原的片段的框架区域。术语“抗原”指的是能够被抗体或由MHC分子呈递时被T细胞受体结合的任何分子。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，它们进而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常而言，抗体的抗原结合区域对于结合的特异性和亲和性而言最为重要。示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体由相同的两对多肽链组成，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VI)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。例如，抗体作为完整免疫球蛋白或由不同肽酶消化所产生的多种成熟表征的片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键连接之下消化抗体，产生F(ab)'2，Fab的二聚体，Fab本身是轻链经二硫键连接于VH-CH1。可在温和条件下还原F(ab)'2以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上是Fab附带有部分绞链区(参见《基础免疫学》(Fundamental Immunology)，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。

[0071] 提及蛋白质或肽时，短语“特异性地(或选择性地)结合”至抗体或“特异性地(或选择性地)与……免疫反应”，指的是确定所述蛋白质的存在(通常在蛋白质和其它生物质的异质群中)的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，特定的抗体与具体蛋白质的结合是背景的至少两倍，且更通常地是背景的高于10～100倍。在这样的条件下与抗体的特异性结合需要抗体是根据其对具体蛋白质的特异性来选出。例如，可选择针对MXPyV抗原产生的多克隆抗体、其多态变体、等位基因、直系同源物和保守修饰的变体，或剪接变体，或其部分，来仅获得与MXPyV抗原而非其它蛋白质发生特异性免疫反应的那些多克隆抗体。该选择可通过减去与其它分子交叉反应的抗体来进行。如本文所述，可利用多种免疫试验形式来选择与具体蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。

[0072] 术语“可检测的部分”或“偶联物”指的是能够直接或间接监测其存在、缺失或水平的任何原子、分子或其部分。本领域技术人员熟知多种可检测部分，并且其可以是通过分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学、光学或化学手段可检测的任何物质。此类可检测的标记物可包括但不限于：磁珠、荧光染料、放射性标记物、酶和比色标记物，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠，其在本文中各有详细描述。

[0073] 术语“疫苗”指的是一种药物组合物，该药物组合物包含诱导动物中免疫学应答的至少一种免疫学活性成分并且可能(但不必)包含增强该活性成分的免疫学活性的一种或多种其它成分。疫苗可额外包含药物组合物通常包含的其它成分。疫苗的免疫学活性成分可包含原始形式的完整病毒颗粒或所谓改良活疫苗(MLV)中的减毒颗粒或通过所谓死疫苗(KV)中通过合适方法灭活的颗粒。可出于如下目的给予包含抗原性物质的疫苗：用于诱导针对MXPyV感染所致疾病的特异性主动免疫。疫苗也能以先前针对MXPyV抗原所产生抗体的形式提供被动免疫。

[0074] 术语“免疫应答”或“免疫学应答”指的是免疫系统对宿主身体中的抗原产生的反应，其包括抗原特异性抗体的产生和/或细胞毒性应答。该术语还指导致针对免疫原性产物的受诱导的感受性(sensitivity)情况的免疫系统应答。

[0075] “生物样品”或“样品”包括组织切片，例如活检或尸检样品，以及为组织学目的获取的冷冻切片。此类样品包括粪便、血液和血液成分或产物(例如，血清、血浆、血小板、血红细胞等)、组织(例如癌组织)、痰、泄殖腔拭子、黏膜、培养的细胞，例如，原代培养物、外植体和转化的细胞、生物液体、尿液等。生物样品通常获自真核生物。取样的组织可以是，例如，皮肤，脑(例如，大脑、小脑、视叶)、脊髓、肾上腺、胸肌、肺、心、肝、嗉囊(crop)、前胃、胃(ventriculus)、十二指肠、小肠、大肠、泄殖腔、肾、法氏囊、脾、胰、肾上腺、骨髓、腰骶部脊髓或血液。接触样品简显普通地指的是暴露至该样品。

[0076] 当述及检测MXPyV的存在时，术语"检测"指的是采用任何方法测定细胞内、细胞上和/或细胞或病毒接触过的培养基中病毒或病毒颗粒(包括病毒抗原)的存在。所述方法的示例包括但不限于：观察细胞变性效应、检测病毒蛋白质，例如通过免疫荧光、ELISA或Western印迹杂交，检测病毒核酸序列，例如通过PCR、RT-PCR、Southern印迹和Northern印迹，核酸杂交、核酸阵列等。

[0077] 短语“MXPyV感染”指的是有或没有症状的细胞或者对象中通过MXPyV的繁殖和/或存在体现的侵入。

[0078] 在用于测试调节MXPyV活性的化合物的试验中，或在用于治疗或预防MXPyV感染的试验中，短语“功能效应”包括测定直接或间接受MXPyV影响的参数，例如，表型或化学效应，例如使病毒基因组复制、病毒RNA和蛋白质生成、病毒包装、病毒颗粒生成(尤其是有复制能力的病毒颗粒生成)、细胞受体结合、病毒转导、细胞感染、抗体结合，诱导细胞或体液免疫应答、病毒蛋白质酶活力等增加或减少的能力。“功能效应”包括体外、体内和离体活性。所述功能效应可通过本领域技术人员已知的任何方式来检测，例如，检测分光光度特性(例如，荧光、吸光度、折射率)的变化；流体力(例如，形状)；色谱性质；或蛋白质的溶解度性质；检测可诱导标志物或蛋白质的转录活化；检测(例如，与抗体结合的)结合活性或结合试验；检测配体或底物结合活性的变化；检测病毒复制；检测细胞表面标志物的表达；检测蛋白质水平的变化；检测RNA稳定性；鉴定下游或报告基因(CAT、荧光酶、0-gal、GFP等)的表达，例如，利用化学发光、荧光、比色反应、抗体结合和可诱导标志物。

[0079] 本文所用术语“测试化合物”或“化合物”或“候选药物”或“调节剂”或其语法等同形式描述待测试其直接或间接调节肿瘤细胞增殖的能力的天然产生或合成的任何分子，如蛋白质、寡肽(如长约5至25个氨基酸，优选长约10至20个或12至18个氨基酸，优选长12、15或18个氨基酸)、有机小分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等。测试化合物可以是测试化合物文库的形式，例如提供足够多样性的组合文库或随机文库。测试化合物任选地连接于融合伙伴，如靶向化合物、拯救化合物、二聚化化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其它官能部分。通常，通过鉴定具有某些所需特性或活性如抑制活性的测试化合物(称为“先导化合物”)，产生先导化合物变体，并评估这些化合物变体的特性和活性，从而产生具有有用特性的新化学实体。这种分析中常常采用高通量筛选(HTS)方法。化合物可以是免疫调节剂，例如MXPyV的抑制剂、活化剂。抑制剂是例如结合至、部分或完全封闭活性、降低、阻止、延迟活化、灭活、脱敏或下调MXPyV的活性或表达的化合物，例如，拮抗剂。活化剂是增加、放开、活化、促进、加强活化、促敏、激动或上调MXPyV活性的化合物，例如，激动剂。抑制剂、活化剂或调节剂也包括MXPyV的遗传修饰形式，例如，活性改变的形式，以及天然产生和和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶或例如小化学分子。

[0080] 短语“有机小分子”指分子量大于约50道尔顿且小于约2500道尔顿，优选小于约2000道尔顿，优选约100至1000道尔顿，更优选约200至500道尔顿的天然产生或合成的有机分子。

[0081] 术语“适体”指的是对靶标有所需作用的非天然产生的核酸。所需作用包括但不限于，结合靶标、催化改变靶标、以修饰/改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、共价连接至靶标作为自毁抑制剂、促进靶标和其它分子之间的反应。适体作用可以是与靶标分子的特异性结合亲和性，所述靶标分子是除了通过主要依赖沃森/克里克碱基配对或三螺旋结合的机制结合至核酸配体的多核苷酸以外的三维化学结构，其中所述核酸配体不是具有被靶标分子结合的已知生理学功能的核酸。

[0082] “siRNA”分子或“RNAi”分子指的是形成双链RNA的核酸，当所述siRNA在与基因或靶基因所在相同的细胞中表达时该双链RNA能够减少或抑制基因或靶基因的表达。因此，“siRNA”指的是由互补链形成的双链RNA。杂交以形成双链分子的siRNA的互补部分通常基本相同或完全相同。在一个实施方式中，siRNA指的是与靶基因基本相同或完全相同，并且形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可与全长靶基因或其子序列相对应。通常而言，所述siRNA长度是至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的各互补序列长度是15-50个核苷酸，并且该双链siRNA长度是约15-50个碱基对，优选约20-30个核苷酸，优选长度是约20-25或约24-29个核苷酸，例如，长度是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。也参见PCT/US03/07237，其全文通过引用纳入本文。

[0083] 术语“反义”指的是与其所杂交的靶核酸分子至少部分互补的寡聚化合物或分子。反义化合物或分子可包括但不限于，寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物和嵌合组合。

[0084] 如果siRNA或反义分子或RNAi分子在该siRNA或RNAi于表达靶核酸的细胞中表达时使该核酸的表达减少至少约10％，则所述siRNA或反义分子或RNAi分子对靶核酸“具有特异性”。

[0085] 术语“处理”或“治疗”包括向对象施加或给予组合物，或向来自被MXPyV感染或具有MXPyV感染症状的对象的细胞或组织施加或给予组合物，其目的在于治愈、复原、减缓、减轻、改变、改善、改进、促进或影响该疾病或病症、该疾病或病症的症状、或该疾病或病症的风险。

[0086] 术语“防止”或“预防”包括阻止或阻碍疾病、紊乱或与MXPyV感染相关联的症状。

[0087] 如本文所用术语“对象”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

[0088] 术语“给予”或“施加”指的是在疗程过程中治疗性或预防性地给予有效量的组合物或药物。预防性的给予可在MXPyV感染的症状特征显示之前进行。

[0089] 本文短语“治疗有效剂量”指的是产生其给予的目的效应的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，且可由本领域技术人员采用已知技术确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(《药物剂型》)(第1-3卷，1992)；Lloyd，The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(《药学混配的艺术、科学与技术》)(1999)；和Pickar，Dosage Calculations(《剂量计算》)(1999))。

[0090] 术语“严谨条件”指通常在核酸的复杂混合物中，探针与其目标子序列杂交，但不与其他序列杂交的条件。术语“杂交”指的是通过互补核苷酸之间的氢键连接，使核酸序列单链形成双螺旋片段的过程。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详细指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes(《生物化学和分子生物学技术—与核酸探针杂交》)，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(核酸测定的杂交原理和方案概览)”(1993)。通常，严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度、pH下的解链温度(Tm)低约5-10℃。

[0091] Tm是50％靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列过量存在，在Tm时50％探针被平衡地占据)。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂交中，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选10倍。示范性的严谨杂交条件可以如下所述：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，42℃培育，或者5×SSC、1％SDS、65℃培育，用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。如果核酸编码的多肽基本相同，那么在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍基本相同。例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严谨的杂交条件下杂交。示范性“中等严谨杂交条件”包括37℃，在40％甲酰胺、1M NaCl、
1％SDS的缓冲液中杂交，并且在45℃下于1×SSC中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。
本领域普通技术人员不难认识到，可利用替代的杂交和洗涤条件提供相似严谨性的条件。
很多文献提供了确定杂交参数的其他指导方法(例如Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，Ausubel等)。

[0092] MXPyV的分离、表达、纯化和检测

[0093] 本文所述的主题依赖重组遗传学领域的常规技术。用于例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或对天然核酸或蛋白质的改变进行修饰，或所述细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达细胞天然(非重组)形式中不存在的基因，或表达其它情况下异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。

[0094] 披露本发明所用的全部方法的基础文本(例如Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)(第2版，2001)；Kriegler，《基因转移和表达：实验室手册》(Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual)(1990)；以及《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等编，1994))。

[0095] MXPyV表达

[0096] 为获得克隆的基因或基因组的高水平表达，通常将核酸亚克隆进入表达载体，该表达载体包含引导转录的强启动子、转录/翻译终止子，以及供转录起始的核糖体结合位点(对于编码蛋白质的核酸而言)。合适的细菌启动子是本领域熟知的，见述于例如Sambrook等和Ausubel等，同上。用于表达所述蛋白质的细菌表达系统可获自，例如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门菌(Salmonella)中(Palva等，Gene22:229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302:543-545(1983)。这类表达系统的试剂盒市售可得。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的，并且也可从市场上购得。逆转录病毒表达系统可用于本发明。

[0097] 用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。该启动子与异源转录起始位点的距离优选和其在天然状态中与转录起始位点的距离大致相同。然而，本领域知道，该距离允许有一些变化而不损失启动子功能。述及核酸的部分时，异源指该核酸包含在天然情况下彼此不存在于同一关系中的两个或更多子序列。例如，所述核酸一般是重组产生的，具有两个或多个来自无关基因的序列，它们经排列组成新的功能性核酸，例如启动子来自一个来源而编码区来自另一来源。相似地，异源蛋白表示该蛋白质包含天然情况下彼此不存在于同一关系中的两个或多个子序列(如融合蛋白)。

[0098] 除启动子以外，表达载体一般还包含转录单元或表达盒，它们含有在宿主细胞中表达该核酸所必须的所有其它元件。因此，表达盒一般包含操作性连接于编码所选核酸的核酸序列的启动子以及有效聚腺苷酸化所述转录物所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止位点。该表达盒的其它元件可包括增强子，如果是基因组DNA用作结构基因的话，还包括具有功能性剪切供体和受体位点的内含子。

[0099] 除启动子序列外，该表达盒也应含有结构基因下游的转录终止区，以便有效终止。终止区可获自与启动子序列相同的基因，或者可获自不同基因。

[0100] 具体用哪种表达载体将遗传信息运输到细胞中并不重要。可使用在真核或原核细胞中表达所用的任何常规载体。标准的细菌表达载体包括质粒，如pBR322、pSKF、pET23D和融合表达系统如MBP、GST和LacZ。也可将表位标签，如c-myc加入重组蛋白中，以提供方便的分离方法。可在表达盒中包含序列标签供于核酸回收(rescue)。标志物例如荧光蛋白、绿色或红色荧光蛋白、13-gal、CAT等可包括在载体中作为用于载体转导的标志物。

[0101] 一般将含有真核病毒调控元件的表达载体用于真核表达载体，如SV40载体、乳头瘤病毒载体、逆转录病毒载体和衍生自EB病毒的载体中。其它示范性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE以及能够在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳房肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或在真核细胞中显示有效表达的其它启动子的指导下表达蛋白质的任何其它载体。

[0102] 还可采用诱导型启动子来调节来自真核载体的蛋白质表达。采用诱导型启动子，通过将诱导剂(例如四环素)的应答元件纳入该启动子，将表达水平与这些诱导剂的浓度相关联。一般而言，仅在诱导剂存在的情况下从诱导型启动子获得高水平表达；基底表达水平是极低的。

[0103] 载体可具有可调节的启动子，例如，tet-调节的系统和RU-486系统(参见，例如，Gossen和Bujard,PNAS 89:5547(1992)；Oligino等，Gene Ther.5:491-496(1998)；Wang等，Gene Ther.4:432-441(1997)；Neering等，Blood 88:1147-1155(1996)；和Rendahl等，Nat.Biotechnol.16:757-761(1998))。这些文献传授候选靶核酸表达的小分子控制。该有利特点可用于确定所需表型是通过转染的cDNA而非体细胞突变所致。

[0104] 一些表达系统具有提供基因扩增的标记，如胸苷激酶和二氢叶酸还原酶。或者，不涉及基因扩增的高产表达系统也是合适的，例如采用昆虫细胞中的杆状病毒载体，其携带多角体蛋白启动子或其它强杆状病毒启动子引导下的所选序列。

[0105] 表达载体中一般包含的元件也包括在大肠杆菌中起效的复制子、编码抗生素抗性以便选择携带重组质粒的细菌的基因和质粒非必需区中用于插入真核序列的独特限制性位点。具体的抗生素抗性基因的选择并不重要，因为本领域已知的许多抗性基因均适用。如果必要，优先选择原核序列，使它们不干扰真核细胞中DNA的复制。

[0106] 可利用标准的转染方法产生细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系来表达大量蛋白质，然后用标准技术纯化(参见例如，Colley等，J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989)；蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)，刊于《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第182卷(Deutscher编，1990))。按照标准技术转化真核和原核细胞(参见例如，Morrison，J.Bact.132:349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，《酶学方法》(Methods in Enzymology)101:347-362(Wu等编，1983))。

[0107] 可采用将外来核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知方法。这些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、基因枪(biolistics)、脂质体、显微注射、原生质载体(plasma vector)、病毒载体和将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质引入宿主细胞的任何其它熟知方法(参见例如，Sambrook等，同上)。唯一必要的是，所用的具体遗传工程方法能够将至少一种基因成功引入能够表达MXPyV蛋白质和核酸的宿主细胞中。

[0108] 将表达载体引入细胞后，在有利于所选蛋白质表达的条件下培养转染的细胞，然后用下述标准技术从培养物中回收。

[0109] 天然产生或重组的MXPyV蛋白质可经纯化用于诊断试验，用于制备抗体(用于诊断和治疗)和疫苗，以及用于检测抗病毒化合物。天然产生的蛋白质可从例如灵长类动物组织样品中纯化。重组蛋白质可从任何合适的表达系统纯化。

[0110] MXPyV蛋白

[0111] 可通过标准技术将该蛋白质纯化至基本纯，所述技术包括用诸如硫酸铵等物质选择性沉淀；柱色谱，免疫纯化法等(参见例如，Scopes，Protein Purification:Principles and Practice(《蛋白质纯化：原理和实践》)(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。

[0112] 纯化重组蛋白时，可使用许多方法。例如，可将具有已确定分子粘附性质的蛋白质与所述蛋白质可逆融合。利用合适的配体或基质，可使特定蛋白质选择性吸附于纯化柱，然后以相对纯的形式由柱释放。然后，通过酶活性去除融合的蛋白质。最后，可利用免疫亲和柱纯化蛋白质。重组蛋白可从任何合适来源纯化，所述来源包括酵母、昆虫、细菌和哺乳动物细胞。

[0113] 重组蛋白可由转化细菌大量表达并纯化，通常而言在启动子诱导之后；但表达可以是组成型的。采用IPTG的启动子诱导是诱导型启动子系统的一个示例。按照本领域标准方法使细菌生长。蛋白质分离采用新鲜或冻存的细菌细胞。

[0114] 细菌中表达的蛋白质会形成不溶的聚集体(“包涵体”)。有数种方案适用于蛋白质包涵体的纯化。例如，包涵体的纯化通常涉及通过破坏细菌细胞对包涵体进行提取、分离和/或纯化，例如，通过在50mM TRIS/HCL pH 7.5，50mM NaCl，5mM MgC12，1mM DTT，0.1mM ATP和1mM PMSF的缓冲液中孵育。细胞悬液可如下裂解：2-3次通过弗氏压碎器，采用Polytron仪器(布林克曼仪器公司(Brinkman Instruments))或冰上声波处理来匀质。裂解细菌的其它方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。

[0115] 必要时，使包涵体溶解，并通常将裂解的细胞悬液离心以去除不需要的不溶性物质。形成包涵体的蛋白质可通过采用合适缓冲液进行稀释或透析来复性。合适的溶剂包括但不限于尿素(约4M～约8M)、甲酰胺(至少约80％，以体积/体积计)和盐酸胍(约4M～约8M)。可用于溶解聚集体形成性蛋白质的有些溶剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)、
70％甲酸，并不适用于本方法，这归因于可能会发生蛋白质的不可逆变性，以及免疫原性和/或活性的缺乏。尽管盐酸胍和类似试剂是变性剂，该变性并非不可逆，并且可在移除(例如通过透析)或稀释所述变性剂之后发生复性，这允许重新形成具有免疫原性和/或生物活性的蛋白质。其他合适的缓冲液为本领域的技术人员已知。人类蛋白质通过标准分离技术(例如，采用Ni-NTA琼脂糖树脂)与其它细菌蛋白质分离。

[0116] 或者，可从细菌周质纯化重组蛋白。在细菌裂解之后，可通过低温渗透刺激加上本领域技术人员已知的其它方法分离细菌的周质组分。为从周质分离重组蛋白，对细菌细胞离心以形成沉淀。将沉淀重悬于包含20％蔗糖的缓冲液。为了裂解细胞，将细菌离心并将沉淀重悬于冰冷5mM MgSO4，并在冰浴中保持约10分钟。将细胞悬液离心并将上清液轻轻倒出并贮存。上清液中存在的重组蛋白可通过本领域技术人员熟知的标准分离技术与宿主蛋白质分离。

[0117] 可采用溶解度分级分离法作为标准蛋白质分离技术用于纯化蛋白质。作为起始步骤，尤其是在所述蛋白质混合物是复合物时，初始盐分级分离法可将许多不需要的宿主细胞蛋白质(或源自细胞培养基的蛋白质)与感兴趣的重组蛋白分离。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效降低蛋白质混合物中的水含量来使蛋白质沉淀。然后，蛋白质可基于其溶解度沉淀。蛋白质越是疏水，其越可能在较低硫酸铵浓度下沉淀。典型的方案包括向蛋白质溶液添加饱和的硫酸铵，从而所得的硫酸铵浓度是20-30％。该浓度将使大多数疏水蛋白质沉淀。然后，弃去沉淀物(除非感兴趣的蛋白质是疏水的)，并向上清液添加硫酸铵至已知能够使感兴趣的蛋白质沉淀的浓度。然后，使该沉淀物在缓冲液中溶解，并在必要时通过透析或透滤法去除过量的盐。依赖于蛋白质溶解度的其它方法，例如冷乙醇沉淀法，是本领域技术人员所熟知的，并且可用于分级分离复杂蛋白质混合物。

[0118] 可利用蛋白质的分子量，通过不同孔径的膜(例如，亚米康(Amicon)或密理博(Millipore)膜)采用超滤将所述蛋白质与较大或较小尺寸的蛋白质分离。第一步，将蛋白质混合物通过孔径分子量截止值低于感兴趣蛋白质分子量的膜来超滤。然后，将超滤渗余物对孔径分子量截止值大于感兴趣蛋白质分子量的膜超滤。该重组蛋白将会通过该膜进入滤液。然后，可如下所述对该滤液进行色谱分析。

[0119] 还可基于蛋白质的尺寸、净表面电荷、疏水性和配体或基质亲和性，采用柱色谱将该蛋白质与其它蛋白质分离。此外，可将针对蛋白质产生的抗体偶联至柱基质，并对该蛋白质进行免疫纯化。所有这些方法均为本领域已知。本领域技术人员应明了，色谱技术可以任何规模，采用多种不同生产商(例如法码西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech))的仪器进行。

[0120] 检测MXPyV的存在与否

[0121] 本文描述检测MXPyV、MXPyV核酸(基因组和基因)、感染对象中的MXPyV抗体和MXPyV蛋白质的诊断试验。

[0122] 检测MXPyV核酸

[0123] 可基于生物样品中MXPyV RNA或DNA的水平来检测MXPyV感染。可采用本发明的核酸序列合成约8-10个核苷酸或更大的DNA寡聚体，其可作为杂交探针用于检测例如疑似带有MXPyV病毒的对象血清中该病毒基因组的存在，或用于就该病毒的存在筛选捐献血液。本发明的核酸序列也允许设计和生成MXPyV-特异性多肽，其可用作诊断试剂检测是否存在该病毒感染过程中产生的抗体。

[0124] 也可采用本发明的核酸序列开发引物。所述引物可用于检测MXPyV、诊断并确定MXPyV病毒载量。可采用任何合适的引物来检测所选基因组、核酸子序列、ORF或蛋白质，例如采用US 20030104009中所述方法进行检测。例如，对象核酸组合物可用作单链或双链探针或引物，用于检测可能存在于生物样品(例如，人类细胞提取物)中的MXPyV mRNA或由所述mRNA产生的cDNA。也可采用本发明的MXPyV多核苷酸产生该多核苷酸的其它拷贝，以产生反义寡核苷酸，以及作为形成三链的寡核苷酸。例如，可在基于聚合酶链式反应(PCR)的试验中采用寡核苷酸引物以扩增源自生物样品的MXPyV cDNA的部分，其中至少一种寡核苷酸引物对该MXPyV多核苷酸具有特异性(即，与该MXPyV多核苷酸杂交)。所述引物长度优选是SEQ ID NO:1或编码MXPyV核酸或多肽的其它多核苷酸序列的至少或约12、15、16、18、20、22、24、25、30、35、40、45或50nt，或是，例如，长度为约12-50nt、15-30nt、15-25nt，或20-30nt)的连续序列片段。然后采用本领域熟知的技术(例如凝胶电泳)来分离并检测扩增的cDNA。类似地，与MXPyV多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸探针可用于杂交试验，以检测生物样品中MXPyV多核苷酸的存在。

[0125] 对PCR而言，尽管退火温度可以根据引物长度在约32℃–48℃变化，约36℃的温度通常用于低严谨扩增。就高度严谨PCR扩增而言，尽管高严谨退火温度可根据引物长度和特异性在约50℃-约65℃范围内，典型温度是约62℃。高严谨性和低严谨性扩增的典型循环条件包括90℃-95℃持续30秒-2分钟的变性阶段，持续30秒-2分钟的退火阶段，和约72℃持续1-2分钟的延伸阶段。例如，在Innis等(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications(《PCR方案：方法与应用指南》，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约)中，提供了低和高度严谨扩增反应的方案和原则。

[0126] 对MXPyV具有特异性的核酸探针或引物可采用本文所述的多核苷酸序列产生。所述探针优选是SEQ ID NO:1或编码MXPyV核酸或多肽的其它多核苷酸序列的连续序列的至少约12、15、16、18、20、22、24或25个碱基的片段。核酸探针的长度可少于约200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、60bp、40bp、30bp、25，2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.25kb、0.1kb 或 0.05kb。
所述探针可通过例如化学合成、PCR扩增、采用限制性酶从较长多核苷酸生成或本领域熟知的其它方法生成。优选的引物和探针与MXPyV核酸序列相同，所述MXPyV核酸序列可通过杂交试验与非MXPyV序列区分开。

[0127] 本文所述的多核苷酸，尤其是作为探针用于诊断试验时，可被可检测标记。示例性的可检测标记物包括但不限于，放射性标记物、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝素、6-羧基荧光素(6-FAM)、2’,7’-二甲氧基-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2’,4’,T,4,7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA))、放32 35 3
射性标记物(例如 p、S和 H)等。可检测标记物可涉及二级系统(例如，生物素-抗生物素蛋白、半抗原-抗半抗原抗体等)。

[0128] 不基于PCR的，序列特异性DNA扩增技术也可用于本发明以检测MXPyV序列。所述技术的一个示例包括但不必限于，侵染检测(Invader assay)(参见，例如，Kwiatkowski等.Mol Diagn.1999年12月,4:353-64.也参见美国专利号5,846,717)。

[0129] 所要求保护的主题还可包括固体基质，例如包含本文所述的任何多核苷酸的阵列。采用本领域已知方法将多核苷酸固定在阵列上。阵列可具有一种或多种不同的多核苷酸。

[0130] 可采用本领域中已知的任何合适的定性或定量方法来检测特定的MXPyV核酸(例如，RNA或DNA)。MXPyV核酸可通过各种方法检测，例如，在组织区段中进行原位杂交，采用检测杂交核酸之间的单碱基对差异的方法(例如，采用如美国专利号5,846,717中所述的侵染子(Invader注册商标)技术)，通过逆转录酶-PCR，或在包含多聚A+mRNA的Northern印迹，以及本领域中熟知的其它方法来检测。为检测血液或血液源性样品中的MXPyV多核苷酸，优选应用允许检测单碱基对错配的方法。

[0131] 采用MXPyV核酸作为基础，可通过从重组多核苷酸切割或合成来制备核酸探针(例如，包括至少约8个或更多个核苷酸的寡聚体)，其中探针与MXPyV核酸杂交，因此可用于检测样品中的MXPyV病毒、鉴定感染的个体，以及进一步表征病毒基因组。用于MXPyV多核苷酸(天然或衍生)的探针的长度或其所具有的序列允许通过杂交检测独特病毒序列。虽然约6-8个核苷酸可能是有用的，但可优选更长的序列，例如，约10-12个核苷酸，或约20个或更多个核苷酸的序列。优选地，这些序列可源自在MXPyV病毒分离物间缺乏异质性的区域。

[0132] 核酸探针可采用常规方法制备，包括自动化寡核苷酸合成方法。MXPyV基因组的任何独特部分的补体都是合适的，所述部分例如能区分MXPyV和样品中可能存在的其它病毒的MXPyV基因组的部分。对于作为探针使用而言，完全互补性是理想的，不过这随着片段长度的增加而并非必要。

[0133] 对于所述探针在诊断学中的应用而言，必要时可处理待分析的生物样品(例如血液或血清)以提取其中包含的核酸。可对获自所述样品的核酸进行凝胶电泳或其它尺寸分离技术；或者，可对所述核酸样品进行斑点印迹而不涉及尺寸分离。所述探针通常用可检测的标记物标记。用于标记探针的合适的标记物和方法为本领域中已知，可包括，例如，通过切口翻译或激酶纳入的放射性标记物、生物素、荧光探针和化学发光探针。然后，在具有合适严谨性的杂交条件下，用标记的探针处理从所述样品提取的核酸。

[0134] 可制备探针使其与MXPyV基因组或其部分(例如，与编码MXPyV小T抗原的序列的全部或部分)完全互补。因此，通常希望采用高严谨性的条件，以防止或至少使假阳性最小化。然而，在所述探针与在MXPyV病毒分离物之间缺乏异质性的病毒基因组区域互补的情况下，应仅采用高严谨性的条件。杂交的严谨性通过杂交期间和清洗步骤期间的多个因素确定，包括温度、离子强度、时间长度和甲酰胺浓度(Sambrook等(1989)，“Molecular Cloning；A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)”第二版(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约冷泉港))。

[0135] 一般而言，预计从受感染个体获得的生物样品(例如，粪便、鼻腔分泌物)中存在2 4 6
相对低水平的MXPyV序列，例如，约10-10条MXPyV序列/10 个细胞。该水平可能需要在杂交试验中采用扩增技术。此类技术是本领域已知的。

[0136] 例如，Enzo生物化学公司的“生物桥(Bio-Bridge)”系统采用终末脱氧核苷酸转移酶向DNA探针添加未经修饰的3’-多聚-dT-尾。带有多聚dT-尾的探针与靶核苷酸序列杂交，然后和生物素修饰的多聚-A杂交。PCT公开号W084/03520和欧洲申请号EPA124221描述了DNA杂交试验，其中：(1)将分析物与单链DNA探针退火，该探针与酶标记的寡核苷酸互补；和(2)使所得的带有尾部的双链体与酶标记的寡核苷酸杂交。EPA 204510描述了DNA杂交试验，其中使分析物DNA接触具有尾部(例如多聚-dT尾)的探针、具有与该探针的尾部杂交的序列(例如多聚-A序列)的扩增链，并且其能够与多种经标记的链结合。

[0137] 特别理想的技术能够首先包括以大约10,000倍扩增血清中的靶MXPyV序列，例如，至约10条序列/mL。这可以例如通过聚合酶链式反应(PCR)技术来进行(Saiki等.(1986),由Mullis，美国专利号4,683,195，和由Mullis等美国专利号4,683,202)。其它扩增方法为本领域熟知。

[0138] 所述探针，或者来自所述样品的核酸，可提供在溶液中用于所述试验，或可使其粘附至支持物(例如，固态或半固态支持物)。能使用的固体支持物实例是硝酸纤维素(如膜或微量滴定孔形式)，聚氯乙烯(如片层或微量滴定孔)，聚苯乙烯胶乳(如珠或微量滴定板、聚偏氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化的珠和蛋白A珠)。

[0139] 探针(或样品核酸)可提供于阵列上以供检测。阵列可例如通过将多核苷酸探针以二维矩阵或阵列的形式点样在基质(例如，玻璃、硝化纤维素等)上来生成。可使探针通过共价键或通过非特异性相互作用(例如疏水相互作用)结合至基质。可对多和氨酸的样品进行可检测标记(例如，采用放射性或荧光标记物)，然后杂交至所述探针。一旦所述样品的未结合部分被清洗掉，即可检测包含了结合至探针多核苷酸的带标记的样品多核苷酸的双链多核苷酸。用于构建阵列的技术和使用这些阵列的方法描述于EP 799897；WO 97/29212；WO 97/27317；EP 785280；WO 97/02357；美国专利号5,593,839；美国专利号5,578,832；EP 728520；美国专利号5,599,695；EP 721016；美国专利号5,556,752；WO
95/22058和美国专利号5,631,734。例如当需要分析单一样品中是否存在两个或更多个核酸靶区域时，阵列是特别有用的，因为在单一阵列上能提供针对各靶区域以及(阳性和阴性)对照的探针。因此，阵列有助于快速且便捷的分析。

[0140] MXPyV抗体

[0141] 针对MXPyV所产生的抗体可用于各种目的，如本文所述，其包括但不限于，用于检测MXPyV的诊断试验。包括MXPyV蛋白质、病毒或核酸的多种免疫原均可用于开发与MXPyV的感兴趣的免疫学表位结合的单克隆和/或多克隆抗体。生成所述抗体的方法为本领域普通技术人员已知(参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256:494(1975)，Mimms等，Virology 176:604619(1990)，Hammerling 等，Protein Purification，Principles and Practice(《蛋白质纯化的原理与实践》)，第2版，纽约Springer-Verlag出版公司，(1984))。

[0142] 例如，重组MXPyV蛋白或其抗原性片段可按本文所述分离。重组蛋白可如上所述在真核或原核细胞中表达，并如上所述进行一般纯化。重组蛋白是用于生成单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。或者，源自本文公开序列并与载体蛋白偶联的合成的肽可作为免疫原使用。可使用纯化或不纯形式的天然产生的蛋白质。然后，将该产物注入能够产生抗体的动物中。可产生单克隆或多克隆抗体供后续用于免疫试验中以检测蛋白质。

[0143] 为制备抗体，例如，重组、单克隆或多克隆抗体，可采用本领域已知的多种技术(参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌治疗》)的第77-96页，Alan R.Liss公司(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(《新编免疫学方案》)(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)(1988)；和Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体：原则和实践》)(第2版.1986))。

[0144] 产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。小鼠(例如，BALB/C小鼠)或兔子的近交品系用带有标准佐剂(例如弗氏佐剂)的蛋白质采用标准免疫方案免疫。通过采集测试血液并测定对β亚基的反应性效价来监测动物对该免疫原制备物的免疫应答。当获得针对该免疫原的适当高的抗体效价时，从该动物收集血液并制备抗血清。必要时，可对该抗血清进行进一步分级分离处理，以富集对所述蛋白质具有反应性的抗体(参见，Harlow和Lane，同上)。

[0145] 可通过本领域技术人员熟知的多种技术获得单克隆抗体。简言之，通常通过与骨髓瘤细胞融合，使采用所需抗原免疫的动物的脾细胞永生化(参见，Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6:511-519(1976))。替代性的永生化方法包括用EB(Epstein Barr)病毒、致癌基因或逆转录病毒转化，或本领域熟知的其它方法。从单一永生化细胞产生的集落就产生对所述抗原具有所需特异性和亲和性的抗体进行筛选，并且由所述细胞产生单克隆抗体的产率可通过各种技术提高，包括注入脊椎动物宿主的腹腔。或者，可根据Huse等人提出的一般方案，来通过人B细胞的DNA文库的筛选来分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列(Huse等，Science 246:1275-1281(1989))。

[0146] 收集单克隆抗体和多克隆血清并针对免疫试验中的免疫原蛋白质滴定，例如，采4
用固定在固体支持物上的免疫原的固相免疫试验。通常而言，选择效价为10或更高的多克隆抗血清并利用竞争结合免疫试验测试其针对非MXPyV蛋白质和核酸的交叉反应。特定多克隆抗血清和单克隆抗体的结合Kd通常至少约0.1mM，更通常与至少约1uM，优选至少约
0.1uM或更佳，以及最优选地，0.01uM或更佳。仅对具体MXPyV蛋白具有特异性的抗体也可通过减除其它交叉反应蛋白质来制备。通过该方式，可获得仅与所选蛋白质结合的抗体。

[0147] 可采用噬菌体展示技术来鉴定特异性结合至所选抗原的抗体和杂聚Fab片段(参见，例如，McCafferty等，Nature 348:552-554(1990)；Marks等，Biotechnology10:779-783(1992))。还可制备具有双特异性的抗体，即，能够识别两种不同抗原(参见，例如，WO 93/08829，Traunecker等，EMBO J.10:3655-3659(1991)；和Suresh等，Methods in Enzymology 121:210(1986))。抗体还可以是异质偶联物(heteroconjugate)，例如，两种共价接合的抗体，或免疫毒素(参见，例如，美国专利号4,676,980，WO 91/00360；WO
92/200373；和EP 03089)。

[0148] 可采用嵌合抗体，其为一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而使抗原结合位点(可变区)连接至类型、效应物功能和/或种类不同或变化的恒定区，或连接至赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分被具有不同或变化的抗原特异性的可变区改变、替代或交换。

[0149] 可采用人源化或灵长类动物化的抗体。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为输入残基，它们一般取自输入可变区。本领域已知人源化或灵长类动物化非人抗体的方法。人源化可基本按照Winter和共事者的方法进行(参见，例如，Jones等，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen 等，Science 239:1534-1536(1988) 和 Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过取代啮齿类CDR或CDR序列为人抗体的对应序列来完成。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体一般是一些CDR残基以及可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。

[0150] 针对MXPyV蛋白、病毒或核酸的特异性抗体一旦可得，该抗原即可采用多种成熟公认的免疫学结合试验中任何一种进行检出和/或定量(参见，例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。可基于表位检测MXPyV病毒颗粒，所述表位由病毒颗粒中存在的病毒蛋白质和/或由分离自病毒颗粒的病毒蛋白质来确定。那么，如本文中所用，“抗原”意在指MXPyV多肽以及MXPyV病毒颗粒。对于免疫试验的概况，也可参见The Immunoassay Handbook(《免疫试验手册》)，第三版(David Geoffrey Wild编，第三版.2005)英国牛津的埃尔斯威尔有限公司(Elsevier Ltd.)；Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology(《细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体》)，第37卷(Asai编.1993)；Basic and Clinical Immunology(《基础与临床免疫学》)(Stites和Terr编，第7版.1991)。免疫学结合试验(或免疫试验)通常采用特异性结合所选蛋白质或抗原的抗体。该抗体可由本领域技术人员熟知的和本文所述的多种方法中的任何方法产生。

[0151] 免疫试验

[0152] 如上所述，本发明包括采用病毒蛋白质或抗原肽，例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag检测针对MXPyV的抗体的方法。更具体地，有两个基础试验类型，竞争型和非竞争型(例如，免疫计量法和夹心法)。各类型可以是定量或非定量的。在用于固相实施方式的两种类型的试验中，抗体或抗原试剂共价或非共价地连接至所述固相。用于共价连接的连接试剂是已知的，并且可以是固相的部分，或者在被覆之前衍生至固相上。用于免疫试验的固相的例子有，多孔和无孔材料、乳胶颗粒、磁性颗粒、微颗粒(参见公开的EPO申请号EP 0 425633)、珠、膜、微滴定孔和塑料管。对于固相材料和标记抗原或抗体试剂的方法的选择基于所需试验形式性能特点来确定。对于一些免疫试验而言，不需要标记物。例如，如果所述抗原位于可检测的颗粒(例如血红细胞)上，则可根据凝集性来建立反应性。或者，抗原-抗体反应可导致可见变化(例如，光免疫扩散)。在大多数情况中，将用于免疫试验的抗体或抗原试剂之一连接至信号生成化合物或"标记物"。该信号生成化合物或"标记物"本身可被检测，或可与生成可检测产物的一种或多种其它化合物反应。所述信号生成化合物的例子包括色原、放射性同位素(例如，125I、131I、32P、3H、35S和14C)、荧光化合物(例如，荧光素、罗丹明)、化学发光化合物、颗粒(可见或荧光)、核酸、络合剂或催化剂例如酶(例如，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶)。在采用酶的情况下，添加有色、荧光或发光底物导致产生可检测信号。其它检测系统，例如时间分辨荧光法、内反射荧光法、扩增(例如，聚合酶链式反应)和拉曼分光光度法也是有用的。

[0153] 非竞争型免疫试验是抗原直接被检测的试验，且在一些情况中，直接检测抗原的量。酶介导的免疫试验，例如免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹(western)和捕获试验，可容易地适应以完成MXPyV蛋白的非竞争型检测。

[0154] 有效检测MXPyV病毒的ELISA方法可以，例如，如下所述：(1)将抗体或抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)固定至基质；(2)使固定的受体接触包含病毒、病毒抗原或针对该病毒的抗体的液体或组织样品；(3)使上述物质接触抗体，该抗体结合有可检测部分(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)；(4)使上述物质接触该酶底物；(5)使上述物质接触显色剂；(6)观察颜色变化。上述方法易于改进以检测样品中抗MXPyV抗体或特定MXPyV蛋白质以及病毒的存在。

[0155] Western印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中MXPyV抗原的存在。该技术一般包括通过凝胶电泳来基于分子量分离样品蛋白质，将分离的蛋白质转移至合适的固体支持物(例如硝化纤维素滤器、尼龙滤器或衍生化尼龙滤器)，并将所述样品与特异性结合MXPyV抗原的抗体孵育。所述抗MXPyV抗原抗体特异性结合至所述固体支持物上的MXPyV抗原。这些抗体可被直接标记，或可采用特异性结合至所述抗MXPyV抗原抗体的带标记抗体(例如，带标记的绵羊抗小鼠抗体)后续检测。

[0156] 其它试验形式包括脂质体免疫试验(LIA)，其采用的脂质体经设计以结合特定分子(例如，抗体)并释放包封的试剂或标志物。然后按照标准技术检测被释放的化学品(参见Monroe等，Amer.ClM.Prod.Rev.5:34-41(1986))。

[0157] MXPyV抗原，例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分，和/或患者的针对MXPyV病毒的抗体，可采用捕获试验检测。简言之，为了检测患者样品中针对MXPyV的抗体，将针对患者的免疫球蛋白的抗体(例如，抗IgG(或IgM))结合至固相基质，并用于从血清捕获患者的免疫球蛋白。然后，使MXPyV或MXPyV的反应性片段与所述固相接触，然后添加带标记的抗体。然后可通过结合的带标记抗体的量来对患者的MXPyV特异性抗体定量。

[0158] 在竞争型试验中，样品中存在的MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)可通过检测与被样品中存在的未知MXPyV抗原从抗MXPyV抗原抗体替换(竞争下来)的已知添加(外源)的MXPyV抗原相关联的可检测信号的减少来间接检测。

[0159] 竞争型试验也适用于间接检测样品中存在的MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)的量。简言之，使来自对象的血清或其它体液与结合至基质(例如ELISA 96孔板)的抗体反应。彻底洗去过量血清。然后，使带标记的(酶联、荧光、放射性等)单克隆抗体与先前反应的MXPyV病毒-抗体复合物反应。相对于对照检测单克隆抗体结合被抑制的量。MAB也可用于通过IFA直接检测样品中对抗体-病毒复合物有特异反应性的MAB。

[0160] 半抗原抑制试验是另一种竞争型试验。在该试验类型中，已知的MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)可被固定在固体基质上。向该样品添加已知量的抗MXPyV抗体，然后使该样品接触所述固定的MXPyV抗原。在半抗原抑制试验中，结合至已知的固定的MXPyV抗原的抗MXPyV抗体的量与样品中存在的MXPyV抗原的量成反比。固定的抗体的量可通过检测固定的抗体组分或留在溶液中的抗体的组分来检测。检测可在抗体带标记的情况下直接进行，或如上所述通过后续添加特异性结合该抗体的带标记部分来间接进行。

[0161] 竞争型结合形式的免疫试验也可用于交叉反应测定。例如，可使MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)固定至固体基质。可向该试验添加与抗血清竞争结合所述固定抗原的蛋白质。将添加的蛋白质与抗血清竞争结合固定蛋白质的能力与MXPyV抗原与其自身竞争的能力做比较。采用标准计算方法计算上述蛋白质的交叉反应性百分比。选择并汇集与上文所列的各添加蛋白质的交叉反应性低于10％的那些抗血清。任选通过免疫吸附，通过添加考虑的蛋白质(例如，远相关同源物)从所述汇集的抗血清移除交叉反应性抗体。

[0162] 然后，所述免疫吸附且汇集的抗血清可被用于上述竞争型结合免疫试验，以将认为可能是MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)的等位基因或多态性变体的第二蛋白质与免疫原蛋白质做比较。为进行该比较，分别以宽浓度范围检测所述两种蛋白质，并且测定抑制50％的抗血清与固定蛋白质的结合所需的各蛋白质的量。如果抑制50％的结合所需的第二蛋白质的量低于抑制50％的结合所需的MXPyV抗原量的10倍，则所述第二蛋白质被认为与MXPyV抗原产生的多克隆抗体特异性结合。

[0163] 免疫试验(竞争型和非竞争型)也常采用标记试剂以特异性结合并标记由所述抗体和抗原形成的复合物。标记试剂本身可以是包含抗体/抗原复合物的部分之一。因此，所述标记试剂可以是带标记的MXPyV蛋白质核酸或带标记的抗MXPyV抗体。或者，标记试剂可以是第三部分，如二抗，其特异性结合抗体/抗原复合物(二抗通常是对一抗来源的物种的抗体具有特异性)。其他能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的蛋白质，如蛋白A或蛋白G也可用作标记试剂。这些蛋白质显示与来自多种物种的免疫球蛋白恒定区强烈的非免疫原性反应性(参见，例如，Kronval等，J.Immunol.111:1401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.135:2589-2542(1985))。可用可检测部分来修饰标记试剂，如生物素，另一种分子可与之特异性结合，如链霉亲和素。本领域技术人员熟知多种可检测部分，并且其可以是通过分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、电学、光学或化学手段可检测的任何物质。所述可检测标记物已在免疫试验领域中成熟开发，其可包括但不限于，磁性珠(例TM如，DYNA珠 )、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记物(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)和比色标记物，例如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。

[0164] 按照本领域中已知的方法，标记物可以与试验的所需组分直接或间接偶联。如上述，可以使用多种标记物，根据需要的灵敏度、与化合物偶联的难易、稳定性要求、可用的设备和处理条件来选择标记物。

[0165] 通常通过间接方式连接非放射性标记物。一般而言，配体分子(例如，生物素)共价结合至所述分子。然后配体与另一个分子(例如，链霉亲和素)结合，该分子是固有可检测的或与信号系统共价结合，如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。所述配体及其靶标可用于与识别MXPyV抗原的抗体，或识别抗MXPyV抗原的二抗进行任何合适组合。

[0166] 所述分子也可直接偶联信号生成化合物，例如，通过与酶或荧光团偶联。用作标签的感兴趣的酶主要是水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或者氧化物酶，尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2,3-二氢双酮酞嗪，例如，鲁米诺。可以使用的各种标记或信号产生系统的综述参见美国专利号4,391,904。

[0167] 检测标记物的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，在标记物是放射性标记物的情况中，检测的方式包括自显影中的闪烁计数或成像胶片。在标记物是荧光标记物的情况中，可通过发射合适波长的光的荧光物并检测所得的荧光来检测。可以通过视觉观察、通过使用电子检测器如电荷耦合装置(CCD)或光电子增倍管等来检测荧光。相似地，可以通过提供合适的酶底物并检测所得的反应产物来检测酶标记物。比色或化学发光标记物可通过简单地观察与标记物相关的颜色来检测。因此，在各种浸渍条试验中，偶联的金通常呈现粉色，而各种偶联的珠呈现出珠的颜色。

[0168] 一些试验形式并不需要采用带标记的组分。例如，微凝集测试也可用于检测测试样品中MXPyV的存在。简言之，乳胶珠用抗体被覆并与测试样品混合，从而组织或体液中的与所述抗体特异性反应的MXPyV与受体交联，造成凝集。沉淀物中的凝集的抗体-病毒复合物肉眼可见或可通过分光光度计观察。其它试验包括血清学试验，其中检测IgG和IgM的相对浓度。

[0169] 本领域技术人员应理解，通常希望使免疫试验中的非特异性结合最小化。具体而言，当所述试验设计固定在固体基质上的抗原或抗体时，希望使非特异性结合至该基质的量最小化。使所述非特异性结合减少的方法是本领域技术人员熟知的。通常而言，该技术涉及用蛋白质组合物被覆所述基质。具体而言，蛋白质组合物例如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶被广泛应用，其中奶粉最为优选。

[0170] 在上述诊断方法中，样品可直接取自对象，或是部分纯化形式。对具体MXPyV具有特异性的抗体通过与该病毒结合来反应(初级反应)。这之后，可加入采用连接有或标记有可检测部分的抗体的二级反应以增强对初级反应的检测。一般而言，在二级反应中，将选择对病毒的不同结合位点(表位)呈特异性或非特异性的抗体或具有反应性的其它配体，因为其能够与抗体和病毒的复合物上的多个位点反应。因此，例如，在二级反应中，所述抗体的若干分子能与初级反应形成的各复合物反应，使初级反应更易于被检测。

[0171] 在其它具体实施方式中，本发明的方法涉及从疑似已接触MXPyV或被MXPyV感染的对象获得样品。一旦获得所需样品，使该样品接触重组MXPyV肽抗原，例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag。一旦该样品与所述重组MXPyV肽抗原接触，随后即测定该样品中针对各肽的抗体的存在与否，并与(1)预测的截止值，或(2)由一种或多种对照生成的信号强度做比较。在一个替代性实施方式中，本文所述的方法还可用于检测血液供给中的MXPyV感染。而在另一个替代性实施方式中，本文所述的方法可用于诊断对象中的MXPyV感染。

[0172] 可将可用于监测样品中特定抗体效价和类型的不同方法归为两大类型：(1)如上所述，抗原被固定在固相上，允许包含特定抗体的人生物液体与所述抗原反应，然后采用结合有信号生成化合物的抗人抗体检测与所述抗原结合的抗体；和(2)使抗人抗体结合至固相，允许包含特定抗体的人生物液体与所述结合的抗体反应，然后添加连接有信号生成化合物的抗原，以检测所述液体样品中存在的特定抗体。在两种形式中，所述抗人抗体试剂可识别所有抗体类型，或者对具体抗体类型或抗体子类型具有特异性，这取决于所需试验目的。这些试验形式以及其它已知的形式意在包含在本发明范围内，并且为本领域普通技术人员熟知。

[0173] 因此，如上所述，本发明包括一种检测样品中针对MXPyV的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：(a)使疑似包含所述抗体的样品与MXPyV抗原或蛋白质(即VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)接触；(b)检测所述复合物的存在，从而检测所述样品中抗体的存在。更具体地，本发明包括一种检测样品中针对MXPyV的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：(a)使疑似包含所述抗体的样品与MXPyV抗原或蛋白质(即VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)接触，所述接触在足以允许形成抗体/抗原复合物的时间和条件下进行；(b)向所得抗体/抗原复合物添加偶联物，所述添加在足以允许所述偶联物结合至已结合抗体的时间和条件下进行，所述偶联物包含的抗体(针对样品中的抗体)连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物；(c)通过检测由该信号生成化合物产生的信号来检测可能存在于所述测试样品中的抗体的存在。还可使用与所述抗原结合的对照或校准物(calibrator)。

[0174] 此外，本发明包括用于检测可能存在于样品中的抗MXPyV抗体的存在的另一方法。该方法包括以下步骤：(a)使疑似包含抗MXPyV抗体的样品与对所述样品中的抗体具有特异性的抗-抗体(例如，对于人样品而言，抗人抗体)接触，所述接触在足以允许形成抗抗体/抗体复合物的时间和条件下进行，和(b)检测该测试样品中可能存在的抗体的存在。(此类抗-抗体市售可得，并且可通过例如用纯化的针对本发明蛋白质或其含表位部分产生的抗MXPyV抗体的μ链免疫哺乳动物来制备)。

[0175] 更具体地，该方法包括如下步骤“：(a)使疑似包含所述抗体(即，抗MXPyV抗体)的样品与对所述抗体具有特异性的抗-抗体接触，所述接触在足以允许形成抗-抗体/抗体复合物的时间和条件下进行；(b)向所得的抗-抗体/抗体复合物添加偶联物，所述添加在足以允许所述偶联物结合至已结合抗体的时间和条件下持续，所述偶联物包含连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物的蛋白质(即，MXPyV抗原或蛋白质，即VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)；和(c)通过检测所述信号生成化合物产生的信号来检测可能存在于该测试样品中的抗体的存在。还可使用包含针对所述抗-抗体的抗体的对照或校准物。

[0176] 本发明还涵盖用于检测样品中针对MXPyV的抗体的存在的第三方法。该方法包括以下步骤：(a)使疑似包含抗MXPyV抗体的样品与对所述抗体具有特异性的抗-抗体接触，所述接触在足以允许形成抗-抗体/抗体复合物的时间和条件下进行；(b)向所得的抗-抗体/抗体复合物添加蛋白质(即，MXPyV抗原或蛋白质，即VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)，所述添加在足以允许所述抗原结合至所述抗体的时间和条件下持续；和(c)向所得的抗-抗体/抗体/抗原复合物添加偶联物，所述偶联物包含的组合物含有连接有能够产生可检测信号的信号生成化合物的单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体针对所述抗原；和(d)通过检测所述信号生成化合物所产生的信号来检测所述测试样品中可能存在的所述抗体的存在。同样地，还可使用包含针对所述抗-抗体的抗体的对照或校准物。

[0177] 还应注意，本发明的一种或多种单克隆抗体可被用作竞争型探针，供于检测针对MXPyV抗原或蛋白质(即VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)的抗体。例如，可将本发明的重组MXPyV肽被覆在固相上。然后，可使疑似包含针对MXPyV抗原的抗体的样品与包含信号生成化合物和本发明的至少一种单克隆抗体的指示剂孵育，所述孵育在足以使测试样品和指示剂与所述固相或指示剂与所述固相形成抗原/抗体复合物的时间和条件下进行。可检测单克隆抗体与所述固相的结合的减少。相比确定的阴性MXPyV测试样品，检测到的信号的减少指示该测试样品中存在抗MXPyV抗体。

[0178] 还应注意，本发明的抗体或其片段可用于多种诊断试验，以确定样品中MXPyV蛋白质(或其对应核酸序列)的存在。例如，可向所述样品添加针对本发明的一种或多种蛋白质(即MXPyV抗原或蛋白质，例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)的抗体，所述添加在足以形成抗体/抗原复合物的时间和条件下持续。如果检测到所述复合物，则所述测试样品中存在所述抗原(即，蛋白质)。

[0179] 而在另一个实施方式中，使已被固定在固相上的多克隆或单克隆抗MXPyV抗体或其片段，或这些抗体的组合与疑似包含疑似包含MXPyV蛋白质的样品接触，从而形成第一混合物。然后使该混合物在足以形成抗原(即，蛋白质)/抗体复合物的时间和条件下孵育。然后，使连接有信号生成化合物的包含特异性结合MXPyV抗原(例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)的单克隆或多克隆抗体或其片段，或这些抗体的组合的指示剂与所述抗原/抗体复合物接触，以形成第二混合物。然后，使该第二混合物在足以形成抗体/抗原/抗体复合物的时间和条件下孵育。所述固相上捕获的样品中的MXPyV蛋白质的存在通过检测由信号生成化合物产生的可检测的信号的存在来确定。样品中突变蛋白质或抗原的量与产生的信号成比例。

[0180] 此外，可采用不同的方法检测样品中MXPyV蛋白质的存在。更具体地，使如下物质相互接触：结合至固体支持物的多克隆或单克隆抗MXPyV抗体(如上所述)或其组合，测试样品，以及包含连接有信号生成化合物的与MXPyV抗原(例如，VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag或其含表位部分)特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体(或其片段)或这些抗体的组合的指示剂，以形成混合物。使该混合物在足以形成抗体/抗原/抗体复合物的时间和条件下孵育。所述固相上捕获的本发明的MXPyV蛋白通过检测由信号生成化合物产生的可检测信号来测定。测试样品中MXPyV蛋白质的量与产生的信号成比例。

[0181] 应注意，还可在同步试验中检测针对MXPyV的抗体和/或抗原的存在。更具体地，使样品同时接触连接至固相的第一分析物的捕获试剂(其包含对第一分析物具有特异性的第一结合成分)，和第二分析物的捕获试剂(其包含针对第二分析物的第一结合成分)。(一对中的一个结合成分被确定为如下分子，其通过化学或物理手段特异性结合至该对中的第二分子)。由此形成混合物。然后，使该混合物在足以形成捕获试剂/第一分析物和捕获试剂/第二分析物复合物的时间和条件下孵育。然后，使这些复合物与两种指示剂接触：
一种指示剂包含标记有信号生成化合物第一分析物特异性结合对的成员，和一种指示剂包含标记有信号生成化合物的第二分析物特异性结合对的成员。形成第二混合物。然后，使该第二混合物在足以形成捕获试剂/第一分析物/指示剂复合物和捕获试剂/第二分析物/指示剂复合物的时间和条件下孵育。通过检测与一种或两种固相上形成的复合物关联生成的信号，作为对测试样品中一种或多种分析物的存在的指示，来确定一种或多种分析物的存在。

[0182] 本领域技术人员熟知多种试验形式，其能够采用重组MXPyV多肽，例如本文所述的VP1、VP2、VP3、ST-Ag和LT-Ag以检测样品中针对MXPyV的抗体。例如，在一个试验形式中，可将一种或多种重组肽固定在固体支持物行以结合并移除测试样品中的一种或多种抗体。然后，可采用结合至肽/抗体复合物并包含可检测标记物的可检测标记物来检测结合的一种或多种抗体。或者，可采用竞争型试验，其中可使用与一种或多种重组肽结合的抗体，其中与一种或多种所述肽结合的抗体用可检测标记物标记，并且允许在与样品中的重组肽孵育之后结合至固定的重组肽。样品成分抑制带标记抗体与一种或多种重组肽结合的程度指示样品与一种或多种固定的肽的反应性。

[0183] 就可检测标记物而言，可使用本领域已知的任何可检测标记物。例如，所述可检测3H 125I 35S 14C 32P 33P
标记物可以是放射性标记物(例如，、 、、 、和 )、酶促标记物(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记物(例如，吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺、硫酯、磺胺、菲啶酯等)、荧光标记物(例如，荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆素蛋白质、R-藻红蛋白、量子点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温标记物或免疫聚合酶链式反应标记物。标记、标记步骤和标记检测的简介参见Polak和Van Noorden“免疫细胞化学研究介绍”(Introduction to Immunocytochemistry)，第2版，施普林格弗莱格公司(Springer-Verlag)，纽约(1997)；以及Haugland《荧光探针和研究化学品手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)，俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)出版的综合手册和目录(1996)。

[0184] 所述固体支持物可以是本领域普通技术人员已知，其上可固定MXPyV重组蛋白如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag的任何材料。可采用的固体支持物的例子有微滴定板中的测试孔、硝化纤维素、尼龙、珠或盘片(其可由玻璃、纤维玻璃、乳胶、塑料或纸材料制成)、凝胶(例如，多肽可跑动通过且后续干燥的凝胶)或试条，盘片或薄片(其可由硝化纤维素、尼龙塑料或纸制成)。本发明方法的示例性试验形式是流通或试条测试形式的免疫印迹试验。在流通或试条测试形式中，所述固体支持物是试条、盘片或薄片形式，其由硝化纤维素、尼龙、塑料或纸制成。更优选地，本文所述的重组肽固定在所述试条、盘片或薄片上。更优选地，使所述重组蛋白在试条、盘片或薄片上排列成分开的、平行的条带、斑点或点(其分别可称为单个"测试"条带、斑点或点，统称为群体"测试"条带、斑点或点)。可采用本领域已知的常规技术将重组蛋白可被固定在所述试条、盘片或薄片上，例如自动化技术，例如通过将所述重组蛋白喷射到所述试条、盘片或薄片上(采用喷射装置，例如可从生物点公司(Bio-Dot)获得的那些((例如AJQ3000Air Jet Quanti或者RR 4200--Dip Tank)，加利福尼亚尔湾)或手动技术，例如通过将所述重组蛋白吸移至所述试条，盘片或薄片上。如果采用薄片，一旦所有重组肽被固定至所述薄片上，即可采用本领域已知的常规技术将该薄片切割成试条用于试验。重组肽(以及任选的任何对照)在该试条、盘片或薄片上的定位并不重要。此外，还可采用本领域已知的常规技术(例如，粘合、叠层等)将所述试条、盘片或薄片进一步固定在支持物层上。所述支持物层可以由塑料、纸板等制成。例如，可将硝化纤维素试条或盘片叠层至压敏塑料薄膜上。进一步任选地，除了用于单板对照(on-board control)或测试条带、斑点或点的定位的任何离散区域以外，所述试条盘片或薄片任选地包含用于标记样品的鉴定区域，从而可将该样品与其它样品区分开(例如，名称、数量、字母数字的加注、条形码或其它合适方式)。

[0185] 可采用本领域技术人员已知的任何技术将重组肽(即，例如VP1、VP2、VP3、ST-Ag、LT-Ag)结合至或固定在固体支持物上(例如，采用Western印迹技术，该方法为本领域技术人员熟知)。此外，任选地，也可将一种或多种对照固定在所述固体支持物上(例如用于免疫印迹试验，即，以流通或试条测试形式)。本文可互换使用的术语"结合"或"固定"指的是非共价连接(例如吸附)和共价连接(其可以是固体支持物上的重组蛋白和官能团之间的直接连接，或者可以是通过交联剂的方式作用的连接)。优选吸附至试条、盘片或薄片的结合。在此类情况中，可通过使各重组肽的溶液以及任选的合适缓冲液中的任何对照，与所述试条、盘片或薄片接触一段合适的时间来实现所述吸附。所述接触时间可根据温度而变化，但在约1小时～约24小时之间。

[0186] 必要时，所述重组肽(和任选的任何对照)与固体支持物的共价连接可通过如下方式实现：首先使所述固体支持物与双功能试剂反应，所述双功能试剂能够与该支持物反应也和该重组肽上的官能团(例如，羟基或氨基基团)反应。例如，可使所述肽结合至利用苯醌而具有合适聚合物覆层的支持物或通过该支持物上的醛基团与所述肽上的胺和活性氢的缩合而结合至支持物。

[0187] 一旦所述重组肽(和任选的任何对照)被固定在所述支持物上，该支持物上剩余的蛋白质结合位点通常被阻断。可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的阻断剂。例如，可采用牛血清白蛋白("BSA")，PBS中的酪蛋白的磷酸盐缓冲盐水("PBS")溶液、吐温TM20 (密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司(Sigma Chemical Company))，以及其它阻断剂。
任选地，对于包含后续被干燥的凝胶的支持物的应用而言，对于该支持物的阻断可能没有必要。在阻断完成后，可任选地清洗该支持物，例如采用PBS，并使其干燥(例如通过空气干燥)一段合适的时间。所述干燥时间可根据温度而变化，但在约30分钟～约24小时之间。

[0188] 然后，使所述固定的重组肽(和任选的一种或多种对照)与测试样品孵育。在所述孵育之前，测试样品可用合适的稀释剂(例如PBS)稀释。在该孵育过程中，如果该测试样品中存在任何抗体，这些抗体将结合至所述固体支持物上的一种或多种重组肽。一般而言，所述孵育过程是足以允许检测该样品中MXPyV抗体的存在的时间段。优选地，所述孵育阶段是约15分钟～约6小时。最优选地，所述孵育阶段是约1小时～约4小时。

[0189] 未结合的测试样品可通过采用合适的缓冲液清洗所述固体支持物来移除，所述合TM适的缓冲液例如PBS或Tris缓冲液(例如，包含20mM Tris、0.15％吐温20 和0.1％叠氮化钠的Tris缓冲液)。可向该固体支持物添加一种或多种可检测试剂。合适的可检测试剂是能够结合至所述固定的肽-抗体复合物(以及任选的任何固定的对照)的任何化合物，以及可通过本领域技术人员已知的多种方式中的任何方式检测的任何化合物。优选地，所述可检测试剂包含结合剂，例如，蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白、凝集素或游离抗原)，其偶联至可检测标记物。所述结合剂与所述可检测标记物的偶联可采用本领域技术人员已知的标准方法来进行。偶联至各种可检测标记物的常用结合剂可购自多家市售来源，包括但不限于甾酶实验室公司(Zymed Laboratories)(加利福尼亚州旧金山)和皮尔斯公司(Pierce)(伊利诺斯州罗克福德)。

[0190] 使一种或多种检测试剂与固定的肽-抗体复合物(和任选的一种或多种对照)孵育足以检测结合的一种或多种抗体(和任选的一种或多种对照)的一段时间。一般而言，合适的孵育时间可由生产商说明书确定，或通过检测一段时间中发生的结合水平来确定。然后，可移除未结合的检测试剂，并利用可检测标记物来检测结合的检测试剂。用于检测可检测标记物的方法取决于该试验中所用的可检测标记物的性质。例如，对于放射性标记物，可采用闪烁计数或自体放射显影法。对于化学发光或荧光标记物，可采用分光光度法。酶促标记物一般可通过添加底物(通常持续一段特定时间)，然后通过分光光度法或针对该反应产物的其它分析方式来检测。

[0191] 为检测测试样品中是否存在针对MXPyV的抗体，将从保持结合至所述固体支持物的一种或多种可检测标记物检测到的信号与预定截止值做比较。更具体地，该截止值可以是当使固定的重组蛋白与来自未感染MXPyV的对象的样品孵育时获得的平均信号。通常而言，产生的信号比平均值高三个标准偏差的样品被认为是呈MXPyV抗体和MXPyV感染阳性。或者，如果采用能够产生数值的光场，暗场或有色读取仪器(例如光密度计)，则可利用接受者操作特性曲线("ROC")，采用Sackett等的方法来确定截止值(Sackett等，Clinical Epidemiology:A Basic Science for Clinical Medicine(《临床流行病学：临床医学的基础科学》)，第106-107页(利特尔布朗出版社(Little Brown and Co.)，1985))。简言之，所述截止值可通过，与用于诊断测试结果的各个可能的截止值相对应的成对的真阳性率(即，灵敏度)和假阳性率(即，100％特异度)的图表来确定。图表上最接近左上角的截止值(即，包括最大区域的值)是最精确的截止值，而产生高于通过该方法确定的截止值的信号的样品可认为是阳性的。或者，可将该截止值沿该图表的左侧移动，以使假阳性率最小化。一般而言，产生高于通过该方法确定的截止值的信号的样品被认为是MXPyV感染阳性。在一些实施方式中，对于显示抗体与所述5种重组蛋白VP1、VP2、VP3、ST-Ag和LT-Ag中至少1、至少2、至少3或至少4种的结合的信号的鉴定指示所述样品中存在MXPyV。

[0192] 如前文所述，优选的试验方式是免疫印迹试验，例如流通或试条方式，其中选自VP1、VP2、VP3、ST-Ag和LT-Ag的一种或多种重组蛋白被固定在试条、盘片或薄片(例如硝化纤维素、尼龙、塑料或纸试条、盘片或薄片，例如分开的测试条带、斑点或点)上。利用本文前述的技术可实现这些重组肽各自在试条、盘片或薄片上的固定。此外，在一些实施方式中，除了上述重组肽以外，所述试条、盘片或薄片还包含固定在其上的作为分开的测试条带、斑点或点的至少一种对照(其各自可称作个体"单板对照"条带、斑点或点，统称群体"单板对照"条带、斑点或点)。优选所述试条、盘片或薄片包含固定于其上的两种分开的、离散的对照(即，第一对照和第二对照)，最优选地，所述试条、盘片或薄片可包含固定于其上的三种分开的、离散的对照(即，第一对照、第二对照和第三对照)。如果存在多于一种对照，则这些对照可彼此相同或彼此不同。优选地，所述对照中有至少两种是相同的(例如，第一对照和第二对照)。如果所述对照中有两种是相同的，则优选固定在试条、盘片或薄片上的其中一种对照(第一对照或第二对照，或如果有三种对照，则是第一对照或第三对照或第二对照或第三对照)的浓度高于(或大于)固定在所述试条、盘片或薄片上的其它对照。若固定在所述试条、盘片或薄片上的对照的浓度高于其它对照，其被称为"高对照"。若固定在所述试条、盘片或薄片上的对照的浓度低于高对照，其被称为"低对照"。所述试条、盘片或薄片上存在的低对照与高对照的浓度之比可以是约1:2～约1:10，优选地，约1:5～约1:6。例如，第一对照可以是低对照，而第二对照可以是高对照。或者，第一对照可以是高对照，而第二对照可以是低对照。举另一个例子，所述试条、盘片或试条可包含3种对照，即，低对照和高对照以及第三对照(其可用于，例如，验证样品添加)。低对照和高对照可以同时是人IgG(其中低对照与高对照之比为约1:2～约1:10)，而第三对照可以是山羊抗人IgG。

[0193] 在流通方式中，可将所述试条、盘片或薄片上结合有重组肽的一端浸入含有所述样品的溶液。或者，可将整个试条、盘片或薄片与稀释剂置于反应托盘中，然后向该反应托盘添加样品。利用前文所述的相同时间和技术，允许所述样品和试条孵育足够的时间。可采用前文所述的技术移除未结合的样品成分。在该方式中，当测试样品通过膜时，该样品中的抗体结合至固定的肽(以及至少一种对照)。可添加至少一种检测试剂(例如，本文前述的含有可检测标记物的检测试剂)。当含有所述检测试剂的溶液流动通过试条时，至少一种检测试剂结合至形成的各个肽和肽-抗体复合物。为确定测试样品中MXPyV抗体的存在与否，可如上所述采用截止值或通过比较由一种或多种对照(下文详述)生成的一个或多个信号的强度来检测结合的检测试剂。

[0194] 当流通方式采用上述低对照和高对照时，优选通过鉴定针对所述肽的各测试条带(或斑点或点)上的可检测标记物的信号的存在来确定样品中MXPyV抗体的存在与否。若在针对肽的测试条带上鉴定到信号，则将该检出信号的强度与来自低对照条带(或斑点或点)和高对照条带(或斑点或点)的信号强度作比较(采用0～4+的标度)。没有可见条带时读数是0。低对照条带和高对照条带的强度分别定义为1+(低对照)和3+(高对照)。强度与低对照强度相当的测试条带评为1+。强度在低对照和高对照条带强度之间的条带评为2+。强度与高对照强度相当的条带评为3+。强度高于高对照强度的条带评为4+。强度比低对照强度弱的暗淡条带评为.+-。如果免疫印迹试验的结果是：无可见条带(除了低对照、高对照和阴性对照的条带以外)，则认为该测试样品是MXPyV阴性。如果免疫印迹试验的结果是，重组多肽的一条或多条条带显示信号，则必须进行后续分析。特定地，如果所有条带显示的强度均弱于低对照，即，所有条带都被评为.+-.，则认为该测试样品对于MXPyV不确定。然而，如果至少一条条带被评为1+或更高，那么认为该测试样品是MXPyV抗体阳性。

[0195] 虽然本发明公开了固相诊断试验的应用，但预期本发明的蛋白质可用于非固相诊断试验。这些试验是本领域普通技术人员熟知的，并且认为包含在本发明范围内。

[0196] MXPyV免疫调节剂的试验

[0197] 可采用多种体外和体内试验(包括基于细胞的模型)来寻找MXPyV的免疫调节剂。采用重组或天然产生的所选蛋白质来测试候选化合物。调节可包括但不限于，感染、复制、受体结合、细胞进入、颗粒形成等的调节。

[0198] 对MXPyV或表达MXPyV(重组或天然产生)的细胞的调节的检测可采用本文所述的多种体内、体外或立体试验来进行。可利用影响活性(例如酶活性)、细胞表面标志物表达、病毒复制和增殖的合适的物理、化学或表型变化来评估测试化合物对本发明多肽的影响。当采用完整细胞或动物测定功能作用时，也可检测多种作用。

[0199] 鉴定具有MXPyV调节活性的化合物的试验可体外进行。所述试验可采用全长MXPyV或其变体，或其突变体，或其片段。纯化的重组或天然产生的蛋白质可用于本发明的体外方法方法。除了纯化的MXPyV以外，所述重组或天然产生的蛋白质可以是部分的细胞裂解物或细胞膜。如下所述，所述结合试验可以是固态或可溶的。优选地，使所述蛋白质或膜共价或非共价地结合至固体支持物。通常，本发明的体外试验是非竞争型或竞争型的底物或配体结合或亲和性试验。其它体外试验包括检测蛋白质的分光光度(例如，荧光、吸光度、折射率)、水力(例如，形状)、色谱或溶解度性质的变化。

[0200] 高通量结合试验可如下进行：其中使蛋白质或其片段与潜在调节剂接触，并孵育合适的一段时间。在一个实施方式中，使潜在调节剂结合至固体支持物，并添加蛋白质。在另一个实施方式中，使所述蛋白质结合至固体支持物。可广泛采用多种调节剂，如下所述，包括有机小分子、肽、抗体等。可广泛采用多种试验来鉴定MXPyV-调节剂结合，包括带标记的蛋白质-蛋白质结合试验、电泳迁移率变化、免疫试验、酶促试验等。在一些情况中，通过采用竞争型结合试验来测定候选调节剂的结合，其中在潜在调节剂的存在下检测已知配体或底物的结合所受干扰。首先使调节剂、已知的配体或底物结合；然后添加竞争物。清洗蛋白质之后，测定潜在调节剂或已知的配体或底物的结合产生的干扰。通常对潜在调节剂或已知的配体或底物做标记。

[0201] 可采用基于细胞的试验，其中MXPyVis在细胞中表达，并且检测功能、物理、化学和表型变化以鉴定病毒调节剂。除了本领域中熟知的病毒抑制试验之外，可如本文所述检测任何合适的功能作用。MXPyV可以是天然产生或重组的。并且，MXPyV的片段或其嵌合蛋白质也可用于基于细胞的试验。此外，催化位点所需的基本残基中的点突变也可用于这些试验。

[0202] 在一个优选实施方式中，高通量筛选方法包括提供含有大量潜在治疗性化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合性有机小分子或肽文库。然后，如本文所述利用一种或多种实验筛选这类“组合化学文库”或“配体文库”，以鉴定具有所需特征性活性的文库成员(特别是化学物种或亚类)。由此鉴定的化合物可用作常规“先导化合物”，或者本身可用作潜在或实际的治疗剂。

[0203] 组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合多种化学“结构模块”如试剂产生的多样性化合物集合。例如，通过以每种可能的方式组合一组化学结构模块(氨基酸)至给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数量)形成线性组合化学文库如多肽文库。可通过这类化学结构模块的组合混合来合成成百万种化合物。

[0204] 组合化学文库的制备和筛选方法是本领域技术人员熟知的。这类组合化学文库包括但不限于：肽文库(参见例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493(1991)和Houghton等，Nature 354:84-88(1991))。也可使用产生化学多样性文库的其它化学类型。这些化学类型包括但不限于：类肽(如PCT公开WO 91/19735)、编码肽(如PCT公开WO 93/20242)，随机生物寡聚物(如PCT公开WO 92/00091)，苯并二氮(如美国专利5,288,514)，多样异构体如乙内酰脲、苯并二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))，具有葡萄糖支架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218(1992))，类似的小化合物有机综合体文库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))，低聚氨基甲酸酯类(Cho等，Science 261:1303(1993))和/或肽酰膦酸酯类(Campbell等，J.Org.Chem.59:658(1994))，核酸文库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，同上)，肽核酸文库(参见例如，美国专利5,539,083)，抗体文库(参见例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3):309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(参见例如，Liang等，Science，274:1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，有机小分子文库(参见例如，苯并二氮，Baum C&EN，1月18日，第33页(1993)；类异戊烯，美国专利
5,569,588；噻唑烷酮和偏噻嗪烷酮(metathiazanone)，美国专利5,549,974；吡咯烷，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮，5,288,514等)。

[0205] 可购得制备组合性文库的装置(参见例如，357MPS，390MPS，肯塔基州路易斯维尔市的先进化学技术公司(Advanced Chem Tech)，Symphony，马萨诸塞州沃本的瑞宁公司(Rainin)，433A加州福斯特城应用生物系统公司(Applied Biosystems)，9050Plus，马萨诸塞州贝德福德密理博公司(Millipore))。此外，许多组合性文库本身市售可得(参见例如，新泽西州普林斯顿的CG公司(ComGenex)，俄罗斯莫斯科的埃斯奈科斯公司(Asinex)，密苏里州圣路易斯的替普斯公司(Tripos，Inc.)，俄罗斯莫斯科的化学之星有限公司(ChemStar,Ltd)，宾夕法尼亚州艾克斯顿的3D制药公司(3D Pharmaceuticals)，马里兰州哥伦比亚的马泰克生物科学公司(Martek Biosciences)等)。

[0206] 可采用MXPyV或受MXPyV(天然产生或重组)感染的细胞或组织进行固态或可溶性高通量试验。可采用高通量方式的固相体外试验，其中使MXPyV连接至固相。本文所述的任何一种试验均适应高通量筛选。

[0207] 在可溶性或固态高通量试验试验中，可在一天内筛选多至数千种不同调节剂或配体。该方法可用于MXPyV体外试验，或用于基于细胞或基于膜的含有MXPyV的试验。具体而言，可采用微滴定板的各孔来进行针对所选潜在调节剂的分开试验，或者，如果需要观察浓度或孵育时间的效应，则可采用各5-10个孔测试单一调节剂。因此，单一标准微滴定板可检测约100种(例如，96种)调节剂。如果采用1536孔板，则单一板可容易地检测约100～约1500种不同的化合物。每天可检测许多块板；采用本发明的整合系统可试验筛选多至约6,000、20,000、50,000或多于100,000种不同化合物。

[0208] 对于固态反应，可使感兴趣的蛋白质或其片段如胞外结构域，或者包含感兴趣的蛋白质或其片段作为融合蛋白的部分的细胞或膜通过共价连接或非共价连接直接或间接地结合至所述固态部分。用于共价或非共价结合的标签可以是各种任何成分。一般而言，使结合所述标签的分子(标签结合物)固定至固体支持物，然后通过标签和标签结合物的相互作用，使该带标签的感兴趣的分子连接至所述固体支持物。

[0209] 可采用多种标签和标签结合物，这取决于文献详述的已知的分子相互作用。例如，当标签具有天然结合物(例如，生物素、蛋白质A或蛋白质G)时，其可用于偶联合适的标签结合物(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素(neutravidin)、免疫球蛋白的Fc区等)。带有天然结合物的分子(例如生物素)的抗体也是广泛可得，并且是合适的标签结合物(参见，SIGMA Immunochemicals 1998catalogue(《SIGMA免疫化学目录1998版》)西格玛公司(SIGMA)，密苏里州圣路易斯)。

[0210] 类似地，任何半抗原或抗原性化合物均可与合适抗体联用以形成标签/标签结合物对。数千种特定抗体是市售可得的，并且许多其它抗体在文献中有描述。例如，在一个常见结构中，所述标签是第一抗体，而所述标签结合物是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用以外，受体-配体相互作用也合适作为标签和标签结合物对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体相互作用，例如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘素家族、整联蛋白家族、选择蛋白家族等(参见，例如，Pigott和Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(《粘着分子资料手册I》)(1993))。类似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如，鸦片、类固醇等)、细胞内受体(例如，其介导多种小配体的作用，所述小配体包括类固醇、甲状腺素、类维生素A和维生素D；肽)、药物、凝集素、糖，核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体可与多种细胞受体相互作用。

[0211] 合成的聚合物，例如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫、聚硅氧烷、聚酰亚胺和聚醋酸酯也可形成合适的标签或标签结合物。本文所述的试验系统中还可使用多种其它标签/标签结合物对，而这对于阅读过本公开内容的技术人员而言是显而易见的。

[0212] 常用接头，例如肽、聚醚等，也可作为标签，并且包括多肽序列，例如约5～200个氨基酸的聚gly序列。这类柔性接头为本领域技术人员已知。例如，聚乙二醇接头可获自阿拉巴马汉茨维尔的谢氏聚合物有限公司(Shearwater Polymers，Inc.)。这些接头任选具有酰胺键、巯基键或杂官能键。

[0213] 采用现有的多种方法中的任何方法，使标签结合物固定至固体基质。通过将固体基质的全部或部分暴露至化学试剂来使该基质常规衍化或功能化，所述化学试剂将化学基团固定至与标签结合物的部分具有反应性的表面。例如，适用于连接至较长链部分的基团将包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。可采用氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷来使不同表面(例如玻璃表面)功能化。所述固相生物聚合物阵列的构建已有成熟的文献描述(例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)(描述例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102:259-274(1987)(描述栓上的固相成分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron44:60316040(1988)(描述纤维素盘片上的不同肽序列的合成)；Fodor等，Science，251:767-777(1991)；Sheldon 等，Clinical Chemistry 39(4):718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine 2(7):753759(1996)(全部描述固定至固体基质的生物聚合物阵列))。用于将标签结合物固定至基质的非化学方法包括其它常用方法，例如加热，用紫外光辐射交联等。

[0214] 测试为MXPyV调节剂的化合物可以是任何有机小分子或生物实体，例如蛋白质，例如，抗体或肽、糖、核酸，例如，反义寡核苷酸或核酶或siRNA，或脂质。或者，调节剂可以是MXPyV的遗传变化形式。通常而言，测试化合物将会是有机小分子、肽、环状肽、siRNA、反义分子、核酶和脂质。

[0215] 基本上，任何化学化合物均可用作本发明实验中的潜在调节剂或配体，但最常使用可溶于水性溶液或有机溶液(特别是基于DMSO)的化合物。设计实验，通过自动化实验步骤并提供来自任何方便来源的化合物筛选大规模化学文库，通常平行运行(例如，在机器人实验中微量滴定板上的微量滴定形式)。应理解，有多家化学化合物供应商，包括西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯)、奥德里奇公司(Aldrich)(密苏里州圣路易斯)、西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)、伏路卡化学-生物化学分析公司(Fluka Chemika-Biochemica Analytika)(瑞士布克斯)等。

[0216] 治疗/预防MXPyV

[0217] 本文所述的实施方式还涉及，用于阻断或调节MXPyV病毒蛋白质的表达或该病毒的繁殖的多种技术的治疗、预防和研究中的应用。可用于治疗或预防MXPyV的MXPyV调节剂可包括但不限于，MXPyV抗原、MXPyV的遗传修饰形式，例如，活性变化的形式，以及天然产生和合成的配体、基质、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、适体，核酸，反义分子、核酶、siRNA分子、miRNA分子和化学小分子，如本领域熟知。

[0218] 本文还描述用于治疗或预防MXPyV目的的免疫原性组合物。在某些方面中，MXPyV病毒、蛋白质或肽及其免疫原性片段，和/或多核苷酸，以及抗MXPyV抗体和/或T细胞，可被纳入药物组合物或免疫原性组合物。全病毒疫苗(活且减毒的，或复制缺陷的，或杀灭的)或亚基疫苗例如结构或非结构MXPyV蛋白质或其免疫原性片段，可用于通过引发对象中的免疫应答来治疗或预防MXPyV感染。或者，药物组合物可包含用MXPyV多核苷酸转染的抗原呈递细胞(例如，树突细胞)，从而该抗原呈递细胞表达MXPyV肽。

[0219] 编码MXPyV的基因组、结构蛋白或非结构蛋白或其片段的核酸疫苗也可用于引发免疫应答以治疗或预防MXPyV感染。本领域熟知多种基因递送技术，例如Rolland的文章及其中引用的参考文献所描述的那些，Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15:143-198。合适的核酸表达系统包含在患者中表达所必需的DNA序列(例如，合适的启动子和终止信号)。在一个优选实施方式中，可利用病毒表达系统(例如，牛痘、天花病毒、逆转录病毒或腺病毒)导入DNA，这可涉及采用非致病性(缺陷型)、有复制能力的病毒。合适的系统公开于，例如，Fisher-Hoch等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:317-321；Flexner 等 (1989)Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86-103；Flexner等(1990)Vaccine 8:17-21；美国专利号4,603,112,4,769,330,4,777,127和
5,017,487；WO 89/01973；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner(1988)Biotechniques 6:616-627；Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434；Kolls等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219；Kass-Eisler 等 (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11498-11502；Guzman等(1993)Circulation 88:2838-2848；和Guzman等(1993)Cir.Res.73:1202-1207。用于将DNA纳入所述表达系统的技术是本领域普通技术人员熟知的。DNA还可以是“裸”DNA，例如Ulmer等所述(1993)Science259:1745-1749以及Cohen的综述，Cohen(1993)Science 259:1691-1692。裸DNA的摄取可通过如下方式提高：将该DNA被覆在生物可降解珠上，将所述珠有效转运至细胞中。显然，疫苗可同时包含多核苷酸和多肽成分。所述疫苗可增强的免疫应答。

[0220] 疫苗制备一般描述于，例如，Powell和Newman编,Vaccine Design(《疫苗设计》)(亚基和佐剂方法),普莱南出版社(Plenum Press)(纽约,1995)。可设计疫苗令其产生抗体免疫性和/或细胞免疫性，例如，由CTL或CD4+T细胞产生的免疫性。

[0221] 非特异性免疫应答增强剂可以是使针对外源性抗原的免疫应答增强的任何物质。非特异性免疫应答增强剂的示例包括佐剂、生物可降解微球(例如，聚乳酸半乳交酯(polylacticgalactide))和脂质体(其中纳入所述化合物；参见例如美国专利号4,235,877)。大多数佐剂包含设计以保护抗原不被快速分解的物质(例如氢氧化铝或矿物油)，以及免疫应答刺激物(例如脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)源性蛋白质。合适的佐剂市售可得，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(密歇根州底特律的笛福科实验室公司(Difco Laboratories))；默克佐剂65(新泽西州罗韦的默克公司(Merck and Company,Inc.))；AS-2(史克必成公司(SmithKline Beecham))；铝盐，例如氢氧化铝凝胶(铝)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍化的多糖；聚磷腈；生物可降解微球；
单磷酰基脂A和Quil A。细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐剂。

[0222] 药物组合物

[0223] 本发明范围内的药物组合物和疫苗还可包含其它化合物，其可以具有或不具有生物活性。例如，可存在其它抗原的一个或多个免疫原性部分，其可被纳入融合或作为分开的化合物存在于所述组合物或疫苗中。多肽可以(但不必)偶联至其它大分子，例如，见述于美国专利号4,372,945和4,474,757。一般而言，药物组合物和疫苗可用于预防和治疗目的。

[0224] 适于口服给予的制剂可由以下物质组成：(a)液体溶液，如溶于稀释液(如水、盐水或PEG 400)的有效量的预包装核酸；(b)胶囊剂、囊剂(sachet)或片剂，各含有预定量的活性成分，作为液体、固体、颗粒或明胶；(c)合适液体中的悬浮液；以及(d)合适的乳液。片剂形式可包含一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填料、粘结剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的运载体。锭剂形式可包含调味料(例如蔗糖)中的活性成分，以及在惰性基料(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶)中含有活性成分的软锭剂，以及除活性成分以外还含有本领域已知运载体的类似形式。

[0225] 可将所选化合物(单独或与其它合适成分组合)制成气溶胶制剂(即，其可以是“雾化”形式)以通过吸入方式给予。可将该气溶胶制剂置于加压的可接受推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

[0226] 适用于胃肠道外给药，例如通过关节内(关节内部)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内以及皮下途径的制剂，包括水性和非水性、等张无菌注射溶液(其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，它们使该制剂与预期接受者的血液等渗)以及水性和非水性无菌悬浮液(其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。在本发明的实践中，可通过，例如静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内方式给予组合物。胃肠外给予和静脉内给予是优选的给予方法。推荐的制剂可以在单剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和管形瓶)中存在。

[0227] 所述组合物还可包含缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如，氢氧化铝)、使制剂与受者血液具有等张性、低渗性或弱高渗性的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，可将本发明的组合物制成冻干物。也采用熟知技术可将化合物包封在脂质体中。

[0228] 注射溶液和混悬液可以由前述无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。也可如上所述静脉内或胃肠外给予用于离体治疗的用核酸转导的细胞。

[0229] 在本发明内容中，给予患者的剂量应足以在一定时间内在患者中实现有益的治疗性应答。所述剂量可通过所用具体载体的功效和患者状况、以及待治疗的患者的体重或表面积来确定。剂量大小也可由给予具体患者特定载体或转导的细胞类型所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来决定。

[0230] 药学上可接受的运载体部分取决于需给予的特定组合物(例如，核酸、蛋白质、调节性化合物或转导的细胞)以及用来给予组合物的特定方法。因此，有多种合适的本发明药物组合物制剂可用(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)；第17版，1989)。给予可通过任何便利的方式进行，例如通过注射、口服给予、吸入、经皮施加或直肠给予。

[0231] 对于给予而言，本发明的化合物和转导的细胞可以一定速率给予，所述速率通过抑制剂、载体或转导的细胞类型的LD-50以及所述抑制剂、载体或细胞类型在不同浓度下的副作用，依照施加的质量和患者总体健康状况来确定。给予可以通过单次或分开多次的剂量完成。

[0232] 药物和疫苗组合物可存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和管形瓶。此类容器优选是密封封闭的，以保护制剂无菌直至使用。一般而言，制剂可以悬液、溶液或油性或水性载剂中的乳剂形式储存。或者，可将疫苗或药物组合物储存在冻干条件下，使用前仅需即时添加无菌液体载体。

[0233] 试剂盒

[0234] 本发明还提供诊断试剂和包含一种或多种所述试剂的试剂盒用于多种诊断试验，包括例如，免疫试验如ELISA和“夹心”型免疫试验，以及核酸试验，例如，PCR试验。在有关的实施方式中，所述试验以流通或试条测试形式进行，其中结合试剂被固定在膜(例如硝化纤维素)上。所述试剂盒可优选包含本发明的至少第一肽，或第一抗体或抗原结合片段、其功能性片段，或其掺混物，或第一寡对，和信号生成物。所述试剂盒的组分可预先连接至固体支持物，或可在试剂盒使用时施加至固体支持物的表面。可将信号生成物与本发明的抗体或核酸预先连接，或可能需要与一种或多种组分，例如缓冲剂、核酸、抗体-酶偶联物、酶底物等在使用前组合。

[0235] 试剂盒还可包含其它试剂，例如，用于减少与固相表面的非特异性结合的阻断剂、清洗剂、酶底物、酶等。所述固相表面可以是微滴定板、微球或适于固定核酸、蛋白质、肽或多肽的其它材料。催化形成化学发光或发色产物或减少化学发光或发色底物的酶是所述信号生成物的一种组分示例。所述酶为本领域熟知。当所述试剂盒中包含放射性标记物、发色性、荧光生成性或其它类型的可检测标记物或检测物时，所述标记试剂可与诊断或治疗性组合物本身在相同的容器中提供，或可置于第二不同容器器具中，其中该第二组合物可置于其中并合适等分。或者，可将所述检测试剂和标记准备于单一容器器具中，而在大多数情况中，所述试剂盒通常还包含以用于市售和/或便于包装和运输的封闭约束形式容纳所述小瓶的器具。实施例

[0236] 应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。

[0237] 实施例1：新型人多瘤病毒(MXPyV)的鉴定

[0238] 方法

[0239] 粪便样品收集、核酸提取和亿明达(Illumina)深度测序

[0240] 2008-2009年之间从墨西哥三个不同的州中患有急性腹泻疾病的96名儿童收集匿名样品。腹泻定义为：每天泻肚或液态排便三次或更多次，而样品在对儿童进行补液(rehydration)和抗生素(若医嘱)治疗之前获取。通过如下方式从粪便样品纯化病毒颗粒：产生由1mL磷酸盐缓冲盐水、0.1g玻璃珠、100ìL氯仿和0.2g粪便组成的悬液，采用机械振荡器振荡×5分钟，在离心机中以1,000g离心×20分钟，然后回收上清液。然后，使500μL的上清液通过0.45μm滤器，并用核酸酶混合物(安碧公司(Ambion)的Turbo DNA酶和英杰公司(Invitrogen)的RNA酶A)处理，然后采用PureLink 96病毒RNA/DNA试剂盒(英杰公司)进行核酸提取。采用随机PCR扩增法从提取的核酸制备样品cDNA文库，分别条形码化，并如先前所述在亿明达HiSeq 2000上测序(10,28)。对由75个碱基对(bp)的成对末端读取组成的亿明达粗测序列进行过滤以排除低复杂性、均聚性和低质量序列，然后通过如先前所述的用于病原体鉴定的自动化传递途径处理(28)。基于病毒BlastX同-5
源性，以10 的阈值E评分截止值来鉴定对应于MXPyV的序列。

[0241] 用于基因组回收的PCR

[0242] 从经病毒BlastX比对显示对多瘤病毒具有同源性的深度测序读取组装三个毗连群(连续序列)(图1中标记为“C1”、“C2”和“C3”)。为了桥接这些毗连群，采用从所述组装的毗连群引导向外的引物和PrimeStar GXL DNA聚合酶试剂盒(宝生物工程株式会社(Takara Bio))，按照生产商的说明书进行长范围PCR。对重叠的PCR产物进行克隆和测序，以获得3X冗余的完整MXPyV基因组的一致序列。采用Geneious软件鉴定开放阅读框(19)。

[0243] 进化分析

[0244] 从GenBank下载对应于全部已知的动物和人多瘤病毒(近期发现的MWPyV和HPyV10病毒除外)的全基因组序列。采用设有E-INS-i选项和默认设置的MAFFT(v6.0)进行MXPyV病毒蛋白质与来自其它多瘤病毒的对应蛋白质的多重序列比对(34)。通过串联VP1、VP2和T-抗原蛋白质序列与运行MAFFT来计算MXPyV与其它多瘤病毒的总体成对氨基酸相同性。为了生成进化树，采用MrBayes V3.2软件计算贝叶斯树拓扑学(5,500采样的树；500棵树因VP1、VP2和小T抗原老化而被弃去；20,000采样的树，10,000棵树因收敛所需的大T抗原老化而被弃去)(48)。选择牛多瘤病毒(图2，“牛”)作为外群(outgroup)。在MrBayes中通过PSRF统计学确认收敛。采用Geneious软件使树可视化(19)。MXPyV、HPyV10和MWPyV的多重全基因组序列比对采用Geneious软件进行(19)。

[0245] 基于PCR筛选MXPyV

[0246] 设计实时定量RT-PCR(qRT-PCR)试验用于从VP1基因检测MXPyV，同样设计两种次级传统RT-PCR试验来从VP1基因的另一区域和大T-抗原来检测。在所有试验中包括逆转录步骤，以检测除基因组DNA之外的MXPyV病毒mRNA。为研究MXPyV mRNA对病毒检测的相对贡献并评估基因组MXPyV的效价，我们还对通过qRT-PCR发现呈MXPyV阳性的样品进行实时qPCR。从定量的137-bp MXPyV PCR扩增子的8个系列log稀释物的3个PCR重复计算标准曲线。试验采用凯杰(Qiagen)One-Step RT-PCR试剂盒，采用13.5μL H2O、5μL5X缓冲液、1μL dNTP、1μL RT/Taq混合物、1.5μL正向和反向10μM引物、0.5μL2.5X SybrGreen(用于实时试验)和2μL提取的核酸进行。用于该PCR试验的MXPyV引物列于补充表2。若通过桑格(Sanger)测序证实，或所述三个RT-PCR试验中有至少两个仍呈阳性，则认为样品为MXPyV阳性。

[0247] 流行性研究群

[0248] 墨西哥。

[0249] 提取来自患有腹泻疾病的96位儿童的粪便样品(包括鉴定的初始MXPyV阳性病例)，并通过PCR测试MXPyV。收集自2010–2012年间的患有肺炎的136名住院儿童的鼻腔洗出物采用PureLink 96病毒RNA/DNA试剂盒(英杰公司)提取，并测试MXPyV。

[0250] 加利福尼亚(SIFT研究)。

[0251] 对应于SIFT(斯坦福感染与家族传播(Stanford Infection and Familial Transmission))研究的粪便样品已于先前描述[38]。简言之，有来自有或没有胃肠炎症状的406个个体(几乎全部是儿童)的553例粪便样品可供于研究。在首次胃肠炎期间左右的时间收集粪便样品，并在前两周检查个体是否存在腹泻、呕吐或同时存在这两种症状。也偶尔收集首次病期后三个月的补充粪便样品。以10％w/v将粪便悬浮于2mL的PBS，并采用PureLink 96病毒RNA/DNA试剂盒(英杰公司)提取核酸用于MXPyV测试。

[0252] 智利。

[0253] 在2009-2011年间从智利收集的192例样品(96例来自患腹泻的儿童，而96例来自年龄/性别相符的对照)可供于测试。通过过滤和核酸酶处理来富集病毒颗粒，然后采用QIAAMP病毒超灵敏试剂盒(凯杰公司)进行核酸提取。

[0254] 加利福尼亚(UCSF研究)。

[0255] 对如下样品测试MXPyV：2012年送入UCSF进行细胞巨化病毒(CMV)测试的来自实体器官和骨髓移植的受者的193例血浆样品，其中31例(16％)样品呈CMV阳性，以及2012年送入进行BKV测试的来自主要为肾移植受者的287例血浆/尿液样品，其中162例(56％)样品呈BKV阳性。采用自动化凯杰EZ1仪器(凯杰公司)，按照生产商提供的方案，进行病毒DNA提取。

[0256] 核苷酸序列登录号

[0257] 已向GenBank提交MXPyV的带注释完整基因组(登录号JX259273)。已向NCBI序列读数档案库提交对应于从中鉴定MXPyV的腹泻粪便文库的深度测序读取(登录号SRA056896)。用于该研究的所有ViroChip微阵列均已保存到NCBI GEO数据库(登录号GSE40008；GSM983236–GSM983247)。用于所述进化分析的动物和人多瘤病毒的登录号如下所列：NC_015150、NC_014743、NC_014407、NC_014406、NC_014361、NC_013796、NC_013439、NC_012122、NC_011310、NC_010277、NC_009951、NC_009539、NC_009238、NC_007923、NC_007922、NC_004800、NC_004764、NC_004763、NC_001699、NC_001669、NC_001663、NC_001538、NC_001515、NC_001505和NC_001442。

[0258] 补充表2

[0259] 用于MXPyV全基因组组装、MXPyV筛选和腹泻病毒筛选的PCR引物序列。

[0260] 用于MXPyV全基因组组装的引物

[0261]

[0262]

[0263] 用于MXPyV筛选的引物

[0264]

[0265] 用于腹泻病毒筛选的引物

[0266]

[0267]

[0268] 来自墨西哥的MXPyV阳性样品的泛病毒微阵列(ViroChip)分析

[0269] 可从来自墨西哥的粪便样品获取足够的材料以通过泛病毒微阵列(ViroChip)测试12例MXPyV阳性样品的共同感染，并对腹泻病毒进行特异性PCR分析。如前所述进行ViroChip分析(10,28)。简言之，采用随机引物(5’-GTTCCCACTGGAGGATA(N9)-3’)将RNA反转录为cDNA，并采用测序酶进行第二链合成。样品用Cy3荧光染料标记，标准化至10pmol纳入的染料，并与ViroChip微阵列于65℃下杂交过夜16小时。本研究中所用的现有8x60k版5.0(v5.0)ViroChip微阵列(GEO登录号GPL15905)在安捷伦(Agilent)平台(安捷伦技术公司(Agilent Technologies))上市售制得，并且包含代表GenBank中所有病毒种类的19,058个70聚体的寡核苷酸探针。以2μm的分辨率，在安捷伦DNA微阵列扫描仪上扫描微阵列。采用先前所述的簇与单寡核苷酸Z-评分分析来解读微阵列杂交图样(10,15,22,28)。如果簇与Z-评分分析均显示阳性，则判断样品微阵列分析呈腹泻病毒阳性。

[0270] 来自墨西哥的MXPyV阳性样品的腹泻病毒PCR分析

[0271] 采用随机扩增的cDNA作为模板，进行5种腹泻病毒(杯状病毒、星状病毒、腺病毒、轮状病毒和肠病毒)的PCR。引物对列于补充表2。所有PCR试验在内含1X PCR缓冲液、2mM MgCl2、0.3mM dNTP、10pmol的各引物和1个单位的Taq DNA聚合酶(英杰公司)的总计20μL中运行。杯状病毒、轮状病毒和肠病毒PCR运行如下：94℃ x 2分钟；35个循环的94℃持续30秒，50℃持续30秒，72℃持续1分钟；并在72℃延伸5分钟。腺病毒和星状病毒PCR运行如下：94℃x 2分钟；35个循环的94℃持续30，55℃持续30秒，72℃持续1分钟；和在72℃x 5分钟的最终延伸。用溴化乙锭对1.5％琼脂糖凝胶染色以观察产物。

[0272] 结果

[0273] MXPyV的发现和全基因组测序

[0274] 来自墨西哥的在研小儿胃肠炎的八例所选粪便样品用无偏差亿明达成对末端测序来分析。对个体样品条形码化并在各含16例样品的池中测序。通过GenBank数据库检索，使各池进入自动化病毒发现传递途径，并归类为人类、细菌、噬菌体、未知和病毒序列(28)。在由79,013,460个成对末端序列组成的一个池中，通过BLASTx发现，全部源自单个条形码化的样品(来自患腹泻的两岁儿童)的三个100-bp读数与多瘤病毒具有氨基酸同-10源性。采用BLASTn，以10 的E-评分截止值，将这3个读取及其对应伴侣对与对应于该条形码化样品的全部深度测序数据集(17,981,772个读取)比对，并将所得的经鉴定读取对组装生成长度为192、275和261bp的3个毗连群(连续序列)(图1，“C1”、“C2”和“C3”)。
GenBank病毒数据库中，与翻译的C1、C2或C3毗连群最接近的蛋白质匹配结果分别包括：
-11
来自猩猩多瘤病毒的VP3(GenBank CAX87756，E-评分＝9x10 ，81％的相同性)、来自TSV-30
的VP1(GenBank YP_003800006，E-评分＝7x10 ，52％的相同性)，和来自猩猩多瘤病毒的-25
大T抗原(GenBank CAX87759，E-评分＝1x10 ，61％的相同性)。然后，利用长范围PCR，采用从各3个毗连群引导向外的引物，对新型多瘤病毒的完整基因组进行克隆，并通过长范围PCR由三个重叠片段对其测序。

[0275] 基因组组织和进化分析

[0276] MXPyV的基因组呈环状并且长度为4,939nt(登录号JX259273)，其编码所有主要多留病毒蛋白的预计全长开放阅读框(图1A)。该组织对于多瘤病毒科家族成员而言是典型的，其具有由调节性小-T抗原(ST-Ag)和大-T抗原(LT-Ag)组成的早期区和编码VP1、VP2和VP3结构蛋白的晚期区。MXPyV的调节和结构蛋白质与其它多瘤病毒的那些蛋白质的氨基酸序列基本不同，其相同性为13–44％(表1)。MXPyV的VP1、VP2、ST-Ag和LT-Ag蛋白质的进化分析显示，MXPyV的分类学位置在蛋白质之间存在变化(图2)。在VP1和大T-抗原中，MXPyV与新近描述的新的人多瘤病毒(HPyV6、HPyV7、WU和KI)共有最近同源性，而在VP2或小T-抗原中，MXPyV分别与啮齿类动物多瘤病毒成簇，或形成独立的进化支。

[0277]

[0278] 表1.MXPyV的VP1、VP2和大T-抗原相对于其它多瘤病毒的氨基酸相同性。

[0279] 调控区

[0280] 位于多瘤病毒的早期区和晚期区之间的是非编码调控区，其包含复制起点和转录启动子/增强子。如几乎所有多瘤病毒常见的，发现MXPyV的调控区在复制起点的后侧包含AT-富集区(nt 26–57)。然而，调控区仅鉴定出由保守五元GAGGC序列确定的三个T抗原-结合位点，这与包含4～7个所述位点的大多数多瘤病毒不同。发现MXPyV调控区中的所述三个T-抗原结合位点中的两个结合以形成五核苷酸回文(GAGGCN4GCCTC)，这是在大多数多瘤病毒中发现的特征。在9种已知的人多瘤病毒中，仅HPyV6(n＝2)和HPyV7(n＝1)具有的T-抗原结合位点少于MxPyV。

[0281] 早期区

[0282] 如多瘤病毒所常见，MXPyV的LT-Ag被剪接。MXPyV的LT-Ag的供体和受体剪接位点基于剪接共有序列来测定，并与其它多瘤病毒的LT-Ag比对(图1A)。MXPyV的T-抗原基因座包含与其它多瘤病毒T抗原共有的保守特征，包括CR1(LXXLL)、DnaJ(HPDKGG)、pRB1-结合基序(LXCXE)、两个PP2A结合位点(CXCX2C)、锌指结构域(CX2CX5HX3H)和解旋酶/三磷酸腺苷酶(ATP酶)结构域(GPX3GKT)(图1B)。核定位信号和宿主范围结构域，尽管存在于SV40、BK和JC病毒(12，24，33，40，52)中，但其似乎在MXPyV中并不保守。

[0283] 晚期区

[0284] MXPyV在晚期区中保持所有已知多瘤病毒中常规的核心特征，包括VP1、VP2和VP3壳体蛋白质的开放阅读框，VP3的编码与VP2在同一ORF而利用了内部起始密码子，且VP1与VP3之间有重叠。与BKV、JCV、SV40和SV12不同，VP2基因上游没有用于未知蛋白(agnoprotein)的ORF。

[0285] 实施例2：临床样品中MX多瘤病毒的流行性

[0286] 设计靶向VP1基因的实时RT-PCR试验以研究临床样品中MX多瘤病毒的流行性(表2和5)。反转录酶步骤的纳入大幅提高了MXPyV检测的灵敏度(表5)，猜测是因为增强了受感染宿主细胞中的病毒mRNA转录本的检测。RT-PCR结果通过凝胶电泳上的预期大小的条带显现，熔解曲线分析和测序来证实。所有阳性结果还采用靶向VP1不同区域和LT-Ag基因的两个额外的传统RT-PCR试验来独立证实。检测来自两个大陆的患有或没有腹泻的儿童的粪便样品中的MXPyV，其中墨西哥的流行性是12.5％(96例中的12例)，加利福尼亚的流行性是3.3％(546例中的18例)，而智利的流行性是4.2％(96例中的4例)。138nt片段中的序列变异度在0.0–4.3％变化(数据未显示)。采用ViroChip泛病毒微阵列和腹泻病毒PCR对来自墨西哥的MXPyV-阳性粪便进行的分析在50％(12例中的6例)样品中鉴定出已知病原性腹泻病毒(补充表1)。

[0287] 补充表1

[0288]

[0289]

[0290] *TTV视为非病原性病毒

[0291] 补充表1.来自患有急性胃肠炎的墨西哥儿童的MXPyV-阳性样品(96例中的12例，12.5％)中发现的其它腹泻病毒。缩写：TTV，细环病毒。

[0292] 加利福尼亚的临床和人口统计数据均可获得，来自加利福尼亚的MXPyV-阳性样品中，没有显示腹泻和MxPyV感染之间的关联性(表3)。有趣的是，发现来自加利福尼亚的一位儿童在急性胃肠炎期间和之后的3个月均显示MXPyV-阳性，说明可能会出现MXPyV在粪便中的持续病毒排出(表4)。此外，发现女孩总体上比男孩更可能受MXPyV感染(p＝0.012)(表4)。鉴于BK和JC病毒与免疫功能不全个体中的疾病或无症状排出之间的已知关联性，在来自加利福尼亚的一家医院中的移植患者的480例血浆和尿液样品中筛选MXPyV，其中所有样品测试为阴性。此外，对来自墨西哥的住院肺炎患儿的136例呼吸样品进行筛选，其中仅有一例样品(0.74％)被证实为MXPyV感染阳性(表2)。该样品对应的是通过RT-PCR被发现受鼻病毒/肠道病毒共同感染的肺炎患儿。

[0293] MXPyV，以及紧密相关的菌株MWPyV和HPyV10的检出结果，似乎大幅限制在胃肠道。MXPyV显示在收集自加利福尼亚、墨西哥和智利的粪便样品中的总体流行性是3.4％(表2)，尽管136例呼吸样品中有一例(0.74％)也被测为阳性。SV40、BKV、JCV和MCV也在人粪便中被检出，尽管其原始病理学位置是人体内的其它位置，如多瘤病毒WU和KI。这些试验没有在来自高度免疫功能不全的移植受者的480例血浆或尿液样品中检出MXPyV，指示这些并不是MXPyV感染的蓄积位置，例如JC和BK病毒的情况。

[0294] 在加利福尼亚和智利胃肠炎研究(有可用对照)中未检出MXPyV存在和腹泻之间的关联(表2和5)。事实上，在来自智利的样品中，该趋势是反向的，其中在96例无症状对照个体间有4例MXPyV阳性样品，而在96例腹泻儿童中无阳性样品(表2)。值得注意的是，通过针对全部已知腹泻病毒的广谱病毒微阵列和特异性PCR试验检出来自墨西哥的12例MXPyV阳性腹泻样品中有6例呈阴性，表明MXPyV(如果是嗜人性)可能是胃肠炎的病因。

[0295] 若干证据线索指示该病毒可能是嗜人性的。在MXPyV的检测中，RT-PCR的灵敏度高于PCR(表5)，说明检测到的是表达的病毒mRNA，推测存在于粪便中受感染的宿主细胞中，暗示病毒复制发生于人的肠中。此外，在一位儿童急性胃肠炎发作时和3个月后在该儿童中检测到MXPyV，表明与其它人多瘤病毒相似，可能发生MXPyV的慢性感染。在患有WHIM综合征的患者组织中检测到与MXPyV紧密相关的变体：HPyV10，也指示MXPyV、MWPyV和HPyV10可能是嗜人性病毒(图4)。

[0296]

[0297]

[0298] *包括通过深度测序鉴定的初始MXPyV-阳性样品。

[0299] **斯坦福感染和家族传播研究。

[0300] 表2.通过PCR对临床样品筛选MXPyV的结果。

[0301]

[0302] 表3.在加利福尼亚SIFT研究中，对应于MXPyV病毒感染的粪便样品相比未感染样品的症状。

[0303]

[0304] *一个人提供两例样品，而16个人各提供1例样品。提供两例样品的个体对应于一位在急性腹泻期间和三个月之后均测出MXPyV阳性的儿童。

[0305] **146个人各提供两例样品，而243个人各提供一例样品。

[0306] p＝0.012的性别差异显著(费舍尔精确检验)。

[0307] 表4.根据MXPyV感染状态对提供加利福尼亚SIFT研究的粪便样品的个体进行人口统计。

[0308]

[0309] 缩写：Mex，墨西哥；CA，加利福尼亚。

[0310] 通过qPCR未检出

[0311] 未经PCR测试，因为样品无法获得，或者因为样品由qPT-PCR检测为

[0312] 阴性而通过其它定量RT-PCT试验检测为阳性

[0313] dol：10.1371/journalpone.0049449.t002

[0314] 表5.定量RT-PCR与PCR试验对于检测MXPyV和粪便中MXPyV效价的比较。

[0315] 本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

[0316] SEQ ID NO：1

[0317] gaggcttaggcctccggcccccggcttatatagaaaaaattttagcttattgttttgctacttaacctcaggtaggtcaacagctattgttggcaagctattgttggcaagtattggtattaatcacccagacaactcagaagtttccacctcttggaggcggtccagagttaacctgtgactgttggcgggaagccaataacagcaactttgacatttcatcacgagccctttaaacgccctctaggcggagacggaagacaattgactcttggcacggacggaagaggaatgccgtctgctcaccttagttaacacgagattttctttggaaatactccaaagtacagtaagtatatgggtgctgtaatctctgttattcttgatttaatagaattaatatcagttacaggctttgaagcagaaactataatttcaggggaggcagctgctatagtagaatcacagctttcatctttggcagttatagaaaatgcttcggcagccgaagttttatctacttttggattaaatgaaacctcttattctttattagtaaattttcctcaggcctttgaaaatgctgtatatactgctcaattaattcaaactatttctggggctagttctctgattgctgctggtatagaaacgcaaccttttcaagtatttgatgctggtagtaatatggctttacagcaatggagaccagactattttgatttatttattcctggatatagacactttgaatattattttaatgttctttctggttggggagaaagtctagtaaatacagtttctagagctttttgggaggctttattatcagaaactagaaacactgcaagacttttagcaagcagtgctgtagataatgtttataatgttggtgaacagggactccagaatattcaaaatgctctggtgggattaatagagagtgcaagatgggctttaagatttccggggaatgtatatcataatttagaaatgtactatacacaattaccaggccttactcctccacaagtaaggtcaattcaaaggcgcttagaagaagcgagaaattatggaccttctgttcaagtggataattctgaaaactcagttttttcagaacatttaagtggagactatatatttagaggagaagctccaggaggagcaagacaaagacagactcctgattggatgctacaattaattttaggaattcttggagatataactcctttttttaaagaagttattgaagaagtagaaggagaggaaaatgccgcctaaaagaaagactgtttgtactaaaactgtttgtaccagagcagaagcccccaacaaaaaagtctgtgaaaaacccacgtgttccagatcttgcagaatgtcatgtaacaaatgtccttgtataccgtgtccagttcctactaaagttcctagaattgtttctaagggtgggatagaagttttaaatataattccagggccggacaccacaatgacagttgaggtcattcttcaaccaaggatgggcaatgatgtaaaaacaaacaaatggtatggctacagtgatccaataacagtaacaaatactcctggtattaatcagctgcccacttatagtacagctaaaattaaactgccacccttaaatgaagatatgacctgtgaaaatttgtatatgtgggaggcagttgttcttaaaactgaattaataggagttactagcttaataactttgcatactccaggtgttgcagatcctgctactgcgccagctttaccagtggaaggggtttcatttcatttttttgcagtgggaggacagcctttagatttacaatattgtgttcctgcagctgatattgtttacccagatggaacaggcagttttgcaagttcagggggaactcagcaaacctatgatgcctcatttaaagccattttagatagagatggatactatcctgtggaggcctgggctccagatccagtaaaaaatgataattctagatactatggaactgttactggaggtactacaacacctcctgtgcttagtacaacaaatgctgtttctacagtattactggatgatagaggtgtgggacccctgtgtaagggagatgggctatatgtaacagcagtagatatttgtggagtgtttcaaatgcctgataatactaggagacacaggggcctagcaagatactttcaggtacagcttagacaaagagctgttagaaatccttatcctgtaaatagtttgttaaacagtttactgacaaaacaaatacctagcattgatggacagccaatggatgggactgataatcaagtacaggatgtaactgtgttccaaggaacagaacctcttccaggagaccccactttaactagacatatggatttgcgttgctgcccgggaaccccagtaacagatatgccaagtgacgacactccaacaccagttgctccagcagcaagataatttattgtgaattaattccagagtcttgttgtgtatcctcgtcagcatctacacatattaaaatatctttcaatggatcttccccagattctatgtttcttcttatatcatgatacattccaaagggtacatatttttcaattgtttctttccaatatcttacattatcatgaatttcaggatgaaatgcaattacaggttgccaccaacaaagaagcaataataatgtaacaccactttgaacaattctttttctgagcaactcagaatttttttccaaagaatttcttaagaacaacttaggcctgaaatttatagtttttatcatcctagcttgcaaagttggaggaataaaatagtcattcatagtaataatacctgggggaaatatttggctctttttattcacatgttttttttcaagatttacttttacacaaccatccaaatgatcccttaaattatctaagttggacatacccattcctggagttaaagatgagttagagccctcgttttgaccttttacatcttcaaaaacaaccatatattcatcaattgcacaaccaatttcaaaagctaacttatctggaggacagttaacatttagagtttttcccccaagcaaatcaagtatagcagcagctacagttgttttaccactattaattgggcctttaaataaaacatatctcctcttaggtacattttcagtcatggcctttattataaataaaataatttcatcaaaatgaggcatcaataatgataaccaagctactccagccatgtattgacaaatttcaacctcaccacaaatgtcttccattttttcaaacatatgtttaaaccttaataccaacagatgttctctggtactttctagtattaataatcttctctgagcagtgacccagtctgtagcttgctgacaaattgttttttgatttttacaatccttaaaaagttttgaattaatattttgagtttcatggaatttataatggtgttttaattttttttgttcacattttgagcacccctctacatcttttgcaaagtctaataacattcccataagtagcaagggatcctcacattgaacttctactgcaaattcacaaatttgctgccaattcacaactttatctttttcttcctcacagaaatctgttttacttaaaccatgttcctgactctgtttaattaatttaaaaggagttttacaaagagcatagtaacattcataggcctttaagcaaccttttactaatagaaagctcactgtacacagatttgaacaataattttttatagcacttactctatgttttccacttaataataaaaataataaactgtcaccatcaaattcatgcaaactataaaacatagctttaaattttaaaggcactttttcatacaagaattgccccttttcccttgtagtatataaaacaaaagaattcagagttttattactaaaaatagcattactaagaaattcaaggagtacttcaggaaaatctacaggattaaagtttcttggcctttttggaggagtacaggtagaattgctgctggattctctgggtctcttcttaggagtgttggtatcatttgcagtctgagaagcactttgagaaggccccggttcttcctcatcactgggagcaaaagattcattacaacttaaatcttcatcccatcctctattaaattcttcccaccattgatcccattcaggagtcccataagtgggatttccctaaaataaaagagaaagaacttacccacaaaattaattctcccagcaagcgaagcagatcaaattcagtattgtgcattatatgcttccaccaaaagaatgaagtatagccaaattcttgtccaaaccaaagcaaaaagcatttgtagcaaaaacattcaccccaaacaagacattgcttttgtttcgctagtttatcatttctgtgctgctttttaagcaagcagcaaacacagccacatttgtgtcttaataaatcacttgcacacaaaggccaaatgtatataattttttcctcaaagctaggtcctagcacatctcctaaagttactacatcgtctataaagtaaccaacctttgcaggaaaataaacttctccttctcttctaagcttttcaattgtagtatacattttagaaaacggctcattcaagcgtttcattttttctccatctccccctttgtcagggtgcagttttaaacaagtctgcctgtatttatattgcattaagggaatatttccccaagcagcagtatttaagcttaaaagagccataagctcttttacttcatctctagaaagtactctatccatccttgctgaatttgcaagtagtaaaaagtttgcagacgcggtaaagatggctcccagagtccttcctcttttcaccggaaagaca

[0318] SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：1的358..1290)

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[0320] SEQ ID NO：3(SEQ ID NO：1的688..1290)

[0321] atggctttacagcaatggagaccagactattttgatttatttattcctggatatagacactttgaatattattttaatgttctttctggttggggagaaagtctagtaaatacagtttctagagctttttgggaggctttattatcagaaactagaaacactgcaagacttttagcaagcagtgctgtagataatgtttataatgttggtgaacagggactccagaatattcaaaatgctctggtgggattaatagagagtgcaagatgggctttaagatttccggggaatgtatatcataatttagaaatgtactatacacaattaccaggccttactcctccacaagtaaggtcaattcaaaggcgcttagaagaagcgagaaattatggaccttctgttcaagtggataattctgaaaactcagttttttcagaacatttaagtggagactatatatttagaggagaagctccaggaggagcaagacaaagacagactcctgattggatgctacaattaattttaggaattcttggagatataactcctttttttaaagaagttattgaagaagtagaaggagaggaaaatgccgcctaa[0322] SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：1的1280..2491)

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[0324] ggaaatcccacttatgggactcctgaatgggatcaatggtgggaagaatttaatagaggatgggatgaagatttaagttgtaatgaatcttttgctcccagtgatgaggaagaaccggggccttctcaaagtgcttctcagactgcaaatgataccaacactcctaagaagagacccagagaatccagcagcaattctacctgtactcctccaaaaaggccaagaaactttaatcctgtagattttcctgaagtactccttgaatttcttagtaatgctatttttagtaataaaactctgaattcttttgttttatatactacaagggaaaaggggcaattcttgtatgaaaaagtgcctttaaaatttaaagctatgttttatagtttgcatgaatttgatggtgacagtttattatttttattattaagtggaaaacatagagtaagtgctataaaaaattattgttcaaatctgtgtacagtgagctttctattagtaaaaggttgcttaaaggcctatgaatgttactatgctctttgtaaaactccttttaaattaattaaacagagtcaggaacatggtttaagtaaaacagatttctgtgaggaagaaaaagataaagttgtgaattggcagcaaatttgtgaatttgcagtagaagttcaatgtgaggatcccttgctacttatgggaatgttattagactttgcaaaagatgtagaggggtgctcaaaatgtgaacaaaaaaaattaaaacaccattataaattccatgaaactcaaaatattaattcaaaactttttaaggattgtaaaaatcaaaaaacaatttgtcagcaagctacagactgggtcactgctcagagaagattattaatactagaaagtaccagagaacatctgttggtattaaggtttaaacatatgtttgaaaaaatggaagacatttgtggtgaggttgaaatttgtcaatacatggctggagtagcttggttatcattattgatgcctcattttgatgaaattattttatttataataaaggccatgactgaaaatgtacctaagaggagatatgttttatttaaaggcccaattaatagtggtaaaacaactgtagctgctgctatacttgatttgcttgggggaaaaactctaaatgttaactgtcctccagataagttagcttttgaaattggttgtgcaattgatgaatatatggttgtttttgaagatgtaaaaggtcaaaacgagggctctaactcatctttaactccaggaatgggtatgtccaacttagataatttaagggatcatttggatggttgtgtaaaagtaaatcttgaaaaaaaacatgtgaataaaaagagccaaatatttcccccaggtattattactatgaatgactattttattcctccaactttgcaagctaggatgataaaaactataaatttcaggcctaagttgttcttaagaaattctttggaaaaaaattctgagttgctcagaaaaagaattgttcaaagtggtgttacattattattgcttctttgttggtggcaacctgtaattgcatttcatcctgaaattcatgataatgtaagatattggaaagaaacaattgaaaaatatgtaccctttggaatgtatcatgatataagaagaaacatagaatctggggaagatccattgaaagatattttaatatgtgtagatgctgacgaggatacacaacaagactctggaattaattcacaataaatggatagagtactttctagagatgaagtaaaagagcttatggctcttttaagcttaaatactgctgcttggggaaatattcccttaatgcaatataaatacaggcagacttgtttaaaactgcaccctgacaaagggggagatggagaaaaaatgaaacgcttgaatgagccgttttctaaaatgtatactacaattgaaaagcttagaagagaaggagaagtttattttcctgcaaag

[0325] SEQ ID NO：6＝SEQ ID NO：1的(4234..4854)的反向互补序列

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[0327] SEQ ID NO：7＝SEQ ID NO：1的(4615..4854)的反向互补序列

[0328] atggatagagtactttctagagatgaagtaaaagagcttatggctcttttaagcttaaatactgctgcttggggaaatattcccttaatgcaatataaatacaggcagacttgtttaaaactgcaccctgacaaagggggagatggagaaaaaatgaaacgcttgaatgagccgttttctaaaatgtatactacaattgaaaagcttagaagagaaggagaagtttattttcctgcaaag

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