针对黄病毒科病毒感染的嵌合多肽及其治疗应用

申请号 CN200680022067.9 申请日 2006-06-20 公开(公告)号 CN101257917B 公开(公告)日 2016-02-10
申请人 巴斯德研究院; 国立科学研究中心; 发明人 F·坦吉; M·卢卡-胡拉尼; E·纳瓦罗-桑切斯; M-P·弗伦凯尔; H·贝杜埃勒; C·孔布勒代; P·德普雷;
摘要 本 发明 涉及用于 预防 或 治疗 黄病毒科 病毒感染 的嵌合多肽的构建。本发明还涉及嵌合多肽在制备重组病毒载体如活麻疹病毒载体中的应用。
权利要求

1.嵌合多肽,其组成为:
从所述嵌合多肽的N端至C端为黄病毒科病毒E蛋白的亚结构域肽、黄病毒科病毒M膜蛋白的亚结构域肽和连接所述E蛋白的亚结构域肽和M蛋白的亚结构域肽的由基酸序列RRDKR组成的连接肽;其中所述嵌合多肽由SEQ ID NO:3的序列组成。
2.一种分离的多核苷酸,其编码权利要求1的嵌合多肽。
3.权利要求2的多核苷酸,其由选自如下一组的核苷酸序列组成:
-SEQ ID NO:4的7至492位核苷酸。
4.一种在病毒基因组中插入了权利要求3的多核苷酸的重组麻疹病毒载体。
5.权利要求4的重组病毒载体,其中所述载体是活麻疹病毒Schwarz株载体。
6.权利要求4的重组病毒载体,其选自由保藏在CNCM的、保藏号为I-3440、I-3455、I-3619、I-3620、I-3621、I-3622和I-3623的病毒载体组成的组中。
7.权利要求4-6任一项的病毒载体在制备用于预防敏感物种中登革病毒感染的免疫组合物中的应用。
8.包含权利要求2的多核苷酸的克隆载体或表达载体。
9.用于预防敏感物种中登革病毒感染的免疫组合物,其包含至少如下成分之一:
-权利要求1的嵌合多肽;
-权利要求2的多核苷酸;
-权利要求4的重组病毒载体;及
-权利要求8的克隆载体和/或表达载体。
10.权利要求9的免疫组合物,其还包含药物可接受的载体。
11.权利要求1的嵌合多肽、权利要求2的多核苷酸、权利要求4的重组病毒载体、或权利要求8的克隆载体和/或表达载体在制备用于预防敏感物种中登革病毒感染的药物中的应用。

说明书全文

针对黄病毒科病毒感染的嵌合多肽及其治疗应用

发明领域

[0001] 本发明涉及用于预防或治疗黄病毒科病毒感染的嵌合多肽的构建。本发明还涉及嵌合多肽在制备重组病毒载体如用于作为疫苗的麻疹活病毒载体中的应用。

背景技术

[0002] 黄病毒(黄病毒科(Flaviviridae))是被膜病毒,其基因组是正链RNA分子。黄病毒粒(flavivirion)由名为C(核心蛋白)、M(膜蛋白)和E(包膜蛋白)的3个结构蛋白质组成。暴露于病毒表面的E蛋白负责包括病毒附着和特异膜融合在内的主要生物学功能。基因组RNA的翻译产生了多蛋白前体,其同时被细胞和病毒蛋白酶切割产生各个病毒蛋白质:3个结构蛋白质C、prM(M蛋白的糖基化前体)、E及7个非结构蛋白质NS1至NS5。黄病毒在感染细胞的细胞质中复制。黄病毒具有复杂的天然传播周期,其涉及多个天然宿主(多数是哺乳动物类)及载体,后者为食血节肢动物如蜱和蚊。这些病毒是严重性人类疾病如出血现象或脑膜脑炎综合症的主要原因。登革(DEN)病毒是全世界公认的严重性出血病原因的两种主要黄病毒之一。
[0003] 登革病是突发疾病并且是公共健康的关注问题。50多年来,进行了针对登革病毒的4种血清型的活减毒候选疫苗的开发。对疫苗的研究困难在于缺少模拟登革病毒引起的疾病即登革出血热和与之相关的休克综合症的动物模型。疫苗的效可在小鼠中评估,利用一组适应小鼠的神经毒性DEN病毒进行,脑内接种后处死成年动物。然而,基于这种类型的鼠类模型的这些研究不能反映人中登革病毒活性。在猴中,这种保护只能通过测量在实验性感染测试后病毒血症(virémie)的减少证 明。因此,用于针对登革病的疫苗的最终测试应该基于在人中进行的临床检验。在最近50年中研发的大多数候选减毒疫苗在临床检验中或者是高反应原性的(trop réactogéniques)或者是免疫原性(immunogènes)不足。现在多个减毒四价候选物已处于I期或II期临床检验。这种类型的四价减毒活疫苗的开发中的困难似乎在于获得四种化合价的均衡混合物以产生针对所述四种血清型的保护性免疫。
[0004] 不同的活嵌合候选疫苗也在研发中。其基于在不同黄病毒中同源结构基因的交换。多种类型的型间嵌合病毒已被构建并在小鼠或猴中测试。嵌合病毒已基于黄热病疫苗病毒(YF-17D)使用Chimerivax 技术构建。这种嵌合物YF-17D/DEN的四价混合物已在恒河猴中测试。而且,很难均衡四种嵌合病毒以获得均一的免疫作用。I/II期临床检验实际上是准备测试登革2嵌合病毒疫苗。其它方法包括产生自表达载体的亚均一(sous-unitaires)产物疫苗候选物和已处在前临床研发中的裸DNA类型的候选物。因此,针对登革病毒的四价疫苗的开发是一个未解决的问题,是世界卫生组织的名录中的最重要的问题之一。
[0005] 因此需要开发新的有效的候选疫苗,其易于生产并配制以预防或治疗由黄病毒科病毒如登革病毒造成的感染。
[0006] 发明简述
[0007] 本发明涉及嵌合多肽及其在预防或治疗黄病毒科病毒感染中的应用。
[0008] 更特别地,本发明涉及包含与黄病毒科病毒M膜蛋白的亚结构域肽结合的黄病毒科病毒E蛋白的亚结构域肽的嵌合多肽。
[0009] 本发明还涉及编码本发明的嵌合多肽的分离的或纯化的多核苷酸。
[0010] 本发明还涉及在基因组中插入了本发明多核苷酸的麻疹重组病毒载体。
[0011] 本发明还涉及特异性识别至少前述多核苷酸和/或本发明嵌合多肽的纯化的单克隆或多克隆抗体
[0012] 本发明还涉及本发明病毒载体在制备用于预防或治疗敏感物种(espèce sensible)中黄病毒科病毒感染的免疫组合物中的应用。
[0013] 本发明还涉及包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。
[0014] 一方面,本发明提供了用于预防和/或治疗敏感物种中黄病毒科病毒感染的免疫组合物,其特征在于包含至少如下成分之一:
[0015] -前述的嵌合多肽;
[0016] -本发明的多核苷酸;
[0017] -本发明的重组病毒载体;
[0018] -本发明的抗体;及
[0019] -本发明的克隆和/或表达载体。
[0020] 本发明还提供了在敏感物种中预防和/或治疗黄病毒科病毒感染的方法,包括给予药物有效量的至少如下成分之一:
[0021] -前述的嵌合多肽;
[0022] -本发明的多核苷酸;
[0023] -本发明的重组病毒载体;
[0024] -本发明的抗体;及
[0025] -本发明的克隆和/或表达载体。
[0026] 附图简述
[0027] 图1示出了384个核苷酸(nt)的序列,其编码通过二肽Arg-Ser与网蛋白(calréticuline)信号肽(ssCRT)融合的病毒株FGA/89的[EDIII]DV1结构域,该序列具有插入载体MVSchw中所需的两个位点BsiWI(5’)和BssHII(3’)。
[0028] 图2示出了516个核苷酸(nt)的序列,其编码通过二肽Arg-Ser与钙网蛋白信号1-40
肽(ssCRT)融合的病毒株FGA/89的[EDIII+M ]DV1 蛋白,该序列具有插入载体MVSchw中所需的两个位点BsiWI(5’)和BssHII(3’)。
[0029] 图3示出了用本发明麻疹重组病毒载体感染的Vero细胞。感染复 数10TCIP50/细胞,30小时。用特异性抗DV-1 HMAF抗体产生免疫荧光
[0030] 图4示出了在用重组MVSchw-DV-1病毒感染的Vero细胞的胞质裂解物(C)和上1-40
清(S)中[EDIII]DV1和[EDIII+M ]DV1抗原结构域的表达和分泌。
[0031] 图5示出了在用S2果蝇细胞的过滤浓缩上清中[EDIII]DV1和[EDIII+M1-40]DV1抗原结构域的表达和分泌,所述细胞以可诱导方式表达这些抗原。
[0032] 图6示出了编码本发明优选的嵌合多肽的核苷酸序列。
[0033] 图7示出了本发明一个优选的嵌合多肽的基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0034] 图8示出了本发明一个优选的胞外结构域III(EDIII)的二聚体的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0035] 图9示出了本发明一个优选的胞外结构域III(EDIII)的二聚体的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0036] 图10示出了本发明一个优选的嵌合多肽的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0037] 图11示出了本发明一个优选的胞外结构域III(EDIII)的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0038] 图12示出了本发明一个优选的胞外结构域III(EDIII)的二聚体的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列。
[0039] 图13示出了编码本发明一个优选的胞外结构域III(EDIII)肽的核酸序列。
[0040] 图14示出了编码本发明一个优选的嵌合多肽的核苷酸序列。
[0041] 图15-19示出了本发明优选的嵌合多肽的氨基酸序列。
[0042] 图20-24示出了分别编码图15-19中所示嵌合多肽的核苷酸序列。
[0043] 图25-29分别示出了图15-19的嵌合多肽的示意图。
[0044] 图30示出了用于构建本发明嵌合多肽的登革病毒的4种血清型的 apoptoM序列的肽序列。
[0045] 发明详述
[0046] 本发明的独创性是构建嵌合多肽及其在预防或治疗黄病毒科病毒感染中的应用。“黄病毒科病毒”是选自如下一组中的病毒:西尼罗病毒、登革病毒、日本脑炎病毒和黄热病毒。
[0047] 1.多肽和多核苷酸
[0048] 第一方面,本发明提供了一种嵌合多肽,其包含与黄病毒科病毒的M膜蛋白的亚结构域肽结合的黄病毒科病毒的E蛋白的亚结构域肽。本发明还提供了由上述肽组成的多肽。
[0049] “多肽”在本发明中无差别地指蛋白质或肽。“嵌合多肽”是指包含不同来源的亚部分(sous-parties)的所有蛋白质或肽,例如来源于第一物种的多肽A和来源于第二物种的多肽(蛋白质或肽)。蛋白质或肽如果其包含来源于相同物种的不同蛋白质或肽或者来源于不同物种的相同蛋白质或肽的亚部分也被认为是嵌合多肽。
[0050] 优选地,E蛋白的亚结构域肽由包含如下限定的序列之一的氨基酸序列的胞外结构域III组成:
[0051] -SEQ ID NO:1的19至120位氨基酸;
[0052] -SEQ ID NO:3的19至117位氨基酸;
[0053] -SEQ ID NO:6的21至123位氨基酸;
[0054] -SEQ ID NO:12的21至121位氨基酸;及
[0055] -SEQ ID NO:14的21至123位氨基酸。
[0056] 特别地,所述E蛋白的亚结构域肽由登革病毒1、2、3或4的胞外结构域III的二聚体组成,其包含如下限定的序列之一的氨基酸序列:
[0057] -SEQ ID NO:8的21至262位氨基酸;及
[0058] -SEQ ID NO:10的21至262位氨基酸,
[0059] 或者由登革病毒1、2、3和4的胞外结构域III的四聚体组成,其包含SEQ ID NO:16的21至494位氨基酸序列或SEQ ID NO:24的 18至429位氨基酸序列。
[0060] M蛋白的亚结构域肽特别由胞外结构域1-40组成,其包含SEQ ID NO:3的123至162位氨基酸序列或apoptoM序列,该序列包含SEQ ID NO:3的154至162位氨基酸序列或SEQ ID NO:12的122至132位氨基酸序列。
[0061] 在一个优选实施方案中,本发明的嵌合多肽还包含连接E蛋白的亚结构域肽与M蛋白的亚结构域肽的连接片段(segment de liaison)。所述连接片段优选是具有序列RRDKR或RREKR的五肽。
[0062] 在更优选的实施方案中,本发明的嵌合多肽包含选自如下序列的氨基酸序列:
[0063] a)SEQ ID NO:3的19至162位氨基酸;
[0064] b)SEQ ID NO:6的21至168位氨基酸;
[0065] c)SEQ ID NO:12的21至132位氨基酸;
[0066] d)SEQ ID NO:20的18至624位氨基酸;
[0067] e)SEQ ID NO:21的18至609位氨基酸;
[0068] f)SEQ ID NO:22的18至624位氨基酸;
[0069] g)SEQ ID NO:23的18至489位氨基酸;及
[0070] h)SEQ ID NO:24的21至474位氨基酸。
[0071] 本发明还提供了下文提及的核苷酸序列编码的多肽(及其片段)。
[0072] 在一个特别优选的实施方案中,本发明的多肽与上述a)至h)限定的氨基酸序列之一在最佳序列对比之后具有至少80%、优选至少90%、更优选至少98%、更优选至少100%的相同性百分比。
[0073] 在相关方面,本发明提供了编码前述限定的嵌合多肽的分离的或纯化的多核苷酸。
[0074] “分离的或纯化的”是指分子已被人为改变其天然状态,即如果分子存在于天然状态中,其最初环境已被改变和/或从其最初环境中提取出。例如,天然存在于及在可以天然表达多核苷酸或多肽的活生物体的生物学环境中发现的该多核苷酸或多肽在本文中不是“分离的”。然而, 分离自其天然环境和/或通过克隆、扩增和/或化学合成获得的相同的多核苷酸或多肽在本发明中被认为是“分离的”。另外,通过转化、遗传操作或通过任何其它重组方法在生物体中导入的多核苷酸或多肽也是“分离的”,只要其存在于所述生物体中。
[0075] 在本发明中无差别使用的术语核苷酸序列、核酸、核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列是指精确的核苷酸链,其被修饰或未被修饰,可以确定核酸的片段或区域,包含或不包含非天然核苷酸,及也可以相应于上述DNA转录产物的双链DNA、单链DNA。因此,本发明的核酸序列还包含PNA(肽核酸(Peptid Nucleic Acid))或类似物。本发明多核苷酸的片段包含至少15个连续核苷酸。优选地,其包含至少20个连续核苷酸及更优选地,其包含至少30个连续核苷酸。
[0076] 本发明还提供了由15、20或30个连续核苷酸的片段组成的多核苷酸片段。
[0077] 所有被化学、酶学或代谢修饰但保留了起始嵌合多肽的生物化学性质的多核苷酸均包括在本发明的范围内。
[0078] 根据本发明的一个实施方案,编码本发明嵌合多肽的本发明的多核苷酸有利地包含如下序列之一的核苷酸序列:
[0079] a)SEQ ID NO:4的7至492位核苷酸;
[0080] b)SEQ ID NO:5;
[0081] c)SEQ ID NO:7的7至504位核苷酸;
[0082] d)SEQ ID NO:13的7至504位核苷酸;及
[0083] e)SEQ ID NO:25-29。
[0084] 根据一个非常优选的实施方案,本发明的多核苷酸与上述a)至e)核苷酸序列之一在最佳对比后具有至少80%、优选至少90%、更优选至少98%及最优选至少100%的相同性百分比。
[0085] 在本发明中两个核酸序列或氨基酸序列之间的相同性百分比是指在较佳对比之后获得的被比较的两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比,上述百分比是无规统计学的(purement statistique)且两 个序列之间的差异依赖于偶然性或其全长。“较佳对比”或“最佳对比”是指如下确定的相同性百分比是最高的对比。两个核酸序列或氨基酸序列之间的序列比较通常是通过对比具有最佳方式排列的这些序列而实现的,所述比较通过比较片段或窗口来鉴定和比较序列相似性的局部区域而实现。用于比较的序列最佳对比除了人工对比之外,还可以通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法(algorithme d’homologielocale)、Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索法(méthode de recherche de similarité)、用于这些算法的信息学软件(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI的Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA和TFASTA)。为了获得最佳对比,优选使用BLAST程序,应用矩阵BLOSUM62。还可以使用矩阵PAM或PAM250。
[0086] 两个核酸序列或氨基酸序列之间的相同性百分比通过比较以最佳方式排列的两个序列来确定,在这两个序列间,被比较的核酸或氨基酸序列与用于最佳对比的参考序列相比可包含添加或缺失。相同性百分比通过确定两个序列间相同核苷酸或氨基酸残基的相同位置数来计算,用相同位置数除以被比较位置的总数再将得到的结果乘以100从而得到这两个序列间的相同性百分比。
[0087] 与参考序列最佳对比之后,具有至少80%、优选至少90%、更优选至少98%的相同性百分比的核酸序列是指与参考核酸序列相比,所述核酸序列具有某些修饰特别如缺失、截短、延长、嵌合融合和/或取代,更准确地,所述核酸序列在最佳对比之后与参考核酸序列具有至少80%、优选至少90%、更优选至少98%的相同性。优选地,特异杂交或强严格性(forte stringence)条件是指确保在最佳对比之后两个序列之一和另一个的互补序列之间至少80%、优选至少90%、更优选至少98%的相同性的条件。
[0088] 在强严格性条件下的杂交是指选择温度和离子强度条件以允许维 持互补核酸片段间的杂交。为了说明目的,如上所述的限定核苷酸序列的杂交步骤的强严格性条件有利地是如下。
[0089] DNA-DNA或DNA-RNA杂交在两个步骤实现:(1)在含有5×SSC(1×SSC相应于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50%甲酰胺、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、
10×Denhardt’s、5%硫酸葡聚糖和1%的鲑精DNA的磷酸缓冲液(20mM,pH7.5)中在42℃预杂交3小时;(2)根据探针的大小在某一温度下杂交20小时(即对于探针大小>100个核苷酸为42℃),随后在2×SSC、20℃洗涤20分钟2次,在0.1×SSC+0.1%SDS、在20℃洗涤20分钟1次。对于探针大小>100个核苷酸,最后一次洗涤在0.1×SSC+0.1%SDS中、在60℃进行30分钟。本领域技术人员可以根据Sambrook等,1989的教导使上述对于一定大小的多核苷酸的强严格性杂交条件适应于更大或更小大小的寡核苷酸。
[0090] 本发明的多肽和多核苷酸可以通过所有合适的方法制备。特别是可以通过化学合成获得,也可以通过在适当的细胞培养物中使用不同载体由生物学手段获得。本发明的肽如果需要可以为去糖基化或糖基化形式。本领域技术人员能够获得不同的多核苷酸/多肽并且也能够确定获得的多肽/多核苷酸中具有足够生物学活性的那些。
[0091] 2.重组病毒载体
[0092] 另一方面,本发明涉及在基因组中插入了本发明多核苷酸的麻疹重组病毒载体。这种载体通常由本领域技术人员使用的方法制备,而且获得的克隆可以通过本领域技术人员熟知的方法导入适当的宿主中。
[0093] 根据一个优选的实施方案,本发明的重组病毒载体有利地是活麻疹病毒载体Schwarz株(souche),如选自由保藏在CNCM保藏号为I-3440、I-3442、I-3452、I-3453、I-3454、I-3455、I-3619、I-3620、I-3621、I-3622和I-3623组成的病毒载体组中的那些。麻疹病毒Schwarz株的完整反基因组序列可以例如通过保藏号为I-3440和I-3442株的pTM质粒获得。
[0094] 载体pTM-MVSchw2-[EDIII+M1-40]WNV(IS-98-ST1)于2005年5月26日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3440。
[0095] 这个载体是含有麻疹病毒Schwarz株的完整反基因组及一个额外的表达单元的PTM质粒,所述额外的表达单元置于P和M基因间、含有与膜蛋白的1-40序列融合的西尼罗病毒(WNV IS-98-ST1)的包膜蛋白的结构域III的序列。
[0096] 所述载体在用小菌落接种后可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0097] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0098] 载体pTM-MVSchw2-[EDIII+ApoptoM]DV1(FGA89)于2005年5月26日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3442。
[0099] 这个载体是含有麻疹病毒Schwarz株的完整反基因组及一个额外的表达单元的pTM质粒,所述额外的表达单元置于P和M基因间、含有与M膜蛋白的凋亡序列融合的登革病毒FGA89株的包膜蛋白的结构域III的序列。
[0100] 所述载体在用小菌落接种后可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0101] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0102] 载体pTRE2-SSCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα1-2于2006年6月16日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3452。
[0103] 这个载体是含有与M蛋白的促凋亡(proapoptotiques)序列以及具有登革病毒1和2的α螺旋序列的E蛋白的胞外结构域III融合的人钙网蛋白信号肽序列的pTRE2质粒。
[0104] 质粒中含有的并且组成了本发明多核苷酸的插入体的序列为图8所示的SEQ ID NO:9。
[0105] 所述载体可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0106] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0107] 载体pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα3-4于2005年6月16日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3453。
[0108] 这个载体是含有与登革病毒1的M蛋白的促凋亡序列和胞外结构 域III的序列融合的人钙网蛋白信号肽序列及登革病毒3-4的Hα的pTRE2质粒。
[0109] 质粒中含有的并且组成了本发明多核苷酸的插入体的序列为图9所示的SEQ ID NO:11。
[0110] 所述载体可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0111] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0112] 载体pTRE2-ssCRT-ApoptoMden1/DIII-Hα1-2-3-4于2005年6月16日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3454。
[0113] 这个载体是含有与登革病毒1的M蛋白的促凋亡序列以及具有登革病毒1、2、3、4的E蛋白的α螺旋(Hα)的胞外结构域III的序列融合的人钙网蛋白信号肽序列的pTRE2质粒。
[0114] 质粒中含有的并且组成了本发明多核苷酸的插入体的序列为图2所示的SEQ ID NO:4。
[0115] 所述载体可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0116] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0117] 载体pTRE2-ssCRT-EctoM40den1/DIII-Hα1-2-3-4于2005年6月16日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3455。
[0118] 这个载体是含有与登革病毒1的M蛋白的1-40胞外结构域序列以及具有登革病毒1、2、3、4的E蛋白的α螺旋(Hα)的胞外结构域III的序列融合的人钙网蛋白信号肽序列的pTRE2质粒。
[0119] 质粒中含有的并且组成了本发明多核苷酸的插入体的序列为图12所示的SEQ ID NO:17。
[0120] 所述载体可以培养于LB ampi 100μ/ml培养基中。
[0121] 其在-80℃冷冻可以长期保存。
[0122] 载体pUC57-TetraDVA(导入于大肠杆菌(E.coli)菌株中)于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3619。
[0123] 这个载体是含有与M膜蛋白的胞外结构域融合的、为在哺乳动物细胞中表达登革病毒4种血清型(1、2、3、4)的E包膜蛋白的胞外结 构域III的四聚体构建体而最优化的核苷酸序列的pUC质粒。
[0124] 质粒载体中含有的插入体为图25所示。
[0125] 含有所述载体的菌株(souche)可以培养于LB ampi 100μg/ml培养基中。
[0126] 载体pUC57-TetraDVB(导入于大肠杆菌菌株中)于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3620。
[0127] 这个载体是含有与M膜蛋白的胞外结构域融合的、为在哺乳动物细胞中表达登革病毒4种血清型(1、2、3、4)的E包膜蛋白的胞外结构域III的四聚体构建体而最优化的核苷酸序列的pUC质粒。
[0128] 质粒载体中含有的插入体为图26所示。
[0129] 含有所述载体的菌株可以培养于LB ampi 100μg/ml培养基中。
[0130] 载体pUC57-TetraDVC(导入于大肠杆菌菌株中)于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3621。
[0131] 这个载体是含有与M膜蛋白的胞外结构域融合的、为在哺乳动物细胞中表达登革病毒4种血清型(1、2、3、4)的E包膜蛋白的胞外结构域III的四聚体构建体而最优化的核苷酸序列的pUC质粒。
[0132] 质粒载体中含有的插入体为图27所示。
[0133] 含有所述载体的菌株可以培养于LB ampi 100μg/ml培养基中。
[0134] 载体pUC57-TetraDVD(导入于大肠杆菌菌株中)于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3622。
[0135] 这个载体是含有与M膜蛋白的胞外结构域融合的、为在哺乳动物细胞中表达登革病毒4种血清型(1、2、3、4)的E包膜蛋白的胞外结构域III的四聚体构建体而最优化的核苷酸序列的pUC质粒。
[0136] 质粒载体中含有的插入体为图28所示。
[0137] 含有所述载体的菌株可以培养于LB ampi 100μg/ml培养基中。
[0138] 载体pUC57-TetraDVE(导入于大肠杆菌菌株中)于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎),保藏号为I-3623。
[0139] 这个载体是含有与M膜蛋白的胞外结构域融合的、为在哺乳动物 细胞中表达登革病毒4种血清型(1、2、3、4)的E包膜蛋白的胞外结构域III的四聚体构建体而最优化的核苷酸序列的pUC质粒。
[0140] 质粒载体中含有的插入体为图29所示。
[0141] 含有所述载体的菌株可以培养于LB ampi 100μg/ml培养基中。
[0142] 3.克隆和/或表达载体和抗体
[0143] 另一方面,本发明涉及任何克隆和/或表达载体及被这种载体转化的并包含允许编码本发明的嵌合多肽的核苷酸序列表达的调节元件的(原核或真核)细胞宿主。所述载体可以使用本领域技术人员常用的方法制备,所得的克隆可以通过常规方法导入适当的宿主中,所述方法例如脂转染、电穿孔、热激、膜化学透化后转化(la transformation aprèsperméabilisation chimique de la membrane)、细胞融合。
[0144] 本发明还包括被本发明载体转化的宿主细胞,特别是真核和原核细胞以及包含前述本发明转化的细胞的非人转基因动物,优选是哺乳动物。这些动物可以用作模型,用于研究炎症疾病和/或免疫疾病的病因,特别是消化道炎症疾病的病因,或者研究癌症。
[0145] 可以用于本发明的细胞可以是细菌细胞(Olins et Lee(1993),Curr.Op.Biotechnology 4:520),也 可 以 是 酵 母 细 胞 (Buckholz,(1993),Curr.Op.Biotechnology 4,538),也可以是动物细胞,特别是哺乳动物细胞培养物(Edwards et Aruffo(1993),Curr.Op.Biotechnology,4,558)。
[0146] 本发明使用的术语“克隆和/或表达载体”是指被用于转染不同类型的细胞的多核苷酸构建体。为此,所述载体是用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的表达载体,用于分离、扩增和复制插入的核苷酸的克隆载体或者包含多个载体特性的穿梭载体。
[0147] 4.多克隆或单克隆抗体
[0148] 本发明的多肽和多核苷酸也可以用于制备能够固定(优选以特异性方式)本发明的至少一种嵌合多肽/多核苷酸的多克隆或单克隆抗体。本发明也涉及通过熟知的技术获得的纯化的所述抗体,所述技术例如Kolher et Milstein(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity,Nature(1975),262:495-497)所述的技术。根据本发明的一个优选的实施方案,所述抗体是人源化形式的。根据本领域技术知识,本领域技术人员知道如何制备这些类型的抗体。
[0149] 5.应用方法和过程
[0150] 另一方面,本发明涉及预防和/或治疗在敏感物种中的黄病毒科病毒感染。更特别地,本发明涉及本发明的重组病毒载体在制备用于预防或治疗敏感物种中黄病毒科病毒感染的免疫组合物中的应用。“敏感物种,,是指对黄病毒科病毒感染易感的动物,例如人。
[0151] 本发明还涉及预防和/或治疗敏感物种中黄病毒科病毒感染的方法,包括给予药物有效量的如下至少一种成分:
[0152] -本发明的嵌合多肽;
[0153] -本发明的多核苷酸;
[0154] -本发明的重组病毒载体;
[0155] -本发明的抗体;及
[0156] -本发明的克隆和/或表达载体。
[0157] “黄病毒科病毒感染”是指例如黄病毒病(flaviviroses)如登革病、黄热病、日本脑炎和西尼罗热病。制备和给予本发明所述成分的方法不再描述,因为其为本领域技术人员所已知。
[0158] 6.组合物
[0159] 本发明还涉及用于预防和/或治疗黄病毒科病毒感染的免疫组合物。“免疫组合物”是指含有具有在体内或体外诱导细胞类型或体液免疫应答的能力的成分的组合物。
[0160] 在一个优选实施方案中,本发明的组合物还含有药物可接受载体及选自如下一组的一种成分:
[0161] -本发明的多核苷酸;
[0162] -本发明的嵌合多肽;
[0163] -本发明的重组病毒载体;
[0164] -本发明的抗体;及
[0165] -本发明的克隆和/或表达载体。
[0166] 本发明的组合物可以为用于药物给予的常规非特异的固体或液体形式,即例如液体给药的形式为凝胶或者为允许例如控释的任何其它载体(support)。可以使用的组合物,在人中可以特别提及的是可注射组合物。
[0167] 本发明的组合物还可以包含增加或倾向增加本发明的嵌合多肽的免疫原性的组分(composants),特别是其它免疫原性肽、特异性免疫佐剂或不增加免疫原性的如明矾、QS21、Freund佐剂、SBA2佐剂、montanide、多糖或等价化合物(composés équivalents)。
[0168] 本领域技术人员能够制备药物可接受的组合物并根据一些因素确定给药的优先方式和要给予的量。影响这种选择的因素中包括:治疗性质、各成分在组合物中的具体性质、活性与否;疾病阶段;患者状态、年龄和体重等等。
[0169] 实施例
[0170] 下文的实施例将能够更明显的阐述本发明的其它特性和优点,其用于阐述本发明而并非限制其范围。在不偏离本发明的精神和范围下,可以进行修改和变化。下文描述了优选的材料和方法,但是也可以使用与其等价的其它方法或产品实施本发明。
[0171] 实施例1:重组麻疹病毒MVSchw-[EDIII+M1-40]DV1作为针对登革的候选疫苗原型(PTR156)
[0172] 如图1和2中描述,基于一部分诱导中和抗体的登革病毒包膜糖蛋白E的结构域III的能力和另一部分涉及病毒致病性(凋亡(apoptose))的M膜蛋白的胞外结构1-40
域(M )的两个免疫原性构建体被插入在麻疹病毒的减毒病毒株Schwarz(MVSchw)的基因组中。病毒序列依赖于钙网蛋白的信号肽以在分泌途径中定位。使用针对DV-1的HMAF小鼠多克隆血清通过间接免疫荧光在感染的Vero细胞中检测重组病毒 MVSchw的
1-40
[EDIII]DV-1和[EDIII+M ]DV-1序列的表达(图3)。通过用Western印迹分析分别用病
1-40
毒MVSchw-[EDIII]DV1和MVSchw-[EDIII+M ]DV-1感染的细胞上清观测到FGA/89株的1型(DV-1)(Holmes E.Cet al.,Mol.Biol.Evol.16(3):405-409,1999 and Desprès P.et al.,
1-40
Virology196:209-219)的EDIII抗原结构域和与登革病毒M 序列融合(具有五肽插入物(intercalant)RRDKR)的EDIII抗原结构域的分泌(图4)。同样地,示出了被诱导表达
1-40
这些蛋白质的果蝇S2/[EDIII+M ]DV-1细胞系培养物上清中的生产和分泌(图5)。
[0173] 两组4只成年小鼠CD46/IFNAR用104 TCID50的每种重组MVSchw病毒免疫(表1和2)。空病毒MVSchw用作阴性对照。在免疫的小鼠中(表1和2)我们确定了针对病毒MVSchw(MVAg)和病毒DV-1(DV-1 Ag)的抗体的产生,其中包含特异性EDIIII(Thullier,P.etal 2001.J.Gen.Virol.82:1885-1892)及中和(Anti-DV-1 FRNT75)抗体。我们观测到在间隔一个月的两次接种后,病毒MVSchw-[EDIII]DV-1不是非常有效地产生特异于DV-1或单
1-40
独的EDIII的抗体(表1)。根据相同的免疫方案,我们观测到病毒MVSchw-[EDIII+M ]DV-1诱导了显著效价的针对DV-1和单独的EDIII的抗体(表2)。免疫结束后4个月仍检测到是中和抗体的抗-DVl抗体。
[0174] 当MVSchw-[EDIII+M1-40]DV-1免疫超过6个月的小鼠用来自被诱导表达融合蛋白1-40 1-40
[EDIII+M ]DV-1的果蝇S2/[EDIII+M ]DV-1的细胞上清浓缩物的单剂量5μg总蛋白质及存在作为佐剂的Alugel下进行回忆(rappel)时,观测到高平的抗-DV-1抗体、抗-EDIII抗体和DV-1中和抗体,其翻译了在免疫动物中已经建立完全的记忆性体液免疫(réponsehumorale mémoire)(表2)。在抗原回忆之后抗-DV-1抗体还存在几个月(表2)。
[0175] 用r[EDIII+M1-40]DV-1进行抗原回忆3个月后,用MVSchw-[EDIII+M1-40]DV-1免疫的7
小鼠用10UFF的FGA/NA d1d株DV-1通过腹膜内(intrapéritonéale)接种(DV-1引起IFNAR小鼠中的无症状感染 (infection asymptomatique))。在病毒测试3周后观测到中和DV-1Hawa 株(中和效价#4000)的抗DV-1(特别是针对EDIII)抗体的高效价(titre)
1-30
(表2)。注意到用病毒MVSchw-[EDIII+M ]DV-1(这个构建体不诱导抗EDIII抗体或DV1中
7
和抗体)免疫9个月然后用10UFF的FGA/NA d1d株DV-1通过腹膜内测试的小鼠产生的抗DV-1抗体、抗EDIII抗体和中和抗体的效价分别为20000、5000和80。其与在用相同实验条件测试的BALB/c或IFNAR小鼠中观测到的结果相当。
[0176] 总之,病毒MVSchw-[EDIII+M1-40]DV-1分泌的融合序列[EDIII+M1-40]DV-1能够产生抗1-40
DV-1中和抗体并诱导长程记忆性体液应答,其一方面通过可溶性抗原r[EDIII+M ]DV-1有效刺激,另一方面应答病毒感染。相反,由病毒MVSchw-[EDIII]DV-1分泌的单独的抗原结构域+
EDIII在小鼠CD46-IFNAR中不是非常免疫原性的。我们的补充工作证明M的C末端的促凋
32-40 1-40
亡肽ApoptoM(M )决定了融合序列[EDIII+M ]DV-1的免疫原性能力,因为没有ApoptoM
1-30
的病霉MVSchw-[EDIII+M ]DV-1诱导产生等价于用病毒MVSchw-[EDIII]DV-1免疫后获得的抗DV-1抗体。
[0177] 作为针对登革病的儿科免疫常规方法学,我们提出用病毒MVSchw-[EDIII+M1-40]DV-1通过间隔一个月的两次接种对年轻个体进行免疫,然后以疫苗回忆或预防登革病毒感染1-40
险为目的用可溶性抗原r[EDIII+M ]DV-1迟后再刺激(restimuler tardivement)。这个免疫策略正处于基于与胞毒性ApoptoM序列融合的DV-1、2、3和4的4个EDIII结构域的四聚体组成的抗原而用于4种登革血清型的确认过程中。
[0178] 我们首先的实验结果强调了衍生自DV1病毒的包膜蛋白的大小减少的免疫原组合活麻疹病毒载体免疫刺激能力的重要性,一种可以诱导有效针对登革病毒的中和体液应答的策略。这显示了可以设计DV的抗原结构域的四聚体构建体的概念,其可以同时免疫并长程针对4种登革血清型。
[0179] 实施例2:优化在哺乳动物中表达的嵌合多肽构建体
[0180] 在本实施例中,发明人开发了新的用于针对黄病毒科病毒感染的抗原构建体。
[0181] 这些新的嵌合多肽基于由登革病毒的4种血清型的EDIII结构域的四聚体组成的抗原,在其间其与图30所示的apoptoM胞毒性序列之一融合。
[0182] 之后,这些优化用于在哺乳动物中表达的嵌合多肽被插入麻疹病毒的减毒病毒Schwarz株(MVSchw)的基因组中。图15至29示出了优选的5个嵌合多肽的氨基酸序列及编码其的多核苷酸序列。
[0183] 根据如下的最佳条件构建这些嵌合多肽:
[0184] 这些序列的最佳化信息
[0185] -(No Cai=0.806,平均%GC=53.46,GC分布:大约均一50%);
[0186] -消除内部″TATA box″序列,富含AT或GC部分,ARE、INS及CRS序列元件,二级RNA的重复序列、结构序列,隐蔽表位(épissagecryptic)序列;
[0187] -消除如下限制位点:NheI,BamHI,XhoI,EcoRI,KpnI,SaII,BspEI,BgIII,NotI,BssHII,BsiWI,除了第一位的BsiWI和最后一位的BssHII;
[0188] -消除基序TTTT,TTTAA,AAAGGG,AAAAGG,GGGAAA,GGGGAA及其互补序列TTCCCC,TTTCCC,CCTTTT,CCCTTT。
[0189] 表1:i.p.接种MVSchw-[EDIII]DV-1的CD46+/IFNAR小鼠中针对MVSchw病毒的抗体应答
[0190]免疫(月) MV Ag效价c DV-1 Ag效价d DV-1 rEDIII效价e 抗-DV-1FRNT75f
1a 15000 <100 <100 ND
2b 40000 100 10 <10
[0191] a.104TCIP50的MV-DV1[EDIII+M1-40]被i.p.给予4只成年小鼠
[0192] b.各个用104 TCIP50的MV-DV1[EDIII+M1-40]进行回忆注射
[0193] c.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trinity Biotech)确定[0194] d.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trinity Biotech)确定。微5
滴定平板用5×10FFU的纯化蔗糖包被,FGA/NA d1d作为病毒抗原。
[0195] e.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trintiy Biotech)确定。微滴定平板用50ng的DV1的高纯化的重组EDIII作为病毒抗原。
[0196] f.通过噬斑(plages)减少的血清中和测试(或者“空斑减少中和试验(FocusReduction Neutralization Test)”(FRNT))检测抗DV1中和抗体。收集(混合)并通过热失活的血清与DV1 Hawa 系温育,病毒滴定通过噬斑免疫检测测试在Vero细胞中进行。FRNT75,测试的血清的最大稀释度,其减少了FFU数至少75%。
[0197] 表2:i.p.接种MVSchw-[EDIII+M1-40]DV-1的CD46+/IFNAR小鼠中针对MVSchw病毒的抗体应答
[0198]h
-DV-1 FRNT75
抗 ND 10 10 40 800 100 4000
g
100
DV-1 rEDIII 效价 ≤ 400 600 100 100000 10000 800000 f
100
DV-1 Ag 效价 < 1600 1000 500 20000 2000 200000 e
MV Ag 效价 15000 40000 30000 20000 20000 10000 10000 )

a b c d
免疫 ( 1 2 3 6 7 9 10
[0199] a.104TCIP50的MV-DV1[EDIII+M1-40]被i.p.给予4只成年小鼠
[0200] b.各个用104TCIP50的MV-DV1[EDIII+M1-40]进行回忆注射
[0201] c.在存在佐剂Alugel的情况下,被免疫的小鼠回忆注射5μg的来自表达1-40
rDV1[EDIII+M ]的S2细胞的上清的总分泌蛋白质。
[0202] d.被免疫的小鼠i.p.接种107FFU的DV1系的FGA/NA d1d 3周。
[0203] e.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trinity Biotech)确定[0204] f.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trinity Biotech)确定。微5
滴定平板用5×10FFU的纯化蔗糖包被,FGA/NA d1d作为病毒抗原。
[0205] g.对收集(混合)并通过热失活的血清通过ELISA(Trinity Biotech)确定。微滴定平板用50ng的DV1的高纯化的重组EDIII作为病毒抗原。
[0206] f.通过FRNT检测抗DV1中和抗体。收集(混合)并通过热失活的血清与DV1 Hawa 系温育,病毒滴定通过应用噬斑免疫检测测试在Vero细胞中进行。FRNT75,测试的血清的最大稀释度,其减少了FFU数至少75%。
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