[0001] 本发明要求于2008年11月20日提交的序列号为61/116,447的专利申请的优先权。

[0002] 本发明涉及用于在微载体上生长、扩增和分化多能干细胞的方法。

[0003] 多能干细胞例如胚胎干细胞具有分化成所有成人细胞类型的能力。因此，胚胎干细胞对于已因疾病、感染或者先天异常而受损的器官来说可能是替代细胞和组织的来源。使胚胎干细胞体外增殖同时保持其多能性的困难限制了胚胎干细胞用作替代细胞来源的潜能。

[0004] 目前用于培养未分化胚胎干细胞的方法需要复杂的培养条件，例如，在存在饲养细胞层的情况下培养胚胎干细胞。或者，可将通过接触饲养细胞培养物而获得的培养基用来培养胚胎干细胞。采用这些方法的培养体系通常利用得自与所培养干细胞的种类不同的种类的细胞(异种细胞)。或者，这些培养体系可补充有动物血清。

[0005] 胚胎干细胞为研究和药物筛选提供了潜在来源。目前，人胚胎干细胞系的大规模培养是困难的，并且带来了严峻挑战。目前增殖多能干细胞的体外方法是在培养瓶中在用细胞外基质(ECM)蛋白或饲养细胞预涂覆的平坦表面上进行的。因为其有限的表面积不能支持多能干细胞长期生长，所以平面培养物也需要频繁继代培养。基于微载体的多能干细胞培养方法可提供一种解决方案。微载体具有高的表面积体积比，因此消除了在平坦表面上培养多能干细胞的表面积限制。

[0006] 例如，Fok等人公开了用于增殖未分化ESC的搅拌悬浮液培养体系微载体和聚集体培养(Stem Cells 2005；23：1333-1342)。

[0007] 又如，Abranches等人公开了在旋转瓶中测试 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)(一种由葡聚糖基质制成的微孔微载体，在表面上具有胶原层)支持小鼠S25ES细胞系扩增的能力(Biotechnol.Bioeng.96(2007)，第1211-1221页)。

[0008] 又如，US20070264713公开了一种用于在悬浮液中培养未分化干细胞的方法，特别是一种用于在容器中的微载体上培养干细胞的方法。

[0009] 又如，WO2006137787公开了一种筛选工具，其包括附接到固相载体(如微量滴定板)的颗粒物质或微载体(如小珠)，用于在所述微载体上培养细胞。

[0010] 又如，WO2008004990公开了一种促进培养物中干细胞的附着、存活和/或增殖的方法，该方法包括在带正电的支持表面上培养干细胞。

[0011] 又如，WO2007012144公开了一种生物反应器，其包括：支持表面；以及结合至该支持表面的合成连接多肽，其中该合成连接多肽的特征在于对胚胎干细胞或多能细胞的高度结合亲和力。

[0012] 本发明提供用于多能干细胞在微载体上生长、扩增和分化的方法。

[0013] 在一个实施例中，本发明提供了一种用于多能干细胞增殖的方法，包括如下步骤：

[0014] a.使多能干细胞的群体附着至第一体积的微载体，

[0015] b.在第一体积的微载体上培养多能干细胞，

[0016] c.将多能干细胞从第一体积的微载体移出，以及

[0017] d.使多能干细胞的群体附着至第二体积的微载体。附图说明

[0018] 图1：Rho激酶抑制剂促进人胚胎干细胞在微载体上的附着和生长。在微载体(Solohill，MI)上在静置培养物中生长2天的H9细胞的图像。在有或没有10μM Rho激酶抑制剂Y27632((Sigma-Aldrich，MO)分别为A和B)的情况下，在小鼠胚胎成纤维细胞调理培养基(MEF-CM)中培养细胞。

[0019] 图2：在微载体上生长的H9细胞。让H9细胞附着至多种微载体，并放置在37℃的摇床上。使用Plastic微载体、ProNectinF微载体、 微载体(Solohill，MI)和Plastic Plus微载体(分别为A、B、C、D)。3天后的生长显示 (Solohill，MI)上的细胞具有与微载体的最佳细胞附着。箭头标示在没有附着至微载体的情况下形成聚集体的细胞。

[0020] 图3：在微载体上的H9细胞增殖。H9细胞附着至 微载体、ProNectinF微载体、Plastic Plus微载体和Plastic微载体(Solohill，MI)，并在存在10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)和MEF-CM的情况下放置在37℃的摇床上的6孔板中。初始细胞接种密度为第0天的值。示出第3天和第5天的细胞数。

[0021] 图4：在附着至微载体后的H1细胞图像。示出了在第3天、第5天和第7天的附着至ProNectinF微载体、Plastic Plus微载体和Plastic微载体的细胞图像。将细胞在37℃的摇床上在12孔板中具有10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的MEF-CM中培养。无论是否结合至Plastic Plus和Plastic微载体，细胞均形成聚集体(G、H中的箭头)。

[0022] 图5：附着至微载体后的H1细胞图像。示出了在第3天、第5天和第7天的附着至微载体、 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)和微载体(Solohill，MI)的细胞图像。将细胞在37℃的摇床上的12孔板中具有10
μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的MEF-CM中培养。

[0023] 图6：在微载体上的H1细胞增殖。让H1细胞附着至 微载体(Solohill，MI)、 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)、 微载体(GE 
Healthcare Life Sciences，NJ)、ProNectinF微载体(Solohill，MI)、Plastic Plus微载体(Solohill，MI)和Plastic微载体(Solohill，MI)，并在存在10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)和MEF-CM的情况下放置在37℃的摇床上的12孔板中。初始细胞接种密度为第0天的值。
示出第3天、第5天和第7天的细胞数。初始接种密度为13,333个细胞/cm2，如直线所指示的。

[0024] 图7：在多种浓度的Rho激酶抑制剂下微载体上的H9细胞增殖。将细胞在摇床上的12孔板中培养，并在第4天和第7天进行计数，以确定附着情况和增殖率。A.将H9细胞在具有
1、2.5、5或10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的MEF-CM中培养。B.将H9细胞在具有0.5、1、
2.5或5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的MEF-CM中培养。

[0025] 图8：将H1细胞在递减浓度的Rho激酶抑制剂中培养。将H1p38细胞在存在递减浓度(10μM/5μM、2.5μM/0.5μM或1.0μM/0.5μM)的Y27632(Sigma-Aldrich，MO)或Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的情况下培养两天或在0.25μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)下连续培养。让细胞附着至 (Solohill，MI)、 或(GE Healthcare Life Sciences，NJ)(分别为A、B、C)。在接种后第3天、第5天和第7天对细胞进行计数。

[0026] 图9：旋转瓶中在不同接种密度下细胞与微载体附着的测定。将H1细胞以左边所列的密度(低密度(0.4×104个细胞/cm2)、中密度(1.2×104个细胞/cm2)或高密度(3×104个细胞/cm2))接种至 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)微载体上。在第3天、第5天和第7天，对细胞进行成像，并测定附着了细胞的微载体的百分比(嵌入在图像中)。

[0027] 图10：旋转瓶中微载体上的细胞生长受初始接种密度的影响。将H1细胞以左边所列的密度(低密度(0.4×104个细胞/cm2)、中密度(1.2×104个细胞/cm2)或高密度(3×104个细胞/cm2))接种至 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)微载体上。在第3天、第5天和第7天，将细胞与微载体解离，并进行计数。

[0028] 图11：旋转瓶中在不同接种密度下微载体上的细胞生长速率的测定。将H1细胞以不同的密度(第0天)(低密度(0.4×104个细胞/cm2)、中密度(1.2×104个细胞/cm2)或高密度(3×104个细胞/cm2))接种至 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)微载体上。在第3天、第5天和第7天，将细胞与微载体解离，并进行计数。示出相对于初始接种密度的细胞数的增加倍数。

[0029] 图12：在培养7天后将在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上生长的H1细胞进行成像。从第3天开始，细胞接受没有Rho激酶抑制剂的MEF-CM。细胞仍然附着至微载体。

[0030] 图13： 微载体(Solohill，MI)上的H9细胞生长和H9细胞的解离。A、B为 微载体(Solohill，MI)上生长6天的H9细胞的10x和20x图像。C为用0.05％
胰蛋白酶/EDTA与 微载体(Solohill，MI)解离10分钟的细胞的20x图像。D为用
TrypLETM Express与 微载体(Solohill，MI)解离10分钟的细胞的20x图像。

[0031] 图14：H9细胞与微载体的解离。将在摇床上的 (Solohill，MI)上生长的H9细胞用TrypLETM Express或0.05％胰蛋白酶/EDTA进行解离。A和B分别示出了细胞数及其生活力。

[0032] 图15：H1细胞与微载体的解离。将旋转瓶中 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)上生长的H1细胞用TrypLETM Express(Invitrogen，CA)、AccutaseTM或胶原酶(10mg/ml)进行解离。A和B分别示出了细胞数及其生活力。

[0033] 图16：在 (Solohill，MI)微载体上生长的H9细胞不会在微载体之间转移。

[0034] 图17：将第43代的H9在旋转瓶中的 (Solohill，MI)微载体上培养5代。每2至3天对细胞进行计数，并在细胞到达1-2×105个细胞/cm2时进行传代。

[0035] 图18：将第43代的H9细胞在旋转瓶中的 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养5代。每2至3天对细胞进行计数，并在细胞到达1-2×105个细胞/
2
cm时进行传代。

[0036] 图19：荧光激活细胞分选法(FACS)显示了在旋转瓶中生长的H9细胞的多能性。A：在 (Solohill，MI)微载体上生长的大部分H9p43细胞表达多能性蛋白质。未评
价第1代和第3代细胞的TRA-1-81。B：在 (GE Healthcare Life Scienoes，NJ)微载体上生长的大部分H9p43细胞表达多能性蛋白质。未评价第1代细胞的TRA-1-81。

[0037] 图20：将H1p49细胞在旋转瓶中的 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养5代。每2至3天对细胞进行计数，并在细胞到达4-8×104个细胞/cm2时进行传代。

[0038] 图21：将第49代的H1细胞在旋转瓶中的 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养5代。每2至3天对细胞进行计数，并在细胞到达1-2×105个细胞/cm2时进行传代。

[0039] 图22：荧光激活细胞分选法(FACS)显示了在旋转瓶中生长的H1细胞的多能性。

[0040] 图23：微载体上H1和H9细胞的群体倍增。计算从第3天至传代日(第5天、第6天或第7天)的群体倍增时间。

[0041] 图24：在成分确定的培养基中的微载体上培养的H9细胞。将细胞在(HII，(Solohill，MI))或 (C3，(GE Healthcare Life Sciences，NJ))上培养。
将细胞在下列培养基之一中的微载体上培养：mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)、StemPro或MEF-CM。将10μM Y27632(Y，(Sigma-Aldrich，MO))或2.5μM Glycyl-H 
1152二盐酸盐(H，(Tocris，MO))添加至培养基中。测定接种后第3天、第5天和第7天的生长速率。

[0042] 图25：将第38代的H1细胞在成分确定的培养基中的微载体上培养。将细胞在(HII，(Solohill，MI))或 (C3，(GE Healthcare  Life Sciences，NJ))微载体上培养。将细胞在下列培养基之一中的微载体上培养：mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)、StemPro或MEF-CM。将10μM Y27632(Y，(Sigma-Aldrich，MO))或2.5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(H，(Tocris，MO))添加至培养基中。测定接种后第3天、第5天和第7天的生长速率。

[0043] 图26：将第50代的H1细胞在旋转瓶中的具有成分确定的培养基的(Solohill，MI))微载体上培养。A：在旋转瓶中的MEF-CM中生长3、7或9天后的H1p50细胞的图像。B：在mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)中生长3、7或9天后的H1p50细胞的图像。箭头标示未附着至微载体的细胞簇。

[0044] 图27：在旋转瓶中五次传代的人胚胎干细胞的分化。A：将第43代的H9细胞在微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上传代五次。B：将第49代的H1细胞在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上传代五次。将两种细胞类
型都从微载体脱离，并接种到MATRIGEL(BD Biosciences，CA)涂覆的板上。在80-90％汇合度下，让细胞接受能使胚胎干细胞向定形内胚层分化的方案。随后通过FACS分析细胞中的表达CXCR4(一种定形内胚层标记物)的细胞的百分比。CXCR4阳性细胞的百分比位于图的右上角。

[0045] 图28：微载体上H1细胞向定形内胚层的分化。这里FACS图显示了表达定形内胚层标记物CXCR4的细胞的百分比。阳性细胞百分比位于右上角。在处理之前所有细胞均在旋转瓶中的微载体上扩增。A：在分化之前的第5次传代之后，将第40代的H1细胞在微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养6天。B：在分化之前的第1次传代之后，将第40代的H1细胞在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养8天。
C：在分化之前的第1次传代之后，将第50代的H1细胞在 微载体(Solohill，MI)上培养6天。

[0046] 图29： 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上的H1细胞向定形内胚层的分化。A：将第40代的H1细胞在微载体上培养八天。B：将第40代的H1细胞在微载体上培养11天。然后使这两种细胞群均在37℃的摇床上向定形内胚层分化。这里FACS图显示了表达定形内胚层标记物CXCR4的细胞的百分比。阳性细胞百分比位于右上角。

[0047] 图30：在微载体上培养的人胚胎干细胞系H1的细胞向定形内胚层的分化。阳性CXCR4细胞百分比的FACS结果在Y轴上示出。在分化之前和在分化期间将H1细胞在或 微载体上培养。

[0048] 图31：在微载体上培养的人胚胎干细胞系H1的细胞向胰腺内胚层细胞的分化。胰腺内胚层标记物Ngn3、Nkx6.1和Pdx1的CT值在Y轴上示出。使H1细胞在高糖DMEM(HG)或DMEM-F12(F12)培养基中的 (HII)、 (C1)或 (C3)微载体上分化。分化方案持续13天。

[0049] 图32：在微载体上培养的人胚胎干细胞系H1的细胞向产激素胰腺细胞的分化。阳性细胞百分比通过示出在Y轴上的胰腺激素细胞标记物(突触素、高血糖素和胰岛素)的FACS来确定。将H1细胞以两种不同浓度10×105(10)或20×105(20)接种至 (C-3)微载体上。在第4天至第9天期间使细胞在高糖DMEM(HG)中分化，并在第10天至第24天在HG或DMEM-12(F12)培养基中进一步分化。

[0050] 图33： 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上的H1细胞向内分泌细胞的分化。使H1细胞通过胰腺内胚层(第14天)向胰腺内分泌细胞，从胰腺内分泌细胞(第21天)向表达胰岛素的细胞(第28天)分化。测量了Pdx1、高血糖素和胰岛素的基因表达水平(分别为A、B、C)。将在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)(C3)上生长并分化的H1细胞与在涂覆有MATRIGEL(BD Biosciences，CA)的6孔板(平板)上生长并分化的那些相比较。重复三次测量 微载体(GE  Healthcare  Life 
Sciences，NJ)上生长的细胞的基因表达值。

[0051] 图34：H9细胞在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上向定形内胚层(DE)分化。CXCR4表达的FACS图。定形内胚层标记物CXCR4阳性细胞的百分比在右上角指出。A：将第39代的H9细胞在涂覆有MATRIGEL(BD Biosciences，CA)的6孔板上培养并使之向DE分化。B、C：将来自旋转器的 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上的H9细胞的双份样品置于12孔板中，并在摇床上孵育。

[0052] 图35： 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上的H9细胞向表达胰岛素的细胞的分化。H9细胞通过胰腺内胚层(第14天)向胰腺内分泌细胞分化，从内分泌细胞(第22天)向表达胰岛素的细胞(第29天)分化。测量Pdx1、高血糖素和胰岛素的基因表达水平(分别为A、B、C)。将在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)(C3)上生长并分化的H9细胞与在涂覆有MATRIGEL(BD Biosciences，CA)的6孔板(平面)上生长并分化的那些进行比较。

[0053] 图36：人胚胎干细胞中的多能性的维持，所述人胚胎干细胞在 微载体上培养了5代，之后经过转移，在所指出的平坦基质上培养，并在存在Rho激酶抑制剂的情况下培养。分图A示出流式细胞技术所检测的多能性标记物CD9、SSEA3、SSEA4、Tra-160和Tra-
181的表达。分图B示出了由实时PCR测定的多能性标记物Nanog、Pou5F1、SOX2和ZFP42以及分化标记物FOXA2、FOXD3、GATA2、GATA4和Brachyury的表达。

[0054] 图37：由在 激载体上培养5代，然后转移并在所指出的平坦基底上培养并在存在Rho激酶抑制剂的情况下培养的人胚胎干细胞形成定形内胚层。分图A示出了由流式细胞计数法所检测的CXCR4的表达。分图B示出由实时PCR测定的所指出标记物的表达。

[0055] 图38：由在 微载体上培养5代，然后转移并在PRIMARIATM平坦基底上培养的人胚胎干细胞形成定形内胚层。所指出的基因的表达由流式细胞计数法来测定。

[0056] 图39：在平坦基底上培养的人胚胎干细胞维持了多能性。收集来自TrypLETM、AccutaseTM或胶原酶传代的H1人ES细胞的mRNA样品，并分析其mRNA多能性基因表达。将细胞在MEF调理培养基中的MATRIGEL上培养生长一代4天(A)，或在补充有Rock抑制剂的MEF调理TM培养基中的Primaria 上培养一代(B)，或在补充有Rock抑制剂的MEF调理培养基中的PrimariaTM上培养两代(C)。

[0057] 图40：测试在存在Rho激酶抑制剂Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下在PRIMARIA上以1∶4、1∶8或1∶16分盘比用AccutaseTM或TrypLETM传代，在PRIMARIA(大于p45)上生长超过7代的H1人胚胎干细胞的多能性(A)以及向定形内胚层分化的能力(B)。对照物是在用胶原酶传代的1∶30MATRIGEL上生长的H1p48人胚胎干细胞。10mA＝通过暴露于AccutaseTM 10分钟进行传代。10mT＝通过暴露于TrypLETM 10分钟进行传代。1∶4、1∶8或1∶16指示传代比。P(X)指示自从MEF饲养物移至PrimariaTM塑料板以来的传代数。

[0058] 图41：测试在存在Rho激酶抑制剂GlYcyl-H 1152二盐酸盐的情况下在PRIMARIA上以1∶4比率用AccutaseTM或TrypLETM传代的PRIMARIA(大于p45)上生长超过7代的H1人胚胎干细胞的分化标记物和多能性的mRNA表达。对照物是第37代的起始细胞群体。10分钟AccutaseTM＝暴露于AccutaseTM 10分钟进行传代。P(X)指示自MEF饲养物移至PRIMARIATM塑料板以来的传代数。

[0059] 图42：测试在存在Rho激酶抑制剂Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下在PRIMARIA上TM TM TM以1∶8比率用Accutase 或TrypLE 传代的PRIMARIA (大于p45)上生长超过7代的H1人胚胎干细胞的分化标记物和多能性的mRNA表达。对照物是第37代的起始细胞群体。10分钟AccutaseTM＝暴露于AccutaseTM 10分钟进行传代。P(X)指示自MEF饲养物移至PRIMARIATM塑料板以来的传代数。

[0060] 图43：测试在存在Rho激酶抑制剂Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下在PRIMARIA上以1∶16比率用AccutaseTM或TrypLETM传代的PRIMARIATM(大于p45)上生长超过7代的H1人胚胎干细胞的分化标记物和多能性的mRNA表达。对照物是第37代的起始细胞群体。10分钟AccutaseTM＝暴露于AccutaseTM 10分钟进行传代。P(X)指示自MEF饲养物移至PRIMARIATM塑料板以来的传代数。

[0061] 图44：在PrimariaTM平坦基底(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上生长，然后在接种后3天转移到微载体的H1细胞的图像。A-C：将H1细胞接种至(GE Healthcare Life Sciences，NJ)微载体上。D-F：将细胞被接种至微载体(Solohill，MI)上。A和D：将H1细胞在PrimariaTM平坦基底(目录号为
353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)板上进行传代，在转移至微载体之前进行
10分钟的TrypLETM Express(Invitrogen，CA)处理。A和E：将H1细胞在PrimariaTM平坦基底(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)板上进行传代，在转移至微载TM
体之前进行10分钟的Accutase 处理。C和F：将第46代的H1细胞在涂覆有MATIRGEL(BD Biosciences，CA)的板上进行传代，在转移至微载体之前用胶原酶(1mg/ml)处理。

[0062] 图45：在PrimariaTM平坦基底(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上生长、然后转移至 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)和微载体的H1细胞的多能性。FACS分析示出了多能细胞表面蛋白质的表达。在
PrimariaTM(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上的传代期间，用AccutaseTM或TrypLETM Express(Invitrogen，CA)处理细胞3至10分钟。

[0063] 图46：在PrimariaTM(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)增殖，然后转移至 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)的H1细胞的分化。CXCR4(定形内胚层标记物)的细胞表面表达的FACS分析。在PrimariaTM(目录号为TM TM
353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上的传代期间，用Accutase 或TrypLE  Express(Invitrogen，CA)处理细胞3至10分钟。

[0064] 图47：在微载体上培养之前在由混合纤维素酯组成的平坦基底上培养的人胚胎干细胞的FACS分析。

[0065] 图48：在微载体上培养和分化之前来自在由混合纤维素酯组成的平坦基底上培养的人胚胎干细胞的定形内胚层谱系特征性标记物的表达的FACS分析。

[0066] 将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。

[0067] 定义

[0068] 干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。

[0069] 根据它们的发育潜能将干细胞分为：(1)全能干细胞，意指能够产生所有胚胎或胚外细胞类型；(2)多能干细胞，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)专能干细胞，意指能够产生一亚组细胞谱系，但这些细胞都位于特定的组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)能够产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板)的子代；(4)寡能干细胞，意指能够产生比专能干细胞更为有限的一亚组细胞谱系；以及(5)单能干细胞，意指能够产生单种细胞谱系(如精原干细胞)。

[0070] 分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定了细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标记物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。

[0071] 有多个术语用来描述培养中的细胞。“维持”通常指将细胞在有利于细胞生长和/或分裂的条件下置于培养基中，这有可能或可能不导致产生更大的细胞群体。“传代”指将细胞从一个培养容器移出并将它们在有利于细胞生长和/或分裂的条件下置于第二培养容器中的过程。

[0072] 细胞的特定群体或细胞系，有时由它已被传代的次数来指称或表征。例如，已被传代十次的培养细胞群体可称为P10培养物。首次培养物(即，在将细胞从组织分离后的第一次培养物)被指定为P0。在第一次继代培养后，细胞被描述为次代培养物(P1或第1代)。在第二次继代培养后，细胞变成三代培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域技术人员会理解，在传代期间可能有多次群体倍增；因此培养物的群体倍增数目大于传代数目。细胞在各次传代之间的期间中的扩增(即群体倍增数目)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基底、培养基、生长条件和各次传代之间的时间。

[0073] “β-细胞谱系”是指对于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4或Pax6。表达β细胞谱系特征性标记物的细胞包括β细胞。

[0074] 本文所用的“表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞”指表达至少一种如下标记物的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。

[0075] 本文所用的“表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞”是指表达至少一种下列标记物的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞包括胰腺内胚层细胞。

[0076] 本文所用的“表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞”指表达至少以下标记物之一的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4或PTF-1alpha。表达胰内分泌系特征性标记物的细胞包括胰内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和β细胞系的细胞。

[0077] 本文所用的“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达以下标记物：CXCR4、HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、c-Kit、CD99和Mixl1。

[0078] 本文所用的“胚外内胚层”指表达至少一种以下标记物的细胞群体：SOX-7、AFP或SPARC。

[0079] 本文所用的“标记物”是在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语境中，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注的细胞中标志核酸或多肽的可检测水平足够高或足够低，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种鉴定所关注的细胞与将其与其他细胞区分开来。

[0080] 本文所用的“中内胚层细胞”指表达以下标记物中的至少一种的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17或GATA-6。

[0081] 本文所用的“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。

[0082] 本文所用的“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。

[0083] 本文所用的“前原条细胞”指表达至少一种以下标记物的细胞：Nodal或FGF8。

[0084] 本文所用的“原条细胞”指表达至少一种以下标记物的细胞：Brachyury、Mix-like同源盒蛋白或FGF4。

[0085] 微载体

[0086] “微载体”指可用于培养物中的贴壁依赖性细胞的附着和生长的颗粒、小珠或小球。微载体具有下列特征：(a)其小得足以允许其可用于悬浮液培养(其中搅拌速率不会对微载体或细胞造成显著剪切破坏)；(b)其为实心或具有在表面上有多孔涂层的实芯；并且(c)其表面(在多孔载体的情况下，外表面和内表面)可带正电或带负电。在一个方面，微载体具有约150与350μm之间的总粒径，并具有约0.8至2.0meq/g之间的正电荷密度。可用的微载体包括但不限于 或 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)。

[0087] 在另一方面，微载体是实心载体。实心载体特别适用于粘附细胞，例如，贴壁依赖性细胞。载体颗粒还可以是多孔微载体。

[0088] “多孔微载体”指可用于培养物中贴壁依赖性细胞的附着和生长的颗粒。多孔微载体具有下列特征：(a)其小得足以允许其用于悬浮液培养(其中搅拌速率不会对微载体或细胞造成显著剪切破坏)；(b)其具有孔和内部空间，孔和内部空间的尺寸足以允许细胞迁移进颗粒的内部空间；以及(c)其表面(外表面和内表面)可带正电或带负电。在一系列实施例中，载体(a)具有约150μm至350μm之间的总体粒径；(b)具有约15μm至约40μm之间的平均孔开口直径的孔；以及(c)具有约0.8meq/g至2.0meq/g之间的正电荷密度。在一些实施例中，正电荷由DEAE(N，N，-二乙氨基乙基)基团提供。可用的多孔微载体包括但不限于和 (GE Healthcare Life Sciences，Piscataway N.J.)。微载体可以是任何形状，但通常大致是球形，并可以是大孔、微孔或实心的。

[0089] 多孔类型和实心类型的微粒载体都是可商购获得的。市售微载体的例子包括和 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)，它们二者均为得自GE Healthcare Life Sciences的葡聚糖基微载体。市场上的多孔微载体包括也得自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore产品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是市售的。在又一个方面，微载体可由聚碳酸脂或混合纤维素酯组成或涂覆有聚碳酸脂或混合纤维素酯。

[0090] 适用于本发明的微载体可由天然或合成材料组成。例子包括胶原基微载体、葡聚糖基微载体或纤维素基微载体以及玻璃、陶瓷、聚合物或金属。微载体可不含蛋白质或者涂覆蛋白，例如使用胶原涂覆。在又一个方面，微载体可由增强细胞与微载体的结合并增强细胞从微载体脱离的化合物组成或涂覆有所述化合物，所述化合物包括但不限于硬脂酸单甘油酯-琥珀酸共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物、透明质酸钠、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻璃粘连蛋白。

[0091] 用于细胞培养的微载体

[0092] 微载体培养是使贴壁依赖性细胞(例如，人胚胎干细胞)的实用高产率培养技术成为可能的技术。微载体特别为在数毫升至超过一千升范围内的培养体积的细胞(例如，人胚胎干细胞)培养而开发。微载体是生物惰性的，并为搅拌的微载体培养物提供强固但非刚性的基底。微载体可以是透明的，使得能对附着的细胞进行显微镜检测。 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)由化学连接至交联葡聚糖基质的变性胶原的薄层组成。
(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上的变性胶原层易受各种蛋白酶(包括
胰蛋白酶和胶原酶)消化的影响，从而提供在维持最大细胞生活力、功能和完整性的同时将细胞从微载体移除的能力。

[0093] 不含蛋白质的微载体可用来培养人胚胎干细胞。例如，以商品名(SoloHill Engineering，Inc.，MI.)市售的用于制造、实验室或研究用途的微载体是改性的聚苯乙烯小珠，阳离子三甲铵连接至表面以向该微载体提供带正电的表面。小珠直径在直径约90至约200微米的范围内。

[0094] 基于微载体的细胞培养方法在许多应用中具有许多优势，包括便于下游处理。微载体通常大致是球形，并可以是多孔或实心的。微载体用于细胞附着有利于将搅拌槽和相关反应器用于贴壁依赖性细胞生长。细胞附着至易于悬浮的微载体。对可悬浮性的要求限制了微载体的物理参数。因而，微载体通常具有50-2000微米范围内的平均直径。在一些应用中，实心类型微载体在约100至约250微米的范围内，而多孔类型微载体在约250至约2500微米的范围内。这些尺寸范围使得能对微载体进行选择，其应大得足以容纳许多贴壁依赖性细胞，同时小得足以形成具有适用于搅拌反应器特性的悬浮液。

[0095] 在使用微载体等中所考虑的因素中的是：附着效率、免疫原性、生物相容性、生物降解能力、达到汇合的时间、附着细胞的生长参数(包括每单位表面积的最大可达密度、在必要时的分离技术以及分离效率)、培养条件的可量测性以及放大条件下培养的均质性、成功放大分离步骤的能力以及微载体是否将用于移植。这些考虑因素会受微载体的表面特性以及微载体的孔隙率、直径、密度和操作特性影响。

[0096] 例如，微载体的密度是一项考虑因素。过大的密度会使得微载体从悬浮液沉淀出来，或易于完全朝向培养容器的底部停留，从而会引起反应器中细胞、培养基和气相整体混合不良。在另一方面，过低的密度会引起微载体的过度漂浮。1.02至1.15g/cm3的密度是许多微载体的典型密度。

[0097] 微载体的小直径以及可添加至反应器的颗粒的体积使得微载体能贡献大量的表面积，这些表面积远超过滚瓶或其他生长贴壁依赖性细胞方法中存在的(例如板上的)表面积。多孔微载体提供甚至更大的每单位体积或重量的表面积。这些多孔微载体具有适用于贴壁依赖性细胞生长的较大腔室。这些腔室极大地增加了表面积，并可保护细胞不受有害机械作用(例如，剪切应力)的影响，例如不受混合或不受气体喷射的影响。

[0098] 可使微载体表面形成纹理，以增强细胞附着和增殖。微载体表面纹理可通过以下技术实现，所述技术包括但不限于模制、浇注、浸滤和蚀刻。带纹理的表面的特征物的分辨率可以是纳米级。带纹理的表面可用来诱导微载体表面上的特定细胞定向。多孔微载体内孔的表面也可以形成纹理以增强细胞附着和增殖。孔表面纹理通过以下技术实现，所述技术例如但不限于模制、浇注、浸滤和蚀刻。

[0099] 微载体表面可被等离子体涂覆，以将荷质比赋予微载体表面。这些电荷可增强细胞附着和增殖。

[0100] 在其他实施例中，微载体由热敏性聚合物(如聚N-异丙基丙烯酰胺)组成或用其涂覆，或具有机电特性。

[0101] 多孔和实心类型的微粒物载体均为可商购获得的。市售的实心微载体的例子包括和 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)，其均为GE Healthcare Life Sciences市售的葡聚糖基微载体。市场上的多孔微载体包括也得自GE Healthcare Life Sciences的Cytoline以及Cytopore产品。Biosilon(NUNC)和Cultispher(Percell Biolytica)也是市售的。

[0102] 微载体还可包含生物活性剂。微载体还可包含可调控细胞的生长或功能或组织环境的生物活性剂，这些因子包括但不限于成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、骨形态形成性蛋白质、转化生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子。可使用完整的因子、其模拟物或活性片段。

[0103] 微载体可用第二细胞类型接种，并与多能干细胞共同培养。在一个实施例中，两种(或更多种)细胞类型可按相等或不等的比例粘附至单个微载体。两种或更多种细胞类型可在相同时间点接种到微载体上，或其可在不同时间接种。可以使得特定细胞类型优先粘附至微载体的特定区域上的方式处理微载体。在另一实施例中，可将具有粘附的单种或多种细胞类型的微载体在培养容器中与在悬浮液中培养的第二细胞类型共同培养。

[0104] 第二细胞类型可包括，例如，上皮细胞(例如，口腔粘膜细胞、胃肠道细胞、鼻腔上皮细胞、呼吸道上皮细胞、阴道上皮细胞、角膜上皮细胞)、骨髓细胞、脂肪细胞、干细胞、角质细胞、黑素细胞、表皮成纤维细胞、角质细胞、血管内皮细胞(例如，主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞、髂动脉内皮细胞、微脉管内皮细胞、脐动脉内皮细胞、脐静脉内皮细胞)和内皮祖细胞(例如，CD34+、CD34+/CD117+细胞))、成肌细胞、肌细胞、肝细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、基质细胞和其他软组织细胞或祖细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、神经细胞(包括但不限于，神经元、星形细胞、施万细胞、肠神经胶质细胞、少突细胞)。

[0105] 多能干细胞

[0106] 多能干细胞的表征

[0107] 多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标记物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector  Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(Vector Laboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这可通过RT-PCR检测。

[0108] 增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。可以通过如下方式来确定干细胞的多能性：例如，将细胞注射入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检测，找出来自三个胚层的细胞类型的证据。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚状体是否存在与三个胚层相关的标志物。

[0109] 增殖的多能干细胞系可用标准G显带技术进行核型分析并与公开的相应灵长类物种的核型相比较。理想的是获得具有“正常核型”的细胞，“正常核型”的细胞意指该细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。

[0110] 多能干细胞的来源

[0111] 可以使用的多能干细胞类型包括已建立多能细胞系。非限制性的例子是已确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。还可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多潜能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG0lv(BresaGen，Athens，GA)。另外合适的是衍生自非多能细胞例如成人体细胞的多能干细胞。

[0112] 将多能干细胞附着至适用于本发明的微载体

[0113] 在附着至微载体之前可通过现有技术的任何方法在平坦基底上培养多能干细胞。例如，可在用细胞外基质蛋白(如，MATRIGEL)处理过的平坦基底上培养多能干细胞。或者，可在接种有饲养细胞层的平坦基质上培养多能干细胞。

[0114] 在一个实施例中，多能干细胞是胚胎干细胞。在替代实施例中，胚胎干细胞是人类的。

[0115] 在本发明的一个方面，通过将多能干细胞用将使细胞从平坦基底脱离的蛋白酶处理而使多能干细胞从平坦基底脱离。蛋白酶可以是例如胶原酶、TrypLETM Express、AccutaseTM、胰蛋白酶等。

[0116] 在一个实施例中，通过将细胞用AccutaseTM处理约五分钟至约十分钟而使多能干细胞从微载体基底脱离。

[0117] 在一个实施例中，通过将细胞用0.05％Trypsin/EDTA处理约十分钟至约二十分钟而使多能干细胞从微载体基底脱离。

[0118] 在一个实施例中，通过将细胞用TrypLETM Express处理约五分钟至约二十分钟而使多能干细胞从微载体基底脱离。

[0119] 在一个实施例中，通过将细胞用10mg/ml胶原酶处理约五分钟至约十分钟而使多能干细胞从微载体基底脱离。

[0120] 将脱离的多能细胞以特定密度添加至含有微载体的培养基。在一个实施例中，以2
每cm的微载体约4,000至约30,000个细胞接种多能干细胞。

[0121] 将脱离的多能细胞添加至含有微载体的培养基。在一个实施例中，通过用Rho激酶抑制剂处理多能干细胞来增强多能干细胞的附着。Rho激酶抑制剂可以是Y27632(Sigma-Aldrich，MO)。或者，Rho激酶抑制剂是Glycyl-H 1152二盐酸盐。

[0122] 在一个实施例中，将多能干细胞用约1μM至约10μM浓度的Y27632进行处理。在一个实施例中，将多能干细胞用约10μM浓度的Y27632进行处理。

[0123] 在一个实施例中，将多能干细胞用约0.25μM至约5μM浓度的Glycyl-H 1152二盐酸盐进行处理。在一个实施例中，将多能干细胞用约2.5μM浓度的Glycyl-H 1152二盐酸盐进行处理。

[0124] 可搅拌含有微载体的培养基。如本发明所用的搅拌可以是培养基的运动。这种搅拌可手动或通过利用设备(例如，摇床、旋转瓶等)来实现。在一个实施例中，含有微载体的培养基通过利用手动运动来进行搅拌。装有微载体和细胞的培养皿来回运动不超过30秒。

[0125] 可搅拌含有微载体的培养基。在一个实施例中，通过利用旋转瓶来搅拌含有微载体的培养基。根据小珠类型，将旋转瓶(Corning，Lowell，MA)放置在30-70RPM的摇床上。

[0126] 在替代实施例中，通过使用摇床(Vari-mix，Barnstead，Dubuque，Iowa)来搅拌含有微载体的培养基。摇床速度约为2秒每转。

[0127] 在微载体上分化多能干细胞

[0128] 在一个实施例中，多能干细胞可在微载体上分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。或者，多能干细胞可在微载体上分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。或者，多能干细胞可在微载体上分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0129] 在一个替代实施例中，多能干细胞可在微载体上增殖，然后在平坦表面上分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。或者，多能干细胞可在微载体上增殖，然后在平坦表面上分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。或者，多能干细胞可在微载体上增殖，然后在平坦表面上分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0130] 可通过本领域任何合适的方法，使按照本发明方法处理的多能干细胞分化成多种别的细胞类型。例如，可使按照本发明方法处理的多能干细胞分化成神经细胞、心脏细胞、肝细胞等。

[0131] 例如，可按照WO2007030870中公开的方法，使按照本发明方法处理的多能干细胞分化成神经祖细胞和心肌细胞。

[0132] 在另一个实例中，可按照美国专利6,458,589中公开的方法，使按照本发明方法处理的多能干细胞分化成肝细胞。

[0133] 表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成

[0134] 可通过本领域的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0135] 例如，可以根据D’Amour等人在Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0136] 例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0137] 例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0138] 例如，可根据D’Amour等人在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0139] 定形内胚层谱系特征性标记物选自SOX17、GATA4、HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞是定形内胚层细胞。

[0140] 又如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使通过本发明方法处理的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开。

[0141] 又如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在不存在血清的情况下培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使根据本发明方处理的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2005中公开。

[0142] 又如，通过含有激活素A和Wnt配体培养基中在不存在血清的情况下培养多能干细胞，然后去除Wnt配体并用含有血清的激活素A培养，可使根据本发明的方法处理的多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。

[0143] 又如，可根据转让给LifeScan，Inc的序列号为No.11/736,908的美国专利申请中公开的方法，将根据本发明的方法处理的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0144] 又如，可根据转让给LifeScan，Inc的序列号为No.11/779,311的美国专利申请中公开的方法，将根据本发明的方法处理的多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0145] 表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞的形成

[0146] 可通过本领域的任何方法使多能干细胞分化为表达胰内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0147] 例如，可根据D’Amour等人在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，将多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0148] 例如，还通过下述方法，将根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞：用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，然后除去含有成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，随后将细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养。该方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。

[0149] 例如，根据转让给LifeScan，Inc.的序列号为No.11/736,908的美国专利申请中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞一段时间，来使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。

[0150] 例如，通过用视黄酸(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4(exendin 4)处理表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞，然后去除含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基，随后在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中培养细胞，可使根据本发明的方法得到的表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。

[0151] 例如，可通过将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞在含有毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，Nature Biotechnology，2006中公开。

[0152] 例如，通过在含有DAPT(Sigma-Aldrich，MO)和毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。

[0153] 例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明方法获得的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。

[0154] 例如，根据转让给LifeScan，Inc.的序列号为No.11/736,908的美国专利申请中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0155] 例如，根据转让给LifeScan，Inc.的序列号为11/779,311的美国专利申请中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0156] 例如，根据转让给LifeScan，Inc.的序列号为11/736,908的美国专利申请中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0157] 例如，根据转让给LifeScan，Inc.的序列号为No.11/779,311的美国专利申请中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞，将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。

[0158] 胰腺内分泌谱系特征性标记物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、NGN3和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞是胰腺内分泌细胞。胰内分泌细胞可为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。

[0159] 在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标记物的细胞。表达β细胞谱系特征性标记物的细胞表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF-3β、MAFA、PAX4或PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标记物的细胞是β细胞。

[0160] 本发明进一步通过如下实例举例说明，但不受限于如下实例。

[0161] 实例

[0162] 实例1：人胚胎干细胞在微载体上的附着和增殖

[0163] 为了确定人胚胎干细胞是否可以在微载体上附着和增殖，用TrypLETM Express使第52代的H9细胞从涂覆有MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)的板上脱离。随后用微载体和MEF-CM对其进行孵育。根据制造商的说明来制备ProNectinF(PN)、Plastic(P)、PlasticPlus(PP)、 (H)、胶原(Col)和FACT III(SoloHill，MI)微载体的悬浮液。在37℃下2天后，基于每日图像表1描述了H9细胞在微载体上的附着和生长。很少细胞在所测试的大多数微载体上附着和/或增殖。H9细胞的确在 微载体(Solohill，
MI)上附着和增殖，但图像显示在静置培养2天后有更少的细胞-珠聚集体(图1B)。

[0164] 为了改善人胚胎干细胞在微载体上的附着和增殖，将一种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶的小分子抑制剂(Rho激酶抑制剂)添加至培养基。具体地讲，使用了Y27632，Y，(Sigma-Aldrich，MO)。每日更换MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)。在存在10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的情况下，H9细胞与所有测试的微载体附着并与之形成聚集体(表2)。通过对图像的分析，在 微载体(Solohill，MI)上生长的
人胚胎干细胞看起来比所测试的其他微载体上的人胚胎干细胞更好地附着和增殖。另外，在存在Rho激酶抑制剂的情况下，H9细胞更好地附着至 (Solohill，MI)(图1A
与图1B相比较)。

[0165] 用于细胞治疗应用的人胚胎干细胞的扩增必需符合产品需求。目前用于扩增的最佳技术包括旋转瓶和生物反应器。这些技术均需要微载体在悬浮液中的物理运动。为了确定运动对人胚胎干细胞在微载体上的生长的影响，将6孔或12孔培养皿放置在37℃培养箱中的摇床上。在生长3天后，细胞聚集体开始从一些微载体脱离。图2A、B、D示出了从Plastic PlusPlastic或Pronectin微载体解离的细胞聚集体。相比之下，细胞仍附着至微载体(Solohill，MI)并增殖(图2C)。实例4描述了在使用Viacount Flex
(Guava Technologies，Hayward，CA)在Guava PCA-96中进行细胞计数之前使用的解离方法。测量细胞在微载体上的生长速率揭示，与接种时的初始数量相比第3天细胞数下降。这很可能是因为细胞与微载体的初始附着不良，接着在此后进行扩增直至实验在第5天结束。
与其他小珠类型相比， 微载体(Solohill，MI)上的H9细胞具有最高的增殖速
率，这很可能是因为细胞更好附着至 微载体(Solohill，MI)(图2、图3)。这证明 微载体(Solohill，MI)可以支持H9细胞在悬浮液中的生长。这在重复传代
之后得到进一步证实，参见实例5。

[0166] 并且测试H1人胚胎细胞系在微载体上生长进行大规模扩增的情况。因为Rho激酶抑制剂Y27632(Sigma-Aldrich，MO)对H9细胞系的附着是必要的，所以也认为对H1细胞是必要的。根据制造商的说明来制备 激载体、 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)、 微载体、Plastic微载体、ProNectinF微载体、Plastic Plus微载体(SoloHill Ann Arbor，MI)。将第47代的H1人胚胎干细胞以约13,333个细胞/cm2微载体接种在MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)中。在37℃下将细胞和微载体以每12孔15cm2置于摇床上的12孔非组织培养物处理过的培养皿中，以允许微载体和培养基进行运动。在3天、5天和7天后，对一个孔进行成像、收获并计数。细胞附着的能力取决于小珠类型。与H9系一样，对H1系获得相似的结果。具体地讲，接种至Plastic微载体、Plastic Plus微载体或ProNectinF微载体上的细胞不能良好地附着和/或增殖(图4)。接种至微载体(Solohill，MI)、 微载体或 微载体(GE 
Healthcare Life Sciences，NJ)上的细胞良好地附着和增殖(图5)。根据实例4分离细胞，并计算其产率。在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上生长的细胞
在培养7天后显示具有最高的细胞数(图6)。

[0167] 实例2：Y27632和用于细胞附着和生长的其他Rho激酶抑制剂的最佳浓度[0168] 为了确定最好地支持人胚胎干细胞在微载体上附着和生长的Rho激酶抑制剂的浓度，进行了下列试验。

[0169] 将13,333个细胞/cm2第44代H9细胞的起始等分试样接种至12孔非组织培养物处理板中的单个孔中的15cm2微载体上。在将细胞在37℃下置于摇床上之前，将其在37℃下放置至少60分钟。在添加细胞之前，如制造商所述制备 微载体(Solohill，MI)和微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)。将细胞在MEF-CM加一系列Rho激酶抑制剂浓度中培养，所述Rho激酶抑制剂为10、5、2.5或1μM的Y27632，或为5、2.5、1或
0.5μM的(S)-(+)-4-甘氨酰-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-IH-1，4-二氮杂卓二盐酸盐(甘氨酰-H 1152二盐酸盐(H)，Tocris，MO)。每天更换培养基，在接种后4天和
7天计算一孔细胞的产率和生活力(图7，A和B)。总的说来，10或5μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)显示出最佳的细胞增殖(第7天)，而2.5和1.0μM看起来具有最佳的附着(第4天)。1和0.5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的浓度显示出最佳的细胞增殖(第7天)，而5μM看起来具有最佳的附着(第4天)。

[0170] 接着尝试了Rho激酶抑制剂的剂量滴定，因为其已表征为促进细胞凋亡。用TrypLETM Express将第48代的H1细胞与涂覆有MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)的板解离。将细胞随后接种至15cm2微载体上，放入12孔非组织培养物处理板的单个孔。用递减量的Rho激酶抑制剂处理 微载体(Solohill，MI)、 微载体或
微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)：在第一天使用10μM Y27632
(Sigma-Aldrich，MO)，接着在第二天使用0.5μM(Y10/5μM)；在第一天使用2.5μM Glycyl-H 
1152]二盐酸盐(Tocris，MO)，接着在第二天使用0.5μM(H2.5/0.5μM)；在第一天使用1μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)，接着在第二天使用0.5μM(HI/0.5μM)；或每天在MEF-CM中应用0.25μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的连续添加(H0.25μM)。将H1细胞和微载体在37℃下每45分钟搅拌一次，持续3小时，然后置于37℃的摇床上。在37℃的摇床上3天、5天和7天之后对细胞进行计数(图8)。总体上，Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的最佳浓度为第一天1-2.5μM，第2天0.5μM，然后停止使用化合物。对于所测试的所有微载体，与10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)相比，在这些浓度的Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)下细胞显示出相似的生长速率。将细胞维持在0.25μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)中导致细胞产率较差。使用最小量的Rho激酶抑制剂还有助于降低工艺成本，并可能对细胞增殖有益。这些数据还显示，人胚胎干细胞不需要Rho激酶抑制剂来保持附着至微载体并增殖。

[0171] 实例3：细胞密度对微载体上附着和生长的影响

[0172] 改善接种密度是一种减少所需总细胞数的方法。为了确定合适的接种密度，对每44 2 4
倍物镜视场的微载体数进行计数。将H1细胞以0.4×10个细胞/cm(低密度)、1.2×10 个细胞/cm2(中密度)或3×104个细胞/cm2(高密度)接种进具有Cytodex  3微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)的10cm板中，保持在MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)中。随后在37℃下将板每45分钟搅拌一次，持续6小时。将细胞和微载体在37℃下转移至转速为30rpm的旋转瓶(如实例5所述)，保持在50ml MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)中。在24小时后，添加25ml的具有5μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的MEF-CM。在24小时后，将旋转速度增加到40rpm。在培养的第3天和第5天，移出75ml中的
50ml，并用MEF-CM进行替换。在6小时、3天、5天和7天从旋转烧瓶获取等分试样的图像。具有附着细胞的微载体的百分比在图9图像中的右下角指出。在接种后3天，覆有细胞的微载体的数量与初始接种密度相对应，但在第5天和第7天，对于较低密度接种的细胞而言，覆有细胞的微载体的数量不增加。这表明0.4×104个细胞/cm2是不足以让微载体整合进聚集体的细胞数。以3×104个细胞/cm2，在第5天和第7天，具有附着细胞的微载体的数量与以1.2×
104个细胞/cm2接种的类似(图9)。当查看细胞数量时，显然对于高密度细胞接种而言，更多细胞附着至微载体(图10)。分析较于起始接种细胞数量的倍数变化揭示在高密度接种培养物中第3天和5天时附着的细胞数量较高(图11)。到第7天，对照物和高密度接种的培养物具有类似的与其起始接种密度相比的细胞数量倍数变化。从这些数据可以推断1.2×104个细胞/cm2是H1细胞在微载体上有效附着和生长的最低细胞数量。换为较高接种密度会有助于减少细胞扩增所需的天数。

[0173] 实例4：细胞从微载体的解离

[0174] 为了确定生长速率，需要将细胞从微载体解离。移除Rho激酶抑制剂Y27632(Sigma-Aldrich，MO)不会导致H1细胞从微载体解离(实例2，图12)。在将 微载体上的H9细胞从微载体解离之前，将细胞在10x和20x放大倍数下成像(分别为图13A、B)。酶处理 微载体(Solohill，MI)上的H9细胞使得活细胞能分离(图13C、D和图14)。将H9细胞在37℃的摇床上在具有 微载体(Solohill，MI)的6孔板中培养6天。
将附着至微载体的细胞置于15ml锥形管中，并在让微载体沉降之后，抽吸培养基。用4ml PBS(没有镁和钙离子)洗涤沉降的微载体三次，从而让微载体因重力沉淀而沉降。抽吸出PBS，添加1ml的PBS。将具有细胞的微载体转移进12孔非组织培养物处理板中的单孔中。让板以一定角度静置，以允许微载体沉降。抽吸出PBS，并将1ml  TrypLETM  Express(Invitrogen，CA)或0.05％胰蛋白酶/EDTA添加至孔中。将板在37℃的摇床上放置10或20分钟。移除板，并将3ml DMEM/F12或MEF-CM添加至孔。用滴管用力地吸取培养基，使细胞脱离(图13C、D)。在显微镜下观察微载体来确定细胞从微载体的分离情况。然后以200×g将细胞离心5分钟。抽吸出培养基，并将沉淀物再悬浮于1ml DMEM/F12或MEF-CM培养基中。然后使用Viacoun染料在Guava PCA-96(Guava Technologies，Hayward，CA)上对细胞进行计数。具体地讲，将200μl体积在培养基适当稀释液的细胞与2μl的Viacount孵育10分钟。测定生活力和细胞数量(图14)。TrypLETM Express和胰蛋白酶/EDTA两者均可使细胞从微载体有效地解离。

[0175] 因为TrypLETM Express使细胞从微载体脱离，并可作为GMP产品获得，所以将其与其他可能的解离试剂(具体地讲是胶原酶和AccutaseTM(Sigma-Aldrich，MO))进行对比测试。将H1p48细胞在旋转瓶中培养(实例5)10天。随后收集微载体，并将其转移至50ml锥形管。如上在PBS中洗涤细胞，并将其转移至12孔板。抽吸出PBS，并将1ml的TrypLETM Express、AccutaseTM或胶原酶(10mg/ml)添加至孔，并在37℃的摇床上放置5或10分钟。将细胞/微载体用力地再悬浮于DMEM/F12中，然后使解离的细胞和微载体通过50ml锥形管上方的40μm细胞过滤网。用额外的2ml培养基洗涤孔，同样添加至过滤网，然后以200×g离心5分钟。将细胞随后再悬浮于1ml DMEM/F12中并稀释以对细胞进行计数，如上所述。细胞生活力与所有测试的酶相似。AccutaseTM和TrypLETM Express在5和10分钟孵育内释放相似的细胞数量(图15)。这说明AccutaseTM和TrypLETM Express适合作为用于微载体上的人胚胎干细胞的细胞解离试剂。

[0176] 实例5：未分化的多能干细胞在微载体上的增殖

[0177] 为了扩增微载体上的细胞，细胞必须能够与微载体分离或通过酶解离并且再附着至新的微载体。细胞在微载体上增殖的典型方法依靠细胞分离和再附着的特性。以下实验显示其不是人胚胎干细胞的特征。具体地讲，将H9p43细胞接种至 微载体(Solohill，MI)上，并在125ml的旋转瓶中孵育(见下文)。存在于培养基中酚红被微载体(Solohill，MI)吸收。在生长8天后，将微载体上的细胞的10ml等分试
样置于装有无酚红的MEF-CM、440mg的 微载体和5μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的新旋转瓶中。在以30rpm的转速旋转在37℃下孵育5天之后，移出微载体，并获取图像(图16)。所示的深色微载体是覆盖有在含有酚红的培养基中生长的H9细胞的微载体。浅色微载体是新近添加的微载体。期望的是H9细胞将分离并再附着至新的微载体，然而相反，细胞与新的微载体形成聚集体。浅色微载体没有附着细胞，细胞也不在具有深色微载体的聚集体中，这表明细胞不能够分离并再附着至微载体。为了增殖微载体上生长的细胞，必须通过酶处理将细胞从微载体解离(见实例4)。

[0178] 因为现在确定了人胚胎干细胞可如何在微载体上增殖，所以需要确定人胚胎干细胞如何在较大规模的旋转瓶中增殖。旋转瓶使得细胞能在高密度体系中扩增。这是节省空间的，并被认为是在生物反应器中扩增细胞的第一步。为了测试人胚胎干细胞在旋转瓶中增殖的能力，将第43代H9细胞接种进125ml旋转瓶中。使细胞初始附着至10cm板中的微载体，然后转移至旋转瓶。具体得讲，通过用TrypLETM Express在37℃下孵育五分钟，使H9细胞从两个六孔培养皿分离。在用TrypLETM Express进行传代之前，细胞已用胶原酶(1mg/ml)进行传代，并接种至涂覆有1∶30低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)的板上。将细胞再悬浮于DMEM/F12中，并使用Viacount在Guava仪器上进行计数。在离心之后，将3×106个2
细胞接种进装有MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)和250cm根据制造商说明制备的 微载体(Solohill，MI)的10cm板。将板置于37℃下，并每45分钟轻轻旋转并搅拌一次，持续4.5小时。然后，将细胞、微载体和培养基转移至125ml旋转瓶。随后用MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)将旋转瓶填充至50ml，并置于40rpm下37℃的搅拌器上。第二天，更换培养基，并用MEF-CM加5μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)将其填充至75ml。
将搅拌速率增至70rpm。在没有添加Y27632化合物(Sigma-Aldrich，MO)的情况下每隔一天
6
更换培养基。根据实例4所公开的方法对细胞进行传代，并将3×10 个细胞重新接种至
250cm2的新微载体上。当培养物到达1-2×105个细胞/cm2的汇合度时，对培养物进行传代。
将其进行5代(图17)。在每代中，评价多能标记物表达，显示80-95％的细胞表达多能性标记物CD9、SSEA4、SSEA3、TRA-1-60和TRA-1-81(图19A)。对 微载体((GE 
Healthcare Life Sciences，NJ)，图18、19B)上的H9p43细胞进行类似的实验。总的来说，细胞在 微载体(Solohill，MI)和 微载体(GE Healthcare Life 
Sciences，NJ)上均良好地增殖并保持多能性。在5代之后在旋转瓶中进行染色体核型分析，在1.5％的细胞中显示出12号染色体中的异常三体性。因为这些细胞在实验结束时接近第
50代，所以观察到这类异常可能经常发生。以较低细胞传代数开始可能使这种假设得到检验。

[0179] 对p48和p49的H1细胞系进行相似的实验。除了旋转速度和接种密度以外，所有参数保持相同。第1天旋转瓶的旋转速度为30rpm过夜，并在所有其他天数增加至40rpm。对于微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)接种密度约为11,000个细胞/cm2，而对于 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)接种密度约为7,000
个细胞/cm2。接种的细胞数在每旋转瓶中保持恒定在3×106个细胞。对于 和
微载体的重量保持恒定在100mg。 和 比于
微载体的一个优点在于其较大的表面积。图20和21分别显示H1细胞在
和 上扩增。细胞在五代期间维持多能性(图22)。对
微载体上的H1细胞的染色体核型分析揭示，10％的测试细胞中Y染色体加倍。在p48时，将这些H1细胞传代至微载体上，并在后面5代进行分析。在MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)平坦表面上生长的H1p55细胞具有正常的染色体核型。对在第3天和传代日(第5天、第6天或第7天)之间这些细胞倍增速率的分析显示，在倍增时间方面没有总体变化(图23)。在微载体上生长的H1细胞和在 微载体(Solohill，MI)上生长的H9
显示出最一致的倍增时间(表3)。

[0180] 实例6：人胚胎干细胞在成分确定的培养基中的微载体上的增殖

[0181] 为了制造治疗性产品，希望将任何动物组分从人胚胎干细胞培养基移除。目前人胚胎干细胞维持在使用小鼠胚胎成纤维细胞调理过的培养基(MEF-CM)中的MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)上。MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)和MEF-CM二者均衍生自小鼠细胞。另外，MEF-CM是生产昂贵且耗时的培养基。为了确定人胚胎干细胞是否可使用成分确定的培养基维持在微载体上，在Stem Pro(Invitrogen，CA)、mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)或MEF-CM中在存在Rho激酶抑制剂、10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)或2.5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的情况下，将H9细胞接种至 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)和 微载体(Solohill，MI)上。将细胞置于37℃摇床上的12孔培养皿中。在第3天、第5天和第7天对细胞进行计数。在MEF-CM中两种小珠类型上生长的H9p39细胞显示出典型的扩增特征(图24)。在存在10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的情况下，mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)中生长的相似细胞在 微载体上良好地增殖，但在 微载体上显示出生
长速率缓慢。已适应StemPro培养基超过20代的第64代人胚胎干细胞系H9的细胞(H9p64)在存在10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的情况下在 和 二者上均
良好地增殖。出乎意外的是，这些细胞在存在2.5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的情况下不能在 微载体上良好地增殖。因此，微载体类型、Rho激酶抑制剂和培养基均在确定人胚胎干细胞增殖能力方面起作用。

[0182] 在12孔培养皿中将第38代H1人胚胎干细胞在mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)或MEF-CM中在存在Rho激酶抑制剂、10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)或2.5μM Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下接种至 微载体或 微载体上。将细胞置于37℃摇床上。在第3天、第5天和第7天对细胞进行计数。在MEF-CM中两种微载体类型上生长的细胞在存在Y27632(Sigma-Aldrich，MO)的情况下显示出典型的扩增特征，但在 上有Glycyl-H 1152二盐酸盐(Tocris，MO)的情况下显示出不良的
生长(图25)。mTESR培养基(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)使得H1细胞能在存在两种Rho激酶抑制剂的情况下在 微载体上增殖，但在 微载体
上显示出缓慢的生长速率。

[0183] 鉴于H1p50细胞在mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)中微载体上良好地增殖，将3×106个细胞接种至250cm2 微载体上。将细胞在10cm2培养皿中在37℃下孵育5小时，每45分钟用手进行搅动。每隔一天更换mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)。这与在MEF-CM中培养的细胞(实例5)平行地进行。不像MEF-CM中培养的细胞，7天之后mTESR培养基(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)中培养的细胞开始从 微载
体脱离(图26A与26B相比)。这表明，需要添加另外的补充物至mTESR(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)，以便人胚胎干细胞能在 微载体
(Solohill，MI)上保持附着并增殖。

[0184] 实例7：人胚胎干细胞在微载体上的分化

[0185] 因为人胚胎干细胞可在微载体上扩增，所以必须确定这些细胞的分化潜能。将第43代的人胚胎干细胞系H9的细胞在 微载体(GE Healthcare Life Sciences，
NJ)上传代五次。在第5次传代时，将细胞在微载体上培养6天，然后用TrypLETM Express将细胞从微载体解离(见实例4)。随后将细胞接种至涂覆有1∶30MATRIGELTM：DMEM/F12的板上。在细胞在板上变为80至90％汇合时，使其暴露于分化试剂。通过在RPMI加100ng/ml激活素A(PeproTech，NJ)、20ng/ml Wnt3a(R&D Biosciences，MN)和8ng/ml bFGF(PeproTech，NJ)中用2％无脂肪酸的牛白蛋白第V组分(FAF BSA，MP Biomedicals，Ohio)处理细胞2天，使人胚胎干细胞分化成定形内胚层。在RPMI加100ng/ml激活素A(PeproTech，NJ)和8ng/ml bFGF(PeproTech，NJ)中，将细胞在2％FAF BSA中额外处理2天。每天更换培养基。针对定形内胚层细胞表面标记物CXCR4进行FACS分析，显示87％的细胞表达蛋白(图27A)。对在微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上生长5代的第49代人胚胎干细
胞系H1的细胞进行类似的实验，揭示91％在微载体上分化的细胞表达CXCR4(图27B)。这证明，在微载体上生长的细胞能够分化为定形内胚层，这是变为产胰岛素细胞的第一步。

[0186] 三种类型的微载体 (GE  Healthcare  Life Sciences，NJ)和 (Solohill，MI)允许H1细胞的附着和生长。在这三种微载体
上进行H1细胞的分化。将细胞在旋转瓶中的这些微载体上培养(实例5)不同的传代数(1至5代)。在最近一次传代后六至八天，将悬浮液中的微载体加细胞等分试样转移至6或12孔板。
2 2
转移了每12孔板总共15cm的微载体加细胞或每6孔板30cm微载体加细胞。然后将分化培养基添加至板孔，并将板置于37℃的摇床上。通过在RPMI加100ng/ml激活素A(PeproTech，NJ)、20ng/ml Wnt3a(R&D Biosciences，MN)和8ng/ml bFGF(PeproTech，NJ)中用2％无脂肪酸的牛白蛋白第V组分(MP Biomedicals，Ohio)处理细胞2天，使人胚胎干细胞分化成定形内胚层。在RPMI加100ng/ml激活素A(PeproTech，NJ)和8ng/ml bFGF(PeproTech，NJ)中，将细胞在2％FAF BSA中额外处理2天。每天更换培养基。针对定形内胚层细胞表面标记物CXCR4进行FACS分析(图28)。在 和 微载体上生长的细胞支持分化
为定形内胚层(分别为87％和92％)，而 微载体不会以与该实验中测试的其他
微载体的相同程度支持分化(42％)。

[0187] 为了确定细胞密度是否影响微载体上细胞的分化，将第40代人胚胎干细胞系H1的细胞在旋转瓶中的 微载体上培养8天或11天。然后将约15cm2的微载体加细胞的等同物置于6孔培养皿中，并放在摇床上。随后如上所述将细胞在定形内胚层分化培养基中孵育。在4天后，通过FACS分析细胞的CXCR4表达。87％在旋转瓶中生长6天的细胞表达CXCR4，而56％在旋转瓶中生长11天的细胞表达CXCR4(图29)。这证明，分化之前细胞培养的天数是重要的，特别是如果细胞密度太高，则可能不能使细胞有效地分化。

[0188] 为了确定人胚胎干细胞是否可在被确定足以满足附着和生长的全部三种微载体类型上分化为胰腺内胚层细胞，将第41代人胚胎干细胞系H1的细胞(H1p41)接种至微载体、 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)和微载体(Solohill，MI)上(见实例1)。根据制造商说明制备微载体。将30cm2的
微载体转移至低附着6孔板。根据制造商的说明用TrypLETM Express将H1细胞从两个10cm2板分离。以每孔5×105个细胞接种细胞。根据实例3所述的方法进行细胞与小珠的附着。简而言之，将细胞和微载体在37℃下在具有10μM Y27632的MEF调理培养基中孵育四小时，每小时简单搅拌一次。将 载体和 微载体上的细胞置于摇床上。让
微载体上的细胞不受干扰地静置过夜。每天更换培养基，并不再包含Y27632。

[0189] 由于在此实验中附着不良， 板中的大部分细胞不再附着至微载体。然而，较长的附着时间和/或较慢的摇动速度可改善细胞附着。在7天之后，在RPMI中用2％无脂肪酸(FAF)BSA(Proliant，IA)和下列生长因子使细胞分化为定形内胚层：bFGF(8ng/ml，(PeproTech，NJ))、激活素A(100ng/ml，(PeproTech，NJ))、Wnt3a(20ng/ml，(R&D Biosciences，MN))。对于分化的第二天至第四天，将细胞用缺少Wnt3a的相同培养基进行处理。在4天后双份样品的FACS分析揭示CXCR4阳性细胞水平为77-83％。不同微载体上生长的细胞之间，定形内胚层表达是相等的。参见图30。

[0190] 随后在DMEM/F12或DMEM-HG加2％FAF BSA(Proliant，IA)中用FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))使细胞进一步分化2天。在此之后，在具有1％B-27补充物(Invitrogen，CA)的DMEM/F12或DMEM-HG中用成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、视黄酸(2μM，(Sigma-Aldrich，MO))和KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))处理四天。随后在具有1％B-27补充物(第13天，胰腺内胚层，(Invitrogen，CA))的DMEM/F12或DMEM-HG中用成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、DAPT(1μM，(Sigma-Aldrich，MO))、Alk5抑制剂II(1μM，(Axxora，CA))使细胞分化三天。图31示出了通过Q-PCR测定的胰腺特异性基因NKX6.1、PDx1和NGN3的表达水平。CT值清楚显示， 微载体上分化的细胞不能有效地分化以表达必要的β细胞前体细胞标记物。尽管细胞在全部三种微载体类型上有效地分化为定形内胚层，但在 微载体上未有效地进一步分化为胰腺先祖细胞。

[0191] 为了确定人胚胎干细胞是否可以进一步分化为产胰岛素细胞，将H1p45细胞在微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)上培养，并类似于上述使之分化。简而言之，根据制造商的说明用TrypLETM Express使H1细胞从10cm2板解离。以每6孔板孔1或2×106个细胞接种细胞。实例3中描述了细胞与小珠的附着。简而言之，将细胞和微载体在37℃下在具有10μM Y27632的MEF调理培养基中孵育四小时，每小时简单搅拌一次。随后让细胞不受干扰地孵育过夜。在第2天，用MEF调理培养基加5uM Y27632更换培养基，并将板置于摇床上。培养基每隔一天改变成没有Y27632。在第五天，用定形内胚层分化培养基更换培养基，所述定形内胚层分化培养基为RPMI中的2％无脂肪酸(FAF)BSA(Proliant，IA)，其具有以下生长因子：bFGF(8ng/ml，(PeproTech，NJ))、激活素A(100ng/ml，(PeproTech，NJ))、Wnt3a(20ng/ml，(R&D Biosciences，MN))。对于分化的第二天和第三天，用缺少Wnt3a的相同培养基处理细胞。在3天之后双份样本的FACS分析揭示CXCR4阳性细胞的水平为97-
98％。随后用DMEM-高糖(HG)加2％FAF BSA(Proliant，IA)中的FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))使细胞进一步分化2天。在此之后，用具有1％B-27补充物(Invitrogen，CA)的DMEM-HG中的成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、视黄酸(2μM，(Sigma-Aldrich，MO))和KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))处理四天。随后用具有1％B-27补充物(Invitrogen，CA)的DMEM-F 12或DMEM-HG中的成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、DAPT(1μM，(Sigma-Aldrich，MO))、Alk5抑制剂II(1μM，(Axxora，CA))使细胞分化三天。在此之后在具有Alk5抑制剂II(1μM，(Axxora，CA))的DMEM-HG或DMEM-F12中分化七天。
最终分化是分别在DMEM-HG或DMEM-F12中进行五天。这就是总共24天的分化，从而导致胰腺内分泌激素表达。图32示出了在此终点细胞的FACS分析结果。具有最高接种密度并在第6天至第24天在DMEM-HG中分化的细胞具有最高水平的胰岛素表达(图32)。

[0192] 作为另一种选择，为了确定人胚胎干细胞是否可以分化为产胰岛素细胞，将H1p44在旋转瓶中在 微载体上培养7天(参见实例5)。将细胞加微载体以15cm2/孔转移至12孔板，并放在37℃的摇床上。如上所述使细胞分化为定形内胚层，但用DMEM/F12代替RMPI。4天之后的FACS分析揭示在一式三份的分析中CXCR4阳性细胞水平为75至77％。随后用DMEM/F12加无脂肪酸的2％牛白蛋白第V组分中的FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))处理细胞3天而使细胞进一步分化。在此之后，用具有1％B-27补充物(Invitrogen，CA)的DMEM/F12中的成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、FGF7(50ng/ml，(R&D Systems，MN))、视黄酸(2μM，(Sigma-Aldrich，MO))和KAAD-环巴胺(0.25μM，(Calbiochem，NJ))处理四天。随后在具有1％B-27补充物(第
15天，胰腺内胚层，(Invitrogen，CA))的DMEM/F12中的成头蛋白(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、Netrin4(100ng/ml，(R&D Biosciences，MN))、DAPT(1μM，(Sigma-Aldrich，MO))、Alk5抑制剂II(1μM，(Axxora，CA))使细胞分化三天。在此之后，用具有1％B-
27补充物(第21天，胰腺内分泌细胞，(Invitrogen，CA))的DMEM/F12中的Alk5抑制剂II(1μM，(Axxora，CA))处理六天。最终的七天处理是具有1％B-27补充物(第28天，胰岛素表达细胞，(Invitrogen，CA))的DMEM/F12。图33示出了通过Q-PCR测定的胰腺特异性基因胰岛素、Pdx1和胰高血糖素的表达水平。将微载体上的数据与此前的在涂覆有MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)的平坦表面上分化的H1p42细胞的数据进行比较。微载体分化细胞的这些胰腺特异性基因的表达水平类似于或优于平坦表面上分化的细胞。

[0193] 用传代至 微载体上并在旋转瓶中扩增的H9p38细胞进行类似的实验。将15cm2的微载体加细胞的等分试样置于12孔板中，并放在具有分化培养基的摇床上。将此与在涂覆有MATRIGELTM(BD Biosciences，CA)的6孔板上接种的细胞相比较。在RPMI和补充物中实现了细胞向定形内胚层的分化，与在平坦基底上72％的细胞表达CXCR4相比，平均
83％的细胞表达CXCR4(双份样品)(图34)。进一步向胰腺内胚层分化(第15天)、向胰腺内分泌细胞分化(第22天)和向胰岛素表达细胞分化(第29天)显示对于微载体上生长的细胞与平坦基底上生长的细胞，具有胰岛素和胰高血糖素的相似表达水平(图35)。培养基组分与上述H1分化实验所列出的那些相同，其中额外处于内分泌细胞分化组分中一天。在胰岛素表达阶段，与第22天相比细胞显示出胰岛素表达的惊人降低。因为在微载体和平坦样品二者中均注意到这种降低，所以其可能不是由于附着基底造成的。这显示，H9细胞还可在微载体上成功地向至少胰腺内分泌细胞分化。

[0194] 总的来说，两种不同人胚胎干细胞系H1和H9可以在 微载体上向胰腺内分泌细胞分化，从而说明了在大规模培养体系中扩增并分化这些细胞的潜能(图17、21、
33和35)。人胚胎干细胞能够附着至至少三种微载体小珠类型并增殖，细胞可向至少定形内胚层分化(图28)。这些结果说明了一种方法，通过该方法，可使人胚胎干细胞扩增和分化以用于治疗用途。

[0195] 实例8：可将在基于3D微载体的培养物中作为单细胞传代的人胚胎干细胞转移至无ECM表面上的培养物而同时维持多能性。

[0196] 根据实例5中所述的方法将H1人胚胎干细胞在微载体上培养。将细胞从微载体移出并接种至具有MEFCM16的Nunc4、Nunc13、CELLBINDTM或PRIMARIATM组织培养聚苯乙烯(TCPS)平坦表面，所述MEFCM16补充有3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐。将细胞以100,000个细胞/cm2的密度接种在六孔板中，然后在各个表面上培养另外一代。随后用TrypLE剥离细胞并通过流式细胞计数来测试细胞的多能性标记物，或用RLT在孔中溶解细胞以用于mRNA纯化和qRT-PCR，或使之向定形内胚层分化。通过用补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、20ng/ml Wnt3a、8ng/ml bFGF和3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐的RPMI培养基处理细胞24小时，来诱导分化。然后将培养基改变为补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、8ng/ml bFGF和3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐的RPMI培养基，持续额外的48小时，每天更换培养基。

[0197] 如使用流式细胞计数法或qRT-PCR通过多能性标记物所测量的，在微载体上培养并转移至Nunc4、Nunc13、CellBIND或Primaria组织培养聚苯乙烯(TCPS)平坦表面上的培养物的细胞在两代后在各个平坦表面上维持了多能性(图36)。此外，细胞维持了向定形内胚层分化的能力(图37)，这可由流式细胞计数法或qRT-PCR测量。在 微载体上传代并向定形内胚层分化的H1和H9人胚胎干细胞的平行测试中也获得类似结果(图38)。

[0198] 这些结果表明，可将人胚胎干细胞在微载体上传代，然后接着在另一表面上培养而同时能维持多能性。还可将细胞转移至另一表面，并有效地诱导分化。

[0199] 实例9：可将人胚胎干细胞从有丝分裂失活的成纤维细胞饲养层上的细胞簇/集落样培养物直接转移，以在无ECM表面上作为单细胞培养至少10代，而没有多能性损失并且无需手动移除成纤维细胞饲养层。

[0200] 人胚胎干细胞系目前使用可促进来自胚泡的单细胞或数个细胞的细胞簇的集落生成物的方法来衍生。然后将该集落生成物连续地传代并增殖，直至获得足够其构成细胞系的细胞簇/细胞集落。一旦已衍生出细胞系，为了维持人胚胎干细胞的多能性和染色体核型稳定特性，本领域中关于人胚胎干细胞的高质量、可重现培养的现行标准是将人胚胎干细胞的细胞簇/集落维持在有丝分裂失活的成纤维细胞的饲养层上，以及使用人工破坏或通过胶原酶或中性蛋白酶或其共混物的温和酶大量传代来传代细胞。这些传代方法可维持人胚胎干细胞簇并促进人胚胎干细胞的集落样式生长。在建立了稳定的人胚胎干细胞系之TM后，可使细胞转换至细胞外基质(ECM)基底，例如MATRIGEL 。然而，不论将细胞在成纤维细胞饲养层上培养还是在ECM基底上培养，人胚胎干细胞的推荐传代方法明确地指示技术人员不能完全分离人胚胎干细胞集落。

[0201] 目前哺乳动物细胞大规模培养的最佳方法是使用严格维持内环境稳定、一致的条件并可掺入微载体来支持贴壁依赖性细胞的3维培养容器。然而，用于人胚胎干细胞培养物(在成纤维细胞饲养层或ECM基底上培养)和细胞簇/集落样式培养物的现行标准方法具有在微载体上成功培养并维持多能性人胚胎干细胞培养的技术障碍，这是因为这些方法不易转移到微载体上的大规模培养。为了在微载体上有效地培养人胚胎干细胞，人胚胎干细胞培养必须能够作为单细胞传代，而不作为集落或细胞簇传代，这是本领域的现行标准。此外，人胚胎干细胞应当能够在没有饲养细胞层或ECM基底的情况下培养。

[0202] 在下面描述了一种解决这些技术障碍的方法。证明了如何将人胚胎干细胞簇从有丝分裂失活的成纤维细胞饲养层上的细胞簇/集落直接转化为不需要下面的成纤维细胞饲养层或涂布有MATRIGEL或其他细胞外基质基底的表面的单细胞培养体系。这种方法利用人胚胎干细胞的大量传代而无需任何人工移除成纤维细胞饲养层或从总细胞群体选择多能细胞，以在存在Rho激酶(ROCK)抑制剂、Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下将培养物直接从基于集落样式的成纤维细胞饲养层的培养物转化为PRIMARIA上无饲养物/基质的培养物。这种方法可在密封容器中完成，以符合调节需要，并产生保持多能性和向定形内胚层分化的能力的高度均质的人胚胎干细胞培养，并不含有成纤维细胞群体。

[0203] 方法：通过抽吸出培养基、用PBS洗涤、然后用分离酶(胶原酶、AccutaseTM或TrypLE)处理细胞以常规方式将细胞进行传代。以1mg/ml浓度使用胶原酶；以1X母液浓度使用AccutaseTM或TrypLE。在达到室温之后，使用所有的酶。将2％BSA在DMEM/F12中的溶液添加至各孔，并在用酶处理细胞之后将细胞均匀地悬浮于溶液中。随后将细胞以200g离心5分钟，将细胞沉淀物和额外的DMEM/F12溶液中的2％BSA加入以再悬浮细胞，并将细胞悬浮液分配至三个50ml无菌锥形管，并以200g离心5分钟。

[0204] 使用顺序法，将细胞簇/集落样式人胚胎干细胞通过用AccutaseTM、TrypLETM或胶原酶处理基于MEF的培养物而高密度传代至Primaria表面来移除成纤维细胞层。在第一次传代时，将细胞接种至涂覆有MATRIGELTM在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)调理培养基(CM)中的1∶30稀释液的T-25瓶，或将细胞接种至T-25PRIMARIATM培养瓶的MEF-CM加3μM Glycyl-H 
1152二盐酸盐中。将所有细胞以1至3.5的分盘比接种，并使细胞暴露于酶10分钟。通过用血球计对台盼蓝染色细胞进行计数来确定用TrypLETM或AccutaseTM剥离的细胞的细胞数量。
在接种细胞后，每天更换培养基，并给接种在MEF-CM+3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐中的细胞每天用MEF-CM+1μM Glycyl-H 1152二盐酸盐饲养，并分析样本的多能性和分化的mRNA标记物的表达。在不含Matrix条件下作为单细胞传代两次的hESC维持了多能基因的表达，并抑制了分化基因的表达(图39)。

[0205] 第2次传代：利用10分钟暴露于TrypLETM或AccutaseTM，将细胞以1至4的比例传代。还引入了通过处理细胞并监测分离而根据经验确定的较短酶接触时间。观察到3分钟接触TrypLETM和5分钟接触AccutaseTM足以剥离细胞。在用酶处理细胞之后，如上将细胞进行传代，并在传代时获取等分试样的细胞mRNA用于qRT-PCR。

[0206] 第3次传代：一旦达到汇合则将细胞用PBS洗涤，用酶破坏3或10分钟(TrypLETM)或TM者5或10分钟(Accutase )，再悬浮于DMEM/F12中的2％BSA中并离心，用DMEM/F12中的2％BSA再次洗涤、离心，然后再悬浮并接种在其各自的培养基中。在这次传代中，以1∶4比例并还以2种额外的分盘比(1∶8和1∶16)接种细胞。在每次传代时获取等分试样的细胞mRNA用于qRT-PCR。

[0207] 4次传代+：从第4代开始维持第2代和第3代时暴露于酶的时间以及传代比所采用的条件。每当培养物生长到汇合点时，将细胞用PBS洗涤，用酶破坏指定时间，悬浮于DMEM/F12中的2％BSA中并离心，用DMEM/F12中2％BSA再次洗涤、离心，然后以指定接种比再悬浮于其各自的培养基中。在接种时用3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐补充接种到PRIMARIA的细胞的培养基。在接种之后，每天更换培养，接种在MEF-CM+3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐中的细胞每天用MEF-CM+1μGlycyl-H 1152二盐酸盐饲养。在传代时获取等分试样的细胞mRNA用于qRT-PCR。

[0208] 在完成超过8代之后，通过流式细胞计数来分析细胞的多能性表面标记物(图40)，并通过qRT-PCR分析细胞的多能性和分化标记物(图41、42和43)。通过用补充有2％BSA、100ng/ml激活素A、20ng/ml Wnt3a、8ng/ml bFGF和3uM Glycyl-H 1152二盐酸盐的RPMI培养基处理细胞24小时，使细胞也分化为定形内胚层。然后将培养基改变为补充有2％BSA、
100ng/ml激活素A、8ng/ml bFGF和3μM Glycyl-H 1152二盐酸盐的RPMI培养基，持续额外的
48小时，每天更换培养基。随后通过流式细胞计数法来测试向定形内胚层分化的样品的定形内胚层标记物CXCR4的存在(图40)。

[0209] 这些结果表明，在存在Rho激酶(ROCK)抑制剂、Glycyl-H 1152二盐酸盐的情况下从基于集落样式成纤维细胞饲养层的培养基传代至PRIMARIA上不含饲养物/基质培养基的大量传代产生保持多能性和向定形内胚层分化的能力且不包含成纤维细胞群体的高度均质的人胚胎干细胞培养物。

[0210] 实例10：人胚胎干细胞从组织培养塑料板转移至微载体

[0211] 将H1细胞在PRIMARIATM(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)组织培养板(实例9中的方法)上培养，通过用TrypLETM Express处理3-5分钟而脱离，并接种进在MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)中具有 (GE Healthcare Life Sciences，NJ)或 (Solohill，MI)微载体的6孔非组织培养物处理板中。作为对照物，以类似的方式将在涂覆有MATRIGEL(BD Biosciences，CA)的板上培养并用胶原酶(1mg/ml)传代的H1p46细胞脱离并接种至微载体上。将板在37℃下孵育5小时，每45分钟用手搅拌一次。随后将板放在37℃的摇床上。每天用MEF-CM加10μM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)更换培养基。图像显示第3天时细胞良好附着至微载体(图44)。在7天后，使细胞脱离(在下文实例4中所述)，并通过FACS分析多能性标记物CD9、SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-
60、TRA-1-81(图45)。在90-100％的细胞上表达大部分的多能性标记物。用AccutaseTM(Millipore，MA)和TrypLETM Express(Invitrogen，CA)传代的细胞之间或者在微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)和 微载体
(Solohill，MI)上的生长之间没有明显的差异。总的来说，当从PRIMARIATM(目录号为
353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)细胞培养塑料板转移至微载体上时，细胞保持了多能性。

[0212] 其次，微载体上的这些H1细胞向定形内胚层分化。该方法在实例7中进行了描述。在分化4天之后，使H1细胞从微载体脱离并进行FACS分析，显示超过82％的细胞表达CXCR4。
参见图46。无论PRIMARIATM(目录号为353846，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上的微载体类型或传代酶如何，细胞可有效地分化为定形内胚层。这证明了扩增体系的灵活性并允许细胞能在塑料板和微载体上在没有基质的情况下生长。

[0213] 实例11：人胚胎干细胞从由混合纤维素酯组成的平坦基底转移至微载体[0214] 根据美国专利申请No.61/116,452所公开的方法，将H1细胞在由混合纤维素酯组成的平坦基底上培养12代。将细胞通过用TrypLETM Express处理3-5分钟而从平坦基底脱离，并接种进在MEF-CM加10mM Y27632(Sigma-Aldrich，MO)中具有 微载体(GE Healthcare Life Sciences，NJ)或 微载体(Solohill，MI)的6孔非组织
培养物处理板中。作为对照物，以类似的方式使在涂覆有MATRIGELTM的板(BD Biosciences，CA)上生长并用胶原酶(1mg/ml)传代的H1p44细胞脱离并接种至微载体上。将板在37℃下孵育5小时，每45分钟用手搅拌一次。随后将板放在37℃的摇床上。每日更换培养基。在7天后，将细胞脱离(在实例4中所述)，并通过FACS分析多能性标记物CD9、SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-
60、TRA-1-81(图47)。在超过90％的细胞上表达大部分的多能性标记物。在
微载体和 微载体上生长的细胞之间没有明显的差异。在
微载体上培养之后未测试H1p44对照细胞的多能性，因为多能性已通过其他
实验证实(参见实例5)。总的来说，当从由混合纤维素酯组成的平坦基底转移至微载体上时，细胞维持了多能性。

[0215] 其次，根据实例7所述的方法，使微载体上的H1细胞向定形内胚层分化。在分化4天之后，使H1细胞从微载体脱离并进行FACS分析，显示超过65％的细胞表达CXCR4(图48)。无论微载体类型如何，细胞均有效地分化为定形内胚层。看起来似乎在(Solohill，MI)微载体上较少数量的细胞分化为定形内胚层。细胞分化的能力证明了扩增系统的灵活性。另外，细胞可以直接在膜和微载体上生长和分化，不需要任何动物组分基质。

[0216] 表1：在静置培养物中H9细胞附著至MEF-CM中的微载体小珠。

[0217]

[0218] 表2：在具有10μM Rho激酶抑制剂Y27632的MEF-CM中H1和H9细胞附着至微载体小珠

[0219]

[0220] 表3：在 或 上生长5代的H1和H9细胞的群体倍增

[0221]细胞系-微载体 群体倍增 标准偏差
H9-HII 27小时 4.1
H9-C3 32.4小时 12.8
H1-C1 20.3小时 3.7
H1-C3 25小时 12.8

[0222] 将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由根据专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。