[0001] 本发明涉及通过施加电磁场体外处理细胞的领域。现有技术

[0002] 如已知的，各种频率的电磁场在远程通信的领域中广泛地使用，但是除了这个主要的用途之外，上文提到的射频最近也已经被证明能够干涉细胞体内平衡的过程。

[0003] 特 别 地，C.Ventura 等 人，在 Turning on stem cell cardiogenesis with extremely low frequency magnetic fields（FASEB J.19（1）：155-157（2005）中已经表明，被暴露于极低频率电磁场（50Hz，0.8mTrms）的小鼠胚胎干（ES）细胞通过升高干细胞衍生的心肌细胞的生产很大地增加心原性的基因和心脏特异性的基因的转录。

[0004] 小鼠和人类成年体的非干细胞（adult somatic non-stem cell）例如成纤维细胞向诱导性多潜能（pluripotent）干细胞（iPS，“诱导性多潜能干细胞”）的重编程以及这些重编程的细胞向特化的成熟细胞的后续的分化已经打开了向再生医学的领域中的新的前景的道路（Takahashi,K.；Tanabe,K.；Ohnuki,M.；Narita,M.；Ichisaka,T.；Tomoda,K.；Yamanaka,S.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell131（5）：861-872；2007）。更近地，已经表明小鼠成纤维细胞可以被直接地重编程为心肌表型，而不首先经过iPS阶段（Ieda,M.；Fu,J.D.；
Delgado-Olguin,P.；Vedantham,V.；Hayashi,Y.；Bruneau,B.G.；Srivastava,D.Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes bydefined factors.Cell142（3）：375-386；2010）。经过中间的iPS阶段和经过直接的表型转化的这样的重编程实验，始终通过借助于经由病毒载体转移特定基因组合的方法进行。

[0005] 这些途径因此被方法的复杂性以及，最重要地，被与病毒载体的使用相关联的潜在的风险阻碍。此外，对于使用中间的iPS的重编程和直接的重编程二者来说，所获得的分化产生率是极端地低的，通常低于1%。这种低分化产生率还与保留在准胚胎的未分化的阶段的已重编程的细胞群体的高的致瘤风险相关联。

[0006] 将明显地感兴趣的是，能够在不必须向细胞施加化学的或遗传的刺激的情况下通过加强细胞的全能性或实际上通过把已分化的细胞带至它们的全能的条件处理细胞，从而尽可能少地干扰细胞结构，这将使，除了别的以外，与干细胞的使用相关联的所有伦理的/法律的问题能够被克服。

[0007] 发明概述

[0008] 描述了用于通过以低功率射频施加电磁场处理已分化的或未分化的细胞的方法。

[0009] 附图简述

[0010] 图1图解地图示了在根据本发明的方法中使用的设备。

[0011] 图2图示了使用以低功率射频的电磁场的刺激对将干细胞导向心原性的、骨胳肌原性的和神经原性的发育线（developmental line）的基因的表达的影响。

[0012] 图3图示了使用以低功率射频的电磁场的刺激如何降低未分化的干细胞的标志物基因的表达。

[0013] 图4图示了将细胞暴露于以低功率射频的电磁场如何调节组织特异性的和干细胞相关的蛋白质的表达。

[0014] 图5示出了在根据本发明的处理的不存在或存在下获得的自发地搏动的集落的增加。

[0015] 发明详述

[0016] 本发明借助于使用低功率射频电磁场的作用的细胞分化的方法使对上文提到的需求的响应成为可能。

[0017] 特别地，作为欧洲专利EP1301241的主题的装置可以被用于发生根据本发明的磁场。

[0018] 简要地，所述装置在附图1中被图解地代表，包括连接于合适的电源11的射频电磁场发生器10、至少一个与所述发生器10相关联并且适应于辐射散射电磁场13的天线12、与所述发生器10相关联并且适应于调制其发射的调制器14、以及至少一个与所述发生器10相关联（可能地通过调制器14）并且适应于导向被上文提到的电磁场13诱导的射频电流的对流器电极15。

[0019] 本发明通过在所述细胞材料周围使用作为欧洲专利EP1301241的主题的装置或相似的装置，把所述对流器电极15在所述干细胞或已分化的细胞的紧邻处施用，如在附图1中图解地示出的，提供待被处理的细胞材料的照射。

[0020] 此外，根据本发明“低功率射频电磁场”用于意指以例如少于100mW，优选地少于50mW，更优选地少于10mW的在低实体发射器（low-entity emitter）测量的辐射功率为特征的射频电磁场。特别地，注意，根据本发明，在中性的生长介质中经受如上文描述的射频电磁场的作用的干细胞能够增加它们的总的多潜能性并且，当被在合适的介质上培养时，不仅仅发育成为任何组织类型的细胞（肌肉、骨骼、神经、腺体等等）。本方面是特别地明显的，如果被上文描述的磁场产生的心原性的影响被考虑的话。实际上，磁场的作用能够不仅诱导具有自发的收缩性的活动的心肌细胞的出现，而且诱导所述心肌细胞的团聚以形成真正的心肌组织，其中总体的收缩性的活动被以螺旋形的过程组织，从节奏设置触发焦点（pace-setting trigger focus）开始。

[0021] 还注意，通过把根据本发明的方法应用于在合适的培养基中的已分化的细胞例如成纤维细胞，如此被处理的细胞逆转以表现为相似于全能性的干细胞。

[0022] 在下文我们报告其中根据上文描述的方法并且使用上文描述的装置处理的干细胞完全地发育成为分别的神经、骨骼肌和心肌细胞并且其中多能（multipotent）成年人类干细胞被导致为多潜能的实施例。

[0023] 根据本发明的成纤维细胞和卵母细胞疗法的实施例也被报告。

[0024] 实施例1

[0025] 在专利EP1301241中描述的装置已经被放置在CO2孵化器中，被以使得发射以约等于2.4GHz的频率的电磁辐射的方式调节，并且对流器电极被浸没在R1小鼠ES细胞已经在其中存在的培养基中。

[0026] 2.4GHz频率源和培养基之间的距离是约35cm。供应的电磁辐射的量使用Tektronix2754p频谱分析仪通过把其天线取向为接收信号的大部分被测量。

[0027] 把200ms的用于每个分别的射频发射的持续时间和2.5s的断开间隔考虑在内，以下的结果被获得：发射的功率P是约2mW，电场E等于0.4V/m，磁场M是约1mA/m，并且比吸3
收率或SAR是约0.128μW/g。已经确定σ=1A/Vm并且ρ=1000Kg/m，培养基内的电磁流密
2
度在被上文描述的装置照射期间等于J=30μA/cm。虽然在装置周围测量到的电磁场由于孵化器的金属壁的存在是高度地不规则的，但是测量孵化器内的最大强度是可能的。等于
2
400W/m 的辐射的功率值在距发射器约35cm的距离并且在计量器的接收天线周围的非常有限的区域内被测量到。

[0028] 通过把R1ES细胞在已经在以100U/ml LIF的终浓度的含有15%FBS的Knockout DMEM的存在下被有丝分裂地灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的层上培养，将它们保持在未分化的状态中。

[0029] 另外，细胞分化根据通常的方法被进行，通过把细胞放置在含有没有LIF的培养基的板上（Costar超低吸附簇（Costar ultra low attachment clusters）），在两天的培养之后把所得到的胚状体（Eb）放置在组织培养板上。

[0030] 基因表达

[0031] 根据制造商（Invitrogen）的指南使用三唑试剂分离总RNA。把总RNA溶解在没有RNA酶的水中，并且，为了进行RT-PCR，根据制造商（Invitrogen）的指导，使用1μl总RNA和MuMLV反转录酶（RT）以50μl合成cDNA。

[0032] 实时定量PCR使用iCycler热循环仪（Bio-Rad）进行。使用Platinum Supermix UDG（Invitrogen）、200nM的每个引物、10nM的荧光素（bio-rad）和Sybr Green，将2μl cDNA扩增为50μl。在94℃的持续10分钟的初始的变性阶段之后，开始热循环。每个循环由在94℃的15秒、在55-59℃的30秒、在60℃的30秒组成，并且荧光在本阶段结束时被读出。在所描述的实施例中，所有的所使用的引物为Invitrogen类型，但是使用不同的引物实现类似的结果。

[0033] 为了实时地评价PCT样品的品质，熔化曲线的分析在每个样品之后进行。

[0034] 使用利用GAPDH的“δ-CT”方法确定分别的表达，如在Maioli M.等人“Hyaluronam esters drive Smad gene expression and signalling enhancing cardiogenesis in mouse embryonic and human mesenchymal stem cells PloS One5（11）：e15151（2010）中报道的。

[0035] 免疫印迹分析

[0036] 把ES细胞收获并且在PBS中成小团，然后把小团使用缓冲液溶解以用于从细胞的提取（Invitrogen）。根据制造商的指导，对细胞溶解产物进行在在MOPS SDS缓冲液中的10%Novex三甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen，CA）上的电泳，使用XCell Sure Mini-Cell。

[0037] 在蛋白质向在聚偏氟乙烯（PVDF）（Invitrogen，CA）中的膜上的转移、膜的饱和化和洗涤之后，在环境温度在1:1000稀释的一抗（抗GATA4抗血清、Myo、β-3-微管蛋白、sox2和NANOG）的存在下进行免疫反应1小时。在进一步的洗涤之后，使用与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的二抗（abCAM）抗兔（Sox2和NANOG）或抗小鼠（GAT4、MyoD、β-3-微管蛋白）培养膜。使用用于化学发光的探测系统测量被标记的蛋白质的表达（使用ECL蛋白质印迹，试剂来自Amersham Biosciences）。

[0038] 免疫染色

[0039] 把施加或不施加射频电磁场被培养3日的R1细胞使用胰蛋白酶处理，并且把所得到的悬浮液在低密度培养以使分别的细胞的可视化成为可能。把培养物使用4%多聚甲醛固定。把细胞在37℃暴露于小鼠抗α-肌节辅肌动蛋白单克隆抗体（anti-actinic,α-sarcomeric monoclonal antibody）、β-3-微管蛋白、MyoD或肌细胞生成素或肌球蛋白重链的兔多克隆抗体的重链持续1h，并且在37℃使用与荧光素缀合的山羊IgG染色1h。

[0040] 使用Leica共聚焦显微镜（LEICA TCSSP5）进行显微镜下的验证，并且使用碘化丙啶（1μg/ml）把DNA可视化。

[0041] 分析数据

[0042] 使用Student’s t检验进行数据的统计分析，取p<0.05的值作为显著性的极限。

[0043] 实时的R-PCR表明在向射频电磁场的24小时暴露之后的强啡肽原基因的表达的显著的增加，其是在2日之后仍然明显的效应（见图2A）（星号指代已处理的细胞的被测量的值）。

[0044] 出乎意料地，在超过48h的延长的电磁刺激的情况下，效应延伸超过下一个7日（见图2A）并且与使用持续10日的连续的暴露获得的效应相容（在图中未示出）。电磁刺激对强啡肽原转录的影响是非常被关注的，考虑到该基因以及其相关产物（强啡肽B）控制细胞溶质的Ca2+的体内平衡以及成年心肌细胞中的收缩性、以及通过自分泌回路和“胞内分泌”信号转导被阿片受体的激活诱导ES细胞中的心原性的基因的转录的能力。

[0045] 通过强调基因强啡肽原在心脏发生中的重要作用，被电磁地刺激的ES细胞显示出GATA4和Nkx-2.5的表达的显著的增加（图2B、C）。这些分别地编码锌指dominium（zinc finger dominium）和homeodominium的基因是对于在各种动物物种包括人类中的心脏发生来说基本的。

[0046] 在刺激之后myoD和神经原素1（neurogenin1）的转录也以相似的方式在时间和持久性二方面被增加（见图2D、E）。

[0047] 也已知的是，为了调节增殖和分化，ES细胞必须能够紧密地控制多种因子包括Sox2、NANOG和Oct4的转录。

[0048] Sox2能够与Oct3/4协同地作用以激活Oct-Sox刺激物，Oct-Sox刺激物调节多潜能干细胞的特定基因例如NANOG、Oct3/4和Sox2自身的表达。

[0049] 小鼠胚胎中的Oct4基因的活性的抑制妨碍内细胞团（ICM）的增殖并且促进向滋养外胚层的分化。在被表达后，NANOG阻滞分化。

[0050] NANOG的负调节因此是在ES细胞的发育期间维持分化必需的。

[0051] 在LIF的去除之后，ES细胞分化的早期阶段，暗示Sox2的表达的次级调节（sub-regulation）（见图3）。

[0052] 虽然以不同的时间，但是相似的效果在向电磁波的暴露之后在基因Oct4和NANOG的表达时被遇到（见图3B、C）。

[0053] 为了评价观察到的转录响应是否指示分化的增加，验证磁场对组织特异性的蛋白质标志物的表达的影响。

[0054] 蛋白质印迹分析已经揭示了，GATA4、β-3-微管蛋白和myoD，分别是心脏、神经元和骨骼肌分化的指示物，在被电磁刺激处理的细胞中显著地过表达，如与未被刺激的细胞比较的（图4A-C）。对于转录效果来说，所述增加在处理之后的2日仍然是明显的，并且持续下一个7日，甚至在刺激不存在时（图4A-C）。

[0055] 在被暴露于射频电磁场的细胞中，Sox2和NANOG的表达反映在使用射频电磁场的刺激之后的增加的转录响应在被暴露的细胞中被显著地次级调节，如与未被暴露的细胞比较的（图4D、E）。

[0056] 心脏表型的形成通过观察到以下被进一步推断：在LIF的去除之后，在根据本发明的处理的不存在（白色圆形）或存在（黑色圆形）下，使用射频电磁场的刺激导致（见图5）自发衍生自聚集的细胞例如EB的自发地搏动的集落的数量的大量增加，持续48小时。

[0057] 所有的所收集的数据因此证明，在ES细胞向射频电磁场的暴露之后，分化发生。

[0058] 与在文献中使用的电磁场不同地，使用根据本发明的射频电磁场的处理，在本发明中描述的形态中，允许分化多潜能性的一致的增加，其在给出的实施例中涉及发育的三个线：心脏发生、神经发生和骨骼肌肌发生，而没有化学的或生物的激动剂或遗传工程的介入；明显地，分化可以通过根据已知的技术作用涉及细胞发育的其他的线，只要根据本发明的方法被应用。

[0059] 此外，如上文已经提到的，通过在相同的条件下但是使用已分化的细胞例如成纤维细胞代替干细胞重复上文例证的实施例中描述的实验，观察到的效果是被处理的细胞被重编程，逆转以表现相似于全能性的干细胞。

[0060] 实施例2

[0061] 多能人类成年间质干细胞（具有小于胚胎干细胞的分化度潜力的分化度潜力，考虑到多潜能性或全能性的定义），被从脂肪组织以及从其他的源例如骨髓、牙髓和足月的胎盘的胎膜分离，当被暴露于根据本发明所描述的磁场持续72h并且然后在不存在进一步的暴露时被培养持续4或7日（相应于从开始时间0的7或10日）时，表现相似于准胚胎的多潜能的细胞，因为它们以与被暴露于本发明的磁场的小鼠胚胎细胞平等的关系，获取在心肌细胞、神经细胞和骨骼肌细胞中分化的能力。这些结果指示如声明的在本发明中进行的处理能够把人类干细胞从多能性的状态转化至极端地更“灵活的”多潜能性的状态，因此将使用成年人类干细胞的细胞疗法和再生医学的假设的前景最大化。

[0062] 实施例3

[0063] 把人类成纤维细胞暴露于磁场72h，并且然后在暴露不存在时培养另外的4或7日（相应于从开始时间0的7或10日）。每个分别的射频发射的持续时间是200ms，具有2.5s的断开间隔。在这些实验条件下，表达神经元分化的标志物β-3-微管蛋白的百分比是高于16%，并且表达骨骼肌分化的标志物myoD的细胞的百分比是多于20%，并且表达终末心肌分化的标志物α肌节辅肌动蛋白的细胞的百分比是实际上超过30%。

[0064] 根据本发明的方法向在培养物中的人类皮肤成纤维细胞的应用能够：

[0065] （i）在转录水平诱导与心原性的取向相关联的组织特异性的基因例如Mef2c、Tbx5、GATA4、Nkx2.5和强啡肽原的激活，

[0066] （ii）在转录水平诱导骨骼肌发生中的关键基因MyoD的表达，

[0067] （iii）在转录水平诱导神经发生的协调基因神经原素1的表达。使用根据本发明的磁场的处理已经另外地诱导对负责是干细胞和多潜能性的条件的转录基因的双相影响。

[0068] 特别地，在前6-20h的过程内，该处理诱导Oct4、Sox2、cMyc、NANOG和Klf4的表达，虽然导致相同的基因在24h之后的转录抑制。这个方面是非常被关注的，因为根据本发明的磁场处理未将人类成纤维细胞“冻结”在iPS阶段，具有干状态（stem-state）基因的持续的过表达，持续的过表达将在然后“制动”向成熟细胞的分化。相反地，在本发明中描述的处理之后24h实现的对上文提到的基因的转录抑制，已经使能够获得在心肌、骨骼肌和神经元方向的分化的特别高的产生率。

[0069] 实施例4

[0070] 如上文描述的并且使用卵母细胞重复实验，具有以下的结果：

[0071] -卵母细胞的成熟的优化，如在马、绵羊和人类的卵母细胞中表明的，具有作为结果的卵丘细胞的核的和细胞质的成熟和扩展的改进，甚至通过精子的细胞质内注射（ICSI）；

[0072] -闭锁的和/或退化的卵母细胞的改进的生活力；

[0073] -裂解的刺激和改进，具有在成纤维细胞阶段的胚胎的发育；

[0074] -在冻结前和后的胚胎的刺激，以帮助后续的受精，甚至通过精子的细胞质内注射；

[0075] -所获得的胚胎的处理，甚至通过精子的细胞质内注射，用于克隆目的；

[0076] -细胞系刺激，以诱导克隆和遗传修饰；

[0077] -精子刺激，用于体外受精的方法

[0078] -刺激甚至是固着的（sessile）精子，通过体外受精的方法。