물리적/물리화학적 자극으로 처리된 무정형 세포 전달 매체

물리적/물리화학적 자극으로 처리된 무정형 세포 전달 매체{Amorphous Cell Delivery Vehicle Treated with Physical/Physicochemical Stimuli}

본 발명은 기능적 조직 공학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 일부 국면에서 손상된 조직을 대체하거나 복구 부위에 사용하기 적합한 조직을 재생하는 데 유용한 시험관내( in vitro ) 배양 방법 및 그의 생성물을 수반한다.

생체의 손상된 조직 또는 발병 부분을 복구시키기 위한 다양한 방법이 존재한다. 하나의 방법은 손상된 조직 또는 발병 부분을 살아있는 조직 대신, 플라스틱, 금속 및/또는 세라믹과 같은 물질로 대체하여 손상된 조직 또는 발병 부분을 복구시키는 것이다. 또 다른 방법은 손상된 조직 또는 발병 부분을 다른 개인 또는 다른 동물로부터의, 또는 상기 생체의 예를 들면 피부와 같은 상이한 위치로부터의 부분으로 대체하는 것이다. 상기 방법은 비생(non-living) 조직의 물리적 마모 및 이탈 및 생 조직의 입수가능성 또는 특정 목적을 위한 적합성을 포함하는 특정의 단점을 가질 수 있다. 세 번째 방법은 새로운 생 조직을 시험관내에서 생성하는 것이다.

따라서, 생체의 손상된 조직 또는 발병 부분을 복구시키는 방법은 조직의 손 상된 부분을, 세포 또는 조직을 시험관내에서 배양함으로써 수득되는 조직으로 대체하는 것이다. 그러한 방법은 피부, 연골, 골격, 혈관, 간 및 췌장과 같은 다양한 조직에 적용가능할 수 있듯이 일반적으로 가능하다고 최근에 보고된 바 있다. 생체로부터 유래된 세포 또는 조직이 환자의 생체 외부에서 배양되고, 상기 배양에 의해 수득된 세포 또는 조직이 손상된 부분의 복구에 적용될 경우, 조직은 상기 생체에서 재생될 수 있다. 또한, 상기 복구에 적용된 조직이 배양된 조직을 받을 개인으로부터 유래될 경우에는, 그 개인에게 이식될 때 조직의 면역 거부에 대한 우려가 없다.

굴곡을 가지고 접합된 골격의 말단을 피복하는 관절 연골은 상기 부하된 관절에서 하중 분배의 기능을 수행한다. 이러한 기능을 위해, 상기 연골 조직은 낮은 부하 또는 압력의 조건 하에 물을 가역적으로 흡수하고 이어서 증가된 부하 또는 압력의 조건 하에 물을 방출할 수 있다. 또한, 상기 연골 표면은 관절에서 미끄러지는 표면으로 작용한다.

연골은 혈관이 없고 그의 생체 내 재생되는 능력은, 특히 성인의 경우 및 재생될 연골의 조각이 작은 부피라도 초과할 경우에, 매우 제한된다. 그러나, 관절 연골은 종종, 자연적으로 재생되는 것에 비하여 상당히 더 큰 부피를 수반하여, 마모, 노화, 질병 또는 외상 또는 혹사 손상으로 인해 퇴화된다. 연골 층의 이러한 종류의 결함은 영향을 받은 관절의 움직임 및 부하를 아프게 하고, 상기 연골 층에 추가의 손상을 줄 수 있는 염증과 같은 추가의 합병증을 초래할 수 있다.

이러한 이유로, 결손 또는 손상된 연골, 특히 관절 연골을 대체 또는 복구시 키기 위해 상당한 기간 동안 노력을 기울여 왔다.

관절 연골만을 또는 관절 연골과 그 아래에 있는 연골밑 뼈 조직을 수반하는 결함을 복구시키기 위한 방법은 상기 결함 위치를 갈거나 뚫어 가능한 한 정밀한 기하학적 형태의 구멍을 형성하고, 연골 또는 연골 및 같은 기하학적 형태의 뼈의 원판을, 예를 들면 천공 또는 펀칭에 의해 같은 관절의 보다 적은 중량을 견디는 위치로부터 뽑아내고, 상기 컬럼을 치료하고자 하는 결함의 부위에 있는 구멍 내로 삽입하는 것에 의한다. 이러한 방식으로, 여러 구멍을 갖는 보다 큰 결함이 복구된다 (모자이크식 성형술, mosaic plasty).

연골을 적어도 부분적으로 시험관내에서 생성하려는, 즉 살아있는 천연의 세포를 이용하여 인공적 조건 하에 연골을 생성하려는 시도에 있어서 다수의 방법이 개발되었다. 이들 방법에서 직면하는 문제점은 이러한 시험관내 조건에서 연골세포가 비교적 빨리 섬유아세포로 탈분화(de-differentiation)되는 경향을 갖는다는 사실이다. 탈분화에 의해 연골세포는 특히, 연골 조직의 가장 중요한 성분의 하나인 II형 콜라겐을 생성하는 능력을 상실한다. 시험관내에서 연골세포의 역분화 문제를 조처하려는 시도는 고도로 세포-조밀한 배양물에서 연골 세포를 단일 층 또는 3-차원 골격으로 고정하는 것을 포함하였다. 이러한 조건 하에서, 연골세포는 실질적인 탈분화 없이 그들 자체를 재생산하고, 이들은 본래 연골의 세포외 매트릭스와 적어도 유사한 세포외 매트릭스를 형성한다. 3-차원 골격은 세포를 고정하기 위해서 뿐만 아니라, 상기 방식으로 생성된 연골 조직의 어느 것도 심지어 낮은 기계적 긴장을 견딜 수 있는 안정성을 갖지 않기 때문에 요구되는 이식 후 기계적 안 정성을 부여하기 위해서도 사용된다.

발명의 요약

기능적 조직 공학의 주요 목표는 손상된 조직을 복구시키거나 대체할 신규-조직(세포 구조)의 발달에 있다. 정형외과 응용의 경우, 이식물이 중량-지지, 관절-부하 및 신장을 견뎌야 하기 때문에, 강성 및 경성이 손상된 조직의 대체를 위해 결정적이다. 본 발명은 3 가지 주요 요소: 분해성 담체, 반투과성 막, 및, 특히 배양 중인 세포에 유체 정역학적 유체 압력을 적용하는 생반응기:를 가지고 이들 문제점을 조처하는 새로운 시스템에 관한 것이다.

특정 국면에서 본 발명은, 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어지는 세포 배양 공간에서, 및 생체 내에서 일어나는 것과 같이 조직의 조건을 모방하는 물리적/물리화학적 조건 하에 배양되는, 생분해성 하이드로겔 및 조직 전구 세포를 함유하는 액체 하이드로겔-세포 조성물을 생성함으로써 대상에 사용하기 위한 새로운 조직을 생성하는 시험관내 방법을 제공한다. 반투과성 막은 세포, 세포에 의해 만들어진 임의의 고분자량 세포외 매트릭스, 및 생분해성 하이드로겔 담체의 고분자량 분해 생성물을 상기 세포 배양 공간 내에 유지하도록 선택된다. 본 발명의 특정 국면에서 특징은 미리형성된 골격 또는 다른 지지체 구조 없이 무정형 하이드로겔 또는 다른 생분해성 담체를 사용하여, 시험관내 배양의 생성물이 변형되어 상기 생성물이 시험관내 또는 생체내( in vivo )에서 그 안에 도입될 수 있는 공간 또는 용기에 의해 정의된 3-차원 형태에 수용되도록 하는 것이다. 상기 시험관내 세포 배양 생성물은 예를 들면 주사기 또는 카테테르를 이용하여 대상 내에 이식될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 예를 들면 연골 조직을 포함하는 다양한 조직의 치료에 유용하다.

특정 국면에서 본 발명은 또한 생성에 관련된 방법 및 조성물 및 내인성 세포외 매트릭스(ECM)를 갖는 연골발생 세포를 포함하는 주사가능한 세포/매트릭스 조성물의 사용을 특징으로 한다. 본 발명의 생체 외 배양 방법을 이용하여 생성된 ECM은 유리하게도 그의 생화학적, 조직학적 및/또는 생물역학적 특성에 있어서 천연에서 나타나는 ECM을 근접하게 모방한다.

하나의 국면에서 본 발명은 시험관내에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 시험관내 배양을 위해 선택된 세포의 개체군을 생분해성 무정형 담체와 접촉시키고; 상기 세포의 접촉된 개체군을 세포를 수용하기 위한 세포 공간에 넣고 (상기 세포 공간은 100 kDa보다 크고 1,000 kDa 이하인 분자량 한계를 갖는 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어짐); 상기 세포의 접촉된 개체군에 주기적으로 압력을 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포는 연골세포 및, 선택적으로 그의 전구 세포를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포는 주로 연골세포로 구성된다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐을 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 덱스트란 비드를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로난 및 이들의 임의 조합에서 선택된 하이드로겔을 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 세포를 수용하기 위한 적어도 하나의 폐쇄가능한 구멍을 포함하는 반투과성 막의 관으로 구성된다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 세포를 수용하기 위한 폐쇄가능한 구멍을 포함하는 반투과성 막 파우치로 구성된다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 200 kDa의 분자량 한계(cut-off)를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 250 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 500 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 1000 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 총 양의 전하를 담지하는 반투과성 막이다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 총 양의 전하를 담지하는 반투과성 막은 폴리-L-리신으로 피복된 반투과성 막이다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 주기적으로 압력을 적용하는 것은 0.001 내지 1 Hz로 0.5 내지 3.5 MPa를 적용하는 것을 포함한다.

하나의 국면에서 본 발명은 생분해성 무정형 담체와 접촉하는 세포의 생체 외-확장된 개체군을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포는 연골세포 및 선택적으로, 그의 전구 세포를 포함한다. 이러한 경우에 세포/매트릭스 조성물을 본 발명의 목적을 위해 연골세포의 세포/매트릭스 조성물이라 한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포는 주로 연골세포로 이루어진다. 이러한 경우에 세포/매트릭스 조성물은 또한 본 발명의 목적을 위해 연골세포의 세포/매트릭스 조성물이라 한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐을 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 생분해성 무정형 담체는 덱스트란 비드를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 생분해성 무정형 담체는 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로난, 및 이들의 조합에서 선택된 하이드로겔을 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포 및 담체는 세포를 수용하기 위한 세포 공간에 담겨있고, 상기 세포 공간은 100 kDa보다 크고 1,000 kDa 이하인 분자량 한계를 갖는 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어진다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 200 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 250 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 500 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 1,000 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

하나의 국면에서 본 발명은 전술한 세포의 생체 외 배양 방법에 따라 생성된 세포/매트릭스 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 연골세포 및 선택적으로, 그의 전구 세포를 포함한다. 상기 경우에 세포/매트릭스 조성물을 본 발명의 목적을 위하여 연골세포의 세포/매트릭스 조성물이라 한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포/매트릭스 조성물의 세포는 주로 연골세포로 이루어진다. 이러한 경우에 세포/매트릭스 조성물도 본 발명의 목적을 위해 연골세포의 세포/매트릭스 조성물이라 한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 I형 콜라겐을 포함하는 생분해성 무정형 담체를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 덱스트란 비드를 포함하는 생분해성 무정형 담체를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로난, 및 이들의 조합에서 선택된 하이드로겔을 포함하는 생분해성 무정형 담체를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 세포/매트릭스 조성물은 세포를 수용하기 위한 세포 공간에 담겨있고, 상기 세포 공간은 100 kDa보다 크고 1,000 kDa 이하인 분자량 한계를 갖는 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어진다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 200 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 250 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 500 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 1,000 kDa의 분자량 한계를 갖는다.

하나의 국면에서 본 발명은 손상된 연골 조직을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을 손상된 연골 조직의 부위 내로 도입하여 손상된 연골 조직을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 연골 조직은 척추 원반이다.

하나의 국면에서 본 발명은 손상된 관절 연골 표면을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을 표면 층 또는 손상된 관절 연골 표면의 위에 놓인 연골의 얕은 과도적 영역 및 손상된 관절 연골 표면의 부위 아래에 있는 연골 또는 연골밑 뼈에 의해 정의된 공간 내로 도입하여 손상된 관절 연골 표면을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 상기 도입은 손상된 관절 연골 표면을 치료하기 위한 관절경 방법의 부분으로 수행된다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 손상된 관절 연골 표면은 무릎의 손상된 관절 연골 표면이다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 손상된 관절 연골 표면은 골반의 손상된 관절 연골 표면이다.

본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 손상된 관절 연골 표면은 어깨, 팔꿈치, 손(손목뼈사이, 손목손허리, 손허리뼈사이, 손허리손가락, 지간) 및 턱관절에서 선택된 관절의 손상된 관절 연골 표면이다.

하나의 국면에서 본 발명은 대상에서 골관절염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 관절의 골관절염을 갖는 대상에 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을, 손상된 관절 연골 표면의 부위 위에 놓인 표면 영역 연골 및 상기 관절의 손상된 관절 연골 표면의 부위 아래에 있는 연골밑 뼈에 의해 정의된 공간 내로 도입하여 골관절염을 치료하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 및 여타 국면 및 구현예를 본 발명의 상세한 설명과 관련하여 더욱 상세하게 기재할 것이다.

도면은 단지 예시적인 것이며 여기에 개시된 발명의 실현가능성을 위해 요구되지 않는다.

도 1은 양의 유체정역학적 유체 압력을 배지의 일정한 관류를 갖거나 갖지 않고 배양 스펀지에 전달하기 위해 고안된 유체 정역학적 압력/관류 배양 시스템(생반응기)을 도시하는 사진 영상이다. 기본 시스템은 (1) 기체 교환 실리콘 관을 갖는 배지 저장용기, (2) 관류 펌프 (단일-피스톤 실린더 펌프), (3) 배양 쳄버 및 (4) 역-압력 제어 모듈을 포함한다. 반투과성 막 파우치를 갖는 세포를 상기 쳄버 내에 현탁시키고, 이는 예를 들면 37℃와 같은 특정 온도로 유지된다. 유체정역학적 유체 압력의 크기, 관류 속도, O ₂ /CO ₂ 기체 농도 및 온도는 컴퓨터를 이용하여 조정 및 제어된다.

도 2는 생분해성 무정형 담체 중 세포의 배양을 위해 반투과성 막을 사용하는 것을 보여주는 개략도이다. 반투과성 막(예, 투석 관)은 작은 분자(예, 기체, 아미노산, 이온, 단백질 및 분해된 잔해)의 유입과 유출을 선택적으로 허용하며 커다란 분자(예, 애그리칸, 콜라겐)의 유출을 방지한다. 동적인 유체 정역학적 유체 압력 및 일정한 매질 변화(관류)로, 확산적 질량 전이가 촉진되며 직접적인 유체 전단 응력이 방지된다.

도 3은 표면 층으로부터 본래 소의 관절 연골 내로 분자 표식(덱스트란-FITC, 500 kDa)의 제한된 확산을 보여주는 사진 영상이다.

도 4는 접시 중 각각이 세포/콜라겐 겔 담체를 함유하는 6 개의 반투과성 막 파우치를 보여주는 사진 영상이다.

도 5는 정적인, 일정한 유체 정역학적 압력, 및 주기적 유체 정역학적 압력 배양 조건 중에서 나타난 세포 형태 및 기하학의 양자에 있어서 주요한 차이를 보여주는 일련의 6 장의 광학 현미경 영상이다. TB, 톨루이딘 블루.

도 6은 반투과성 막 파우치에서 배양되고 물리적 자극을 이용하여 처리된 주사가능한 연골세포/매트릭스를 이용하는 외과적 처치의 방법을 도시하는 개략도이다.

본 발명은 예를 들면 연골과 같은 성장하는 신규 조직을 위한 방법, 및 조성물, 및 대상에서 손상된 조직의 치료를 위해 상기 신규 조직 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

1. 정의

달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

여기에서 사용되는, 시험관내 배양을 위해 선택된 세포의 개체군은 그들의 자연 환경으로부터 단리되고 시험관내 배양을 위해 제공된 살아있는 세포의 임의의 적합한 수집을 의미한다. 세포의 개체군은 세포 종류 면에서 근본적으로 균일하거나, 불균일할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서 세포의 균일한 개체군은 구축된 세포주, 세포의 클론, 성인 줄기 세포의 원천 또는 초대 배양의 증식물로부터 유래된 세포의 대표적 표본을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포의 불균일 개체군은 2종 이상의 세포 유형을 포함할 수 있고, 1종 이상의 구축된 세포주, 세포의 클론, 초대 배양물 및 이들의 임의 조합으로부터 유래된 세포의 대표적 표본을 포함하는 임의의 적합한 원천(들)로부터 유래할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포의 개체군은 히알린(예, 관절) 연골의 원천으로부터 수득된 세포의 집합이다. 그러한 개체군은 연골세포, 섬유아세포, 표피 섬유아세포 및 윤활 막 세포를 비제한적으로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포의 개체군은 주로 연골세포로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 세포의 개체군은 연골세포의 전구 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 세포의 개체군은 대표적인 역분화된 연골세포를 포함한다.

여기에서 사용되는, 생분해성 무정형 담체는 실온 내지 생리적 온도(즉, 20-38℃)에서 그 자체의 소정 3-차원 형태가 없고, 포유류 세포의 시험관내 배양에 적합한 멸군 조건 하에 2 주 내지 약 6 주의 기간에 걸쳐 상당한 양으로 분해되는 임의의 적합한 하이드로겔을 의미한다. 그러한 조건은 온도, pH, 염 및 효소 또는 조직 배양 배지 성분의 존재, 보충물, 또는 하이드로겔에 직접 또는 간접적으로 작용하여 그의 분자량을 감소시킬 수 있는 폐기물을 포함한다. 분해는 평균 분자량으로 평가되어, 예를 들면, 절반 분해된 담체는 그의 초기 평균 분자량의 50%인 평균 분자량을 갖는 담체를 의미할 수 있다. 그렇지 않으면 및 마찬가지로, 절반 분해된 담체는 초기 평균 분자량 물질의 그 출발하는 양의 단지 50%를 갖는 담체를 의미할 수 있다. 평균 분자량을 측정하기 위한 방법은, 비탁법, 비중, 크로마토그래피, 삼투압, 광산란 및 전기영동을 비제한적으로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 2 주에 50% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 2 주에 60% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 2 주에 70% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 2 주에 80% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 2 주에 90% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 3 주에 50% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 3 주에 60% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 3 주에 70% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 3 주에 80% 이상이다. 하나의 구현예에서 분해의 정도는 3 주에 90% 이상이다.

"하이드로겔"은 유기 중합체(천연 또는 합성)가 경화 또는 고체화되어 물 또는 다른 용액의 분자를 포획하여 겔을 형성하는 3-차원 개방-격자 구조를 형성할 경우 형성되는 물질을 의미한다. 고체화는 예를 들면, 응집, 응고, 소수성 상호작용 또는 가교에 의해 일어날 수 있다.

하나의 구현예에서, 상기 생분해성 무정형 담체는 가교되지 않은 것이다. 예를 들면, 당 분야에 알려진 일부 방법에서, 특정 하이드로겔은 조합된 다음 광중합되어 세포를 피막으로 감싸 3-차원의 골격을 형성한다. 예를 들면, 문헌[Bryant SJ 등 (2003) J Biomed Mater Res 64A:70-9; Bryant SJ 등 (2002) J Biomed Mater Res 59:63-72] 참조.

하나의 구현예에서 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐, 덱스트란, 히알루로난 또는 다른 탄수화물, 콘드로이틴 황산염, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 여타 생분해성 합성 중합체, 및 이들의 조합에서 선택된 하이드로겔이다. 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체는 덱스트란 비드를 포함한다. 생분해성 무정형 담체는 일반적으로 그의 초기 평균 분자량이 본 발명에 사용된 반투과성 막의 분자량 한계보다 크도록 선택된다. 그러나, 후술하는 바와 같이, 상기 생분해성 무정형 담체의 초기 평균 분자량은 본 발명의 방법에 사용된 반투과성 막의 분자량 한계보다 작도록 선택된 적어도 하나의 환경에 있을 수 있다.

여기에서 사용되는, 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 세포의 개체군 및 생분해성 무정형 담체가 그 안에 놓이고, 세포에 대하여, 시험관내 배양에 대하여 바로 한정된 용기의 내부를 의미한다. 하나의 구현예에서, 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 여기에 기재된 것과 같은 반투과성 막으로 만들어진 관이다. 하나의 구현예에서 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 여기에 기재된 것과 같은 반투과성 막으로 만들어진 파우치이다. 이들 구현예 각각에서, 세포를 수용하기 위한 세포 공간은 예를 들면 세포를 상기 관 또는 파우치 내로 피펫팅함으로써, 세포를 수용하기 위한 폐쇄가능한 구멍을 포함한다. 상기 폐쇄가능한 구멍은, 예를 들면 기계적 클램프, 묶기, 열 봉합 등을 포함하여 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 봉합 폐쇄될 수 있다.

여기에서 사용되는 반투과성 막은 특정 분자 또는 용질의 통과를 허용하지만 다른 것은 허용하지 않는 임의의 적합한 다공성 벽 재료를 의미한다. 반투과성 막은 그 표면 위 세공의 공간적 분포에 있어서 균일 또는 불균일할 수 있다. 반투과성 막은 그 표면 위의 세공 크기의 분포에 있어서 균일 또는 불균일할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 막 표면 위의 공간적 분포 및 세공 크기의 양자에 있어서 근본적으로 균일하다. 그러한 반투과성 막의 예는 당 분야에 공지되어 있고 투석 막, 여과 막 등을 비제한적으로 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 막은 관의 형태로 만들어진다. 하나의 구현예에서 상기 막은 파우치의 형태로 만들어진다.

용질의 투과성은 분자의 형태, 그의 수화 정도 및 그의 전하에 의존한다. 이들 각각은 용매의 성질, pH 및 이온 강도에 의해 영향을 받을 수 있다. 일반적으로, 분자 크기는 분자량으로 편리하게 표현될 수 있다. 잘 정의된 분자량 한계를 갖는 반투과성 막이 당 분야에 알려져 있고, 상업적으로 입수가능하며, 투석 막, 투석 관, 및 상기 언급된 여과 막을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위해, 상기 막 재료는 일반적으로 조직 배양에 사용하기 적합할 것이며, 예를 들면 재생된 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF; Spectra/Por ^(R) , Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA)로 만들어진 반투과성 막을 포함할 수 있다. PVDF 막 및 관은 오토클레이브 처리가능하고 열 봉합가능하다. 투석 막을 사용하기 위한 전형적인 응용은 염, 계면활성제, 세제 및 용매의 제거; 시료 용액의 완충 및 pH 조절; 단백질, 펩티드 또는 항체의 농도; DNA 전기용리; 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 앞선 단백질의 준비; 오염시키는 미세분자의 제거; 결합 연구; 및 조직 배양 추출 정제를 포함한다.

상기 반투과성 막은 정의된 분자량 한계를 갖는다. 시판되는 반투과성 막은 100 돌턴(0.1 kDa) 내지 1,000,000 돌턴(1000 kDa) 범위의 명목상 분자량 한계를 갖는 것들을 포함한다. 투석 막 세공 크기는 일반적으로, 90%의 용질이 막에 의해 보유되는 (투과를 방지하는) 분자량으로 표현된다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막 세공 크기는 적어도 90%의 용질이 막에 의해 보유되는 (투과를 방지하는) 분자량으로 표현된다.

하나의 구현예에서, 반투과성 막은 전하-중성이며, 즉 그 자체가 총 전기 전하를 근본적으로 담지하지 않는다. 그러한 막은 그들의 전하에 상관없이 용질의 분자 크기에 근거하여 용질 분자의 통과를 허용한다. 하나의 구현예에서, 반투과성 막은 총 양의 전하를 담지한다. 하나의 구현예에서 상기 반투과성 막은 총 음의 전하를 담지한다. 하나의 구현예에서, 총 전하는 아래에 놓인 전하-중성 막에 적용된 피복에 의해 제공된다. 상기 전하 또는 피복은 막의 양면 또는 단지 한 면 위에, 예를 들면 관의 형태의 막의 내부에 존재할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구현예에서 상기 반투과성 막은 총 양의 전하를 담지하고, 폴리-L-리신으로 피복된 반투과성 막이다. 총 양의 전하는, 그렇지 않으면 크기 만으로는 막을 통과하였을 용매를 포함하여, 양의 전하를 가진 용질을 거부하도록 작용한다.

여기에서 사용되는, 생분해성 무정형 담체와 접촉하는 세포의 시험관내-확장된 개체군은 배양물 내에 넣은 세포의 초기 개체군보다 수적으로 많은 세포의 개체군을 포함하는 시험관내 조직 배양 생성물을 의미하며, 상기 세포는 여기에 기재된 생분해성 무정형 담체와 접촉한다. 상기 생분해성 무정형 담체는 반투과성 막에 의해 상기 세포 공간의 한계 내에 보유된 무정형 담체의 분해 생성물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 생분해성 무정형 담체와 접촉하는 세포의 시험관내-확장된 개체군은 세포에 의해 만들어지고 상기 반투과성 막에 의해 세포 공간의 한계 내에 보유된 세포외 매트릭스 물질을 또한 포함한다. 여기에서 사용되는 그러한 후자의 생성물을 본 발명의 방법에 따라 생성된 세포/매트릭스 조성물이라 한다. 상기 조직 배양 생성물은 일반적으로 무정형이어서, 겔 또는 점성 액체로서 주사기 또는 트로카와 같은 강성의 용기 내에 도입될 수 있고 상기 강성의 용기에서 구멍을 통해 압출될 수 있다.

여기에서 사용되는, 연골은 연골 세포 및 상기 연골세포에 의해 만들어진 무정형의 겔-같은 매트릭스 중에 파묻힌 세포외 섬유를 포함하는 결합 조직의 특수화된 무혈관 형태를 의미한다. 연골은 긴, 중량-지지 골격, 뿐만 아니라 관절 표면의 형성에 대한 기초를 제공한다. 연골의 3 가지 주요 유형은 히알린 연골, 탄성 연골 및 섬유연골이며, 그 중 히알린 연골이 가장 일반적이다. 긴 뼈의 관절 표면 상에 존재할 뿐만 아니라, 히알린 연골은 성인에서 갈비의 배쪽 말단 위에서, 기관륜 및 후두에서 발견될 수 있다. 조직학적으로, 히알린 연골은 점액다당류(예, 콘드로이틴 황산염) 및 콜라겐, 특히 II형 콜라겐이 풍부한, 유력한 세포외 히알린 매트릭스에 의해 둘러싸이고 감싸진 단리된 연골세포로 나타난다. 아마도 그의 무혈관 특성 때문에, 연골은 일반적으로 치유 능력에 있어서 제한된다.

19 종류가 넘는 콜라겐이 확인되었고, 그 중 I형, II형, III형 및 IV형이 가장 잘 특징화되어 있다. 가장 많은 형태인 I형 콜라겐은 피부, 인대, 힘줄, 골격 및 대동맥에서 발견되며 2 개의 동일한 α1(I) 사슬 및 하나의 α1(II) 사슬로 이루어진다. 얇은 원섬유의 아케이드를 형성하고 연골의 건조 중량의 대략 40-50%를 차지하는 II형 콜라겐은 3 개의 동일한 α1(II) 사슬로 이루어진다. 대동맥과 같은 대형 혈관에서 주로 발견되고, 피부, 인대 및 힘줄에서 보다 적은 양으로 발견되는 III형 콜라겐은 3 개의 동일한 α1(III) 사슬로 이루어진다. 원섬유가 없는 IV형 콜라겐은 기저막에 존재한다.

여기에 사용되는, 관절 연골 표면은 가동 (움직일 수 있는, 내부-윤활된) 관절의 관절 표면 위에 있는 히알린 연골의 층의 임의 국면을 의미한다. 관절 표면은 주어진 관절 운동의 완전한 원래 범위에 포함되는 관절 표면의 임의 부분을 포함한다.

여기에서 사용되는 손상된 관절 연골 표면은 어떠한 이유로든 물리적으로 결함이 있는 임의의 관절 연골 표면을 의미한다. 예를 들면, 관절 연골 표면은 예를 들면 외상에 의해 급성적으로 손상되거나, 관절 연골 표면은 예를 들면, 반복적인 충격 부하 또는 스트레스 손상, 통풍 및 관절염(예, 골관절염), 감염, 자동면역 질환(예, 류머티스 관절염), 무균 괴사, 및 낫적혈구 빈혈을 포함하는 임의의 염증성 과정에 의해 만성적으로 손상될 수 있다. 상기 손상은, 상응하는 반대편 관절에 존재할 수 있는 등과 같은 정상의 관절 연골 표면에 비하여 관절 연골 표면의 얇아짐 또는 파괴의 형태를 취할 수 있다. 정상의 관절 연골 표면은 임의의 병들지 않거나 수반되지 않은 상응하는 관절 연골 표면에 관하여 정의될 수 있다. 하나의 구현예에서, 손상된 관절 연골은, 평면 X-선, 전산화 단층촬영 (CT) 영상, 및 자기 공명 영상 (MRI)을 포함하는 방사선 사진으로 시각화될 수 있다. 예를 들면, 경대퇴골 또는 다른 관절 공간 좁아짐의 방사선 사진 증거가 관절 연골 얇아짐의 신호로 빈번히 간주된다.

유체 정역학적 압력의 연골발생에 미치는 효과가 보고되었지만, 데이터 해석은 연골 디스크 대 연골세포(현탁 또는 배양된)의 사용, 한정된 대 한정되지 않은 모델, 및 고정 압력 대 간헐적 (주기적) 압력의 적용 등 복잡하고 일관성없는 방법에 의해 어려워졌다. 기계적 자극의 연골 및 연골세포에 미치는 효과가, 문헌[Mow VC 등 (1999) Osteoarthritis Cartilage 7:41-58 및 Mizuno S 등 (1998) Mat Sci Eng C 6:301-6]에 의해 검토된 바와 같이, 한정된 및 한정되지 않은 모델에서 맞춤-고안된 장치를 이용하여 시험되었다. 한정되지 않은 모델에서, 연골의 압축 부하는 조직 변형 및 유체 정역학적 압력에서의 변화, 유체 삼출, 및 흐름 전위를 가져왔다. [Maroudas A (1975) Biorheology 12:233-48; Comper WD 등 (1993) Biochem J 289:543-7] 상기 모델은 또한 세포 형태를 상당히 변화시킬 수 있다. [Guilak F 등 (1995) J Ortho Res 13:410-21; Guilak F (2000) Biorheology 37:27-44]

시험관내 실험은 연골 대사에 미치는 생물리적 힘의 영향을 평가하기 위해 연골의 디스크를 빈번히 사용하였다. 0-3 MPa에서 12 시간 동안 고정적인 압축은 황산염과 프롤린 도입 사이에 반비례 관계를 나타내었다. [Gray M 등 (1988) J Ortho Res 6:777-92] 소 관절 연골의 얇은 조각에서 황산염 및 프롤린 도입에 미치는 유체 정역학적 압력의 영향은 압력의 크기 및 지속시간에 의존한다. [Hall A 등 (1991) J Ortho Res 9:1-10] 생리적 수준의 압력(5-10 MPa)을 20 초 또는 2 시간 동안 적용하는 것이 이어지는 매트릭스 합성을 자극한 반면, 20 MPa를 2 시간 동안 연속적으로 적용하는 것은 매트릭스 합성을 감소시켰다. [위 문헌] 그러나 동적인 또는 간헐적인 압축에 대한 생합성 반응은 부하의 빈도수 및 크기에 따라 자극 또는 저해될 수 있다. [Sah RLY 등 (1989) J Orthop Res 7:619-36; Ostendorf RH 등 (1994) J Rheumatol 21:287-92; Palmoski MJ 등 (1984) Arthritis Rheum 27:675-81; Klein-Nulend J 등 (1987) J Biol Chem 262:15490-5; Torzilli PA 등 (1997) J Biomech 30:1-9; Buschmann MD 등 (1996) J Cell Sci 109:499-508; Mankin KP 등 (1998) J Pediatr Orthop 18:145-8]

압력-유도된 긴장 및 이어지는 흐름 전위는 ECM 합성의 강력한 자극제일 수 있다. [Kim Y 등 (1994) Arch Biochem Biophys 311:1-12; Bachrach NM 등 (1998) J Biomech 31:445-51; Kim YJ 등 (1995) J Biomech 28:1055-66] 그러나, 관절 연골의 단단한 매트릭스는 12 MPa에 이르는 유체 정역학적 압력에 처해질 경우 압축가능하지 않다. [Bachrach NM 등 (1998) J Biomech 31:445-51] 더욱이, 유체 정역학적 압력은 세포 부피에 영향을 주지 않는다. 부시맨 등은 연골 조직 변형은 세포 형태의 변화보다 더 강력한 자극임을 시사하였다. [Buschmann MD 등 (1995) J Cell Sci 108:1497-1508] 유체 정역학적 압력이 연골세포에 영향을 주는 형질도입 메카니즘은 분명하지 않지만, 유체 정역학적 압력의 일부 영향을 연골 디스크 및 단리된 연골 세포의 단일층을 가지고 생체 외에서 조사하였다.

배양된 연골세포 및 연골 디스크에 미치는 주기적 유체 정역학적 압력의 효과는 파키넨 등[Parkkinen 등 (1993) Arch. Biochem. Biophys. 300]에 의해 비교되었다. 황산염 도입은 1.5 시간 동안 0.5, 0.25 또는 0.05 Hz의 주기적 부하에 처해진 세포 배양에서 저해되었지만, 1.5 시간 동안 0.5 Hz의 주기적 부하에 처해진 연골 디스크에서는 자극되었다. 보다 긴 부하(20 시간)에 처해진 소 연골세포 배양물은 0.05 및 0.25 Hz에서 황산염 도입의 자극을 나타냈지만 0.0167 Hz에서는 저해를 나타냈다. [위 문헌] 연구자들은 세포/매트릭스 상호작용이 주기적 유체 정역학적 압력이 세포 기능에 미치는 효과에 영향을 주는 것으로 결론지었다.

뿐만 아니라, 대사의 자극이 유체 흐름 및/또는 세포 형태[Guilak F 등 (1995) J Ortho Res 13:410-21; Kim Y 등 (1994) Arch Biochem Biophys 311:1-12; Bachrach NM 등 (1995) J Biomech 28:1561-9; Lammi MJ 등 (1994) Biochem J 304:723-30] 및 흐름 전위[Kim YJ 등 (1995) J Biomech 28:1055-66]에 있어서의 변화와 관련된다는 시각을 지지하는 데이터가 존재한다. 유체 정역학적 압력(HP)은 욕 용액을 쳄버 내에서 가압함으로써 배지욕에 현탁된 단리된 연골세포에 간접적으로 적용되었다. [Hall A 등 (1991) J Orthop Res 9:1-10] 모델이 축적된 연골 ECM을 함유하지 않았음에도 불구하고, 각 세포와 HP 사이의 상호작용은 단순히 조작되었다. 단리된 연골세포를 이용한 연구는 또한 프로테오글리칸 합성 및 애그리칸 mRNA 발현에 미치는 압력의 2-상 효과를 보였다. [Lammi MJ 등 (1994) Biochem J 304:723-30] 500 또는 1000 파운드/평방 인치(psi)에 간헐적으로 (5 초 가압 및 15 초 탈압력을 매일 4 시간 동안, 5주가 될 때까지) 노출된 3-차원 골격 내 글리코스아미노글리칸(GAG)의 축적은 압력이 없는 경우보다 컸다. [Hall A 등 (1991) J Orthop Res 9:1-10]

단리된 연골세포를 이용한 연구 또한 프로테오글리칸 합성 및 애그리칸 mRNA 발현에 미치는 효과가 압력의 방식에 의존함을 나타내었다. [Lammi MJ 등 (1994) Biochem J 304:723-30] GAG 합성은, 10 MPa에서 4 시간 동안의 일정한 압력 부하가 mRNA 수준에 영향을 주지 않고 고밀도 단일층 배양물에서 연골세포에 의한 II형 콜라겐 및 GAG 합성을 자극한 반면, 간헐적인 압력은 애그리칸 mRNA 수준을 31% 만큼 및 콜라겐 mRNA 수준을 36% 만큼 증가시켰다고 보고한 스미스 등에 의한 전사 및 유전암호 해독에 직접 의존하지 않는다. [Mueller SM 등 (1999) J Bone Min Res 14:2118-26]

관절 연골은 연골세포, 및 연골세포에 의해 합성되고 그 주위에 침착되는 2종의 주요 고분자; 즉 콜라겐 및 프로테오글리칸으로 이루어진다. 연골세포는 또한 관절 연골을 뒤덮는 윤활액을 합성한다. 건강한 상태에서, 관절 연골은 관절형성 골격 말단의 사이에 매끈한 표면을 형성하여 운동에 의해 생기는 마찰을 감소시킨다. 이러한 마찰은 윤활액에 의해 더욱 감소된다. 관절 연골의 구조적 완전성은 다른 것들 중에서도 골반, 무릎, 어깨 및 팔꿈치에서 골격 관절의 적정한 기능의 기반이다. 골격 관절의 손상된 기능은 운동성을 현격히 감소시키고 앉은 위치에서 일어나기 또는 계단 오르내리기와 같은 일상적 활동을 어렵게한다.

관절 연골의 구조적 완전성 및 적절한 기능을 유지하기 위해, 연골세포는 관절 연골의 주성분인 콜라겐 및 프로테오글리칸, 뿐만 아니라 마찰을 감소시키는 윤활액을 일정하게 합성한다. 이러한 고분자 및 윤활액의 일정한 합성이 골격 말단 사이의 마찰에 의해 생기는 통상의 마모의 대부분에 대한 회복 메카니즘을 갖는 관절 연골을 제공한다.

2. 시험관내( in vitro ) 배양 방법

하나의 국면에서 본 발명은 시험관내 세포 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 시험관내 배양을 위해 선택된 세포의 개체군을 생분해성 무정형 담체와 접촉시키고; 상기 세포의 접촉된 개체군을 세포를 수용하기 위한 세포 공간에 넣고 (상기 세포 공간은 100 kDa보다 크고 1,000 kDa 이하인 분자량 한계를 갖는 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어짐); 상기 세포의 접촉된 개체군에 주기적으로 압력을 적용하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 기존의 시험관내 배양 방법에 비하여, 특히 ECM을 만드는 세포와 함께 사용할 경우 몇 가지 장점을 갖는다. 이러한 장점은 ECM 생성을 증가시키는 능력, 그 생물역학적 성질의 면에서 더욱 천연에 가까운 조직인 조직을 생성하는 능력, 고분자량 ECM 성분의 선택적 보유, 및 직접적인 유체 전단 응력으로부터 세포의 보호를 비제한적으로 포함한다.

본 발명에 따르는 시험관내 배양의 방법은 대상에서 예를 들면 손상된 연골 조직의 부위 중 퇴화된 천연 유래의 세포/매트릭스의 부위를 채우고 따라서 회복시키기 위한 주사가능한 페이스트로 사용될 수 있는 세포/매트릭스 구조를 제조하는 데 사용될 수 있다.

조직 세포 및/또는 조직 전구 세포는 공여자, 예를 들면 환자 자신의 세포로부터, 공여자로부터 세포의 배양으로부터, 단리된 줄기 세포로부터, 또는 구축된 세포주 배양으로부터 수득되거나 직접 유래될 수 있다. 다양한 구현예에서 공여자는 생쥐, 쥐, 토끼, 기니픽, 햄스터, 암소, 돼지, 말, 염소, 양, 개, 고양이 또는 사람이다. 동일 또는 상이한 종의 세포 및 바람직하게는 같은 면역 윤곽의 세포가 대상 또는 가까운 친척, 예를 들면 생물학적 부모 또는 형제로부터 생검에 의해 수득될 수 있다.

수여자와 같은 종의 면역적으로 구분되는 공여자로부터의 세포와 같은, 면역 반응을 도출할 수 있는 세포가 사용될 경우, 상기 수여자는 예를 들면 코르티코스테로이드 및 사이클로스포린과 같은 여타 면역억제제의 계획을 이용하여 필요에 따라 면역억제될 수 있다. 그러나, 자가 세포의 사용은 그러한 면역 반응 및 상기 면역 억제 처치의 필요가 없다.

세포는 공여자로부터 직접 수득되고, 세척되고, 세포 배양 공간 내로 공급되기 전에 선택된 하이드로겔에 현탁될 수 있다. 세포는 그들을 세포 배양 공간 내로 삽입하기 직전에 하이드로겔에 첨가 또는 혼합될 수 있다. 그렇지 않으면, 세포 및 무정형 담체가 세포 배양 공간 내에 별도로 및 순차적으로, 세포를 먼저 담체를 나중에, 또는 그 반대로 도입될 수 있으며, 단 세포 및 담체는 일단 그들이 세포 배양 공간 내에 있을 때 완전히 혼합될 수 있다. 뿐만 아니라, 세포 성장은 상기 시험관내 배양 배지에 적합한 성장 인자 또는 선택된 세포 종류의 성장을 특이적으로 또는 비특이적으로 지지하는 다른 조직 배양 성분을 가함으로써 향상될 수 있다.

생검에 의해 수득된 세포를 선택적으로 수확, 배양한 다음 필요에 따라 통과시켜, 본 발명의 생체 외 배양 방법에 사용하기 전에 오염하는 원치 않는 세포를 제거할 수 있다.

연골세포를 공여자 부위 또는 원천으로부터 무균 절제에 따라 단리시킨 다음, 첨가제 없이 둘베코(Dulbecco)의 개질된 이글즈 (Eagle's) 배지 (DMEM, Gibco) 중 0.2% 콜라게나아제 II형 (Gibco) 및 5% 소 태아 혈청(Gibco)의 용액을 이용하여 17 시간까지 37℃에서 궤도 진탕기 상에서 소화시켰다. 상기 용액을 그 후 70 mm 나일론 세포 여과기를 통해 여과하고 1000 rpm에서 10 분 동안 원심분리할 수 있다. 흡인하거나 상청액을 가만히 따라낸 다음, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco) 및 0.02% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Aldrich)이 인보충된 인산염 완충된 염수(PBS, Gibco) 중에 펠렛을 재현탁시킨다. 다음, 그 용액을 원심분리하고 추가로 2번 후 PBS에 재현탁시킨다. 연골세포의 수 및 생존성을 트리판 블루 배제 및 혈구계를 이용하여 결정한다.

배양물 내에 넣을 세포의 수는 세포의 종류, 원하는 신규-조직의 부피, 및 배양 중 시간의 양에 의존하여 변할 수 있다. 전형적인 사용에서, 배양물 내에 넣을 세포의 수는 세포 배양 공간의 부피에 의해 결정되며, 즉 초기 또는 접종 세포 밀도로서 결정된다. 예를 들면, 배양물 내에 넣을 세포의 수는 전형적으로 약 1x10 ⁶ 내지 1x10 ⁹ 세포/ml의 범위일 수 있고, 더욱 전형적으로는 약 1x10 ⁷ 내지 1x10 ⁸ 세포/ml의 범위일 것이다. 세포가 성장하고 배양물 중에서 분할될 때, 전체 세포 밀도는 그에 따라 증가할 것이다.

하나의 구현예에서, 상기 세포는 연골세포 및, 선택적으로 그의 전구 세포를 포함한다. 예를 들면, 적절한 조건 하에, 섬유아세포가 연골세포로 분화되도록 만들어질 수 있다; 따라서 섬유아세포는 연골세포의 전구 세포로 간주될 수 있다. 중간엽 줄기 세포를 포함하는 다른 세포들이 연골세포의 전구 세포일 수도 있다.

하나의 구현예에서 세포의 전부 또는 실질적으로 전부가 연골세포이다. 존재하는 세포의 종류는 예를 들면 조직학적 검사, 세포 표면 단백질 분석, 생화학적 또는 다른 ECM 특징화, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 핵전사 분석, 효소-결합된 면역형광 분석 (ELISA), 웨스턴 블로팅, 면역조직화학, 전자 현미경, 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석, 및 당업자에게 공지된 여타 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 평가될 수 있다.

생분해성 무정형 담체는 생적합성이고 실질적으로 몇 주 내지 몇 달의 과정에 걸쳐 완전히 생분해가능한 임의의 적합한 천연 또는 합성 재료이다. 하나의 구현예에서, 무정형 담체는 I형 콜라겐을, 예를 들면 배양 배지 또는 다른 생리적으로 허용되는 유체중 I형 콜라겐의 0.3% 용액(w/v)으로 포함한다. I형 콜라겐은 다양한 형태로 시판된다. I형 콜라겐은 본 발명의 방법에 사용되기 앞서, 용매 교환을 포함하는 표준 기술을 이용하여 원치않는 염, 방부제 또는 다른 물질로부터 단리될 수 있다. 그러한 기술은 예를 들면 원심분리, 초미세 여과, 투석 등을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서 상기 생분해성 무정형 담체는 덱스트란 비드이거나 이를 포함한다. 다양한 구현예에서 상기 생분해성 무정형 담체는 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루로난 및 이들의 임의 조합에서 선택된 하이드로겔을 포함한다. 이들 각각은 여기에 기재된 바와 같이 특정 분자량 한계의 반투과성 막과 함께 사용하기 적합하도록 그들의 분자량을 기준으로 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 생분해성 무정형 담체의 출발 분자량은 그것이 반투과성 막에 의해 세포 배양 공간 내에 실질적으로 유지되도록 선택된다. 생분해성 무정형 담체의 더 큰 분자량 형태는 막을 투과하지 않을 것인 한편, 생분해성 무정형 담체의 더 작은 분자량 분해 생성물은 그들이 형성될 때 막을 투과함으로써 세포 배양 공간을 빠져나가 배양 배지 내로 소실될 것이다.

특정 구현예에서, 세포를 수용하기 위한 세포 배양 공간은 반투과성 막의 관 또는 파우치, 예를 들면 세포 및 담체를 수용하기 위한 폐쇄가능한 구멍을 갖는 투석 관이다. 세포 및 담체가 세포 배양 공간 내로 도입된 후, 상기 폐쇄가능한 구멍을 임의의 적합한 방법으로 닫아서, 전체의 수득되는 구조(즉, 세포 및 담체를 함유하는 폐쇄된 반투과성 관 또는 파우치)가 적합한 배양 배지 내에 잠기거나 상기 배지와 달리 접촉하여 위치할 수 있게 한다.

상기 반투과성 막의 분자량 한계(MWCO) 크기는 세포, ECM 및 생분해성 무정형 담체의 고분자량 성분을 보유하는 한편, 담체, 자양분, 폐기물 및 기체의 저분자량 분해 생성물이 상기 배양 배지와 교환되는 것을 허용하도록 선택된다. 물론 상기 담체, 자양분, 폐기물 및 기체의 저분자량 분해 생성물은 일반적으로, 예를 들면 담체의 저분자량 분해 생성물이 상기 세포 배양 공간으로부터 빠져나가도록 그들의 농도 구배를 흘러 내려올 것이다. 이상적으로, 막의 MWCO 크기는 초기 분자량 및 담체의 생분해 역학의 지식에 근거하여 선택된다. 예를 들면, 비교적 신속한 분해를 갖는 담체는 비교적 느린 분해를 갖는 담체를 위해 사용되는 것보다 더 작은 MWCO를 갖는 반투과성 막과 함께 가장 잘 사용되어, 고분자량 담체의 제거 역학 및 고분자량 ECM의 제작이 유사하게 될 것이다. MWCO의 선택은, 이하의 실시예에 기재된 기술을 이용하여 과도한 실험이 없이 이루어질 수 있다.

따라서 하나의 구현예에서 상기 반투과성 막은 적어도 200 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 250 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 300 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 400 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 500 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 600 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 700 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 800 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 900 kDa의 MWCO를 갖는다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 적어도 1,000 kDa의 MWCO를 갖는다.

일부 구현예에서, 상기 반투과성 막은 총 양 또는 음의 전하를 담지하도록 처리될 수 있고, 그럼으로써 적절한 크기를 갖는 유사하게 전하를 띤 및 반대 전하를 띤 용질의 막을 가로지르는 흐름에 영향을 줄 수 있다. 하나의 구현예에서 상기 반투과성 막은 총 양의 전하를 담지한다. 하나의 구현예에서, 상기 반투과성 막은 양이온 또는 폴리-L-리신과 같은 폴리양이온으로 피복된다. 투석 관의 경우, 그러한 피복은 상기 막을 폴리-L-리신의 용액에 단순히 담금으로써 편리하게 수행될 수 있다.

휴지 조건에서, 알부민과 같은 대형 분자는 프로테오글리칸 응집물로부터 근본적으로 배제된다. [Ogston AG 등 (1973) Proc R Soc Lond A 333:297-316] 관절 연골 디스크에서 2.8 MPa의 주기적 부하는 알부민의 이송을 상당히 향상시킨 것으로 보고되었다. [O'Hara BP 등 (1989) Ann Rheum Dis 49:536-9] 일단 연골세포가 세포주위 ECM을 축적하면, 상기 ECM은 용해성 인자가 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 물리적으로 막을 수 있다. [Ogston AG 등 (1973) Proc R Soc Lond A 333:297-316] 그러므로, 세포주위 매트릭스의 축적은 배양물 중 미토겐의 시간에 따른 이용가능성을 저하시킬 것이며, 유체 정역학적 압력이 필요한 조절 인자의 이송에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

다른 대형 분자와 비교할 때, 주된 연골 ECM 성분인 프로테오글리칸은 높은 삼투압을 갖는다. 프로테오글리칸 응집물(애그리칸)은 Na ⁺ 및 Ca ²⁺ 와 같은 유리 양이온과 상호작용하는 다수의 -COO ^- 및 -SO ^3- 의 고정된 음이온을 갖는다. 더 많은 프로테오글리칸이 축적될수록, 삼투압은 증가한다. 더욱이, 삼투압의 증가는 세포 주위 프로테오글리칸의 팽윤 인장을 초래한다. 삼투압은 파우치(관류된 매질 상)의 내부와 외부의 사이에서 오스몰라이트(osmolite)의 구배를 가지고 생성된다. 이들 압력의 균형은 조직의 형태발생 및 조직발생에 영향을 줄 것으로 기대된다.

상기 반투과성 막을 통해, 콘드로이틴 황산염 및 덱스트란 황산염(정의된 분자량의)과 같은 풍부한 ECM 성분의 첨가에 의해 매질 중의 삼투압이 변화될 것이다. 외부적으로 적용된 유체 정역학적 유체 압력 및 내부적으로 생성된 삼투압이 용질의 질량 전이를 변화시킨다. 연골세포를 둘러싸는 ECM의 영향은 유체 정역학적 및 삼투 압력 사이의 균형에 있어서 고려되어야 할 필요가 있다. 인체 대퇴머리의 표면 및 석회화 영역의 그 자리에서의 삼투압은 각각 310 내지 370 mOsm 및 370 내지 480 mOsm이다. 원래 연골의 ECM 삼투압은 일반적인 배양 배지의 것보다 높다. 배양 배지의 삼투압은 콘드로이틴 황산염 또는 덱스트란의 첨가와 함께 변화될 수 있다.

시험관내 배양의 방법은 배양 중인 세포의 개체군에 압력을 적용하는 것을 포함한다. 상기 압력은 전형적으로 유체 정역학적 유체 압력으로 적용되며, 이는 막을 통해, 약 0.5 내지 약 5 MPa의 수준으로 전달가능하다. 5-10 MPa 사이의 범위일 수 있는 생리적 수준의 압력이 또한 본 발명에 의해 고려될 수 있다. 정적인 배양 조건(즉, 주위 대기압)의 조건 하에 담체 중 연골세포의 증식은 최소인 한편, 담체 중 연골세포에 유체 정역학적 압력을 적용하는 것은 향상된 세포 증식 및 세포에 의한 ECM 생성을 초래한다. 하나의 구현예에서 압력은 0.001 내지 1 Hz에서 0.5 내지 3.5 MPa의 유체 정역학적 유체 압력으로 적용된다.

3. 배양 장치

본 발명의 생체 외 배양 방법을 실시하는 데 유용한 장치는 미국 특허 제 6,432,713 호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용은 여기에 참고문헌으로 도입된다. 요약하면, 미국 특허 제 6,432,713 호에 개시된 바와 같이, 상기 발명에 따르는 세포 또는 조직의 배양을 위한 장치는 그 안에 세포 또는 조직을 함유하고 배양 배지를 공급하는 배양 쳄버를 갖는 배양 단위 (배양 회로 단위), 상기 배양 쳄버 내 세포 또는 조직에 압력을 적용하기 위한 압력 적용 수단(압력 적용 장치), 및 배양 배지를 상기 배양 단위에 간헐적으로 또는 연속적으로 공급하기 위한 배양 배지 공급 수단(배양 배지 공급 장치)를 포함하는 것으로 특징된다.

즉, 상기 배양 단위는 상기 배양 쳄버에서 배양될 세포 또는 조직을 수용하여 외기로부터 단리된 세포 또는 조직에 필요한 배양 배지를 공급한다. 외기로부터 단리된 세포 또는 조직은 세균 등에 의한 오염으로부터 보호되며, 따라서 이는 우수한 품질을 갖는 조직으로 성장한다. 수압에 의해 발생된 물리적 자극 및 배양 배지에 의한 흐름에 더하여 압력 적용 수단에 의한 원하는 압력이 세포 또는 조직에 적용된다. 그 결과, 이는 대사 기능, 세포 분열 사이클, 생체 자극의 농도 구배 또는 분산에 영향을 주어 배양을 촉진한다. 배양 배지를 세포 또는 조직에 공급하는 방식은 배양 배지 공급 수단에 의해 임의로 조정되며, 상기 배양 배지는 배양이 다양한 물리적 자극에 의해 촉진되도록 간헐적으로 또는 연속적으로 세포 또는 조직에 공급될 수 있다. 배양 배지의 공급 방식은 매 번 새로운 배양 배지의 공급 또는 배양 배지를 반복적으로 순환시키는 것에 의한 배양 배지의 공급의 하나 또는 양자를 포함한다. 배양 배지의 순환 방식은 배양 배지를 절약할 수 있지만, 배양 배지를 한 방향으로 공급할 경우 배양 배지의 농도에 있어서 변동을 방지하는 장점이 있다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따르는 세포 또는 조직의 배양을 위한 장치는 압력 적용 수단 또는 배양 배지 공급 수단을 제어하기 위한 제어 수단을 더욱 제공하는 것으로 특징된다. 즉, 압력 적용 수단 또는 배양 배지 공급 수단은 임으로 제어될 수 있지만, 피드백 제어 또는 공급 전방 제어 및 프로그램 제어 등과 같은 다양한 제어가 컴퓨터와 같은 제어 수단을 사용하여 수행될 수 있다. 중단에 의한 사람의 수거 제어를 가하는 것 및 수거 제어가 배제되지 않음은 물론이다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 압력 적용 수단으로부터 세포 또는 조직에 적용된 압력이 세포 또는 조직에 의존하여 임의로 조정될 수 있다는 것으로 특징된다. 압력, 즉 압력 패턴을 적용하는 방식은 배양될 세포 또는 조직에 상응하고, 따라서 효과적인 배양을 수행하도록 조정된다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따르는 세포 또는 조직의 배양을 위한 장치는 압력 적용 수단으로부터 세포 또는 조직에 적용되는 압력이 간헐적으로 변하는 압력이거나, 매 주어진 시간마다 반복되는 압력이거나, 매 주어진 시간마다 증가 또는 감소하는 압력인 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 압력 패턴은 모든 방식에 있어서 고려될 수 있고, 따라서 압력 패턴의 방식을 선택함으로써 세포 또는 조직을 효율적으로 배양할 수 있다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 배양 단위가 배양 장치 본체로부터 독립적이거나 분리되어 있음을 특징으로 한다. 즉, 그 안에 배양된 세포 또는 조직을 수용하기 위한 배양 쳄버를 갖는 배양 단위는 배양 장치 본체와 독립적이거나 분리되어 있어서, 상기 세포 또는 조직이 외기로부터 분리되어 있는 배양 단위와 함께 움직여 상기 세포 또는 조직이 그 움직이는 도중 세균에 의해 오염되는 것으로부터 보호되도록 할 수 있게 한다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 배양 단위가 외기로부터 단리된 밀봉된 공간에 수용되는 것을 특징으로 한다. 즉, 밀봉된 공간이 배양 공간이고, 이는 외기로부터 단리되므로, 원하는 기체의 공급에 의해 배양 환경을 조정하여, 외기에 의한 오염으로부터 세포 또는 조직을 보호하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 배양 장치가 질소 기체, 산소 기체, 이산화 탄소 기체를 흡수할 수 있는 기체 흡수 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 질소 기체, 산소 기체 또는 이산화 탄소 기체 중 임의의 1종 또는 조합이 상기 밀봉된 공간에 수용된 배양 단위에 공급될 수 있고, 상기 기체 흡수 수단이 상기 배양 단위에 구비되어 상기 기체가 상기 세포 또는 조직에 적용되고, 기체를 공급 및 조절함으로써 살아있는 환경이 모방되도록 할 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 상기 밀봉된 공간이 질소 기체, 산소 기체, 이산화 탄소 기체로 채워지는 것을 특징으로 한다. 즉, 질소 기체, 산소 기체, 이산화 탄소 기체가 상기 밀봉된 공간에 의해 형성된 배양 공간에 채워질 때, 생체 환경이 모방될 수 있다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 그 안에 배양 단위로 공급될 배양 배지를 저장하기 위한 배양 배지 탱크를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 배양 배지 공급원은 상기 배양 단위에 필요한 배양 배지를 공급 또는 순환시키는 데 필요하며, 상기 배양 배지 탱크가 공급원이다. 특히, 상기 배양 배지 탱크가 외기로부터 고립된 밀봉된 공간에 설치될 경우, 배양 단위에 보유된 배양 배지가 오염되는 것을 방지하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 배양 쳄버가 외부로부터 압력을 수용하기 위한 압력-전달 막을 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 외기로부터 고립되어 있는 상태에서 배양 쳄버에 수용된 세포 또는 조직에 압력 적용 자극을 가하는 것과, 압력-전달 막을 제공함으로써 생체 환경을 모방하는 자극과 같은 원하는 압력 적용 자극을 실현하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 상기 배양 쳄버가 압력 완충 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 생체 환경과 유사한 물리적 자극을 실현하는 것과, 배양 단위의 일부가 가압될 때 압력 완충 수단에 의해 압력을 조절함으로써 세포 또는 조직의 배양을 향상시키는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따르는 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 상기 장치가 압력-전달 막에 의해 배양 쳄버에 고정된 압력 쳄버를 더 포함하며, 수압, 오일 압력 또는 공기 압력이 상기 배양 쳄버 내 세포 또는 조직에 작용하는 것을 허용함으로써 배양 쳄버에서 세포 또는 조직에 압력을 적용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 원하는 압력 적용 자극을 실현하는 것과, 압력 형성 수단으로서 수압, 오일 압력, 또는 공기 압력 중 임의의 것을 이용하여 높은 정확도로 생체 환경을 모방하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 배양 배지 공급 수단이 배양 단위 내에 구비된 배지 공급 쳄버 및 상기 배지 공급 쳄버 내에 있어 배양 배지를 가압하고 가압된 배양 배지를 공급하기 위한 배지 공급 단위를 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 배양 배지 공급 수단은 배양 단위 중 배양 배지를 공급 및 순환시키기 위한 수단이고, 이는 다양한 형태로 형성되며, 예를 들면 이는 그것이 배지 쳄버 및 배지 공급 쳄버 내에 있는 배양 배지를 가압하기 위한 배지 공급 단위로 형성될 경우, 적용된 압력의 양이 공급 배지의 원하는 양을 조정하도록 제어될 수 있다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 이완 밸브가 배양물 중에 구비되고, 배양 배지의 압력이 이완 밸브에 대하여 임의로 조정된 주어진 압력을 초과할 때, 상기 이완 밸브가 열려 배양 배지의 압력을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 즉, 이상적인 압력 적용 자극을 세포 또는 조직에 가하기 위해 배양물에 적용되는 압력을 완충하는 것이 중요하다. 상기 압력 이완 밸브가 하나의 수단으로 사용되고, 배양 배지의 압력이 상기 이완 밸브에 대하여 임의로 고정된 주어진 압력을 초과할 때 이것이 열려 배양 배지의 압력을 감소시킬 경우, 상기 배양 배지는 배양 배지를 오염시키지 않고 이상적인 압력 상태에서 제어된다.

하나의 구현예에서 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 가열 수단 또는 가습 수단이 밀봉된 공간에 구비되고, 상기 밀봉된 공간이 원하는 온도 또는 습도에서 유지 및 제어되는 것을 특징으로 한다. 즉, 배양 단위가 그 안에 수용되어 있는 밀봉된 공간의 온도 및 습도를 제어함으로써 생체 환경에 부합되는 배양 공간을 제공하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따르는 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 초음파 등의 음파를 배양 단위 중 배양 쳄버에 적용하기 위한 소리 생성 단위를 특징으로 한다. 즉, 생체가 외부로부터 음향 자극을 수용하기 때문에 소리 생성 단위를 함께 사용하여 음향적으로 생체 환경을 모방하는 것이 가능하며, 함께 초음파를 사용하여 배양 쳄버 중에 배양될 세포 또는 조직을 높은 신뢰도로 주입하는 것이 가능하다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치는 상기 장치가 상기 밀봉된 공간에 공급될 기체의 농도를 제어하기 위한 제어 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 제어 수단에 의해 밀봉된 공간에 공급될 기체의 농도를 제어함으로써 세포 또는 조직의 배양을 향상시키기 위해 생체 환경을 모방하는 것이 가능하다.

4. 조성물

특정 국면에서 본 발명은 본 발명의 생체 외 배양 방법에 따라 생성된 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 일반적으로, 생분해성 무정형 담체와 접촉하며 반투과성 막에 의해 적어도 부분적으로 경계지어진 세포 공간 내에 함유된 세포의 생체 외-확장된 개체군을 포함한다. 본 발명의 조성물은 예를 들면 대상에서 손상된 조직을 치료하기 위한 본 발명의 임상적 방법에 사용될 수 있다.

하나의 국면에서 본 발명은 생분해성 무정형 담체와 접촉하는 세포의 시험관내-확장된 개체군을 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서 세포의 개체군은 연골세포, 및 선택적으로 그의 전구 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 세포는 주로 연골세포로 이루어진다. 상기 생분해성 무정형 담체는 여기에서 전술한 것과 같을 수 있고, I형 콜라겐, 덱스트란 비드, 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, PEG, 히알루로난 또는 이들의 임의 조합을 비제한적으로 포함한다. 전술한 것 외에, 본 발명의 상기 국면에 따르는 생분해성 무정형 담체는 시험관내 배양의 임의 시점에 세포의 개체군과 접촉하여 위치하는 생분해성 무정형 담체 물질로부터 유래된 남아 있는 고분자량 물질을 포함한다. 전형적인 구현예에서, 본 발명의 상기 국면에 따르는 상기 남아 있는 생분해성 무정형 담체는 시험관내 배양의 시작 시 세포의 개체군과 접촉하여 위치하는 생분해성 무정형 담체 물질로부터 유래된 남아 있는 고분자량 물질을 포함한다. 예를 들면, 세포의 개체군은 수일 내지 수 주의 기간에 걸쳐, 전형적으로 1주 내지 6 주, 더욱 전형적으로는 3 내지 6 주, 가장 전형적으로 3 내지 4 주의 기간에 걸쳐 유지될 수 있고, 상기 기간의 동안 상기 생분해성 무정형 담체는 약 100%에 이르지만 100%를 포함하지는 않도록, 상당한 정도로 분해될 수 있다. 하나의 구현예에서 상기 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐이다.

하나의 국면에서, 본 발명은 본 발명의 시험관내 배양 방법에 따라 제조된 세포/매트릭스 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 하나의 구현예에서, 연골세포 전구 세포를 갖거나 갖지 않는 연골 세포의 개체군이 전술한 것과 같이 배양되어, 유지된 생분해성 무정형 담체와 함께 시험관내-확장된 연골세포의 개체군과 상기 연골세포에 의해 만들어진 고분자량의 세포외 매트릭스 물질을 생성하며, 여기에서 선택적으로, 세포, 매트릭스 물질 및 담체는 세포를 수용하기 위한 세포 공간 내에 보유되며, 여기에서 상기 세포 공간은 100 kDa를 초과하는 분자량 한계를 갖는 반투과성 막에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 경계지어진다. 다양한 구현예에서, 상기 반투과성 막은 100 kDa 초과 1,000 kDa 이하; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 250 kDa 내지 1,000 kDa; 500 kDa 내지 1,000 kDa; 및 1,000 kDa에서 선택된 분자량 한계를 갖는다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 생분해성 무정형 담체는 전술한 바와 같고, I형 콜라겐, 덱스트란 비드, 덱스트란, 콘드로이틴 황산염, PEG, 히알루로난, 및 이들의 고분자량 분해 생성물 중 임의의 1종 또는 조합을 비제한적으로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서 상기 생분해성 무정형 담체는 I형 콜라겐이다. 세포의 개체군은 수 일 내지 수 주의 기간에 걸쳐, 전형적으로 1주 내지 6 주, 더욱 전형적으로는 3 내지 6 주, 가장 전형적으로 3 내지 4 주의 기간에 걸쳐 배양물 중에 유지될 수 있다.

세포/매트릭스 생성물이 반투과성 막에 의해 경계지어진 세포 공간을 포함할 경우, 상기 반투과성 막은 세포 및 본 발명의 시험관내 배양 방법에 따라 생성된 그들이 만든 세포 매트릭스의 이송을 위한 포장물의 편리한 형태를 제공한다. 예를 들면, 세포 공간이 예를 들어 투석 관과 같은 반투과성 막으로 만들어진 관의 형태일 경우, 상기 세포/매트릭스 물질을 함유하는 관이 하나의 단위로서 임상적 사용을 위한 부위까지 전이될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 관형 반투과성 막 내에 함유된 그러한 세포/매트릭스 물질은 예를 들면 관의 말단을 열거나 절단해내고 감싸진 세포/매트릭스 물질을 그 구멍 말단을 통해 관으로부터 압출시킴으로써, 마치 치약 튜브에서의 치약과 같이, 관으로부터 쉽게 제거될 수 있다.

5. 임상적 방법

본 발명은 또한 대상에서 손상된 연골 조직을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에서 손상된 관절 연골 표면을 치료하기 위한 방법을 포함한다. 일반적으로 상기 방법은 본 발명의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을 손상된 연골 조직 또는 손상된 관절 연골 표면의 부위 내로 도입하는 것을 수반하며, 여기에서 상기 도입된 세포/매트릭스 물질은 생명이 있고 손상된 조직을 대체하기 위한 살아있는 이식조직으로서 체재하여, 손상된 조직을 치료한다. 본 발명의 세포/매트릭스 조성물은 골격 구조가 그 안에 있는 조성물과는 달리, 그 자체의 고유한 3-차원 형태를 갖지 않으므로, 그것이 채우고자 하는 조직 결함에 의해 정의된 형태에 쉽게 일치되는 압출가능한 생성물로서 조직 공간 내에 도입될 수 있다.

하나의 국면에서 본 발명은 손상된 연골 조직의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을 손상된 연골 조직의 부위 내에 도입하여 손상된 연골 조직을 치료하는 것을 수반한다. 상기 세포/매트릭스 조성물은 의도한 목적에 적합한 임의의 방법을 이용하여 상기 부위 내로 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 예를 들면 주사기, 캐뉼라 또는 트로카를 이용하여 손상된 연골 조직의 부위 내로 압출된다. 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 열린 과정의 부분으로 상기 부위 내에 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 세포/매트릭스 조성물은 예를 들면 관절경 방법과 같은 소위 최소 침투 방법의 부분으로 상기 부위 내에 도입될 수 있다.

하나의 구현예에서, 상기 방법은 손상된 척추 원반을 치료하기 위한 방법이다. 척추 원반은 척주를 형성하는 인접한 척추뼈 몸통 사이에 반-탄성의 쿠션으로 작용한다. 합쳐서 생각할 때, 상기 척추 원반은 인체에서 척주 길이의 1/4을 차지한다. 각각의 원반은 중앙 부분인 속질핵, 및 주변 부분인 섬유테로 이루어진다. 젊은 성인에서 반-유체 속질핵은 다량의 물 및 약간의 연골 세포를 함유한다; 나이가 들면 수분 함량이 감소하고 섬유연골로 대체된다. 상기 섬유테는 내부의 속질핵을 정상적으로 보유하는 섬유연골로 이루어지고 후자가 탈출되는 것을 막아준다. 손상된 척추 원반은 일반적이며, 급성 및 만성 요통, 엉덩뼈 신경통, 근육 약화, 발처짐, 마비, 양측마비, 방광 정체, 및 의약 분야의 숙련자에게 친숙한 여타 증상과 관련된다.

하나의 국면에서 본 발명은 손상된 관절 연골 표면을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물의 유효량을, 손상된 관절 연골 표면의 부위 위에 놓인 표면 영역 연골 및 손상된 관절 연골 표면의 부위 아래에 있는 연골 또는 연골밑 뼈에 의해 정의된 공간 내에 도입하여, 손상된 관절 연골 표면을 치료하는 단계를 수반한다. 본 발명에 의하면, 관절 연골 표면의 결함을 예를 들면 피브린 글루와 같은 생분해성 중합체로 채울 경우, 신규 연골 세포의 얇은 층이 성장하여 상기 글루의 표면 위에 퍼진다는 것이 발견되었다. 상기 표면 영역 연골의 형성과 동시에, 상기 피브린 글루는 분해되어, 시간이 경과함에 따라 상기 글루는 다시 흡수되어, 표면 결함의 원래 부위의 위에 얇은 표면 영역 연골만을 남기게 된다. 상기 글루에 의해 종전에 차지되었던 공간은 본 발명의 방법에 따르는 신규 연골의 도입을 위한 부위로 작용할 수 있다. 본 발명의 생체 외 배양 방법에 따라 생체 외-확장된 연골세포는 상기 표면 영역 연골의 아래에 도입될 수 있다. 상기 표면 영역 연골은 상기 시험관내-확장된 연골세포/매트릭스 조성물을 제자리에 유지하는 것을 돕는 한편, 상기 세포는 주위의 연골 환경 내로 일체화된다.

하나의 구현예에서, 연골세포는 치료할 대상의 조직으로부터 유래된다. 예를 들면, 세포는 상기 부위를 준비하는 시점에, 상기 부위의 죽은조직 제거술 및 결함의 부위 내로 피브린 글루의 도입을 포함하여, 손상된 관절 표면의 부위로부터 수확될 수 있다. 그 후, 대상 자신의 세포를 전술한 것과 같이 생체 외 확장시키는 한편, 상기 피브린 글루는 그 자리에서 분해되고, 이어서 상기 세포/매트릭스 조성물이 적합하게 팽창되거나 성숙될 때 상기 대상으로 되돌려 보내진다. 세포/매트릭스 조성물의 도입 시 피브린 글루의 분해 정도는, 분해가 살아있는 세포/매트릭스 조성물의 도입 후에도 계속할 것으로 기대되므로, 완료될 수 있지만, 반드시 완료되어야 하는 것은 아니다.

하나의 구현예에서, 상기 연골세포는 치료될 대상이 아닌 공여자의 조직으로부터 유래된다. 공여자는 동종이형이거나 이종발생성일 수 있다. 예를 들면, 세포는 시신 또는 살아있는 공여자의 관절 연골 표면으로부터 수확될 수 있다. 다음, 공여자의 세포를 전술한 것과 같이 시험관내 확장시킨 다음, 상기 세포/매트릭스 조성물이 적합하게 확장 또는 성숙되었을 때 대상에 투여한다.

하나의 구현예에서, 세포/매트릭스 조성물을 상기 공간 내로 도입하는 단계는 손상된 관절 연골 표면을 치료하기 위해 관절경 또는 최소 침투 방법의 부분으로 수행된다. 하나의 구현예에서, 세포/매트릭스 조성물을 도입하는 단계는 초음파 또는 다른 적합한 영상 안내 하에 폐쇄된 과정으로 수행된다. 하나의 구현예에서 폐쇄된 과정은 원하는 부위 내로의 경피 주사를 포함할 수 있다.

바로 위에 기재된 방법은 대상에서, 무릎, 골반, 어깨, 팔꿈치, 손목/손(손목뼈사이, 손목손허리, 손허리뼈사이, 손허리손가락, 지간), 발목/발 (발목뼈사이, 발목발허리, 발허리뼈사이, 발허리발가락, 지간) 및 턱관절에서 선택된 관절을 비제한적으로 포함하는 임의의 다수의 관절을 치료하는 데 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 손상된 관절 표면은 무릎의 손상된 관절 표면이다. 하나의 구현예에서, 상기 손상된 관절 표면은 골반의 손상된 관절 표면이다.

하나의 국면에서 본 발명은 대상에서 골관절염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 따르는 방법은 관절의 골관절염을 갖는 대상에서 본 발명의 연골세포의 세포/매트릭스 조성물을, 손상된 관절 연골 표면의 부위 위에 놓인 표면 영역 연골 및 상기 관절의 손상된 연골 표면의 부위 아래에 있는 연골밑 뼈에 의해 정의된 공간 내에 도입하여, 골관절염을 치료하는 단계를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 손상된 관절 표면은 무릎의 손상된 관절 표면이다. 하나의 구현예에서, 상기 손상된 관절 표면은 골반의 손상된 관절 표면이다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 설명하며, 이는 어떤 식으로든 한정적으로 여겨져서는 아니된다.

실시예 1

세포 또는 조직을 배양하기 위한 장치

본 발명의 시험관내 배양 방법에 사용하기 적합한 유체 정역학적 압력/관류 배양 시스템(생반응기)을 도 1에 나타내며, 이는 그 전체 내용이 여기에 참고문헌으로 도입되는 미국 특허 제 6,432,713 호에 기재되어 있다. 생분해성 무정형 담체에서 세포의 배양을 위한 반투과성 막 파우치의 사용을 도시하는 개략도를 도 2에 나타낸다. 세포 및 생분해성 무정형 담체를 함유하는 반투과성 막 파우치를 배양 쳄버 내에 넣고, 이를 수평으로 유지하고 1 내지 6 주 또는 그 이상의 배양 기간 동안 37℃로 유지한다.

실시예 2

시험관내 유체 정역학적 압력의 적용 후 반투과성 막 파우치 중 생분해성 중합체를 이용한 분자 표지의 질량 전이의 평가

정적인 배양 조건에서, 뿐만 아니라 상이한 크기 및 주기의 유체 압력에서 반투과성 막을 통한 무정형 세포 담체 중 분자 표지의 질량 전이를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 연골 ECM은 높은 분자량을 가지며 반투과성 막 파우치 내에 머무를 것이다. 분해된 세포 담체 잔해(작은 분자) 및 대사 폐기물은 매질 상 내로 배출될 것이다. 정적인 조건 하에, 자양분은 픽의 법칙(Fick's law)에 의해 파우치를 침투할 수 있다. 뿐만 아니라, 생반응기는 정의된 유체 정역학적 유체 압력, 매질 흐름, 및 제어된 산소/이산화 탄소 농도로 질량 전이를 조종하는 데 사용된다. 질량 전이의 모델로서, 분자량 표지가 일련의 실험 조건(표 1) 하에 질량 전이를 평가하는 데 사용된다: 0.3% 중화된 콜라겐 I형 (Vitrogen, Cohesion), PEG (Coseal, Baxter) 및 보충된 히알루로난(Smith & Nephew)이 정의된 분자량 한계(MWCO) 크기의 반투과성 막 파우치 내 가능한 세포 담체로서 평가된다. 형광 FITC- 또는 로다민-덱스트란(Sigma)의 적어도 70 kDa, 250 kDa 및 500 kDa의 분자량 표지가 상기 담체에 첨가된다. 황산염-GAG(S-GAG)은 고도로 음의 전하를 가지므로, FITC-덱스트란(산성 pI) 표지가 전하를 띤 분자를 모방하기 위해 사용된다. 상기 표지/담체를 반투과성 파우치(1 mm 내경, 1.2 mm 외경, 10 mm 길이) 내로 주입한다. 상기 파우치를 열-봉합하고 정적인 조건(즉, 주위 압력) 하에 또는 유체 정역학적 압력을 적용하여 항온처리한다. 상기 파우치를 1, 3, 12, 24, 48 및 74 시간에 수확한다. 시료(표지/담체 물질)를 그 후 상기 파우치로부터 단리한다. 형광 강도 및 시료의 부피를 측정한다. 그렇지 않으면, 막을 폴리-L-리신으로 피복하여 막의 양의 전하를 증가시킨다. 이는 음의 전하를 띤 연골 ECM을 포획하는 효율을 변화시킬 수 있다.

각 배양 조건에 대한 분자량 표지의 역학을 각 분자량에 대한 질량 전이 계수에 대하여 계산하였다. 막의 전하 조정은 특정 전하 조정을 갖는 질량 전이에 영향을 준다.

실시예 3

반투과성 막 파우치에서 무정형 세포 담체의 질량 전이 및 분해에 미치는 유체 정역학적 유체 압력의 효과

생분해성 무정형 중합체(하이드로겔 또는 솔/겔 가역적 중합체)를 조직 배양 시스템을 이용하는 정의된 세포 배양 조건에서 시험하였다. 반투과성 막 파우치를 사용하여 세포 구성 및 연골세포에 의해 생성된 고분자량의 세포외 매트릭스 생성물을 유지한다. 파우치의 성능은 0 내지 5 MPa 및 0 내지 0.5 Hz 범위의 유체 정역학적 유체 압력(HFP) 하에 100 내지 500 kDa의 분자량 한계 크기에 준하여 분석한다. 시험 담체를 상기 파우치 내에 주입하고 분해의 역학에 의해 평가한다. 100 내지 500 kDa 범위의 형광 분자 추적자(예, 덱스트란-FITC)를 표지로 사용한다. 형광 여기 및 검출을 위해 적합하게 선택된 파장을 이용하는 형광측정기로 형광 강도를 측정한다. 사전 연구로부터, 500 kDa에서 덱스트란-FITC은 본래의 연골 내로 침투되지 않았음이 관찰되었다 (도 3). 따라서, < 500 kDa의 분자 표지가 본 실험에 사용하기 적합하다.

사전 데이터는 가교된 덱스트란 비드-형태의 중합체가 통상의 배양 접시에서 10 일의 배양 후에 용해되었음을 나타내었다. 인체 관절 연골세포가 상기 비드의 표면에 접착되지 않았지만, 상기 비드는 세포독성을 나타내지 않았다.

실시예 4

반투과성 파우치 중 속질핵 세포 및 연골세포에 의한 세포 증식 및 ECM 생성에 미치는 유체 정역학적 유체 압력의 효과

세포 실험은 토끼 속질핵 (NP)-유래 세포 및 폐기된 인체 척추 원반(hIVD) 조직을 이용하여 수행되었다. 2주 내지 4주령의 갓 죽인 토끼를 지역 도살장(USDA 인가된)으로부터 구입한다. NP 및 섬유테(AF)를 허리 IVDs로부터 수확한다. NP- 및 AF-유래된 세포를 별도로 효소에 의해 단리한다. 단리된 NP 및 AF 세포를 표준 배양 접시 내에 접종하여 세포 수를 확장시킨다. 모든 조직에 대한 표현형의 유지를 위해 통과 수를 최소화한다.

2 내지 3회 통과 후, 세포를 반투과성 막(MWCO 크기: 100 kDa, 250 kDa 또는 500 kDa)로 만들어진 파우치 내에 접종하고, 미국 특허 제 6,432,713 호에 기재된 기술 상태의 조직 공학 처리기(도 1)를 이용하여, 유체 정역학적 유체 압력(HFP)의 크기, 관류 속도 및 기체 농도의 정의된 조건 하에 항온처리한다. 이러한 변화된 조건은 연골세포 표현형을 극대화하기 위해 시험되었다. 사전 데이터로부터, HFP의 크기, 주기 빈도수, 및 매질 흐름 속도는 0-3 MPa, 0-0.5 Hz, 및 0.01 - 1.0 ml/min의 생리적으로 적절한 범위에서 변한다. 매질 흐름 속도는 자양분 및 기체 양자의 질량 전이의 적정 수준에 따라 변한다. 배양 시간은 사전 데이터를 참고하여 2일 내지 21에서 조정된다. 생화학적 평가를 이용하여 적정 시점 및 접종 밀도를 결정한다.

폐기된 인체 조직은 단리된 토끼 NP-유래 세포 및 AF-유래 세포를 이용하여 정의된 적정 배양 조건에서 동일한 배양 시스템을 이용하여 시험하였다. 입증된 대조로서, 세포를 콜라겐 겔/스폰지 구조 내에 접종하거나 소량의 콜라겐 겔과 함께 파우치 내로 접종하였다. 상기 방법은 HFP의 처리와 함께 연골발생을 촉진하기 위한 표준 방법이다. 임의의 추가 평가를 위한 품질 보증을 유지하기 위해, 상기 세포 구조를 배양 접시에서 1 주 동안 항온처리하였다.

본래의 자가조직 NP는 환자로부터 수확하기 어렵기 때문에 IVD 재구성을 위한 세포의 원천이 중요하다. 환자의 관절 연골은 IVD 재구성을 위한 세포 원천으로서 하나의 선택이다.

사전 데이터로부터, 폐기된 탈출된 조직은 섬유증을 가진 것으로 보이며 세포 단리를 위해 효소적 소화를 필요로 하였다. 인체 IVD 세포를 배양 접시 내에 접종하고 약 1-2 주 동안 항온처리한다. 부착된 IVD 세포를 반투과성 파우치 내에 접종하고 토끼 IVD-유래 세포를 이용하여 정의된 적정 조건에서 항온처리하였다. 사전 데이터로부터, 외인성 콜라겐 매트릭스(겔)이 분해된 것으로 나타났다. 단리된 세포는 섬유아세포 또는 역분화된 연골세포를 함유할 수 있다. 매트릭스 금속단백분해효소 (MMP) 활성이 조직학적으로 및 생화학적으로 평가된다. 아스코르브산과 같은 보충물이 세포외 매트릭스(ECM) 분해에 대하여 보호하기 위해 선택적으로 첨가된다. ECM 분해에 대하여 보호하기 위한 다른 가능한 보충물 또한 시험하였다.

연골 매트릭스 생성 및 세포충실성은 조직학적으로 및 ELISA에 의해 생화학적으로 평가된다. 배양물로부터 ECM의 축적은 총 S-GAG에 대한 1,9-디메틸메틸렌 블루(DMB) 분석에 의해 측정된다. 콜라겐 II형, 애그리칸 및 결합 단백질은 웨스턴 블로팅에 의해 측정된다. 광범한 분자 평가는 연골세포의 세포 표현형을 정의하기 위하여 애그리칸 및 II형 콜라겐 mRNA 발현을 포함한다. 세포 수(DNA 농도) 및 세포충실성은 훽스트(Hoechst) 형광 염료 및 증식 세포 핵 항원(PCNA) 분석, 뿐만 아니라 형광 세포독성 분석으로 평가된다. 세포를 유체 정역학적 유체 압력/관류 배양으로부터 수확하고, 손상된 세포는 PCNA에 대한 모노클론 항체와 함께 고정 및 염색된다.

조직학 . 견본을 0.1 M 카코딜레이트 완충액(pH 7.4) 중 2% 파라포름알데히드로 4℃에서 24 시간 동안 고정시키고 글리콜메타크릴레이트(JB-4, Polysciences, Warrington, PA) 또는 파라핀의 어느 하나에 파묻었다. JB-4-파묻힌 시료의 부분(20 μm)을 pH 4에서 0.2% 톨루이딘 블루 O(Fisher, Franklin, NJ)로 염색하였다.

ELISA . 매트릭스 성분의 생화학적 측정을 위해, 얼린 스펀지를 외과용 블레이드로 1-mm ³ 조각이 되도록 잘게 썰었다. 8 개 반복 시료의 각각을 4℃에서 48 시간 동안, 단백분해효소 저해제(0.1 M ε-아미노헥산산 및 0.005 M 벤자미딘 히드로클로라이드)를 갖는 1 ml의 4 M 구아니딘-히드로클로라이드, 10 mM EDTA(pH 5.8)에서 추출하였다. 3,000 xg에서 5 분 동안 원심분리 후, 상청액을 3x 부피의 무수 에탄올 중 1.3% 아세트산 칼륨으로 -20℃에서 2 시간 동안 침전시키고, 상기 침전물을 14,000 xg에서 20 분 동안 원심분리함으로써 단리하였다. 상기 에탄올 침전을 2 회 반복하고, 마지막 침전물을 프로테오글리칸의 측정을 위해 사용하였다. 상기 스펀지 내에 프로테오글리칸의 축적을 항-케라탄 황산염, 항-콘드로이틴 4-황산염, 및 항-콘드로이틴 모노클론 항체를 가지고 ELISA에서 평가하였다. 상기 에탄올 침전물을 탄산염 완충액(35 mM NaHCO ₃ , 18 mM Na ₂ CO ₃ , pH 9.8)에 용해시키고 같은 방식으로 재-침전시켰다. 시료의 희석액에 면역화학적 분석을 수행하였다. 소 코 연골(ICN Biomedicals)로부터의 프로테오글리칸 단량체를 표준으로 사용하였다. 각 시료 또는 표준의 50-마이크로리터 분액을 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트 상에 피복하고, 행구고, 37℃에서, 0.1 M 트리스-HCl 및 0.03 M 아세트산 나트륨(pH 8.0) 중 50 μl의 0.1 단위/ml의 단백분해효소가 없는 콘드로이티나아제 ABC (Seikagaku America, Falmouth, MA)로 1 시간 동안 소화시켰다. 각각의 웰을 200 μl의 차단 용액(BLOTTO, Pierce, Rockford, IL)으로 처리하였다. 콘드로이티나아제 ABC 소화로 소화시킨 후, 콘드로이틴 Di-4 황산염 프로테오글리칸(Clone; 2-B-6, Seikagaku America)에 대한 항체를 PBS(pH 7.4) 중 1:3000 희석으로 사용하고 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 두 번째 항체인 염소 항-생쥐 IgG + IgM- 비오틴 접합체(Pierce)를 PBS 중 1:20,000 희석으로 사용하고 1 시간 동안 항온처리하였다. 향상을 위해, 인산분해효소-스트렙타비딘 접합체(GIBCO/BRL Laboratory)를, PBS를 이용한 1:1000 희석으로 1 시간 동안 가하였다. 단계들 사이에, 웰을 0.05% 트윈(Tween) 20-PBS로 헹구었다. 각각의 웰을, 22 mM의 탄산 나트륨, 28 mM의 중탄산 나트륨 및 1 mM의 MgCl ₂ (pH 9.8)을 함유하는 완충액 중 100 μl의 4 mg/ml p-니트로페닐포스페이트(GIBCO/BRL Laboratory)와 함께 1 시간 동안 항온처리하였다. 각 반응을 100 μl의 1N NaOH를 가하여 종결시켰다. 마이크로타이터 플레이트 판독기(Bio-Rad, Cambridge, MA)를 이용하여 405 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다.

웨스턴 블로팅 . 매트릭스 성분의 생화학적 측정을 위해, 시료를 피스톨 호모지나이저를 이용하여 4℃에서 5 초 동안 균질화하였다. 균질화물을 15 분 동안 얼음 위에 둔 다음 4℃에서 3,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하였다. 8 개의 반복 시료 각각을 4℃에서 48 시간 동안, 단백분해효소 저해제(0.1 M ε-아미노헥산산 및 0.005 M 벤자미딘 히드로클로라이드)를 갖는 1 ml의 4 M 구아니딘 히드로클로라이드, 10 mM EDTA(pH 5.8)에서 추출하였다. [Mizuno S 등 (1996) Exp Cell Res 227:89-97] 3,000 xg에서 5 분 동안 원심분리 후, 상청액을 3x 부피의 무수 에탄올 중 1.3% 아세트산 칼륨으로 -20℃에서 2 시간 동안 침전시키고, 상기 침전물을 14,000 xg에서 20 분 동안 원심분리함으로써 단리하였다. 상기 에탄올 침전을 2 회 반복하고, 마지막 침전물을 프로테오글리칸의 측정을 위해 사용하였다. 상기 겔 내에 프로테오글리칸의 축적을 항-콘드로이틴 4-황산염 모노클론 항체를 가지고 평가하였다.

SDS-PAGE 겔(Invitrogen)을 이용하여 각 시료의 분액(20 μl)을 전기영동하였다. 150 mV에서 전기영동 후, 각 겔을 PVLA 막(Pharmacia)으로 25 mV에서 45 분 동안 전이시켰다. 상기 막을 실온에서 밤새 5% 탈지 분유를 갖는 트윈-20 PBS로 차단하였다. 상기 막을 4℃에서 밤새 1차 항체 중에 항온처리하였다. 상기 막을 트윈 20-PBS로 5 분 동안 3 회 세척하였다. 화학발광에 의한 검출을 위해, 단백질 블롯을 폴리비닐리덴 클로라이드 랩 위에 단백질 면이 위로 오게 놓고, 상기 블롯을 제조자의 지시에 따라 검출 시약으로 도포하였다 (ECL plus Western blotting detection system, Amersham, Buckinghamshire, England). 방사선사진 필름의 시트(Heyperfilm ECL, Amersham)를 폴리비닐리덴 클로라이드 랩을 이용하여 감싸진 막의 상단 위에 놓고, 1 분 동안 노출시켜 현상하였다.

콜라겐 겔/스펀지를 이용하는 돼지 관절 연골세포로부터의 사전 데이터는 HFP 적용 후의 정적인 배양 조건이 HFP 단독인 경우보다 더 많은 S-GAG 축적을 촉진하였음을 보였다. HFP는 연골세포의 특이적 대사 기능, 예를 들면 고도로 황산염화된 콘드로이틴 황산염 생성을 자극하는 능력을 갖는다. 한편, 상기 세포 구조의 세포 및 물질 성질 또한 증식 및 새로 축적된 ECM의 결과로서 고려될 필요가 있다. 상기 생물학적 변화(성장)는 예를 들면 자양분 및 기체의 투과성과 같은 구조의 물질 성질에 영향을 준다. 정적인 배양 조건은 ECM 및 파묻는 세포의 안정화를 촉진한다. 반투과성 막 파우치는 세포가 접종될 때 세포/담체와 매질 상 사이의 칸막이 역할을 한다. 따라서 ECM 축적은 배양의 시작시에도 나타난다. 밝혀진 바와 같이, 증식된 세포(PCNA-양성 세포)의 대부분은 구조의 표면 상에서 보인다. 반투과성 막 파우치를 이용하면, 세포/구조 기질과 매질 흐름 사이에 계면이 존재하지 않는다.

기질에 대한 세포 부착이 세포 증식을 위해 요구될 수 있다. 이러한 경우, 무정형 담체를 보충하기 위해 섬유증 콜라겐 단편을 선택적으로 가한다. 기질에 대한 세포 접착이 필수적일 경우, 상기 기질은 아르기닌-글리신-아르파르트산(RGD)-펩티드 (Integra, CA) 또는 또 다른 접착 분자로 선택적으로 피복된다.

증식 및 연골발생 표현형은 적정의 HFP 알고리즘으로 자극되며, 이는 연골-특이적 ECM의 표지를 이용하여 고안된다.

실시예 5

미리-선택된 크기의 유체 정역학적 압력에서 반투과성 막 내 무정형 담체 중 연골발생 활성의 평가 및 유체 정역학적 압력을 위한 알고리즘의 결정

본 실시예는 미리-선택된 크기의 유체 정역학적 압력에서 반투과성 막 내 무정형 담체 중 연골발생 활성(세포 생존성, 증식, 표현형)을 조사하고 유체 정역학적 압력을 위한 알고리즘을 결정한다. 새로 합성된 ECM(주로 연골세포-특이적 프로테오글리칸 또는 애그리칸)의 분자량은 2-3 x 10 ³ kDa이다. II형 콜라겐 섬유는 500 nm의 길이를 갖는다. ECM은 반투과성 막 파우치 내에 유지된다. 연골세포는 그들의 새로 합성된 ECM 내에 파묻혀 있고, 담체 물질은 파우치(실시예 2로부터 정의된 한계 크기) 내에 효과적으로 유지되도록 선택된다. 물리적 자극(유체 정역학적 유체 압력 및 정적인 조건을 갖는 그의 알고리즘; 매질 유량)을 조정함으로써, 세포 활성(세포 생존성 및 증식 뿐만 아니라 표현형 발현)이 변화된다. 적정의 물리적 자극 하에, 연골세포는 생체 외 및 새로이 재생 과정을 시작한다. 본 실시예는 상기 언급된 생물학적 표지를 이용하는 적정의 배양 조건을 정의한다.

사전의 조직학적 발견은 막 내에 봉합된 콜라겐 겔 담체 내 균일한 세포 분포 및 강력한 ECM 축적을 나타내었다. 일련의 물리적 자극 및 알고리즘, 뿐만 아니라 평가의 정량적 방법을 표 1에 나타낸다. 유체 정역학적 압력은 일정하게 0, 0.7, 또는 3.5 MPa로 적용되거나 0.5 Hz에서 주기적인 0.7 또는 3.5 MPa로 적용된다. 파우치 배양물은 접종 후 1, 3, 7 및 14일에 수확된다. 무정형 담체 외에, 도입된 히알루로난(800-1200 kDa)은 새로 합성된 히알루로난이 사용가능할 때까지 애그리칸에 대한 결합 부위로서 나타나는 것이 유용하다. 조직학적 및 생화학적 분석(표 1)의 방법은 근본적으로 앞서 기재된 것과 같다.

사전 데이터는 세포 증식 및 II형 콜라겐 합성이 적용된 유체 정역학적 유체 압력으로 자극됨을 지적하였다. 정적인 배양 기간(즉, 주위 압력)은 S-GAG의 축적에 유리하다. 목표 알고리즘은 S-GAG 축적을 위한 정적인 배양 방식 및 증식을 위한 유체 정역학적 유체 압력을 사용한다.

실시예 6

반투과성 막 파우치에서 배양되고 물리적 자극을 이용하여 조정된 주사가능한 연골세포/매트릭스의 발생

핵심 방법은 무정형 세포 담체를 이용하여 시험되었다: 0.3% 콜라겐 겔 (Cohesion), PEG-기재 지혈제 (COSEAL ^TM , Baxter), 및 1.2% 알긴산 칼슘 겔 (Inotech). 소 관절 연골세포를 담체로 현탁시켜 반투과성 막 파우치(PVDF, 1 mm 내경, 1.2 mm 외경, MWCO 크기: 500 kDa) 내로 도입하였다. 파우치 중 세포/겔 담체를 고정 (주위) 압력, 0.7 MPa, 0.1 Hz에서 4 시간에 이어 20 시간 동안 쉬는 주기적 유체 정역학적 유체 압력, 또는 0.7 MPa에서 4 시간에 이어 20 시간 동안 쉬는 일정한 유체 정역학적 압력에서 1 주 동안 항온처리하였다. 배양물 중 소 관절 연골세포는 콜라겐 및 알기네이트 겔에서 S-GAG 및 축적된 매트릭스를 생성하였다 (도 4).

세포 형태 및 기하학 형태의 양자에 있어서의 상당한 차이가 정적, 주기적 및 일정한 유체 정역학적 압력 조건 사이에서 나타났다 (도 5). 정적인 배양 조건 하에, 우세한 이염색성 ECM이 축적되었지만, 채워진 콜라겐 겔은 수축하였다. 주기적 유체 정역학적 압력 하에서는, 섬유-같은 ECM이 축적되었다. 일정한 유체 정역학적 압력 하에, 세포는 소와-같은 형태(화살표)를 가졌고 이염색성 ECM 및 방사상의 섬유-같은 축적에 의해 둘러싸였다.

실시예 7

반투과성 막 파우치의 전하 조정

실시예 3에서의 사전 결과는 분자 추적자의 본래 관절 연골에 대한 침윤이 제한되었음을 나타내었다. 상기 침윤은 형광 표지의 pI 및 세로 조직 형태학에 의존하였다. 이러한 데이터는 세포외 매트릭스(ECM) 축적을 제어하는 것이 가능할 수 있음을 나타낸다. 연골세포가 고도로 황산염화된 ECM을 성공적으로 생성할 경우, ECM은 상기 백 안에 축적될 것이다. 전하 조정은 선택적인 분자 투과성을 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 양의 전하를 띤 표면을 만들기 위해 막을 폴리-L-리신으로 피복한다.

유체 정역학적 유체 압력 처리를 이용하여 작은 분자량 분자는 주기적 유체 정역학적 유체 압력 하에 파우치 내로 효과적으로 침윤한다. 큰 분자량의 생성물, 예를 들면 ECM은 파우치 내에 유지된다. 생분해성 무정형 중합체가 새로 합성된 ECM으로 대체된다.

실시예 8

반투과성 막 파우치에서 배양되고 물리적 자극을 이용하여 조정된 자가의 주사가능한 연골세포/매트릭스를 이용한 외과적 처치

본 외과적 접근은 주사가능한 세포/매트릭스를 사용하며, 총체적인 조직 대체 대신 자가-치유 과정 및 시험관내 세포 치료에 의존한다. 상기 복구 기술은 손상의 부위에서 연골의 표면 층을 만드는 조직 자체의 표면재생 능력을 이용한다. 이주된 세포로 일단 표면 층이 형성되면, 연골세포(그들 자체의 매트릭스를 갖는)를 새로운 표면 아래에 주입하여 결함을 채운다. 상기 외과적 접근은 더 침투적인 외과적 방법 대신 관절경의 사용을 허용한다. 실시예 1-7의 방법을 이용하여 개발된 적정화된 배양 방법을 기초로, 물리적 자극으로 처리된 주사가능한 세포/매트릭스는 연골을 새로 재생하는 것을 용이하게 한다. 시험관내에서 세포/매트릭스 구조를 형성하기 위해, 효율적인 ECM 축적을 위한 반투과성 막을 사용하고, 무정형 세포 담체를 선택하고, 물리적 자극의 알고리즘을 정의함으로써 일련의 시험관내 배양 방법이 개발되었다 (도 6). 상기 방법은 다음의 3 단계를 포함한다:

1) 연골세포를 단리하고, 손상된 결함을 청결히 하고, 상기 결함을 피브린 글루로 채운다.

2) 단리된 세포를 확장시키고 무정형 겔과 함께 반투과성 막 파우치 내에서 실시예 1의 생반응기를 이용하여 배양물 중 적정의 물리적 자극 하에 항온처리한다.

3) 표면 층의 새로운 덮개 또는 연골 및 연골밑 뼈의 표면 전이 영역 사이에 상기 세포/매트릭스를 주입한다.

동등물

전술한 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기 충분한 것으로 생각된다. 실시예는 본 발명의 하나의 국면의 하나의 예시로서 의도되며 다른 기능적으로 동등한 구현예가 본 발명의 범위 내에 있기 때문에, 본 발명은 제공된 실시예에 의해 범위가 제한되어서는 아니된다. 여기에 나타내고 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 수정이 전술한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 청구항의 범위 내에 해당할 것이다. 본 발명의 장점은 본 발명의 각 구현예에 의해 반드시 포함되는 것은 아니다.

본 출원에 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 공보는 그 전체로서 여기에 참고문헌으로 도입된다.