自从首次对从人胚细胞分离胚胎干细胞进行描述以来，很多报道并不 深入地涉及了对胚胎干细胞和成年干细胞的分离和分析。Bongso，A..et al. (1996)，Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocyst， Hum.Reprod.U.S.A.9，2110-17。
干细胞(胚胎和成年的)能长期自我更新，并能产生具有特定形态和 功能的成熟细胞类型。类似地，与来自胚细胞内物质的胚胎干(ES)细胞 一样，成年干细胞的来源也共享共同来源。
典型地，成年干细胞共享至少两种特征：i)它们能在长时期内制造自 身的相同拷贝(长期自我更新)，并且它们能产生具有特征性的形态和专 门化的功能的成熟细胞类型。Stem cells：Scientific Progress and Future Research Directions，Dept. of Health and Huamn Services，Jun 2001； http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。成年干细胞可能缺少与ES 细胞相关的多能性，但是，至少一篇报道表明，成年干细胞展示出了与人 们以前所认识的更大的可塑性。Lagasse，E.et al.(2000)，Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo，Nat.Med.6， 1229-34。
最终，为展示出可塑性，成年干细胞应当产生具有成熟表型的完全分 化细胞。成年干细胞还应当完全整合进它们的新组织环境，并且能展示出 适于该组织的专门化的组织功能。Stem Cells：Scientific Progress and Future Research Directions，见上。
对成年干细胞可塑性进行研究的难处在于建立起：成年干细胞来自一 类细胞或细胞群。迄今为止，研究得最好的成年干细胞基于骨髓和脑细 胞。但是，使用来自骨髓的干细胞(即，造血干细胞、基质细胞和/或内皮 细胞)和脑干细胞(即成神经细胞)存在其局限性。例如，使用细胞拣选 仪对来自骨髓的造血干细胞进行拣选，所述细胞拣选仪按照多种细胞表面 标记来对细胞加以拣选。该方法产生了高度纯化至部分纯化的细胞类型。 在另一个例子中，对神经干细胞的纯化是困难的，因为这些细胞定位于不 同的组织(即，小鼠的侧脑室、嗅球以及海马体)，而不在一种方便的位 置或组织器官中。Altman，J.and Das，G.D.(1965)，Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats，J.Compl Neurol.，124，319-335；Altman，J.(1969)，Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis.IV.Cell proliferation and migration into the anterior forebrain，with special reference to persisting neurogenesis in the olfactory bulb，J.Compl Neurol.，137，433-457。
成年干细胞的其它候选者是皮肤和消化系统中的内皮祖细胞、骨骼肌 干细胞、上皮细胞前体，以及胰腺和肝中的干细胞。Stem Cells：Scientific Progress and Future Research Directions，见上。
成年干细胞的另一种类型来自生殖细胞或原性细胞(PSC)，其位于 睾丸的生精小管和卵巢内层——分别为精原细胞和卵原细胞。精原细胞产 生涉及减数分裂的前体。存在至少两种类型的精原细胞：A型和B型，它 们可基于独特的特征分化。例如，A型精原细胞更呈球形，其具有突出的 核仁和均匀分散的常染色质。然而，B型精原细胞形状上趋向于更不规 则、更小，具有浅裂(lobed)核仁。Guillaume E，et al.(2001)，Proteome analysis of rat spermatogonia：reinvestigation of stathmin spatio-temporal expression within the testis，MoI.Reprod.Dev.，60(4)：439-45。Chiarini-Garcia， H.and Russell，L.D.(2002)，Characterization of mouse spermatogonia by transmission electron microscopy，Reproduction，123(4)：567-77。因此，与其 它成年干细胞不同，成年生殖细胞易于定位，以及与其它间质细胞区别 开。
类似于其它成年身体干细胞，成年生殖细胞是二倍体的(2n)。与其 它成年身体干细胞相反，生殖细胞(精原细胞和卵原细胞)含有未受损伤 的、未损坏的基因组。然而，身体细胞的DNA受到更多损伤(即，自由 基)，这是由于其老化和低速补充导致的。此外，身体干细胞最终会屈服 于产生身体组织的分化力量。因此，包含由未受损伤的DNA构成的干细 胞的方法是优选的。
使用成年干细胞体内移植的一个持久问题是免疫排斥。因此，迄今为 止，干细胞的受体依赖于其细胞不会被受体免疫系统排斥的供体。
因此，提供具有高速长期自我更新能力，同时易于分离和纯化，并且 能降低体内或体外移植的相关免疫排斥的成年干细胞的改进方法将改进与 干细胞生物学以及其治疗用途相关的现有问题。

本发明的一个目的是提供杂交干细胞(HSC)，其中包含摘除了细胞 核的成年干细胞，所述成年干细胞具有来自原性细胞或胚胎干细胞的细胞 核。
可选地，HSC可以包含来自同一动物的摘除了细胞核的成年干细胞和 原性细胞。此外，当成年干细胞和原性细胞来自同一动物时，该动物可选 地为哺乳动物。在本发明的一种单独的实施方式中，HSC在出生后动物中 具有生物活性。
在本发明的另一种实施方式中，HSC包含摘除了细胞核的成年干细 胞，所述成年干细胞具有来自原性细胞的细胞核。在一种实施方式中，原 性细胞是精原细胞。在另一种不同的实施方式中，原性细胞是未分化的精 原细胞。在又一种实施方式中，原性细胞是分化的精原细胞。或者，在另 一种单独的实施方式中，原性细胞可以是卵原细胞。
在本发明的另一种实施方式中，HSC包含：使用电融合与原性细胞融 合的摘除了细胞核的成年干细胞。可选地，在不同的实施方式中，HSC包 含通过基于病毒的融合方法与原性细胞融合的摘除了细胞核的成年干细 胞。或者，HSC包含使用化学融合与原性细胞融合的摘除了细胞核的成年 干细胞。此外，HSC可选地包含使用基于机械的融合与原性细胞融合的摘 除了细胞核的成年干细胞。
本发明的另一种实施方式提供了一种方法，用于制备经过修饰的生殖 细胞，所述方法包括：(a)从第一供体动物获得成年干细胞；(b)从与 第一供体动物相同物种的第二供体动物获得原性细胞(PSC)；(c)摘除 成年干细胞的细胞核；以及(d)将摘除了细胞核的成年干细胞与PSC融 合。
在本发明的一种不同实施方式中，治疗组合物包含摘除了细胞核的成 年干细胞，所述成年干细胞具有来自原性细胞或胚胎干细胞的细胞核。可 选地，在另一种实施方式中，治疗组合物被用于再生需要其的动物的有疾 病的或受损伤的组织。在一种不同的实施方式中，由治疗组合物再生的组 织是心脏组织。在另一种实施方式中，治疗组合物再生肺、肝、神经、肾 或身体肌肉组织。
在另一种实施方式中，融合的细胞包含摘除了细胞核的成年干细胞和 与所述摘除了细胞核的成年干细胞融合的原性细胞或胚胎干细胞。在一种 不同的实施方式中，原性细胞与摘除了细胞核的成年干细胞融合。可选 地，在另一种实施方式中，胚胎干细胞与摘除了细胞核的成年干细胞融 合。
本发明的其它实施方式包括：一种HSC，其中，摘除了细胞核的成年 干细胞和原性细胞来自同一物种的不同个体。
或者，HSC中，摘除了细胞核的成年干细胞和原性细胞来自同一个 体。
此外，本发明的HSC包括下述细胞，其中包含来自同一个体的摘除了 细胞核的成年干细胞和胚胎干细胞。
特定术语的定义
本文中使用的术语“原性细胞”指：二倍体生殖细胞和/或精原细胞和 卵原细胞。
本文中使用的术语“精原细胞”指，产生初级精祖细胞的原始雄性细 胞。
本文中使用的术语“卵原细胞”指用作为卵子来源的原始雌性细胞。
本文中使用的术语“卵子”是雌性配子，单倍体未受精的卵，其被精 子受精时能发育为新的动物。
本文中使用的术语“卵母细胞”指卵子发生过程中的发育中的卵细 胞，经历减数分裂时形成卵子。
本文中使用的术语“干细胞”描述了一种细胞，其能再生，并且还能 产生祖细胞，所述祖细胞最终将产生发育上被限制为特定系代(lineage) 的细胞。
本文中使用的术语“生物反应器”指一种专门的腔，用于在体外培 养、扩展、保持、维持细胞和使细胞成熟。
本文中使用的术语“杂交干细胞”指，用摘除了细胞核的成年干细胞 制造的干细胞，所述摘除了细胞核的成年干细胞具有从原生殖细胞或胚胎 干细胞移植来的细胞核。读者应当注意，通常使用缩写“HSC”来表示造 血干细胞。但是在本文中“HSC”是杂交干细胞的缩写。
发明详述
下述描述不作限制用，其仅用于阐述本发明一般性原理。本详述的章 节标题和总体概括仅用于方便的目的，而不欲限制本发明。
本文中使用的术语“杂交干细胞”描述了下述细胞，其中包含摘除了 细胞核的成年干细胞，所述成年干细胞具有来自原性细胞或胚胎干细胞的 细胞核。
被描述于此的本发明涉及对杂交干细胞(HSC)组合物的制备及其用 途。HSC组合物通常是通过下述方法制备的：向摘除了细胞核的成年干细 胞提供具有供体生殖细胞或干细胞的细胞核。HSC具有来自成年干细胞的 表面抗原和受体，但是具有来自发育上更年轻的细胞的细胞核。结果，本 发明的杂交干细胞是细胞因子、趋化因子和其它细胞信号试剂能接受的， 但具有不含衰老相关损伤的细胞核。衰老相关的损伤包括但不限于核酸自 由基损伤和端粒变短。
根据本发明的教导制造的HSC可用于广泛的治疗应用。例如但不作限 制用，本发明的HSC可用于补充下述动物中的干细胞，所述动物的天然干 细胞由于衰老或切除手术(例如癌症放疗和化疗)已损耗。在另一种非限 制性的例子中，本发明的HSC可用于器官再生和组织修复。在本发明的一 种实施方式中，HSC可用于恢复受损的肌肉组织，包括营养不良的肌肉以 及萎缩事件(例如心肌梗塞)损伤的肌肉。在本发明的另一种实施方式 中，本文公开的HSC组合物可被用于改善动物中创伤或手术后的伤痕。在 该实施方式中，本发明的HSC被全身性施予，优选通过静脉方式，并迁移 到新鲜受伤的组织，所述组织由受损细胞分泌的循环细胞因子给养。
在一种实施方式中，本发明的HSC利用下述成年干细胞，所述成年干 细胞被摘除了细胞核，然后与胚胎干细胞或原性细胞融合。在一种实施方 式中，摘除了细胞核的成年干细胞与原性细胞融合。摘除了细胞核的成年 干细胞和原性细胞可以来自相同或不同的动物。得到的HSC可由任何动物 或动物组合制得，并被转到其它任何动物中，优选地，HSC在出生后动物 中具有生物活性。
在本发明的一种实施方式中，原性细胞是精原细胞。原性细胞可以是 未分化的精原细胞或分化的精原细胞。或者，在本发明的一种不同的实施 方式中，原性细胞是卵原细胞。
摘除了细胞核的成年干细胞可通过本领域技术人员已知的多种方法与 原性细胞融合。例如，此类融合方法包括但不限于，电融合；基于病毒的 融合方法；化学融合；以及基于机械的融合。上述方法是本领域技术人员 公知的。因此，无需提供对这些已知方法的描述。此外，将摘除了细胞核 的成年干细胞与原性细胞融合不限于上面列出的方法。对于本领域技术人 员而言，使用其它融合方法获得同样的结果是显而易见的。
或者，在本发明的不同实施方式中，HSC可以包含与胚胎干细胞融合 的摘除了细胞核的成年干细胞。对该特定的实施方式而言，可利用上面列 出的同样的融合方法来获得HSC。此外，融合技术不限于上面提到的那些 方法。
摘除细胞核和成核(nucleation)的其它方法也包括在本发明的范围 内，包括，使用显微外科技术去核和重新成核的机械方法。虽然我们认为 细胞融合技术可以提供HSC的最具有生物活性的形式，但是，共同未决的 美国专利申请10/346,816号(’816申请)中教导的技术和方法也可用于本 发明。’816申请的全部内容通过引用并入本文。
根据本发明的教导制造的HSC可以是全能的、多能的、专能的或双能 的。HSC可形成至少一种类型的组织，更特别地，HSC能形成至少多于一 种类型的组织。一旦建立起了HSC，可以通过本文所述的多种方法来对其 进行操作，以产生想要的特征。例如，杂交干细胞可被被扩展并保持于特 定培养基中。
HSC的制备物可从同一物种获得，或者它们可来自不同物种。HSC的 转移可进入到相同物种的宿主或不同物种的宿主。
或者，引物(primed)HSC可被用于获得用于治疗异常症状和组织修 复的疗法的细胞。
在本发明的另一种实施方式中，治疗组合物包含摘除了细胞核的成年 干细胞，所述成年干细胞具有来自原性细胞或胚胎干细胞的细胞核。治疗 组合物可用于再生需要其的动物的、有疾病的或受损伤的组织。有疾病的 或受损伤的组织可以包括下述组织：例如，心脏组织、肺组织和其它身体 组织。
实施例
本文没有描述的所有细胞类型和其它材料是通过可获得的来源和/或通 过本领域中使用的标准方法获得的。
除非另有指明，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所 属领域的技术人员通常所理解的一样的含义。
本文中提到的所有公开文献都通过引用被并入本文，以描述和公开： 与引用这些参考文献的目的相关的特定信息，它们不被解释为承认通过在 先的发明使本发明预见了这样的公开内容。
在本说明书中，所展示的优选实施方式和实施例应被认为是示例性 的，而非对本发明的限制。
实施例1  分离原性细胞(PSC)
对哺乳动物或动物进行麻醉，取出性腺，横切。在显微镜扶助下分离 初级性细胞(PSC)。或者，还可使用对性腺的活组织打孔，在显微镜辅 助下分离PSC。在显微镜下，PSC具有干细胞的形态(即，大、圆、光 滑)，是从性腺中机械取回的。特别地，从性腺中取回精原细胞和卵原细 胞。特别地，取回A型和B型精原细胞。
为获得(多个)卵子，令动物排卵过度，取回至少一个卵子，将其放 置于营养培养基上使其存活。使用微量移液管将卵子固定在合适的位置， 使用另一支微量移液管进入卵子，直到尖端邻近卵子的细胞核。摘除卵子 的细胞核可以通过向微量移液管施加小量真空来进行。弃去卵子(ln)细 胞核。可用PSC(即，精原细胞和/或卵原细胞)来重复进行(上述)摘除 细胞核的方法，不同之处在于此时保留细胞核，弃去胞质溶胶。
摘除细胞核和成核的其它方法也包括在本发明的范围内，包括其它机 械方法以及利用电刺激的方法。
实施例2  分离和纯化A型精原细胞
下文是用于分离和纯化A型精原细胞的说明性实施例。在第1步中， 从6天大的供体小鼠(n＝8)取出睾丸，将其放置到具有灭菌磷酸缓冲盐 水(PBS)(含有10％青霉素-链霉素)的皮氏培养皿中。
接着，在第2步，在解剖显微镜下对睾丸去膜，收集、汇合生精索 (seminiferous cord)/小管，将其放到含有下述溶液的圆锥离心管中，所 述溶液为：Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM；Specialty Media)中的2 mg/ml胶原酶(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)和10μg/ml Dnase I (Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的溶液。
在第3步，离心之后的内容物于37℃在摇床上培养30分钟，其间伴 随偶尔的轻柔吹吸(pipetting)，以将间质Leydig细胞与生精小管分开。
在第4步，培养之后，令生精小管下沉到试管底部，移出含有Leydig 细胞的上清液。
在第5步，重复一次消化和下沉步骤。
在第6步，用DMEM对生精小管洗两次，用2mg/ml胶原酶、10 μg/ml Dnase I和1mg/ml II型透明质酸酶(Sigma Chemicals，St.Louis， MO)在振荡水浴中于37℃进行20-30的分钟的进一步消化，直到小管周 围细胞(peritubular cells)与生精小管分离。
在第7步，令生精小管下沉，弃去含有小管周围细胞的上清液。
在第8步，通过向沉淀中加入1ml含有2mg/ml胶原酶、10μg/ml Dnase I和1mg/ml III型透明质酸酶的DMEM来进行第四次消化，直到获 得单一的细胞悬浮液。这次消化产生了含有Sertoli细胞和A型精原细胞的 细胞悬浮液。
在第9步，用DMEM对细胞洗两次，经80μm的尼龙筛(Tetko)过 滤。
在第10步，为使A型精原细胞与Sertoli细胞分离，用识别c-kit受体 胞外域的大鼠抗小鼠抗体(克隆2B8；Pharmigen)的1∶200稀释液对细 胞混合物进行1小时的培养。为分离来自成年动物的A型精原细胞，推荐 使用识别同嗜性粘着分子，Ep-CAM的大鼠抗小鼠抗体(克隆G8.8， Develomental Studies Hybridoma Bank，University of Iowa，Iowa City，Ia； Anderson et al，1999)的1∶200稀释液。
在第11步，在Orbitron旋转仪(Boekel Scientific)上对细胞进行30 分钟的培养。然后对细胞悬浮液加以离心，去除上清液，然后用DMEM 对沉淀洗两次，以去除任何过量的抗体。
在第12步，将细胞重新悬浮于4ml培养基中。然后，用涂布有绵羊 抗大鼠免疫球蛋白G(Dynabeads；Dynal)的M-450磁性珠粒与细胞悬浮 液按照4粒珠粒/目标细胞的比例混合，混合在34℃于摇床上进行1小 时。用施加到离心管壁的磁体从悬浮液中获取c-kit阳性细胞。c-kit阳性细 胞(A型精原细胞)粘到壁上。收集A型精原细胞，将其重新悬浮于5ml 的培养基中。
实施例3  分离和纯化成年干细胞
下文是针对分离和纯化成年动物干细胞，特别地，专能成年祖细胞 (MAPC’S)的过程的说明性实施例。首先，在第1步中，从5-8周龄的 供体取股骨和胫骨，将其放置于冰上的HBSS+(Gibco-BRL 14170161) /2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES缓冲液(Gibco-BRL 15630080)中。 骨头应不含肌肉和脂肪组织。在冲洗之前将骨头切开，以消除BMC的损 失。此外，所有时间都将骨头保持于冰上，直到进行操作。
接着，在第2步，使用3cc注射器(装有HBSS+(Gibco-BRL 14170161)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES缓冲液(Gibco-BRL 15630080))，用22号针头来冲洗胫骨和股骨。(取决于所用供体的数 量，冲洗骨头时，最好试着不用超过15ml的HBSS+，从而使全部样品可 装入一支15ml的圆锥管)。用18号针头和3cc注射器，通过上下冲洗悬 浮液，重新悬浮BMC。以足够大的力度来冲洗悬浮液，使得团块分开， 但力度不要大到令细胞受损。所有可能的时候都将样品和培养基放在冰 上。
在第3步，通过Ficoll-Hypaque分离来收集骨髓单核细胞 (BMMNC)。
在第4步，将BMMNC以1×105/cm2涂开于涂布有10μg/ml纤连蛋白 (FN；Sigma Chemicals，St.Louis，MO)的培养皿上。
在第5步，制造MAPC培养基，其由下述成分构成：60％DMEM-LG (Gibco，BRL)，40％MCDB-201(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)， 其中具有1X胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)，1X亚油酸-牛血清清蛋白 (LA-BSA)，10-9M地塞米松(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，10-4 M2-磷酸抗坏血酸酯(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)，100个单位的青 霉素，1000个单位的链霉素(Gibco BRL)，具有2％胎牛血清(FCS； Hyclone Laboratories)，含有10ng/mL hPDGF-BB(R&D Systems)、10 ng/mL mEGF(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)以及1000个单位/mL的 mLIF(Chemicon)。
在第6步，将BMMNC培养物保持为5×103/cm2，3-4周后，使用微 磁珠分离器(Miltenyi Biotec)收获细胞，除去CD45+/Terr119+细胞。
在第7步，将CD45-/Terr119-(～20％)以10个细胞/孔放置于FN(10 ng/mL)处理过的96孔板，按照0.5-1.5×103/cm2的密度涂开。大约1％的 孔产生持续生长的MAPC培养物。
最后，在第8步，MAPC可通过CD3、Gr-1、Mac-1、CD19、 CD34、CD44、CD45、cKit和主要组织相容性复合体(MHC)组I和组II 的阴性来表征。
实施例4  对成年干细胞进行细胞核摘除
下文是针对摘除成年干细胞细胞核的说明性实施例。首先，在第1 步，在适合的生长需求和培养基下，将按照上文实施例3所述分离的成年 干细胞培养至大约1×106的满盘度(confluency)。
接着，在第2步，为摘除细胞核，对细胞进行胰蛋白酶处理，将其重 新悬浮于预热过的培养基中(37℃)，培养基中含有浓度为10μg/ml的细 胞松弛素B。
在第3步，于37℃以8,500 rpm对细胞悬浮液进行30分钟的离心。
离心之后，在第4步，移开核质沉淀，用培养基洗一次胞质。
在最后的第5步，用荧光DNA染料Hoechst 33528(Sigma Chemicals， St.Louis，MO)对胞质进行染色，以检验摘除细胞核的效率。
实施例5  对摘除了细胞核的成年干细胞进行Hoechst 33528染色
下文是针对对摘除了细胞核的成年干细胞进行Hoechst 33528染色的 说明性实施例。首先，在第1步，摘除细胞核后，立即将成年干细胞放置 于预热至37℃的培养基中。
在本方法的第2步，向培养基中加入Hoechst 33528，至终浓度为5 μg/ml。
接着，在第3步，对细胞进行很好的混合，将其在37℃水浴中精确 培养90分钟，其中，每几分钟混合一下细胞。
在第4步，90分钟的培养期后，在300xg于4℃进行3分钟离心， 使细胞离心下来，将沉淀重新悬浮于预冷的(4℃)HBSS(Gibco-BRL 14170161)/2％FBS(Hyclone)/10mM HEPES缓冲液(Gibco-BRL 15630080)中。
在第5步，将染色的细胞保持于4℃，以使Hoechst染料从FACS细 胞的渗漏最小化，并且测定较之未用细胞松弛素B处理的对照细胞的百分 比细胞核摘除率。用UV激光在350nm处激发Hoechst染料，用450/20 BP滤光器(Hoechst Blue)和675 EFLP光学滤光器(Hoechst Red)来测 量其荧光。
实施例6  制造HSC
在含有营养培养基的培养皿中，使用微量移液管将摘除了细胞核的卵 子保持在合适的位置，使用另一支微量移液管将来自供体细胞(干细胞的 原性细胞)插入到摘除了细胞核的成年干细胞中，以形成本发明的HSC。
使用组织培养领域普通技术人员公知的技术，可将摘除了细胞核的或 成核的干细胞和/或细胞核供体细胞和HSC保持为冷藏状态。在稍后解冻 并使用这样贮存的细胞。
使细胞重新核化的其它方法，包括细胞融合方法，全都包括在本发明 的范围内。
实施例6  HSC扩展：生物反应器腔
在本发明的一种实施方式中，使用传统的生物反应器来进行HSC扩 展。例如，提供具有至少一个腔的生物反应器，优选地，至少两个腔。腔 被用于培养、扩展、保持、维持和分化本发明的HSC。所述的腔可被限制 为一个，但是，优选地，至少两个腔。所述腔由二氧化硅或玻璃构成。但 是，用于构造类似生物腔的其它材料也可使用。
通过管道使腔互相连接，再进一步通过管道与多种辅助系统连接，包 括蠕动泵微型充氧器(micro-oxygenator)、CO2储备容器和分子筛过滤 器。管道由氯丁橡胶或用于生物系统中的其它类似制备材料构成。管道可 以具有不同的直径，从1/8英寸到1/3英寸。但是，对于类似用途而言， 更小或更大直径的管道是可能的。不同尺寸的管道适应不同大小的腔装 置。管道允许管道中的流体培养基在腔之间流动，所述培养基包含营养物 质，由此包含大分子和小分子。营养物质的流由两个蠕动泵驱动，或者， 由具有多个头的至少一个泵驱动。每个蠕动泵或多头式蠕动泵的每个头驱 动一个方向上的流体流动。但是，使用至少两个泵，允许进出腔的双向流 体流动。
此外，pH传感器和pH计被用于控制酸/碱平衡。ph传感器先与ph计 相连，ph计进而浸到腔中培养基的表面以下。pH传感器探测腔中培养基 中pH的升降，并将向pH计传递刺激。pH计依次含有与CO2阀连接的 线，该阀进一步连接腔上的装置。例如，当腔中培养基中pH低的时候， 刺激回到pH计，开启(多个)CO2阀，由此令CO2从CO2储备容器流入 腔中。
辅助系统包括通过CO2阀提供CO2的CO2储备容器。此外，还使用微 型充氧器(Aqua Pro)和泵。类似CO2储备容器，微型充氧器通过阀门和 管道被连接。来自管道的流体流经微型充氧器，被向空间注入氧气的进口 和侧端口充氧；由此使流体充满气体，提高细胞存活率。
此外还有分子透析过滤器，其类似于微型充氧器和附件，流体流经该 过滤器，特定大小的分子受到限制，例如，至少大约60kDa的分子被限制 离开流体。透析过滤器在逆流系统和单向流系统上工作。
此外，高纯水(即，去离子的、UV处理的和经微滤的)被用于维持 系统中的恰当水含量。可通过任何可获得的灭菌方式将高纯水加入到腔中 的培养基中。
用于腔中的培养基是适合用于支持初级细胞生长的任何标准细胞培养 基。例如，作为细胞生物学和细胞培养技术领域普通技术人员已知的、包 含至少M15：高葡萄糖DMEM、大约15-20％胎牛血清(FBS)、1X 1-谷氨 酰胺、1X青霉素/链霉素、1X非必要氨基酸和其它生长因子的营养培养 基。
实施例7  针对表面受体表达筛选HSC
按照下文所述，针对表面受体和抗原表达来筛选本发明的HSC。适当 的扩展时间段过去后，从生物反应器移出细胞。合适的扩展时间段被定义 为至少一次细胞群倍增(population doubling)。
荧光共振能量转移(FRET)和生物发光共振能量转移(BRET)是基 于共振能量转移(RET)的技术。已有报道，能量转移效率高度依赖于供 体和受体部分之间的距离以及它们相互之间的相对定位。在大多数基于 RET的试验中，供体和受体之间典型的有效距离为10至100埃，该范围 与大多数生物相互作用相关(BRET；Packard BioScience，BioSignal Packard Inc.，Meriden，CT)。使用BRET和FRET技术，针对受体的一定数量以及 它们在细胞上的位置筛选HSC。使用BRET和FRET的可视鉴定可在大屏 幕或监视器上看到。这些投影系统是本领域内标准的。
或者，其它针对受体位点进行筛选的方法也包括在本发明内，虽然本 文中没有描述。
最后，HSC将发育出在成熟干细胞上观察到的全部，或接近全部，或 大多数受体位点。
实施例8  转入需要的受体
如前文所讨论的，本发明的HSC有大量的用途。例如，遭受萎缩事件 (例如心肌梗塞)影响的患者具有不再存活的心肌膜(myocardium)区 域。受损的心肌膜最终替代死亡的心肌细胞，所述心肌膜具有带纤维的受 惊组织，其不仅缺乏收缩功能，并且还会抵抗收缩。结果，患者心脏变得 越来越没用，丧失了其将足够质量的血液泵向身体组织的能力。最终，发 生充血性心力衰竭，患者死亡。近来，细胞治疗技术已被用于治疗充血性 心力衰竭，这是通过将造血干细胞、骨骼成肌细胞(见，例如，美国专利 号[USPN]6,579,523和6,682,730，其整体内容通过引用并入本文，特别是 两篇专利的第14栏，第7行至第18栏第45行)和间质干细胞(见，例如 USPN 6,387,639，其整体内容通过引用并入本文，特别是实施例1)直接 注射进受损心肌膜或其附近来实现的。适合将本发明的HSC提供给需要其 的心脏的方法包括：为了穿刺进心脏腔特别设计，或改造的经皮导管，例 如，USPN 6,544,230(其整体内容通过引用并入本文)中公开的那些等。
在一种实施方式中，本发明的HSC被用于恢复或提高心肌膜受损区域 的收缩功能。可使用注射导管，通过直接注射将按照本发明的教导制造的 HSC施予心肌膜，或者可施予一条或多条冠状动脉，令其迁移到受损组 织。在另一种实施方式中，HSC被施予到冠状动脉的外膜组织。
在本发明的另一种实施方式中，在体内将HSC全身性地注射进宿主的 循环系统。在该实施方式中，HSC迁移到受损组织的区域，例如，肝、肺 和脑。此外，可在创伤和手术之后全身性地施予本发明的HSC。本发明的 有新生能力的HSC将导致迅速康复和最小的疤痕。
再次说明，本说明书描述了本发明的特定实施方式，本领域普通技术 人员可以在不偏离本发明思想下设计出本发明的变化。