[0001] 相关申请案的交叉引用

[0002] 本申请案主张2011年1月3日申请的美国临时专利申请案第61/429,409号、2011年1月10日申请的美国临时专利申请案第61/431,376号的优先权。所有前述申请案均以全文引用的方式并入本文中。

[0003] 目前存在许多在治疗学上用于治疗许多疾病的重组多肽和蛋白质。这些重组多肽和蛋白质在商业上都是使用原代连续非人类或人类二倍体细胞系制造的。举例来说，一些是使用细菌（如大肠杆菌（E.Coli））制造的，而其它的是使用酵母或动物来源的多种卵巢细胞系制造的。细菌不能被使用来制造一些多肽和蛋白质，尤其在糖基化模式和其它蛋白质修饰对生物制品的生物受体结合亲和力、生物活性、生物分布或药物动力学或对接受者免疫识别至关重要时。当糖基化是关键可变因素时，中国仓鼠卵巢细胞是当前生物制造最常用的细胞系之一。

[0004] 不幸的是，需要长时间使用重组多肽或蛋白质或用于长期治疗会使得患者产生针对所述产品的中和抗体，从而使得患者对所述药物的反应较小或没有反应。在一些情况下，患者可以改用同一类别的另一种药物，如多种抗-TNF生物制品，如恩博（Enbrel），也称为依那西普（Etanercept）；瑞米凯德（Remicaide），也称为英利昔单抗（Infliximab）；赛妥珠单抗（Certolizumab）；以及修美乐（Humira），也称为D2E7，它们常规地用于治疗如类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎以及克罗恩氏病（Crohn′s disease）的疾病。然而，产生针对一种特定抗-TNF生物制品的中和抗体通常使患者倾向于最终产生针对另一种抗-TNF生物产品的中和抗体。在一些情况下，对于患者不存在替代疗法，因此这种中和抗体形成会使得患者没有治疗可选择。即便是在存在适当的治疗选择时，产生针对同一类别的其它药物的中和抗体的倾向最终也意味着这些患者可能会没有治疗可选择。

[0005] 可以被人类抗体中和的其它生物产品包括：那他珠单抗（Natalizumab）或泰萨布里（Tysabri），一种用于多发性硬化的创新疗法；和狄诺塞麦（Denosumab），一种针对核因子κ-B受体活化因子配体（RANKL）的完全人单克隆抗体，被批准用于治疗骨质疏松症和化学疗法诱发的骨裂，并且可能用于治疗由HRT和激素类避孕药引起的乳癌。阿巴西普（Abatecept）是一种被批准用于已变得用抗-TNF疗法难治愈的类风湿性关节炎患者的CTLA-4融合蛋白。尽管它的使用太新而没有关于阿巴西普诱导的中和抗体的证据，但也有可能的是它可以诱导人抗体中和抗体反应。

[0006] 除基于抗体和融合蛋白的药物之外的其它多肽和蛋白质也已显示在长期治疗的情况下会引发免疫反应。举例来说，重组人类红细胞生成素引发中和抗体形成从而降低它的功效并且会引起罕见的发育不全综合症。另外，对于血友病患者来说针对凝血因子疗法的抗体的产生率在所述患者中高达25%-30%。这是使用凝血因子情况下的普遍问题。针对癌症和乙型肝炎的重组干扰素α2a疗法也因产生针对所述疗法的中和抗体而受阻。针对身高矮小的儿童的长期生长激素疗法的难治愈性也成问题。亦有关于针对一些胰岛素产品的中和抗体形成的报道。

[0007] 有可能引发中和抗体的其它生物药物包括全血、血清、血浆混合液或生物供应品的其它主要来源，例如，人类白蛋白、人类α1-蛋白酶抑制剂、人类抗血友病因子/血管性血友病因子（von Willebrand Factor）复合物、贝比贝歌（BabyBig）静脉内肉毒中毒免疫球蛋白、C1酯酶抑制剂、纤维蛋白封闭剂（fibrin sealant）、纤维蛋白原、静脉内免疫球蛋白、皮下免疫球蛋白、蛋白质C浓缩物、ρ(D)静脉内免疫球蛋白、凝血酶、血管性血友病因子/凝血因子VIII复合物。

[0008] 重组多肽和蛋白质引发基于多种特征的免疫反应和中和抗体产生，所述特征包括：生物治疗的时间范围、重复疗法的时间间隔、生物制品的氨基酸组成以及对生物制品的修饰，如糖基化、甲基化、亚硝基化、唾液酸化、磷酸化、硫酸化、异戊烯化、硒化、泛素化、维生素依赖性修饰、蛋白质结合缔合、酰化、糖化、三维构型以及超螺旋化。因此，需要在用生物产品处理的动物中产生具有降低的抗原性水平的多肽蛋白质产物的方法。

[0009] 本文中所引用的所有参考文献的教示以全文引用的方式并入本文中。发明内容

[0010] 本发明通过提供用以通过转染或转化合成产生的多能干细胞（spPSC）或内源性多能干细胞（ePSC）产生生物制品（如多肽或蛋白质、核酸、病毒以及疫苗）的方法来满足这一需要。这些细胞衍生自被处理的物种，并且用表达所需生物制品并且诱导该生物产品被经转染或转化的spPSC或ePSC表达的载体转染。

[0011] 本发明进一步提供一种产生重组多肽或蛋白质的方法，包含自成年细胞产生spPSC或分离动物的ePSC，并且在所述多肽或蛋白质被所述干细胞表达的条件下用编码所述多肽或蛋白质的核酸转染或转化所述spPSC或ePSC。

[0012] 在本发明的一替代实施例中，来自与被施予重组多肽或蛋白质的个体相同的族群的细胞产生spPSC或分离ePSC。不同族群从一个群组到另一个群组可能具有不同糖基化模式和不同多形性。族群是具有相同血型或组织类型的那些群。因此，根据本发明，自spPSC或ePSC产生重组多肽和蛋白质，其中所述ePSC或spPSC是由来自与被施予多肽或蛋白质的个体相同的族群分离的细胞所产生。个体将被施予由spPSC或ePSC产生的重组多肽或蛋白质，其中由来自属于所述个体所属的族群的细胞制造spPSC或分离ePSC。

[0013] 本发明进一步提供一种向个别动物施予多肽或蛋白质的方法，包含自所述动物的所述细胞产生spPSC（如诱导性多能干细胞（iPSC））或分离ePSC，并且在所述多肽或蛋白质被所述多能干细胞表达的条件下用编码所述多肽或蛋白质的核酸转染或转化所述spPSC或ePSC，自所述诱导性多能干细胞分离所述多肽或蛋白质，并且向所述个体施予所述被分离的多肽或蛋白质。

[0014] 本发明提供一种用于个人化产生多肽或蛋白质治疗剂从而使得spPSC或ePSC在商业上可行并且有用的方法。本发明涉及如何制备患者特异性spPSC或ePSC以制造患者特异性多肽或蛋白质从而克服在长期使用多肽或蛋白质的情况下通常发生的中和抗体形成问题的方法。患者可以是任何动物，优选地为哺乳动物并且更优选地为人类。本发明还提供一种用于产生核酸或病毒的方法，包含在产生所需核酸或病毒的条件下用载体转染或转化spPSC或ePSC。

[0015] 此外，本发明提供衍生患者特异性和器官或细胞类型特异性细胞系用于产生用于治疗性用途的密切匹配的翻译后修饰的生物制品的方法。患者特异性干细胞可以使用SCNT、诱导性重编程、单性生殖或ANT-OAR重编程方法来衍生或它们可以自目标患者分离。由此衍生或分离的多能干细胞可以使用标准分子生物技术程序来进行基因修饰，以表达所关注的治疗剂，例如使用插入型或游离型表达载体或同源重组方法。基因修饰的细胞系可以在培养物中扩增，并且建库用于将基于所产生的生物制品的储藏寿命来进行时间安排的周期性生物制造操作（实例2）。或者，所衍生的患者特异性干细胞系可以在培养物中向通常对所需治疗性蛋白质表达最高水平的细胞类型分化并接着用于生物制造。分化可以针对各制造操作来进行或可以大规模进行并且将分化的患者特异性细胞系建库以用于基于所产生的治疗剂的储藏寿命的后续制造操作（实例3）。

[0016] 另外，由于已知糖基化模式和其它翻译后修饰在不同组织和细胞类型之间不同，所以可以由自内源性表达生物制品的器官或细胞类型分离的成年细胞或体细胞制备患者特异性干细胞系。作为实例，可以接着应用SCNT、PGA、ANT-OAR或重编程技术来衍生多能细胞系以便进行生物制造。由此衍生或分离的多能干细胞可以使用标准分子生物技术程序来基因修饰以表达所关注的治疗剂。基因修饰的细胞系可以在培养物中扩增，并且建库用于将基于所产生的生物制品的储藏寿命来进行时间安排的周期性生物制造操作（参见实例4）。进一步利用重编程细胞（iPS细胞）的‘记忆’性质，患者和组织或细胞类型特异性iPS细胞可以被诱导以分化回它们的原始细胞类型以更充分地形成能够进行内源性翻译后修饰的细胞系。iPS细胞可以在向原始的被分离的细胞类型再分化之前或在向原始细胞类型再分化之后进行基因修饰以表达所关注的治疗剂（参见实例5）。

[0017] 举例来说，生长激素通常由垂体前叶中的促生长细胞最高量产生，并且另外在胎盘（滋养层）和舌头以及外阴或肛门皮肤内的细胞中高度表达。根据人类蛋白质表达图谱（Human Protein Atlas），因子VIII蛋白质表达在肾小管细胞中较高，并且由多种组织和细胞类型适度表达。抗体通常由B细胞产生，B细胞在脾脏和其它淋巴器官的生发中心成熟。具有高抗体依赖性细胞介导细胞毒性（ADCC）水平的抗体的治疗性产生通过GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（GMD）的含量来测定，所述GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶可以将N-乙酰葡萄糖胺（GlcNac）放在制造细胞系中所存在的IgGl亚型抗体的二等分位置（生物化学杂志（J Biol Chem.）,第273卷,第14582-14587页,1998和生物医学中心生物技术学刊（BMC Biotechnol）,7:84-97(2007)）。使用制造CHO的细胞系产生具有高ADCC活性的抗体并不总是最佳的（生物化学杂志278:3466-3473,2003）。本发明提供新颖哺乳动物细胞系以便获得所制造的抗体、融合蛋白以及细胞毒性生物制品的最佳ADCC活性。

[0018] 已知与高生物制造水平相关的转录因子可以与所关注的基因共转染以优化患者特异性细胞系的表达水平。举例来说，高Pit-1表达水平可以引起一个细胞类型中的高促乳素表达，同时阻断或阻止生长激素表达（基因与发育（Genes Dev）,3:946-958 1989）。

[0019] 单克隆抗体产生可以通过使用如由中华人民共和国（Peoples Republic of China）义翘神州生物技术有限公司（Sino Biological Inc）研发的那些系统、形态发生（morphogenics）（美国国家科学院院刊（Proc Natl Acad Sci）,103:3557-3562,2006）或其它标准生物技术方法来优化基因密码子而增强。

[0020] 合成产生的多能干细胞的产生

[0021] 任何类型的合成产生的多能干细胞都可以用于产生本发明的个人化生物制品。两个主要类别是诱导性或重编程多能干细胞（iPSC）以及通过核转移（SCNT）、ANT-OAR以及单性生殖产生的干细胞。

[0022] 体细胞核转移（SCNT）是一种无核卵被注入成年体细胞的核并且植入到准备好的接受者子宫内，所引起的活产得到完整核基因克隆的技术。另外，已经由SCNT方法在培养物中衍生出多能干细胞（细胞重编程（Cell Reprogram）12:105-113,2010和基因组研究（Genome Res.）19:2193-2201,2009）。

[0023] 改变的核转移卵母细胞辅助的重编程（ANT-OAR）是一种与SCNT类似的技术，然而，供给者核在注射到接受者卵中之前在基因上被改变从而阻止ANT-卵母细胞分化并形成完整有机体（基因组研究19:2193-2201,2009）。

[0024] 单性生殖（PGA）也用于产生多能干细胞，它使用如无透明带核转移（zona-free nuclear transfer）、单性生殖活化的技术；并且克隆技术（如SCNT）和单性生殖（PGA）也已经被用于产生重编程多能干细胞（细胞重编程,12:105-113,2010和自然（Nature）,450:497-502 2007）。

[0025] 这些多能干细胞可以在培养物中维持略微长期的不定时间，从而使它们成为生物制造（如重组蛋白、DNA以及病毒）的潜在来源。

[0026] 诱导性或重编程spPSC

[0027] 诱导性多能干细胞在许多方面与天然多能干细胞（如胚胎干（ES）细胞）类似，如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、拟胚体形成、畸胎瘤形成、活嵌合体形成以及效能和可分化性。

[0028] 诱导性多能干细胞（通常缩写为iPS细胞或iPSC）是一类自非多能细胞（通常为成年体细胞）通过诱导特定基因的“被迫”表达而人工衍生的多能干细胞（自然报告干细胞（Nature Reports Stem Cells）2007）。

[0029] 诱导性多能干细胞（iPSC）是通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞中而产生。诱导性多能干细胞通常是通过将某些干细胞相关基因转染到如成年成纤维细胞的非多能细胞中而衍生。转染通常是通过病毒载体（如反转录病毒或反转录转座子）来实现。被转染的基因包括主转录调节子Oct-3/4（Pou5f1）和Sox2，不过已提出其它基因可增强诱导效率。3-4周后，少量被转染的细胞在形态上和生物化学上开始变得与多能干细胞类似，并且通常通过形态选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择来分离。

[0030] 胚胎干细胞衍生的成纤维细胞和成年成纤维细胞以及其它细胞已经通过以下方法重编程到多能状态：与胚胎干细胞融合（细胞（Cell.）126:652-655,2006和干细胞综述（Stem Cell Rev）,2:331-340,2006）、使用反转录病毒转染技术添加4种基因（细胞126:663-676,2006）、单一卡盒或双顺反子慢病毒转染方法（干细胞（Stem Cells.）,27:543-549,2009和干细胞,27:1042-1049,2009）以及多能性所需的转录因子的内源性刺激（干细胞,27:3053-3062,2009）。多能性的诱导也可以通过以下方法来实现：修改基因组的甲基化或聚腺苷酸化状态（科学公共图书馆·综合（PLoS One.）,4:e8419,2009）；微RNA（发育生物学（Dev Biol.）,344:16-25,2010）、所需转录因子的小分子活化因子、后生重编程（再生医学（Regen Med.）,2:795-816,2007）；基于蛋白质的重编程（血液（Blood）116:386-395,2010）；添加培养物中多能细胞的培养上清液或细胞提取物；化学或辐射或其它基因突变手段以再活化多能性基因；以及添加诱导或维持内源性多能状态的生长因子或细胞因子或细胞信号传导部分。

[0031] 使用反转录病毒来将细胞重编程到多能状态呈现出使基因疗法试验恢复免疫缺乏的危险。切除技术（如Cre-lox）已经被用于在成功重编程之后消除反转录病毒，并且佩吉拜克（piggyBac）转座子方法完全消除了对反转录病毒的需要（生物技术新见（Curr Opin Biotechnol）,20:516-521,2009）。

[0032] 已经通过使用四种关键基因（Oct3/4、Sox2、Klf4以及c-Myc）及反转录病毒系统将人类成纤维细胞转化成多能干细胞来产生人类iPSC。也已经使用OCT4、SOX2、NANOG以及不同的基因LIN28使用慢病毒系统产生人类iPSC。也已经使用腺病毒将必需的四种基因运输到小鼠的皮肤和肝脏细胞的DNA中，从而产生与胚胎干细胞一致的细胞（科学（Science）322(5903):945-949,2008）。成年细胞重编程为iPSC也可以在根本不存在任何病毒转染系统的情况下通过质体实现（科学322(5903):949-953,2008）。已经使用佩吉拜克转座子系统、微环技术、蛋白质刺激或条件培养基刺激的重编程来产生iPSC。

[0033] iPS细胞的产生关键取决于用于诱导的基因。Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员（Sox1、Sox2、Sox3以及Sox15）已经被鉴别为诱导过程中所涉及的关键转录调节子，它们不存在会使得诱导为不可能的。然而，已经鉴别包括Klf家族的某些成员（Klf1、Klf2、Klf4以及Klf5）、Myc家族的某些成员（C-myc、L-myc以及N-myc）、Nanog以及LIN28在内的其它基因会增加诱导效率。

[0034] ○Oct-3/4（Pou5f1）（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司（Bioclone,San Diego CA））（核酸研究（Nucleic Acids Res.）20(17):4613-20,1992）：Oct-3/4是八聚体（“Oct”）转录因子家族中的一员，并且在维持多能性中起关键作用。
+
Oct-3/4 细胞（如分裂球和胚胎干细胞）中不存在Oct-3/4会引起自发性滋养层分化，并且因此存在Oct-3/4会产生胚胎干细胞的多能性和分化潜能。“Oct”家族中的多种其它基因（包括Oct-3/4的密切相关物Oct1和Oct6）未能引发诱导，因此证实Oct-3/4对于诱导过程的排他性。

[0035] ○Sox家族：与Oct-3/4类似，Sox家族基因与维持多能性相关，不过它与专能和单能干细胞相关，这与Oct-3/4形成对比，后者只在多能干细胞中表达（发育生物学227(2):239-55,2000）。虽然Sox2（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）是用于诱导的起始基因（哺乳动物基因组（Mamm.Genome）5(10):640-642,1995），但已经发现Sox家族中的其它基因同样在诱导过程中起作用。Sox1（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）以与Sox2类似的效率产生iPS细胞，并且基因Sox3（人类cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）、Sox15以及Sox18也产生iPS细胞，不过效率降低。

[0036] ○Klf家族：Klf家族基因中的Klf4是用于产生小鼠iPS细胞的因子。Klf2（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）和Klf4（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）是能够产生iPS细胞的因子，并且相关基因Klf1（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）和Klf5（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）同样如此，不过效率降低。

[0037] ○Myc家族：Myc家族基因是癌症所涉及的原癌基因。C-myc（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）是小鼠iPS细胞产生所涉及的因子。然而，c-myc对于人类iPS细胞的产生可能是非必需的。使用“myc”家族基因来诱导iPS细胞对于iPS细胞作为临床疗法的可能性来说是有困难的，因为被移植有c-myc诱导的iPS细胞的小鼠中有25%形成致命性畸胎瘤。已经鉴别N-myc（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）和L-myc可代替c-myc以类似效率进行诱导。

[0038] ○Nanog：（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）在胚胎干细胞中，Nanog以及Oct-3/4和Sox2是促进多能性所必需的（细胞113(5):643-55,2003）。

[0039] ○LIN28：（cDNA，可购自加利福尼亚州圣地亚哥拜欧克隆公司）LIN28是在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中表达的与分化和增殖相关的mRNA结合蛋白（发育生物学258(2):432-42,2003）。

[0040] 合成产生的多能干细胞的身份

[0041] 所产生的spPSC在以下方面明显与天然分离的多能干细胞（如小鼠和人类胚胎干细胞（ESC），分别为mESC以及hESC）类似，因此针对天然分离的多能干细胞确认spPSC的身份、真实性以及多能性：

[0042] 细胞生物性质：

[0043] ○形态：iPSC在形态上与ESC类似。各细胞具有圆形形状、大核以及较少的细胞质。iPSC的群落也与ESC的群落类似。人类iPSC形成与hESC类似的边缘清晰、平坦、紧密堆积的群落并且小鼠iPSC形成与mESC类似的群落，与hESC的群落相比较不平坦且较多聚集的群落。

[0044] ○生长性质：倍增时间和有丝分裂活性是ESC的基础，因为干细胞如它们的定义的一部分必须自我更新。iPSC有丝分裂活跃，以与ESC相等的速率活跃地自我更新、增殖以及分裂。

[0045] ○干细胞标记物：iPSC表达在ESC上表达的相同细胞表面抗原标记物。人类iPSC表达对hESC具有特异性的标记物，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E以及Nanog。小鼠iPSC与mESC类似，表达SSEA-1但不表达SSEA-3与SSEA-4。

[0046] ○干细胞基因：iPSC表达在未分化的ESC中表达的基因，包括Oct-3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4以及hTERT。

[0047] ○端粒酶活性：端粒酶是维持细胞分裂不受约50次细胞分裂的海弗利克限制（Hayflick limit）而限制所必需的。hESC表达高端粒酶活性以维持自我更新和增殖，并且iPSC也展现高端粒酶活性并且表达hTERT（人类端粒酶逆转录酶），这是端粒酶蛋白质复合物中的一种必需组分。

[0048] 多能性：iPSC能够以与ESC类似的方式分化成完全分化的组织：

[0049] ○神经分化：iPSC可以分化成神经元，表达βIII-微管蛋白、酪氨酸羟化酶、AADC、DAT、ChAT、LMX1B以及MAP2。儿茶酚胺相关酶的存在可以指示iPSC（如hESC）可能可分化成多巴胺能神经元。干细胞相关基因在分化之后下调。

[0050] ○心脏分化：iPSC可以分化为自发地开始跳动的心肌细胞。心肌细胞表达TnTc、MEF2C、MYL2A、MYHCβ以及NKX2.5。干细胞相关基因在分化之后下调。

[0051] ○畸胎瘤形成：被注入免疫缺陷小鼠中的iPSC在九周后自发地形成畸胎瘤。畸胎瘤是含有衍生自三个胚层（内胚层、中胚层以及外胚层）的组织的多个谱系的肿瘤；这与通常仅具有一种细胞类型的其它肿瘤不同。畸胎瘤形成是针对多能性的标志性测试。

[0052] ○拟胚体：培养物中的hESC自发地形成称为“拟胚体”的球状胚胎样结构，其由有丝分裂活跃并且在分化的hESC的核心和自所有三个胚层完全分化的细胞的周边组成。iPSC也形成拟胚体并且具有周边的已分化细胞。

[0053] ○四倍体互补：被注入四倍体囊胚（其本身只可以形成胚胎外组织）的来自小鼠胎儿成纤维细胞的iPS细胞可以形成完整非嵌合的能繁殖小鼠，不过成功率较低。四倍体互补分析是一种生物学技术，其中两个哺乳动物胚胎的细胞组合以形成新的胚胎。它被用于构建基因修饰的有机体，以研究胚胎发育中某些突变的后果，并且用于多能干细胞的研究中。

[0054] 已自消化道肠系膜细胞（细胞重编程,12:237-247,2010）、视网膜着色上皮细胞（干细胞（Stem Cells.）,28:1981-1991,2010）、羊膜细胞（分化（Differentiation.）,80:123-129,2010）、成纤维细胞（可视化实验杂志（J Vis Exp.）,8:1553,2009）、成年神经细胞（自然,第454卷,第646-650页,2008）、牙髓（牙科研究杂志（J Dent Res）,第89卷,第
773-778页,2010）、脂肪细胞（细胞移植（Cell Transplant.）,19:525-536,2010）、卵巢（生殖与发育杂志（J Reprod Dev.）,56:481-494,2010）以及来自胚胎、胎儿以及成体来源的许多其它细胞产生诱导性多能干细胞（iPS）。理论上可以自任何细胞类型产生iPS细胞，不过尚未系统地研究人体中所有220种细胞类型。若干近期研究已证实iPS细胞保留关于它们的原始细胞类型的‘记忆’。这体现为在培养物中iPS细胞优先（有时自发地、最容易地）向它们的原始细胞类型再分化。

[0055] 内源性干细胞的分离

[0056] 干细胞（包括内源性多能干细胞（ePSC））可以通过在它们的表面上表达的特异性抗原来表征和分离。多能干细胞可以通过阶段特异性胚胎抗原（SSEA）、转录因子Oct4和Nanog以及其它标记物的表达以及其它方法来表征。迄今为止已分离的主要类型的内源性多能干细胞是非常小的胚胎样（VSEL）干细胞。

[0057] VSEL较小（在小鼠中直径为3-5微米并且对于人类来说直径为3-7微米），并且核与细胞质的比率较高。VSEL对于SSEA1、Oct4、Nanog、Rex1以及其它多能干细胞标记物并且对于CD133、CD34、AP、cMet、LIF-R以及CXCR4呈阳性。（美国心脏病学会杂志（J Am Coll Cardiol）53(1):10-20,2009；干细胞综述（Stem Cell Rev）4:89-99,2008）。它们对于CD45呈阴性。VSEL比HSC小（3-6对比6-8μm）并且具有较高核/细胞质比率。VSEL核较大，含有开放型染色质并且被具有众多线粒体的窄细胞质边缘包围。因此，它们的形态与原始PSC一致。

[0058] PB中循环VSEL的绝对数目格外低（在稳态条件下，1mL血液中有1到2个细胞）并且因此必须应用特殊流式细胞方案来进行它们的鉴别和分离。用于鉴别VSEL的表型标记物包括CD45（小鼠和人类）的阴性表达，Sca-1（小鼠）、CXCR4、CD133以及CD34（小鼠和人类）的阳性表达，对于袓代干细胞标记物（也就是说，Oct-4、Nanog以及SSEA）呈阳性，并且表达外胚层/生殖系干细胞的若干特征性标记物。

[0059] 只使用VSEL的荧光活化的细胞分选机分离，100mL UCB中所存在的所有VSEL的分选可以在4个工作日内完成。较有效且经济的三步分离方案允许Lin-/CD45-/UCB-VSEL的回收率为起始数目的60%。所述方案包括将红细胞溶解于低张氯化铵溶液中，通过免疫磁珠进行 细胞选择并且通过FACS使用尺寸标记珠粒对照物进行Lin-/CD45-/ 细胞的分选。分离的细胞高度富含小的高度原始的Lin-/CD45-/细胞的 和 群。

[0060] 用于分选VSEL的另一种方法是基于若干表面标记物的存在和细胞的直径。简单来说，起始步骤是溶解红细胞，以获得有核细胞的部分。使用红细胞溶解缓冲液代替聚蔗糖离心（Ficoll centrifugation），因为后一种方法可能用尽非常小的细胞的群体。然后，细胞用针对Sca-1（鼠类VSEL）或CD133（人类VSEL）、全造血系抗原（CD45）、造血谱系标记物（lin）以及CXCR4的抗体染色，并且使用多参数活无菌细胞分选系统（MoFlo，贝克曼库尔特（Beckman Coulter）；FACSAria，贝迪医疗（Beckton Dickinson））分选。这一方法使用“扩展的淋巴细胞门”以包括直径2-10μm的情况，包括约95%的VSEL。

[0061] 内源性干细胞可以含在来自骨髓、全血、脐带血、脂肪组织或其它来源的单核细胞部分内，或者它们可以通过针对CD34、CD133、CD105、CD117、SSEA1-4、染料排除或其它特异性干细胞抗原进行选择来纯化。干细胞可以使用聚蔗糖-泛影钠（Ficoll-Hypaque）或其它可购得的梯度通过密度梯度离心自全血、骨髓、脐带血、脂肪组织、来自嗅粘膜和可以解离成单细胞悬浮液的其它干细胞来源（如脐带组织）的组织刮屑分离。干细胞可以从由这类程序产生的单核细胞部分回收。或者，可以在密度梯度离心后的其它部分内发现干细胞（干细胞发展（Stem Cells Dev.）2011[印刷前的电子版本]）。举例来说，可以将脐带血在PBS中1:1稀释，小心地铺到黑斯妥佩克（Histopaque）1077（西格马公司（Sigma））上并且在室温下在1500rpm下离心30分钟。如所描绘的所得的各层可以进一步加工以便进行干细胞分离。第1层是血小板层，第2层是含有单核细胞的白细胞层，第3层是聚蔗糖层，并且第4层是也含有VSEL的红细胞团块层。可以收集第1层、第2层以及第3层，在存在或不存在FBS的情况下用适当介质（如DMEM F12）稀释并且再次离心以获得细胞团块。第4层可以用适当介质（如DMEM F12）稀释并且在室温下在标准台式离心机中在800rpm下离心15分钟。可以按照上文概述的流式细胞方法的类型主要自第2层（白细胞层）和第4层（RBC团块）回收干细胞。图1展示由全血的梯度离心产生的各层的典型视图。1展示血小板；2展示具有MNC和干细胞的白细胞层；3展示聚蔗糖；并且4展示RBC团块和干细胞。

[0062] 另外，由于糖基化模式和其它翻译后修饰在不同组织和细胞类型之间可能不同，所以可以由自内源性表达生物制品的器官或细胞类型分离的成年细胞或体细胞制备患者特异性干细胞系。参见雷珀特-德梅兹E（Rajpert-De Meyts E）等人“人类睾丸和睾丸赘瘤中简单粘蛋白型O-聚糖和多肽GalNAc转移酶的型态变化与生殖细胞成熟和肿瘤分化相关（Changes in the profile of simple mucin-type O-glycans and polypeptide GalNAc-transferases in human testis and testicular neoplasms are associated with germ cell maturation and tumour differentiation）”,维尔荷氏文献（Virchows Arch）,第451卷:805-814(2007)。参见佩瓦洛瓦M.（Pevalova M.）等人,“τ蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications of tau protein）”,布拉迪斯拉发医学论文杂志（Bratisl Lek Listy）,107:346-353(2006)。附图说明

[0063] 下文参考以下图式详细描述本发明的优选和替代实例：

[0064] 图1描绘由全血的梯度离心产生的各层。

[0065] 永生化spPSC和ePSC的产生

[0066] 在本发明的一个优选实施例中，spPSC和ePSC优选地通过通常使用多瘤病毒猴病毒40（SV40）非病毒诱导较大T-抗原来永生化。参见罗斯MR.（Rose,MR）等人,(1983).“多瘤病毒的较大T蛋白的表达促进“正常”啮齿动物成纤维细胞系在培养物中的建立（Expression of the Large T Protein of Polyoma Virus Promotes the Establishment in Culture of″Normal″Rodent Fibroblast Cell Lines）”.美国国家科学院院刊（PNAS）80:4354-4358(1983)；以及霍夫曼M.C.（Hofmann,M.C.）等人“使用SV40较大T抗原使生殖细胞和体睾丸细胞永生化（Immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40large T antigen）”实验细胞研究（Experimental Cell Research）,201:417-435(1992)。

[0067] 使用合成产生的、优选地为诱导性多能干细胞或更优选地为分离的内源性多能干细胞的实施例的概述

[0068] 在一个优选实施例中：

[0069] 1.分离内源性多能干细胞；

[0070] 2.使ePSC永生化；

[0071] 3.使用非病毒技术用所关注的基因、病毒或核酸转染永生化ePSC；

[0072] 4.接着诱导已转染的永生化ePSC分化成生殖系细胞、优选地卵巢细胞，以便能够以较有效的方式表达核酸产物；

[0073] 5.现在可以诱导已分化的细胞表达来自先前转染的含有所关注的核酸的载体的所关注的核酸产物。

[0074] 在另一个优选实施例中：

[0075] 1.分离体细胞；

[0076] 2.使体细胞转化成诱导性多能干细胞（iPS细胞）；

[0077] 3.使iPS细胞永生化；

[0078] 4.用含有所关注的基因、病毒或核酸的载体转染永生化iPS细胞；

[0079] 5.接着诱导已转染的永生化iPS细胞再分化成体细胞，以便能够以较有效的方式表达蛋白质；

[0080] 6.现在可以诱导已再分化的细胞表达来自含有所关注的基因的先前转染的载体的所关注的蛋白质。

[0081] 在一个甚至更优选的实施例中：

[0082] 1.分离内源性多能干细胞；

[0083] 2.使用非病毒技术用所关注的基因、病毒或核酸转染永生化ePSC；

[0084] 3.接着诱导已转染的永生化ePSC分化成生殖系细胞，优选地卵巢细胞，以便能够以较有效的方式表达核酸产物；

[0085] 4.现在可以诱导已分化的细胞表达来自先前转染的含有所关注的核酸的载体的所关注的核酸产物。

[0086] 实现本发明的优选实施例的方法是所属领域的技术人员所熟知的。

[0087] 在替代实施例中，可以在永生化之前用含有所关注的核酸的载体转染ePSC或spPSC。参见杜C.（Du C.）等人“自新颖siRNA表达载体产生可变和固定长度siRNA（Generation of Variable and Fixed Length siRNA from a novel siRNA Expression Vector）”,生物化学与生物物理学研究通讯（Biomed.&Biophys.Res.Comm.）545:99-105(2006)；朱约克（York Zhu）,于2008年11月21日申请的美国专利申请案第
12/313,554号。或者，可以诱导ePSC或spPSC细胞再分化，接着可以使所述细胞永生化并且可以用含有所关注的核酸的载体转染已永生化、再分化的细胞。另一种可能是可以诱导ePSC或spPSC细胞再分化，可以用所关注的核酸转染已再分化的细胞并且可以使已再分化、转染的细胞永生化。

[0088] 优选的是ePSC或spPSC细胞在再分化之前在培养物中、优选地在含有自体性人类血清和干细胞因子或白血病抑制因子的细胞培养基中扩增。

[0089] 所产生的多肽或蛋白质可以是任何多肽或蛋白质。尤其受关注的是选自由以下组成的群组的多肽或蛋白质：红细胞生成素、因子VIII、因子IX、凝血酶、抗体或抗体片段、α干扰素、干扰素α2A和2B（参见美国专利第4,810,645号和第4,874,702号）、β干扰素（参见美国专利第4,738,931号）、复合干扰素（参见美国专利第5,661,009号）、生长激素、抗血友病因子、G-CSF、GM-CSF、可溶性受体、融合蛋白（如可溶性受体融合到免疫球蛋白（Ig）的恒定区中（参见美国专利第5,155,027号））、TGF-β、骨形态发生蛋白（BMP）、TGFα、白细胞介素2、β-葡糖脑苷脂酶或其类似物、α1-蛋白酶抑制剂、纤维蛋白、纤维蛋白原、血管性血友病因子、伊米苷酶（imiglucerase）、半乳糖苷酶（agalsidase）β、拉罗尼酶（laronidase）、阿糖苷酶（alglucosidase）α、阿糖苷酶α、促甲状腺素α以及胸腺素α。

[0090] 根据本发明的方法可以产生任何抗体或抗体片段。尤其受关注的是那些结合于标靶的抗体或抗体片段，其中所述标靶是选自由以下组成的群组：肿瘤坏死因子（TNF）分子、生长因子受体、血管内皮生长因子（VEGF）分子、白细胞介素1、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素11、白细胞介素12、γ干扰素、核因子κ-B受体活化因子配体（RANKL）以及Blys。

[0091] 干细胞分化的诱导

[0092] 为优化所关注的蛋白质的产生，应诱导已转染的ePSC或spPSC细胞分化成体细胞。

[0093] 在一个替代实施例中，可以扩增ePSC或spPSC细胞群并且可以诱导分化，并且可以接着用所关注的核酸转染已分化的细胞。可以通过以下方法来诱导干细胞在培养物中向体细胞类型分化：添加多种生长因子到培养物中（血液,85:2414-2421,1995）、改变培养基中的养分、操纵培养条件（如氧张力（生物医学中心细胞生物学杂志（BMC Cell Biol.）,11:94,2010）或温度）或在多种细胞外基质上培养干细胞以及其它如细胞生物学和细胞分化领域中的人员已知的方法。举例来说，视黄酸、TGF-β、骨形态发生蛋白（BMP）、抗坏血酸以及β-甘油磷酸酯引起成骨细胞的产生；吲哚美辛（indomethacin）、IBMX（3-异丁基-1-甲基黃嘌呤）、胰岛素以及三碘甲状腺原氨酸（T3）引起脂肪细胞的产生；αFGF、βFGF、维生素D3、TNF-β以及视黄酸引起肌细胞的产生（心脏衍生的干细胞（CARDIAC DERIVED STEM CELLS）（WO/1999/049015）1998年3月）。已使用单层培养，形成拟胚体（EB），与产生BMP4的细胞共聚集并且使用睾丸或卵巢细胞条件培养基，或用重组人类骨形态发生蛋白（BMP）形成EB，自多能干细胞产生生殖细胞（科学公共图书馆·综合2009;4(4):e5338）。生殖细胞标记基因包括具有ZNF结构域（PRDM1，也称为BLIMP1）的含PR结构域蛋白1、含PR结构域蛋白14（PRDM14）、蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）、DPPA3、IFITM3、GDF3、c-kit、趋化因子（C-X-C基序）受体4（CXCR4）、NANOS1-3、DAZL、VASA、PIWI家族基因（PIWIL1和PIWIL2，在人类中分别称为HIWI和HILI）、Mut-L同系物-1（MLH1）、联会复合蛋白1（SCP1）以及SCP3。所得生殖细胞系可以与使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和其它当前所用的制造细胞系类似地被基因修饰以表达所关注的基因或蛋白质产物。用于自多个阶段的干细胞获得多种体细胞系的分化策略是干细胞生物学领域中的人员所熟知的。

[0094] 已知与高水平的生物制造相关的转录因子可以与所关注的基因共转染以优化患者特异性细胞系中的表达水平。举例来说，高水平的Pit-1表达可以引起一细胞类型中的高促乳素表达，同时阻断或阻止生长激素表达（基因与发育,3:946-958,1989）。

[0095] 单克隆抗体产生可以通过使用如由义翘神州生物技术有限公司研发的那些系统、形态发生或其它标准生物技术方法来优化基因密码子而增强。

[0096] 根据本发明，在ePSC和spPSC中产生重组多肽和蛋白质，其中spPSC和ePSC是自特定品种或族群的细胞产生或分离，这是归因于以下事实：在由特定品种或族群产生的多肽或蛋白质中，特定物种的动物的一些品种或族群具有不同糖基化模式。根据本发明，族群是成员通过共同遗传性彼此联系在一起的人群，所述共同遗传性往往由共同祖先或同族结婚组成（在特定群内结婚的惯例，例如阿什肯纳兹犹太人（Ashkenazi Jews））。一般而言，它是一种高度生物自我长存的群。在多肽和蛋白质中可能具有不同糖基化模式的族群的实例在莱文森（Levinson）、戴维（David）(1998),世界各国的族群：便捷参考手册（Ethnic Groups Worldwide:A Ready Reference Handbook）,绿木出版集团（Greenwood Publishing Group）中有说明。

[0097] 干细胞疗法的方法和系统

[0098] 本发明还包括一种用于在不形成畸胎瘤的情况下促进干细胞疗法的方法。本发明教示如何有利地利用所观测到的上文所定义的本文中称为合成产生的多能干细胞（spPSC）的重编程体细胞的‘记忆’以便获得较大治疗效益。spPSC的记忆赋予向重编程之前的原始细胞类型再分化的优先性，提供一种增强spPSC用于再生药物的安全性和治疗效用的手段。

[0099] 一般步骤

[0100] 本发明涉及

[0101] 1.所关注的体细胞、尤其是希望再生的体细胞的分离；

[0102] 2.体细胞转化为如上文所描述的合成产生的多能干细胞（spPSC）、尤其是诱导性多能干细胞（iPSC）；

[0103] 3.spPSC群的扩增，其中spPSC维持体细胞的固有后生记忆；

[0104] 4.spPSC在培养物中再分化成具有原始体细胞类型的再分化的体细胞；以及[0105] 5.将再分化的体细胞施予或递送到需要所述细胞类型的身体区域中。

[0106] 若干近期研究已经证实spPSC细胞保留关于它们的原始细胞类型的‘记忆’（干 细 胞 28:1981-1991,2010）、（自 然 ,467(7313):285-90,2010）、 自 然 生物 技 术（Nat Biotechnol）,28:848-855,2010）以 及（分 子 人 类 生 殖 学（Mol Hum Reprod.）,16:880-885,2010）。这体现为spPSC在培养物中优先（有时自发地、最容易）向它们的原始细胞类型再分化。科学家和临床医师科学家已经使用tunnel测定去专注于产生可能适用于临床治疗、药物发现、疾病模型化或毒性筛选的多能干细胞（生物技术新见（Curr Opin Biotechnol）,20:516-521,2009），漏掉了多能干细胞的记忆方面对于安全人类疗法所提供的治疗性优势。实际上，公开关于重编程多能干细胞的‘记忆’方面的数据的科学家已专注于spPSC细胞的这种性质关于治疗形成的限制，但是漏掉了这种性质关于提供这些细胞的治疗效用的重要性。

[0107] 已经由多种来源的体细胞观测到spPSC的记忆方面。举例来说，使用OCT4、SOX2、LIN28以及Nanog的慢病毒表达将初代胎儿视网膜上皮细胞重编程为iPSC（干细胞28:1981-1991,2010），并且通过关于多能性的标准测试；它们形成畸胎瘤并且表达多能干细胞标记物。在从生长介质中去除碱性FGF后，一些视网膜spPSC细胞系自发地再分化回视网膜上皮细胞谱系。自人类胎儿视网膜上皮spPSC细胞自发地分化的细胞中约60%是视网膜上皮细胞，这可与来自人类胎儿肺成纤维细胞、人类包皮成纤维细胞或人类ESC细胞的spPSC的视网膜上皮细胞在5%与16%之间相比。然而，每三个来自人类胎儿视网膜上皮细胞的spPSC细胞就有一个未能分化成视网膜上皮细胞。金姆（Kim）等人（自然,467(7313):285-90,2010）使用反转录病毒引入Oct4、Sox2、Klf4以及Myc而将来自年老小鼠的骨髓祖细胞和真皮成纤维细胞重编程。使用通常适用于人类样品的准则，它们的所产生的所有干细胞系都展示多能性。它们的重编程多能干细胞的后续分化证实与成纤维细胞来源相比，造血来源更容易向造血谱系再分化，并且类似地，与造血来源相比，成纤维细胞来源更容易向间叶细胞谱系再分化。作者还展示这一优选地向它们的原始体细胞谱系再分化的倾向可以部分地通过向造血谱系分化然后进行另一轮多能重编程接着再进行分化来克服。举例来说，衍生自神经祖细胞的重编程细胞向造血谱系分化，接着重编程到多能性，与向神经细胞分化、重编程接着向造血细胞分化的神经祖细胞相比显示较高的造血群落形成。

[0108] 使用人类胎儿神经祖细胞的非病毒重编程已经获得重编程细胞优先向它们的原始细胞类型再分化的类似观察结果（科学公共图书馆·综合,4:e7076-e7088,2009）。所产生的重编程细胞表达多能性的若干标记物（关于所有三个生殖层的标记物）并且能够形成在培养物中的拟胚体和畸胎瘤，然而，使用基因芯片分析，作者证实重编程神经祖细胞保留神经干细胞基因的一些表达。保罗（Polo）等人（自然生物技术,28:848-855,2010）自小鼠尾尖衍生的成纤维细胞、脾B细胞、骨髓粒细胞以及骨骼肌前体衍生出多能重编程细胞。自发分化研究指示脾B细胞和骨髓粒细胞重编程的spPSC细胞与成纤维细胞或骨骼肌衍生的spPSC细胞相比更有效地产生造血祖细胞。有趣的是，这些多种spPSC细胞系的连续传代使得第16代消除了基因和甲基化差异，接着所述细胞也展示出相等的分化效率，这是与第4代的早期结果不同的。有趣的是，这一差异性分化潜能的现象并不限于重编程的体细胞，对于已经发现具有不同基因特征并且自发地优先向某些细胞谱系分化的胚胎干细胞系也已观测到这一现象（自然生物技术,26:313-315,2008）（人类生殖新进展（Hum Reprod Update）,13:103-120,2007）（发育生物学,307:446-459,2007）（生物医学中心细胞生物学杂志,10:44,2009）。

[0109] 干细胞可以通过在它们的表面上表达的特异性抗原来表征和分离。多能干细胞可以通过阶段特异性胚胎抗原（SSEA）、转录因子Oct4和Nanog以及其它标记物的表达以及其它方法来表征。已经通过以下方法将胚胎干细胞衍生的成纤维细胞和成年成纤维细胞以及其它细胞重编程到多能状态：与胚胎干细胞融合（细胞126:652-655,2006和干细胞综述,2:331-340,2006）、使用反转录病毒转染技术添加4种基因（细胞126:663-676,2006）、单一卡盒或双顺反子慢病毒转染方法（干细胞,27:543-549,2009和干细胞,27:1042-1049,2009）以及对多能性所需的转录因子的内源性刺激（干细胞,27:3053-3062,2009）。多能性的诱导还可以通过以下方法来实现：修改基因组的甲基化或聚腺苷酸化状态（科学公共图书馆·综合4:e8419,2009）；微RNA（发育生物学,344:16-25,2010）、所需转录因子的小分子活化因子、后生重编程（再生医学,2:795-816,2007）；基于蛋白质的重编程（血液116:386-395,2010）；添加培养物中多能细胞的培养上清液或细胞提取物、化学或辐射或其它基因突变手段以再活化多能性基因，或添加诱导或维持内源性多能状态的生长因子或细胞因子或细胞信号传导部分。使用反转录病毒来将细胞重编程到多能状态呈现出使基因疗法试验恢复免疫缺乏的危险。切除技术（如Cre-lox）或佩吉拜克转座子方法已经用于在成功重编程之后消除反转录病毒（生物技术新见,20:516-521,2009）。克隆技术（如SCNT）和单性生殖（PGA）（细胞重编程,12:105-113,2010）也已经用于产生重编程的多能干细胞（自然,450:497-502,2007）。

[0110] 已经投入大量资源（经济、智力以及劳力）来发现多种多能干细胞来源，主要希望这些干细胞将适合于人类再生药物疗法。不幸的是，除了成年VSEL（干细胞综述4:89-99,2008）以外，迄今为止分离的所有多能干细胞都由于畸胎瘤形成、肿瘤形成以及甚至赘生性的问题而受挫。因此，为了利用在过去大约15年里已经作出的经济、智力以及劳力投入，需要在一定程度上利用这些多能干细胞。

[0111] 可以通过以下方法来诱导干细胞在培养物中向体细胞类型分化：添加多种生长因子到培养物中（血液,85:2414-2421,1995）、改变培养基中的养分、操纵培养条件（如氧张力（生物医学中心细胞生物学杂志,11:94,2010）或温度）或在多种细胞外基质上培养干细胞以及其它如细胞生物学和细胞分化领域中的人员已知的方法。举例来说，视黄酸、TGF-β、骨形态发生蛋白（BMP）、抗坏血酸以及β-甘油磷酸酯引起成骨细胞的产生；吲哚美辛、IBMX（3-异丁基-1-甲基黃嘌呤）、胰岛素以及三碘甲状腺素原氨酸（T3）引起脂肪细胞的产生；aFGF、bFGF、维生素D3、TNF-β以及视黄酸引起肌细胞的产生（（WO/1999/049015）1998年3月）。用于自多个阶段的干细胞获得多种体细胞系的分化策略是干细胞生物学领域中的人员所熟知的。

[0112] 干细胞疗法正在被研究并且完美地用于治疗许多人类疾病。NIH网站www.clinicaltrials.gov中所含的临床试验信息列出了超过3000项干细胞研究。评估中的疾病包括：恶性血液病、白血病、淋巴瘤、癌症、骨质石化病、再生障碍性贫血和血细胞减少症、镰状细胞病和地中海贫血、角膜缘干细胞缺乏症、乳癌、急性心肌梗塞、冠状动脉疾病、外周血管疾病、心脏衰竭、1型糖尿病、2型糖尿病、中风、脊髓损伤、成神经细胞瘤、多发性硬化症、全身性硬化症、红斑狼疮、慢性伤口愈合、烧伤、骨折愈合、软骨修复、CNS肿瘤、骨关节炎、肾衰竭、帕金森氏病（Parkinson′s Disease）、骨髓瘤、糖尿病足、肝硬化和胆硬化、扩张型心肌症、贫血、色素性视网膜炎、克罗恩氏病、糖尿病性神经病变、肥大细胞增多症、卵巢癌、癫痫症、重症肌无力、自体免疫疾病、肉芽肿性疾病、骨坏死、肝脏衰竭、PMD疾病、脂质营养不良、脱髓鞘疾病、软骨缺陷、视网膜疾病、狼疮性肾炎、阿尔茨海默氏病（Alzheimer′s Disease）、创伤性脑损伤、肉瘤、肌炎、高血糖症、黄斑变性、溃疡性结肠炎、肌肉变性以及其它疾病。

[0113] 可以使用所属领域的技术人员已知的多种标记物分离干细胞。举例来说，可以在http://stemcells.nih.gov/info/scireport/appendixe.asp#eii找到常用干细胞标记物的列表。可以通过使用CD133分离神经干细胞；通过使用骨形态发生蛋白受体（BMPR）分离间叶干细胞和祖细胞；通过CD34分离造血干细胞；通过CD34+Sca1+Lin-标记物的组合分离间叶干细胞；通过ckit、Stro1或Thy1分离造血和间叶干细胞；通过巢蛋白分离神经和胰脏祖细胞；通过波形蛋白分离外胚层、神经以及胰脏祖细胞；以及其它标记物。

[0114] 本发明进一步提供安全地重编程和再分化体细胞用于再生药物的方法。适用的体细胞可以包括完全分化的体细胞、祖细胞或较原始的干细胞。视需要再生疗法的器官而定，较原始的干细胞或多或少地可以通过器官穿刺、生检、刮屑或手术获取来获得。当有可能获得这些干细胞时，使用较原始的干细胞是优选的。较不优选但与完全分化的体细胞相比较优选的是使用祖细胞。

[0115] 自作为治疗标靶的特定器官分离体细胞，重编程那些体细胞，在培养物中短期扩增从而确保维持spPSC的固有‘记忆’，然后在培养物再分化成原始细胞类型，然后进行治疗性应用允许多能干细胞方法用于治疗患者且肿瘤或畸胎瘤形成的危险降低。

[0116] 重编程的体细胞在第1代与第12代之间、最优选地在第4代时可以使用。可以根据标准细胞生物学和分化技术使重编程的体细胞向用于所需再生的细胞类型分化。所产生的治疗性细胞可以使用标准注射技术通过静脉内、动脉内、肌肉内或其它注射方法来施予，所述标准注射技术可以包括导管，如NOGAStar或MyoStar注射导管或其它被批准的导管注射装置。或者，可以通过最小侵入性或较大侵入性手术方法将治疗性细胞施予到靶组织中。可以在含有0%与15%之间、最优选地5%的自体性人类血清白蛋白的缓冲液组合物中施予治疗性细胞。为治疗中枢神经系统的疾病，将优选地使用自体性脑脊髓液缓冲治疗性细胞。
也可以通过使用如胶原蛋白、纤维蛋白原或其它细胞外基质或细胞外基质的组合的脚手架或通过使用如使用海藻酸盐或其它标准方法产生的细线将细胞保持在适当的位置并且维持与需要再生修复的器官接触来施予治疗性细胞。

[0117] 优选地，将施予最少500个治疗性细胞，并且通常细胞疗法将利用1,500万到5亿个细胞。更优选地，将施予1,500万与1亿个之间的细胞以便获得最佳效益。

[0118] 作为实例，对于用于神经疾病（如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、中风、亨廷顿氏病（Huntington′s Disease）、多发性硬化症、麻痹以及中枢神经系统（CNS）的其它疾病）的细胞疗法来说如所公开将使用硬质内窥镜优选地分离嗅粘膜（脊髓医学杂志（J Spinal Cord Med.）29:191-203,2006）。根据再生药物领域的技术人员所熟知的方法自嗅粘膜分离神经干细胞和祖细胞或嗅鞘细胞。或者，可以自人发囊分离神经嵴干细胞（生物学报（Folia Biol.）56:149-157,2010）。最优选地，通过添加规定的因子重编程神经干细胞，扩增并且传代4代，通过添加规定的因子向特定中枢神经系统细胞类型再分化，接着向患者施予以便进行再生疗法。

[0119] 本发明提供安全地重编程和再分化体细胞用于再生药物的方法。适用的体细胞可以包括完全分化的体细胞、祖细胞或较原始的干细胞。视需要再生疗法的器官而定，较原始的干细胞或多或少地可以通过器官穿刺、生检、刮屑或手术获取来获得。当有可能获得这些干细胞时，使用较原始的干细胞是优选的。较不优选但与完全分化的体细胞相比较优选的是使用祖细胞。

[0120] 对于脊椎损伤修复，通过硬质内窥镜去除嗅粘膜，使用1992年由雷诺（Reynolds）和外斯（Weiss）首次描述的神经球检验（科学,255:1707-1710,1992）分离神经干细胞，添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）到嗅粘膜培养若干天存活的细胞中以刺激神经球生长，并且神经干细胞在培养7到10天内可回收。通过添加用于递送OCT4和NANOG的游离型载体来重编程所得神经干细胞，用潮霉素选择5-7天。将所述细胞传代并且扩增直到第4代，以获得无整合群落，接着使用自体性脑脊髓液或规定的因子向嗅鞘和干细胞样神经祖细胞分化。在手术期间使用标准中线切割和后部中线脊髓切开术使受损的脊髓暴露，允许的话去除疤痕组织，治疗性细胞在自体性脑脊髓液中缓冲，接种到生物活性脚手架上并且直接应用于受伤脊髓。

[0121] 实例

[0122] 实例1

[0123] 对合成产生的患者特异性多能干细胞进行基因修饰以便产生重组蛋白[0124] 使用来自患者的合成产生的多能干细胞（spPSC）（如SCNT或PGA或ANT-OAR或iPSC）进行基因修饰以诱导生物制造。通过将患者细胞的核转移到已经制备的无核卵母细胞中来制备SCNT衍生的干细胞。通过对患者的核DNA进行基因修饰然后将修饰的核转移到已制备的无核卵母细胞中来制备ANT-OAR衍生的干细胞。通过使用基因修饰、多能转录因子的活化因子、后生修饰或如上文所描述的所属领域中已知的其它方法将患者的细胞重编程来制备iPSC衍生的干细胞。将所产生的合成产生的患者特异性干细胞系以主细胞库和工作库的形式‘建库’用于后续基因修饰以便进行生物制造。

[0125] 使用单层培养、形成拟胚体（EB）、与产生BMP4的细胞共聚集、使用睾丸或卵巢细胞条件培养基或用重组人类骨形态发生蛋白（BMP）形成EB来自多能干细胞产生生殖细胞。通过标记基因的表达来鉴别生殖细胞，所述标记基因可以包括具有ZNF结构域（PRDM1，也称为BLIMP1）的含PR结构域蛋白1、含PR结构域蛋白14（PRDM14）、蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）、DPPA3、IFITM3、GDF3、c-kit、趋化因子（C-X-C基序）受体4（CXCR4）、NANOS1-3、DAZL、VASA、PIWI家族基因（PIWIL1和PIWIL2，在人类中分别称为HIWI和HILI）、Mut-L同系物-1（MLH1）、联会复合蛋白1（SCP1）以及SCP3。根据通常用于制造重组因子VIII的方法用所关注的基因（如因子VIII）转染所产生的生殖细胞。

[0126] 实例2

[0127] 对合成产生的患者特异性多能干细胞进行基因修饰以便产生重组胰岛素[0128] 使用来自患者的合成产生的多能干细胞（spPSC）（如SCNT或PGA或ANT-OAR或iPSC衍生的干细胞）进行基因修饰以诱导生物制造。通过将患者细胞的核转移到已经制备的无核卵母细胞中来制备SCNT衍生的干细胞。通过对患者的核DNA进行基因修饰然后将修饰的核转移到已制备的无核卵母细胞中来制备ANT-OAR衍生的干细胞。通过使用基因修饰、多能转录因子的活化因子、后生修饰或如上文所描述的所属领域中已知的其它方法将患者的细胞重编程来制备iPSC衍生的干细胞。将所产生的合成产生的患者特异性干细胞系以主细胞库和工作库的形式‘建库’用于后续基因修饰以便进行生物制造。

[0129] 根据通常用于在酿酒酵母（S.cerevisiae）[克尔森T.（Kjeldsen T.）等人,“施加到胰岛素的酵母中工程化增强的蛋白分泌表达（Engineering-enhanced protein secretory expression in yeast with application to insulin）”.2002年5月21日,生物化学杂志,277:18245-18248(2002年5月)；张B.（Zhang B.）等人,“酵母中新合成的胰岛素的细胞内保持是由高尔基复合体中的内切蛋白酶解加工引起（Intracellular retention of newly synthesized insulin in yeast is caused by endoproteolytic processing in the Golgi complex）”,细胞生物学杂志,153:1187-1198(2001年6月)；以及克里斯滕森C.（Kristensen C.）等人,“胰岛素的丙氨酸扫描突变诱发（Alanine scanning mutagenesis of insulin）”,生物化学杂志,272:12978-12983(1997年5月)]或大肠杆菌[孙YJ.（Son YJ.）等人“β-巯基乙醇和过氧化氢对人类胰岛素原到胰岛素的酶促转化的影响（Effects of beta-mercaptoethanol and hydrogen peroxide on enzymatic conversion of human proinsulin to insulin）”,微生物学和生物技术杂志（J.Microbiol Biotechnol.）,18:983-989(2008年5月)]中制造胰岛素的方法来进行胰岛素前体在患者特异性干细胞中的表达，接着根据标准方法加工并纯化。将表达患者特异性细胞系的胰岛素前体以主细胞库和工作细胞库形式‘建库’以便进行后续胰岛素制造。

[0130] 实例3

[0131] 产生β细胞以便使用对合成产生的患者特异性多能干细胞的基因修饰产生胰岛素

[0132] 为产生胰岛素，使用来自患者的体细胞进行基因修饰以产生spPSC并且使用这些spPSC来诱导生物制造。通过使用基因修饰、多能转录因子的活化因子、后生修饰或所属领域中已知的其它方法将患者的细胞重编程来制备spPSC衍生的干细胞。将所产生的患者特异性干细胞系以主细胞库和工作库的形式‘建库’用于后续基因修饰以便进行生物制造。或者可以根据上文所描述的技术分离内源性多能干细胞（ePSC）并且建库。

[0133] 根据如上文所描述的通常用于在酿酒酵母或大肠杆菌中制造胰岛素的方法来进行胰岛素前体在患者特异性干细胞中的表达。在用适当胰岛素基因构建体基因转染之后，按照可见于β细胞生物学联盟http://www.protocolonline.Org/prot/Cell_Biology/Stem_Cells/Differentiation_of_Stem_Cell/index.html.在线方案（Protocol Online.）[网上][引用：2010年12月19日]的以下文献中的标准方案使所述细胞向β细胞谱系分化：[史Y.（Shi,Y.）等人“通过新颖的三步法用活化素A和全反式视黄酸诱导胚胎干细胞分化成胰脏β细胞（Inducing embryonic stem cells to differentiate into pancreatic beta cells by a novel three-step approach with activin A and all-trans retinoic acid）”干细胞,23:656-662(2005)；或立石K.（Tateishi,K.）等人“自人类皮肤成纤维细胞产生胰岛素分泌的胰岛样团簇（Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts）”,生物化学杂志,283:31601-31607(2008)]。

[0134] 接着根据标准方法加工并纯化所产生的被表达的生物产物。将所产生的表达胰岛素前体的患者特异性干细胞系以主细胞库和工作库的形式‘建库’用于后续基因修饰以便进行生物制造。

[0135] 或者，按照标准可见于β细胞生物学联盟（同上）的史等人（同上）或立石等人（同上）中的方案使所产生的患者特异性干细胞向β细胞谱系分化。一经分化，即根据如上文所论述的通常用于在酿酒酵母或大肠杆菌中制造胰岛素的方法进行胰岛素前体在患者特异性干细胞中的表达。接着，根据标准方法加工并纯化所产生的被表达的生物产物。

[0136] 实例4

[0137] 分离产生抗体的成年（体）细胞用于重编程并且转染以产生生物抗体治疗剂[0138] 出于产生患者特异性制造细胞系以产生治疗性抗体生物制品的目的，自外周血液、骨髓以及其它可容易获得的造血细胞来源分离产生抗体的B细胞。使用可获得的基于CD19表达的试剂盒（干细胞技术公司（StemCell Technologies））分离B细胞。可以采用限制稀释或细胞分选方法来选择产生最高水平的免疫球蛋白（Ig）的细胞。短暂扩增之后，使用标准重编程技术使克隆性高Ig产生性的细胞重编程到多能或祖代状态。使用标准分子生物学技术和方法用所需抗体基因构建体转导所产生的患者特异性干细胞。根据目前先进的生物技术方法（无论是可公开地获得的还是由关于抗体治疗剂的物质组合的拥有者所秘密持有的）加工并纯化所产生的被表达的抗体治疗剂。获得所需纯化抗体产物的方法包括离子交换色谱法。

[0139] 实例5

[0140] 分离产生抗体的成年（体）细胞用于重编程并且转染以在再分化成产生抗体的体细胞的情况下产生生物抗体治疗剂

[0141] 出于产生患者特异性制造细胞系以产生治疗性抗体生物制品的目的，自外周血液、骨髓以及其它可容易获得的造血细胞来源分离产生抗体的B细胞。可以采用限制稀释或细胞分选方法来选择产生最高水平的免疫球蛋白（Ig）的细胞。短暂扩增之后，使用标准重编程技术使克隆性高Ig产生性的细胞重编程到多能或祖代状态。使用标准技术和方法用所需抗体基因构建体转导所产生的患者特异性干细胞。基因修饰之后，通过在CD40L、BAFF、toll样受体活化（TLR）[林E.A.（Hayashi E.A.）等人“TLR4促进B细胞成熟：独立性以及与B淋巴细胞活化因子合作（TLR4promotes B cell maturation:independence and cooperation with B lymphocyte-activating factor）”, 免 疫 学 杂 志（J Immunol.）,184:4662-4672(2010)]或如所属领域中已知的其它B细胞成熟因子（如B细胞受体（BCR）活化和刻痕受体配体家族活化[帕拉尼察米A.（Palanichamy A.）等人“通过B细胞耗尽疗法揭示的新颖人类过渡B细胞群（Novel human transitional B cell populations revealed by B cell depletion therapy）”2009年5月10日,免疫学杂志,第182卷,第5982-5993页(2009)；托马斯M.D.（Thomas M.D.）等人,“外周B细胞成熟的调节（Regulation of peripheral B cell maturation）”,细胞免疫学（Cell Immunol.）,239:92-102(2006)]）存在下培养使患者特异性多能细胞系分化成成熟的产生抗体的B细胞。

[0142] 可以通过使用如李J.（Li J.）等人,“通过人类B细胞融合瘤技术产生用于免疫疗法开发的人类抗体（Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology）”,美国国家科学院院刊,103:3557-3562(2006)所描述的形态发生技术的方法来提高治疗性抗体的效价和亲和力。根据目前先进的生物技术方法（无论可公开地获得的还是由关于抗体治疗剂的物质组合的拥有者所秘密持有的）加工并纯化所产生的被表达的抗体治疗剂。

[0143] 或者，通过在CD40L、BAFF、toll样受体活化（TLR）（参见林等人（同上））或如所属领域中已知的其它B细胞成熟因子（如B细胞受体（BCR）活化和刻痕受体配体家族活化（参见帕拉尼察米A.等人（同上）和托马斯M.D.等人（同上）））存在下培养使患者特异性多能细胞系分化成成熟的产生抗体的B细胞。可以通过使用如所描述的形态发生技术（参见Li等人（同上））的方法来提高治疗性抗体的效价和亲和力。

[0144] 使用标准技术和方法用所需抗体基因构建体转导所产生的产生抗体的患者特异性细胞。根据目前先进的生物技术方法（无论可公开地获得的还是由关于抗体治疗剂的物质组合的拥有者所秘密持有的）加工并纯化所产生的被表达的抗体治疗剂。

[0145] 实例6

[0146] 产生患者特异性细胞系以便产生高活性ADCC抗体

[0147] 免疫球蛋白的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNac）翻译后修饰对于抗体依赖性细胞介导毒性（ADCC）来说是重要的，并且非海藻糖基化GlcNac残基具有最高的Fcγ受体亲和力（莫里K.（Mori K.）等人,“非海藻糖基化治疗性抗体：下一代治疗性抗体（Non-fucosylated therapeutic antibodies:the next generation of therapeutic antibodies）”,细胞技术学（Cytotechnology）,55:109-114(2007)）。

[0148] 因此，当需要具有高水平ADCC的抗体治疗剂时，能够转移适当水平的GlcNac并且使得GlcNac非海藻糖基化的患者特异性细胞系是所需要的。已知癌瘤细胞表达较高水平的GMD，并且因此，由于癌干细胞和多能细胞具有类似基因特征，所以怀疑多能细胞可能也表达高水平的GMD，GMD是负责翻译后GlcNac连接的酶。在正常组织中，结肠和胰脏表达最高水平的GMD。对于功效取决于ADCC活性的治疗性抗体（如利妥昔单抗（Rituximab）或赫赛汀（Herceptin））制造来说，在患者特异性干细胞系中缺乏对使抗体海藻糖基化的酶负责的FUT8将为所需要的。举例来说，大鼠融合瘤YB2/0细胞中产生的单克隆抗体的ADCC活性是使用CHO细胞产生的相同单克隆抗体的50倍。脂肪衍生的干细胞和生殖细胞系以及B细胞淋巴瘤表达高于平均水平的FUT8，而造血干细胞（HSC）、未成熟的B细胞、正常骨骼肌表达低于平均水平的FUT8。

[0149] 在事先用干细胞动员剂处理或不事先用干细胞动员剂处理的情况下，根据标准方法自骨髓抽出物或根据全血分离术分离造血干细胞。然后，如先前所描述使分离的HSC重编程到多能性。使用标准技术和方法用所需抗体基因构建体转导所产生的患者特异性干细胞。基因转染之后，通过在CD40L、BAFF、toll样受体活化（TLR）（参见林E.A.等人（同上））或如所属领域中已知的其它B细胞成熟因子（如B细胞受体（BCR）活化和刻痕受体配体家族活化（参见帕拉尼察米A.等人（同上）和托马斯M.D.等人（同上）））存在下培养使患者特异性多能细胞系分化成成熟的产生抗体的B细胞。可以通过使用如所描述的形态发生技术（参见李等人（同上））的方法来提高治疗性抗体的效价和亲和力。根据目前先进的生物技术方法（无论是可公开地获得的还是有关于抗体治疗剂的物质组合的拥有者所秘密持有的）加工并纯化所产生的被表达的抗体治疗剂。

[0150] 或者，出于产生患者特异性制造细胞系以产生治疗性抗体生物制品的目的，自外周血液、骨髓以及其它可容易获得的造血细胞来源分离产生抗体的B细胞。可以使用限制稀释或细胞分选方法来选择产生最高水平的免疫球蛋白（Ig）的细胞。短暂扩增之后，使用标准重编程技术使克隆性高Ig产生性的细胞重编程到多能或祖代状态。使用标准技术和方法用所需抗体基因构建体转导所产生的患者特异性干细胞。基因修饰之后，使患者特异性多能细胞系向HSC、未成熟的B细胞或骨骼肌细胞分化，以便产生低海藻糖或缺乏海藻糖的治疗性抗体。

[0151] 虽然已经说明并描述本发明的优选实施例，但如上文所提到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多变化。因此，本发明的范围不受优选实施例的公开内容限制。实际上，应完全参考以下权利要求书来界定本发明。