一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法 |
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| 申请号 | CN201710443698.8 | 申请日 | 2017-06-13 | 公开(公告)号 | CN107435039A | 公开(公告)日 | 2017-12-05 |
| 申请人 | 安徽安龙基因医学检验所有限公司; | 发明人 | 韦玉军; 李航; 陆宝石; 苏军; 吴远航; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种分选白细胞的免疫 磁珠 的制备方法及储存方法，具体步骤如下：合成油酸-Fe3O4；Fe3O4/PVAc 磁性 微球制备；(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备；将0.4ml 3- 氨 丙基三乙 氧 基 硅 烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的 乙醇 悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加 磁场 从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二 醛 的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff 碱 在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl； 抗体 的肼基化修饰；免疫磁珠的制备，储存方法为：置于4℃下保存。本发明具有 稳定性 好、特异性强等优点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下： |
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| 说明书全文 | 一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法技术领域[0001] 本发明涉及免疫磁珠制备领域，具体来说是一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法。 背景技术[0002] 免疫磁珠(immunomagnetic beads,IMB)技术是近年来国内外研究的一种新的免疫学技术,IMB是免疫微球的一种，为包被有单克隆抗体的球形磁性微粒，可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。该技术由John Ugelstar等于1979年首先制备出，从此被广泛的应用于医学卫生、科研等领域的许多方面，并由此引发了生物分离技术上的一次革命。 [0003] 由于磁性微粒直径介于纳米级别，故又被称为磁性纳米粒子,近年来，人们将纳米磁珠表面包被抗体后，可以与特异性的抗原(如细菌、病毒、细胞、酶等)结合，利用磁性粒子所具有的磁响应性，在外加磁场作用下结合磁珠的靶物质就会被磁场吸附，从而与其他成分分离，达到纯化、富集或消除靶物质的作用。 [0004] 磁性纳米颗粒的应用对材料的制备及表面性质要求较高,在人们所熟知的大量磁性材料中，可以做磁性材料的仅有少数几种：主要为金属氧化物Fe2O3、Fe3O4、MeFe2O4(Me＝Co、Mn、Ni)、化合物钕铁硼、钐钴等，它们的饱和磁化强度依次递增，但稳定性(抗氧化能力)依次递减,由于稳定性问题，人们在选择一些高饱和磁化强度的磁性微粒时，通常采纳工艺条件工艺条件十分苛刻的路线，这在一定程度上限制了这些饱和强度高但稳定性低的材料的应用,考虑到材料对人体的毒副作用及来源等方面，目前研究较多的为前两种材料。 发明内容[0006] 本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下： [0007] 一、合成油酸-Fe3O4 [0008] (1.1)、在通氮气的条件下，将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌的同时，把346ml NaOH溶液加入以上溶液中； [0009] (1.2)、加入20ml油酸，90℃条件下，搅拌1小时后停止反应； [0010] (1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗1-7次，产物即为油酸-Fe3O4； [0011] 二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备 [0012] (2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min； [0013] (2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀； [0014] (2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀； [0015] (2.4)、温度均匀上升，在45-60℃的范围内停留30-120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色有黑色变为红棕色； [0016] (2.5)、反应结束后，利用外加磁场将产物从溶液中分离出来，即将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次，并且分散在200ml无水乙醇溶液中； [0017] 三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备 [0018] (3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水混合液中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散； [0020] (3.3)、加入7ml NaOH溶液，室温下搅拌3h，最后利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中； [0021] 四、磁性颗粒的氨基化修饰 [0022] 将0.4ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用； [0023] 五、磁性颗粒的醛基化修饰 [0024] 将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl； [0025] 六、抗体的肼基化修饰 [0027] 七、免疫磁珠的制备 [0028] 将1mg醛基修饰的磁性微球与0.01mg肼基修饰的CD45抗体混合，在4-25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h-24h,在磁分离作用下得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45抗体免疫磁珠。 [0029] 作为优选，所述的步骤(1.1)中，所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L。 [0030] 作为优选，所述的步骤(1.1)中，所述的FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaOH的摩尔比为1:2:8。 [0031] 作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的表面活性剂为十六烷基三甲氧基溴化铵，所述的助表面活性剂采用正丁醇。 [0032] 作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的十六烷基三甲氧基溴化铵为0.3g，所述的正丁醇为3ml。 [0033] 作为优选，所述的步骤(3.1)中，所述的乙醇和水的比例为4:1。 [0034] 作为优选，所述的步骤(3.2)中，所述的正硅酸乙酯加入量为1.0ml，SiO2壳的厚度为200nm级。 [0035] 作为优选，所述的步骤六中，所述的二甲基甲酰胺溶液中的对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的浓度为5mmol/L，所述的CD45抗体溶液的浓度为10μmol/L。 [0036] 作为优选，所述的步骤六中，抗体的肼基化修饰中，对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的摩尔当量可为CD45抗体的10-50倍。 [0037] 作为优选，所述的步骤七中，所述的醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的CD45抗体质量比为1:0.01-1。 [0038] 作为优选，本发明还公开了上述分选白细胞的免疫磁珠的储存方法： [0039] 取上述制得含磁珠溶液，在外加磁场作用下，去除上清，加入等体积的0.1‰硫柳汞与1％蔗糖的混合溶液，置于4℃下保存。 [0040] 与现有技术相比，本发明具有以下有益优点： [0041] 本发明采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，即将一定比例的铁盐与亚铁盐混合滴加到碱性溶液中，反应得到，此法操作简便； [0042] Fe3O4/PVAc磁性微球制备过程中添加了表面活性剂和助表面活性剂，分别为CTAB(十六烷基三甲氧基溴化铵)和正丁醇，这可以增强磁微粒的稳定性； [0044] (Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备过程中，可通过加入不同量的TEOS(正硅酸乙酯)来选择生成的SiO2壳的厚度； [0045] 抗体的肼基化修饰中，SANH(对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂)的摩尔当量可为抗体的10-50倍； [0046] 本发明制备的免疫磁珠优选用0.1‰硫柳汞与1％蔗糖的混合溶液作为保护剂，并置于4℃保存，可维持期最佳性能； 具体实施方式[0049] 以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。 [0050] 本发明公开了一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下： [0051] 一、合成油酸-Fe3O4 [0052] (1.1)、在通氮气的条件下，将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌的同时，把346ml NaOH溶液加入以上溶液中； [0053] (1.2)、加入20ml油酸，90℃条件下，搅拌1小时后停止反应； [0054] (1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗1-7次，产物即为油酸-Fe3O4； [0055] 二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备 [0056] (2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min； [0057] (2.3)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀； [0058] (2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀； [0059] (2.4)、温度均匀上升，在45-60℃的范围内停留30-120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色有黑色变为红棕色； [0060] (2.5)、反应结束后，利用外加磁场将产物从溶液中分离出来，即将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次，并且分散在200ml无水乙醇溶液中； [0061] 三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备 [0062] (3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水混合液中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散； [0063] (3.3)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min； [0064] (3.3)、加入0.5ml NaOH溶液，室温下搅拌3h，最后利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中； [0065] 四、磁性颗粒的氨基化修饰 [0066] 将0.4ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用； [0067] 五、磁性颗粒的醛基化修饰 [0068] 将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl； [0069] 六、抗体的肼基化修饰 [0070] 将5μL含对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLCD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD45抗体； [0071] 七、免疫磁珠的制备 [0072] 将1mg醛基修饰的磁性微球与0.01mg肼基修饰的CD45抗体混合，在4-25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h-24h,在磁分离作用下得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45抗体免疫磁珠。 [0073] 作为优选，所述的步骤(1.1)中，所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L。 [0074] 作为优选，所述的步骤(1.1)中，所述的FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaOH的摩尔比为1:2:8。 [0075] 作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的表面活性剂为十六烷基三甲氧基溴化铵，所述的助表面活性剂采用正丁醇。 [0076] 作为优选，所述的步骤(2.2)中，所述的十六烷基三甲氧基溴化铵为0.3g，所述的正丁醇为3ml。 [0077] 作为优选，所述的步骤(3.1)中，所述的乙醇和水的比例为4:1。 [0078] 作为优选，所述的步骤(3.2)中，所述的正硅酸乙酯加入量为1.0ml，SiO2壳的厚度为200nm级。 [0079] 作为优选，所述的步骤六中，所述的二甲基甲酰胺溶液中的对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的浓度为5mmol/L，所述的CD45抗体溶液的浓度为10μmol/L。 [0080] 作为优选，所述的步骤六中，抗体的肼基化修饰中，对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的摩尔当量可为CD45抗体的10-50倍。 [0081] 作为优选，所述的步骤七中，所述的醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的CD45抗体质量比为1:0.01-1。 [0082] 作为优选，本发明还公开了上述分选白细胞的免疫磁珠的储存方法： [0083] 取上述制得含磁珠溶液，在外加磁场作用下，去除上清，加入等体积的0.1‰硫柳汞与1％蔗糖的混合溶液，置于4℃下保存。 [0084] 实施例1： [0085] 本发明公开了一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，具体步骤如下： [0086] 一、合成油酸-Fe3O4 [0087] (1.1)、在通氮气的条件下，将8.6g FeCl2·4H2O、23.5g FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌的同时，把346ml NaOH溶液加入以上溶液中； [0088] (1.2)、加入20ml油酸，90℃条件下，搅拌1小时后停止反应； [0089] (1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗3次，产物即为油酸-Fe3O4； [0090] 二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备 [0091] (2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min； [0092] (2.4)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀； [0093] (2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀； [0094] (2.4)、温度均匀上升，在50℃的范围内停留100min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色有黑色变为红棕色； [0095] (2.5)、反应结束后，利用外加磁场将产物从溶液中分离出来，即将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次，并且分散在200ml无水乙醇溶液中； [0096] 三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备 [0097] (3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水混合液中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散； [0098] (3.4)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min； [0099] (3.3)、加入7ml NaOH溶液，室温下搅拌3h，最后利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中； [0100] 四、磁性颗粒的氨基化修饰 [0101] 将0.4ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用； [0102] 五、磁性颗粒的醛基化修饰 [0103] 将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl； [0104] 六、抗体的肼基化修饰 [0105] 将5μL含对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLCD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD45抗体； [0106] 七、免疫磁珠的制备 [0107] 将1mg醛基修饰的磁性微球与0.01mg肼基修饰的CD45抗体混合，在20℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合15h,在磁分离作用下得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45抗体免疫磁珠。 [0108] 所述的步骤(1.1)中，所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L。 [0109] 所述的步骤(1.1)中，所述的FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、NaOH的摩尔比为1:2:8。 [0110] 所述的步骤(2.2)中，所述的表面活性剂为十六烷基三甲氧基溴化铵，所述的助表面活性剂采用正丁醇。 [0111] 所述的步骤(2.2)中，所述的十六烷基三甲氧基溴化铵为0.3g，所述的正丁醇为3ml。 [0112] 所述的步骤(3.1)中，所述的乙醇和水的比例为4:1。 [0113] 所述的步骤(3.2)中，所述的正硅酸乙酯加入量为1.0ml，SiO2壳的厚度为200nm级。 [0114] 所述的步骤六中，所述的二甲基甲酰胺溶液中的对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的浓度为5mmol/L，所述的CD45抗体溶液的浓度为10μmol/L。 [0115] 所述的步骤六中，抗体的肼基化修饰中，对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的摩尔当量可为CD45抗体的25倍。 [0116] 所述的步骤七中，所述的醛基修饰的磁性微球与肼基修饰的CD45抗体质量比为1:0.03。 [0117] 本发明还公开了上述分选白细胞的免疫磁珠的储存方法： [0118] 取上述制得含磁珠溶液，在外加磁场作用下，去除上清，加入等体积的0.1‰硫柳汞与1％蔗糖的混合溶液，置于4℃下保存。 [0119] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。 |
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