一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法 |
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| 申请号 | CN201610290827.X | 申请日 | 2016-05-04 | 公开(公告)号 | CN107345218A | 公开(公告)日 | 2017-11-14 |
| 申请人 | 上海大垚生物科技有限公司; | 发明人 | 王晓冰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种 视网膜 节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，筛选出节细胞特异性表面蛋白、该表面蛋白特异性的表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前 体细胞 的细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化节细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类 青光眼 的细胞替代 治疗 奠定了 基础 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，其特征在于包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法技术领域背景技术[0002] 视觉是机体最重要的感觉功能，视觉系统疾病分为可逆性(如：白内障)和不可逆性(如：青光眼)两大类。调查结果表明，截至2010年，全世界大约有6050万青光眼患者，并且这种疾病的发病呈上升态势，预计到2020年大约会升至7960万。青光眼主要累及视网膜节细胞，导致视神经受损，使得视觉传导通路障碍，视觉信号不能正常传递到中枢神经系统。青光眼的主要致病因素为眼压升高，但青光眼发病早期几乎没有症状，且往往在临床诊断之前已经发生了严重的视力丧失。目前治疗青光眼的主要手段就是降低眼内压，但只能减缓青光眼的病程进展，并不能完全阻止病情的发展，因此，基于干细胞的节细胞移植疗法给青光眼的逆转和治愈带来了新的希望。目前的研究结果显示，间充质干细胞、胚胎干细胞、视网膜前体细胞以及Müller细胞移植后可以与宿主的视网膜节细胞发生整合，甚至有些移植的细胞可能表达一些节细胞特异性蛋白。而诱导的多能干细胞来源的节细胞样细胞则不能和宿主的视网膜节细胞发生整合。另外，即使移植的细胞可以发生整合，但没有发现模型动物表现出视觉功能的改善，可能是移植的细胞不能地很好与视觉中枢系统建立突触联系有关。 [0003] 目前，细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。 发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，从而找到节细胞前体细胞的特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化，从而用于临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。 [0005] 本发明的具体技术方案如下： [0006] 一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，包括如下步骤： [0007] (1)将人多能干细胞诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中消化过夜，得到细胞悬液； [0010] 如果细胞球过硬，不容易消化，为了充分分散细胞球，将步骤(2)得到的单细胞用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，然后进行步骤(3)的操作。 [0011] 步骤(1)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml。 [0012] 步骤(1)中，所述消化是在25℃的条件下进行消化。 [0013] 步骤(2)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml。 [0014] 所述步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对106/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定节细胞特异性表面蛋白。 [0015] 采用本发明所述的视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，对已知的370种CD抗体对人胚胎干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞进行筛选；通过筛选得到一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面。利用FACS技术对这种细胞表面蛋白进行筛选，可以将诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源的节细胞前体细胞进行纯化。将这种纯化的节细胞进行贴壁培养，可以观察到有长的轴突产生，另外，将这种节细胞与小鼠脑片共培养，节细胞的长轴突可以与脑片形成突触联系。将纯化的节细胞移植到青光眼动物模型的玻璃体腔，经过长时间的观察，可以发现动物视网膜光感功能得到改善。 [0016] 利用本发明所述方法筛选出的其中一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化节细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类青光眼的细胞替代治疗奠定了基础。 具体实施方式[0018] 一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，包括如下步骤： [0019] (1)将人多能干细胞诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中于25℃的条件下消化过夜，消化时在摇床轻摇，得到细胞悬液；Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml； [0020] (2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，轻轻吹打以分散细胞，细胞分散后，1000r/m离心5min，筛网过滤后备用；如果细胞球过硬，不容易消化，则需要用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，以充分分散细胞球，获得单细胞；Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml； [0021] (3)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选、筛选出CD抗体，然后对CD抗体进行筛选、确定节细胞特异性表面蛋白。 [0022] 步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对106/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定节细胞特异性表面蛋白。 [0023] 人多能干细胞的培养和诱导分化 [0024] Ⅰ.人多能干细胞的培养：将人多能干细胞接种在铺有0.65×105/ml MEFs的六孔板内；干细胞培液内含：DMEM/F12(1：1)、20％血清替代物、1mM L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(MEM non－essential amino acids)、0.1mMβ-巯基乙醇、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；每5至7天传代一次，传代时将形态上已明显分化的细胞刮除。 [0025] Ⅱ.人多能干细胞的诱导：Dispase酶(1mg/ml)消化人多能干细胞约2min后，吸除Dispase酶，用干细胞培液(1ml/孔)漂洗一次，再次加入干细胞培液，用吸管将干细胞克隆吹下成小片状移入离心管中，800r/min离心1min后，用干细胞培液重悬细胞，将细胞重悬液移入非粘附的培养皿中，用干细胞培液培养4天，隔天换液，得到细胞球。将细胞球移入神经诱导培养基中(HNM)，HNM包含：DMEM/F12，1％N2复合物，1％非必须氨基酸(MEM non－essential amino acids)，2ug/ml肝素(heparin)，1％L-谷氨酰胺，2天后，将细胞球移入粘附性培养皿中，为了促使细胞球贴壁，可以在HNM中加入10％的胎牛血清(FBS)，12h后更换新鲜的不含FBS的HNM。几天后，贴壁的细胞球会形成许多神经管样的结构，大约在贴壁的第9天，将贴壁后形成的神经管样结构吹下，移入视网膜诱导培养基中(RDM),RDM包含：DMEM/F12、15％血清替代物、1％L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(NEAA)、10mM烟酰胺(Nicotinamide,NIC)。将形成的神经球悬浮培养，每2～3天换液。 [0026] Ⅲ.报告细胞系的建立：利用Talen的同源重组技术，将编码GFP的序列插入到H9人胚胎干细胞系的Brn3基因位点，从而建立报告细胞系。 [0027] 人胚胎以及成年人视网膜组织的收集 [0028] 研究用经药物流产的4周至12周人胚胎共18例(Table 2.2)。胎龄的计算是根据当事人末次月经的日期减去2周的时间，即受孕时作为第0天。成年人视网膜取自捐献角膜后的眼球组织。人组织的获取及相关研究经相关伦理委员会批准，并在捐赠者签署知情同意书的情况下进行。 [0029] 细胞流式及细胞分选 [0030] 将诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶(1mg/ml；Worthington)的Hanks溶液(NaCl:136mM,NaHCO3:4.16mM,NaPO4:0.34mM,KCl:5.36mM,KH2PO4:0.44mM,dextrose:5.55mM,HEPES:5mM)中25℃消化过夜，消化时在摇床轻摇。第二天，在细胞悬液中加入等量的含有Ⅱ型胶原酶(1mg/ml；Worthington)、牛磺酸10mM、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸0.1mM、牛血清白蛋白1mg/ml的Hanks溶液进一步消化，轻轻吹打以分散细胞。细胞分散后，1000r/m离心5min，筛网过滤后备用。如果细胞球过硬，不容易消化，则需要用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，以充分分散细胞球，获得单细胞。 [0031] 应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒，对消化的单细胞进行分析。单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％saponin(sigma)的PBS溶液中进行，细胞染色后用LSRII流式细胞仪(BD公司)进行分析。对于细胞分选，我们选用FACS Aria TMII(BD公司)细胞分选仪(Sickkids-UHN Flow Cytometry Facility)对106/ml的细胞进行分选，细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液。为了防止细胞分选过程中由于压力和剪切力所导致的细胞死亡，我们选用100um的吹管进行分选。另外，我们选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选，分选出CD抗体；操作步骤和分选条件按照说明书进行。对于CD抗体的高通量细胞流式分析，我们选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析(high-throughput sampler,HTS)进行操作，操作步骤参照说明书。所有数据应用流式分析软件Treestar进行分析。 [0032] 免疫染色 [0033] 免疫荧光染色的步骤按照常规进行，对于细胞球切片或组织切片，过程如下：取出-80℃冰箱内保存的冰冻切片，室温复温30分钟。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。含有0.25％Triton X-100和10％驴血清的0.01M PBS孵育1小时。加一抗，湿盒内4℃冰箱孵育过夜。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。加二抗，避光室温孵育1小时。0.01M PBS洗3次，每次10分钟。用抗荧光淬灭的封片液进行封片，避光晾干后，于荧光显微镜下进行观察和拍照。对于细胞爬片，所不同的是前面的固定过程，即：4％多聚甲醛固定30min,0.01M PBS洗3次，每次 10分钟，-20℃甲醇固定10min,0.01M PBS洗3次，每次10分钟，后续封闭以及抗体孵育的步骤同前。如果染色的是细胞膜抗原，则封闭时不加Triton X-100。 [0034] RT-qPCR [0035] 用RNA提取试剂盒(Ambion)进行细胞RNA的抽提。用逆转录试剂盒(Invitrogen)对50ng～1ug的RNA进行逆转录。QPCR使用QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)。表达量以管家基因TATA盒子(TBP)为标准参照，除此之外，基因组DNA作为DNA的参考标准。基因组DNA的靶基因拷贝数按照如下计算方式：人基因组大小2.7×109bp，对应于6.022×1023个单基因拷贝，1ug的基因组DNA对应于3.4×105个单基因拷贝。RT-qPCR图的Y轴代表被TBP拷贝数分隔开的目的基因的拷贝数，因此是一个随机的独立单位，可用于不同实验组之间的对比。 |
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