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一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法
申请号	CN201610289894.X	申请日	2016-05-04	公开(公告)号	CN107345217A	公开(公告)日	2017-11-14
申请人	上海大垚生物科技有限公司;			发明人	王晓冰;
摘要	本发明涉及一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，对已知的370种CD 抗体对人胚胎干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞进行筛选，筛选出的其中一种CD 抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化节细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，从而用于临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。
权利要求	1.一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤： (1)利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化； (2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白； (3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞； (4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面； (5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养后，将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系；在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，为了证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面。
说明书全文	一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物医药领域，涉及视网膜细胞方面，具体涉及一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法。背景技术 [0002] 视觉是机体最重要的感觉功能，视觉系统疾病分为可逆性(如：白内障)和不可逆性(如：青光眼)两大类。调查结果表明，截至2010年，全世界大约有6050万青光眼患者，并且这种疾病的发病呈上升态势，预计到2020年大约会升至7960万。青光眼主要累及视网膜节细胞，导致视神经受损，使得视觉传导通路障碍，视觉信号不能正常传递到中枢神经系统。青光眼的主要致病因素为眼压升高，但青光眼发病早期几乎没有症状，且往往在临床诊断之前已经发生了严重的视力丧失。目前治疗青光眼的主要手段就是降低眼内压，但只能减缓青光眼的病程进展，并不能完全阻止病情的发展，因此，基于干细胞的节细胞移植疗法给青光眼的逆转和治愈带来了新的希望。目前的研究结果显示，间充质干细胞、胚胎干细胞、视网膜前体细胞以及Müller细胞移植后可以与宿主的视网膜节细胞发生整合，甚至有些移植的细胞可能表达一些节细胞特异性蛋白。而诱导的多能干细胞来源的节细胞样细胞则不能和宿主的视网膜节细胞发生整合。另外，即使移植的细胞可以发生整合，但没有发现模型动物表现出视觉功能的改善，可能是移植的细胞不能地很好与视觉中枢系统建立突触联系有关。 [0003] 目前，细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。发明内容 [0004] 本发明的目的在于一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，从而找到节细胞前体细胞的特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化，从而加快临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。 [0005] 本发明的具体技术方案如下： [0006] 一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，包括如下步骤： [0007] (1)利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化； [0008] (2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白； [0009] (3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞； [0010] (4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面； [0011] (5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养后，将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系； [0012] 在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。通过体外电生理检测和体内的移植实验来证实纯化的节细胞具有功能，从而探讨纯化的节细胞对受损视网膜结构与功能修复的作用。 [0013] 步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。 [0014] 步骤(4)中，为了证实筛证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面。 [0015] 目前通过干细胞诱导分化所获得的视网膜细胞通常是多种细胞的混合，而视网膜疾病的发病早期多数仅累及一种细胞，因此，如果能够获得某种纯化的细胞，且在视网膜疾病的发病早期将纯化的细胞移植到体内，则可以从两个方面对患者的视觉功能进行改善：首先，移植的纯化细胞可以改善患者局部的微环境，从而有利于患者自身残存细胞的生存；其次，移植的纯化细胞可以部分替代受损细胞，从而改善患者的视觉功能。 [0016] 采用本发明所述的验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，对已知的370种CD抗体对人胚胎干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞进行筛选。通过筛选，我们可以发现其中一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面。利用FACS技术对这种细胞表面蛋白进行筛选，可以将诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源的节细胞前体细胞进行纯化。将这种纯化的节细胞进行贴壁培养，可以观察到有长的轴突产生，另外，将这种节细胞与小鼠脑片共培养，节细胞的长轴突可以与脑片形成突触联系。将纯化的节细胞移植到青光眼动物模型的玻璃体腔，经过长时间的观察，可以发现动物视网膜光感功能得到改善。 [0017] 利用本发明所述方法筛选出的其中一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面，这将提供一种简单的方法用于人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化。通过表面蛋白筛选获得的纯化节细胞，可以避免转基因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。这一关键科学问题的解决，将加快干细胞向临床转化的过程，符合医学研究的需要，为人类青光眼的细胞替代治疗奠定了基础。具体实施方式 [0018] 本发明所述的“人胚胎干细胞诱导分化”采用申请号为201210301765.X，名称为“一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前体细胞的方法”中提到的方法。本发明其他未提及部分均为现有技术。 [0019] 报告细胞系构建技术：目前已有的报告细胞系构建技术包括传统的锌指蛋白技术、Talen技术和Cas9技术，我们采用Talen技术进行报告细胞系的构建。 [0020] 一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，包括如下步骤： [0021] (1)利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化； [0022] (2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白； [0023] (3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞，培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位； [0024] (4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面； [0025] (5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞进行功能学检测；检测方法如下： [0026] a、将步骤(3)中得到的细胞与外侧膝状体所在区域的小鼠脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养，培养基为视网膜诱导分化培养基，显微镜下将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系；b、在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。 [0027] 视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选 [0028] 报告细胞系的建立：利用Talen的同源重组技术，将编码GFP的序列插入到H9人胚胎干细胞系的Brn3基因位点，从而建立报告细胞系。 [0029] 利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，通过申请号为201210301765.X中所建立的诱导分化方案，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周左右；通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化；应用BD公司所提供的表面蛋白筛选试剂盒，对纯化的节细胞前体细胞进行分析，通过数模分析，找到一种节细胞所特异的表面蛋白。 [0030] 通过节细胞特异性表面蛋白筛选并纯化人胚胎干细胞来源的视网膜细胞[0031] 为了证实筛选获得的节细胞特异性表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，我们将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，通过FACS筛选分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞；培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。 [0032] 通过节细胞特异性表面蛋白筛选并纯化诱导的人多能干细胞来源的视网膜细胞[0033] 为了证实筛选获得的节细胞特异性表面蛋白不仅可以用来筛选人胚胎干细胞来源的视网膜细胞，同时也可以用来筛选诱导的人多能干细胞来源的视网膜细胞，从而加快干细胞治疗从实验室走向临床，我们应用同样的手段，筛选出表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞，然后应用同样的鉴定方法进行验证。 [0034] 筛选获得的节细胞特异性表面蛋白可以表达在人胚胎及成年人的视网膜节细胞膜表面 [0035] 通过我们前期的收集工作，我们获得了不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织。为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白仅仅特异性表达在节细胞膜表面，我们对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的节细胞表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面。 [0036] 将纯化的节细胞与小鼠脑片组织共培养 [0037] 通过以上鉴定，基本可以确定我们所筛选获得的节细胞表面蛋白是节细胞所特有的，但通过这种表面蛋白筛选获得的节细胞在体外是否具有功能，我们希望通过与脑片组织的共培养来初步确定，培养基为视网膜诱导分化培养基。如果纯化的节细胞具有功能，则节细胞与脑片组织共培养后，我们将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系。 [0038] 将纯化的节细胞移植到青光眼小鼠眼球的玻璃体腔内 [0039] 在确定了纯化的节细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，我们希望证实纯化的节细胞在体内是否具有功能。因此，我们利用青光眼小鼠的动物模型，将纯化的节细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位。如果纯化的节细胞具有功能，则节细胞移植后的一段时期内，通过一系列功能学检测，我们将会看到小鼠的视觉功能有部分改善。 [0040] 通过上述方法进行筛选后，我们可以发现其中一种CD抗原特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的细胞膜表面。利用FACS技术对这种细胞表面蛋白进行筛选，可以将诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源的节细胞前体细胞进行纯化。

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