一种胎盘造血干细胞的制备方法 |
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| 申请号 | CN201710111925.7 | 申请日 | 2017-02-28 | 公开(公告)号 | CN106834230A | 公开(公告)日 | 2017-06-13 |
| 申请人 | 福建泽源生物科技有限公司; | 发明人 | 徐鹏; 章晟; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，所述制备方法得到的胎盘造血干细胞感染率低，细胞数量多，提取步骤操作简单。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤为： |
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| 说明书全文 | 一种胎盘造血干细胞的制备方法技术领域背景技术[0002] 造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力，广泛应用于恶性血液病（如急性白血病、慢性粒细胞白血病等）、非恶性难治性血液病（如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等）遗传性疾病（先天性免疫缺陷病﹑地中海贫血等）和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。 [0003] 随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，且所含造血干细胞数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，移植后反应较轻且不需要采用药物等优点，从胎盘组织提取造血干细胞的方法成为领域内的研究方向。 发明内容[0004] 本发明提供一种从健康产妇足月胎盘中收集造血干细胞的方法。 [0005] 所述方法包括胎盘的预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤分别为：1、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在 2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS中添加组合抗生素。 [0007] 继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液。 [0008] 3、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至离心管进行离心，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞。用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测；在细胞悬液中加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察细胞集落形成状态。 [0009] 上述步骤1中胎盘预处理的磷酸盐缓冲液PBS的组分为：1000ml灭菌超纯水中加入氯化钠8.5g、磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.27g、氯化钾0.2g，其中缓冲液中添加抗生素组合青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素、两性霉素B分别添加浓度为3%、2%、1%。 [0011] 图1为流式细胞检测图；图2：胎盘血细胞集落形态40×，其中A为胎盘血形成的红细胞爆式集落，B为胎盘血形成的粒-巨噬细胞集落。 具体实施方式[0012] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发作进一步说明，但不作为对本发明的限定。 [0013] 1、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS的组分为：1000ml灭菌超纯水中加入氯化钠8.5g、磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.27g、氯化钾0.2g，其中缓冲液中添加组合抗生素组合A青霉素、链霉素混合液（双抗），添加浓度为1%，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率为5%；添加抗生素组合B青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素分别添加浓度分别为2%和1%，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率为3%；添加抗生素组合C青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素、两性霉素B分别添加浓度为3%、2%、1%，每组试验50个胎盘，分离得到胎盘造血干细胞，分别取样采用血培养仪仪器培养，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率小于1%。 [0014] 2、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用100mL生理盐水和市购的体积分数10%的血液保存液Ⅲ的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至50mL离心管内。 [0015] 继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水100毫升灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液。 [0016] 3、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至50mL离心管，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞。 [0017] 4、胎盘造血干细胞的检测：用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测，胎盘造血干细胞有核细胞数和CD34+细胞数如表一，流式细胞仪检测CD34+细胞数量如图1所示，CD34+阳性细胞的比率可达到1%-2%。 [0018] 表一：样本编号 样本体积（ml） 有核细胞数 CD34+细胞数 1 150 2.1×109 2.3×107 2 145 1.5×109 1.65×107 3 122 1.4×109 1.5×107 5、细胞集落培养：取0.9毫升5×104的细胞悬液，加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察，细胞接种第14天可观察到细胞集落形成良好，如图2所示。胎盘造血干细胞细胞集落形成数目如表二。 [0019] 表二：样本编号 红细胞爆式集落 粒-巨噬细胞集落 1 55 65 2 42 64 3 32 60 |
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