一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法 |
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| 申请号 | CN201610986118.5 | 申请日 | 2016-11-09 | 公开(公告)号 | CN106754667A | 公开(公告)日 | 2017-05-31 |
| 申请人 | 云南舜喜再生医学工程有限公司; | 发明人 | 闫姗姗; 李一佳; 尹义强; 刘国燕; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，属于 生物 医药技术领域。本发明经过人胎盘绒毛膜组织或脐带组织首次分离后组织的回收、人胎盘绒毛膜或脐带组织的间充质干细胞二次分离及间充质干细胞的体外培养和冻存，并对分离获得的细胞进行相关检测，与首次分离的细胞数量进行比较。本发明能够从已经分离过一次间充质干细胞的人胎盘绒毛膜组织或脐带组织中再次分离获得大量表型均一稳定的间充质干细胞，经检测符合临床应用标准。通过培养体外扩增获得大量间充质干细胞满足市场需求。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法[0001] 技术领域背景技术[0003] 间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，越来越多的临床研究表明间充质干细胞对很多疾病具有较好的缓解治疗效果，应用间充质干细胞治疗目前传统方法很难治愈的疾病已经得到普遍认可和接受，其在临床上的应用价值越来越大。 [0004] 作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单，细胞数量多等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，数量多，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。研究证明，人绒毛膜或脐带来源的间充质干细胞具有较好的自我更新和多向分化潜能，其免疫原性低，同种异体、异种异体移植不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。 [0005] 脐带、胎盘绒毛膜组织来源于孕妇产后新生儿的脐带和胎盘组织，采集方便，胎盘组织具有一定的弹性，易于绒毛膜组织的剥离，因此脐带、绒毛膜是间充质干细胞的丰富来源之一。 [0006] 现有技术中，制备脐带、绒毛膜间充质干细胞的方法存在的不足之处：目前，脐带、绒毛膜间充质干细胞的分离方法有组织块培养法和酶消化法两种，两种方法中组织只应用一次，得到的细胞数量有限，很难满足目前市场对间充质干细胞的需求，而实际上分离一次后的组织当中仍含有大量的间充质干细胞残留，这无形中又造成了一种资源的浪费。另外，干细胞的培养成本较高，很多患者的经济条件很难承受间充质干细胞的治疗费用，这也在一定程度上限制了它的广泛应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药技术领域亟需解决的问题。 发明内容[0007] 本发明提供一种从已经利用过一次的人胎盘绒毛膜组织中较快的分离获得大量细胞形态均一、稳定、细胞活性好、可应用于临床的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，同时本方法也适用于从脐带组织中二次分离间充质干细胞，以解决上述背景技术中提出的问题。 [0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法，包括如下步骤： 步骤（1），组织收集：采用组织贴壁法分离培养围产期间充质干细胞至第一次传代时，收集培养瓶中的人绒毛膜组织或脐带组织； 步骤（2），原代培养：将步骤（1）收集到的组织于间充质干细胞无血清培养基中静置培养3-4天，至细胞汇合度为50%以上；所述的培养条件为5%CO2、饱和湿度、37℃； 步骤（3），更换培养基后继续原代培养：待步骤（2）培养至细胞汇合度为50%以上后，更换为新的培养基（即采用新的间充质干细胞无血清培养基更换旧的间充质干细胞无血清培养基），于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下继续静置培养至细胞汇合度为60-90%； 步骤（4），传代培养：待步骤（3）培养至细胞汇合度为60-90%后进行传代培养，弃掉原培养基及悬浮的组织，之后采用DPBS缓冲液清洗贴壁的细胞及组织，弃DPBS缓冲液及悬浮的组织，接着加入重组型胰酶消化细胞2-5min，待细胞开始收缩后加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用； 然后采用移液管吹打细胞至细胞完全分散，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将接种细胞于新的细胞培养瓶中，置于 5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱中培养； 步骤（5），间充质干细胞的冻存：当步骤（4）培养的细胞汇合度达90%后进行细胞冻存，先弃原培养基，加入DPBS缓冲液清洗细胞，再用重组型胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶的作用，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，混匀后将重悬溶液分装至冻存管中； 步骤（6），冻存细胞缓慢降温：将步骤（5）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，- 80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存； 步骤（7），冻存细胞的复苏：从步骤（6）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，将细胞悬液移至装有DPBS缓冲液的离心管中，混匀后离心以去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于 5%CO2、饱和湿度、37℃细胞培养箱继续培养。 [0009] 进一步，优选的是，步骤（1）中人绒毛膜组织或脐带组织的收集方法为：将采用组织贴壁法分离培养间充质干细胞至第一次传代时，将培养瓶中的组织块收集于离心管中，离心，去上清，备用。 [0010] 进一步，优选的是，所述的离心参数为300g、5min。 [0011] 进一步，优选的是，步骤（1）中人绒毛膜组织或脐带组织的收集方法为：将采用组织贴壁法分离培养间充质干细胞至第一次传代时，收集组织块后留下的物质（包括细胞和残留的组织）采用DPBS缓冲液清洗，之后加入重组型胰酶消化细胞2-5min，待细胞开始收缩后加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用；然后采用移液管吹打细胞至细胞完全分散，将细胞悬液移走，剩下的物质即为组织。 [0012] 进一步，优选的是，将细胞悬液移至离心管中，离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将重悬溶液移至培养瓶中进行传代培养。 [0013] 进一步，优选的是，所述的离心参数为1200rpm、5min。 [0014] 进一步，优选的是，在普通光学显微镜下观察重组型胰酶消化细胞的情况，观察到细胞开始收缩，可用手轻拍细胞培养瓶将细胞拍散，之后再加入DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用。 [0015] 进一步，优选的是，步骤（4）的离心参数为1200rpm、5min，接种于新的细胞培养瓶5 中的接种浓度为1×10 个/ml；步骤（7）冻存细胞的复苏中离心的参数为1200-1800rpm、 5min。 [0016] 进一步，优选的是，第一次传代比例为1:2，即一个T-75培养瓶可传成2个T-75培养瓶。 [0017] 进一步，优选的是，步骤（7）中将细胞悬液移至DPBS缓冲液中混匀时，细胞悬液与DPBS缓冲液的体积比为1：5-10。 [0018] 优选原代培养组织接种时，组织：间充质干细胞无血清培养基的体积比优选为1:6。 [0019] 本发明原代培养时，组织应均匀的分布在细胞培养瓶底部。 [0020] 本发明所有培养过程中，应注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或pH值不符时应及时进行补充或更换新的上述间充质干细胞无血清培养基。（pH值在6.5-7.5之间，优选为7.25），细胞密度达到要求应及时进行传代，以免影响细胞生长状态。 [0021] 本发明技术方案中两种收集方法收集到的组织，可以分别单独进行培养，也可以合并在一起进行培养，但不同来源的组织不可以合并在一起进行培养，（即绒毛膜组织不可以和脐带组织混在一起培养）。 [0023] 本发明加入培养基重悬细胞时，培养基的加入量没有具体限制，只要能重悬细胞即可，具体可根据实际情况中细胞的数量及培养瓶的大小来确定。 [0024] 本发明中用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基也可自行配制，将间充质干细胞培养基、二甲基亚砜和右旋糖酐按体积比为8:1:1，混匀，即得。 [0025] 本发明的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，具有如下优势：1)将已经分离过一次间充质干细胞的绒毛膜组织再次利用，达到了资源的最大化利用程度； 2) 其分离时间周期明显缩短，相对于首次分离过程平均需要12天可进行第一次传代，本方法只需6-8天可进行第一次传代； 3)成本低，用本方法获得的间充质干细胞传至第二代的细胞数量是其他方法获得的细胞传至第三代的1.5倍左右； 4)此方法分离获得的间充质干细胞可进行稳定传代，并保持性能稳定，主要包括细胞形态、增殖能力、MSC 表面标记物表达； 5)本方法中所采用的试剂均为人工合成试剂，无外源物质，成分明确，并进行相关临床检测符合标准； 6）冻存复苏后细胞状态良好，能够稳定保持细胞干性和细胞活力，对细胞无伤害。 附图说明 [0026] 图1是二次分离获得的原代人绒毛膜间充质干细胞和传代后人绒毛膜间充干细胞形态图；其中，A为分离获得的原代间充质干细胞；B为第1代间充质干细胞；C为第3代间充质干细胞；D为第5代间充质干细胞；E为第10代间充质干细胞；F为第15代间充质干细胞；图2是二次分离获得的原代人脐带间充质干细胞和传代后人脐带间充干细胞形态图； 其中，A为分离获得的原代间充质干细胞；B为第1代间充质干细胞；C为第3代间充质干细胞； D为第5代间充质干细胞；E为第10代间充质干细胞；F为第15代间充质干细胞； 图3是流式检测人绒毛膜间充干细胞表面抗原表达情况图；其中，A为收集细胞位置；B为获取的数据，共收集10000个细胞，其中R1门中有8490个细胞，R2门中有8457个细胞，R3门中有8414个细胞，R4门中有8367个细胞，R5门中有8367个细胞，R6门中有8398个细胞，R7门中有7785个细胞；C为CD90阳性峰图；D为CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性峰图；E为CD105阳性峰图；F为CD73阳性峰图；G为CD90阳性，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞团位置；H为CD105阳性、CD73阳性细胞团位置。 [0027] 图4是组织贴壁法第一次分离获得细胞数量（首次分离法）和本方法分离获得的细胞数量（二次分离法）比较结果。 具体实施方式[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。 [0029] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。 [0030] 本发明所用的间充质干细胞无血清培养基购自北京百乐通生物技术有限公司，货号为10150A。 [0031] 本发明所用的重组型胰酶溶液购自Gibco，货号为12563-029。 [0032] 本发明所用的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐的细胞冻存混合液，购自WAK-Chemie Medical GmbH，货号为WAK-DEX40-50-5。 [0033] 本发明所用的DPBS缓冲液购自BI，货号为02-023-1ACS。 [0034] 本发明所有离心过程中均要保持温度为零度以上、室温以下，优选采用低温离心机，温度设定为4℃，以防止离心时引起的离心机温度过高而导致细胞失活。 [0035] 本发明原代培养时组织接种比例，组织：间充质干细胞无血清培养基的体积比优选为1:6，但不限于此。 [0036] 实施例1绒毛膜组织的二次收集 绒毛膜间充质干细胞的第一次分离采用组织贴壁法，每次换液要轻拿轻放，防止组织脱落，换液两次。每3-4天更换一次新鲜的间充质干细胞无血清培养基，细胞密度达30%可进行传代，将T-75培养瓶中悬浮的组织块连同少量培养上清移至50ml离心管，将50ml离心管于离心机中，300g离心5min，去上清，得到含有组织块的50ml离心管，备用； 取上文提到的T-75培养瓶，加入10ml DPBS缓冲液清洗细胞一次，移除DPBS，加入3ml重组型胰酶，轻轻晃动培养瓶，使细胞培养瓶底面的细胞充分接触重组型胰酶，静止2-5min，期间注意观察细胞消化情况，细胞开始收缩可以用手轻轻拍打细胞培养瓶侧壁，此时组块也会随之脱落，加入10ml DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用，用移液管轻轻吹打细胞悬液，吹打过程中组织块儿容易堵塞移液管，吹打时要小心污染，待细胞完全分散后，吸取细胞悬液至50ml离心管，将组织块遗留在T-75细胞培养瓶中； 离心装有细胞悬液的50ml离心管，1200rpm，5min，离心结束后去上清，加入5ml间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并将细胞悬液移至T-25细胞培养瓶于含5% CO2、饱和湿度、 37℃培养箱培养； 取含有组织的50ml离心管，用巴氏吸管吸取1ml组织至之前有组织块遗留的T-75细胞培养瓶中，加入6ml间充质干细胞无血清培养基（若培养瓶中遗留的组织较多，可直接加入间充质干细胞无血清培养基），于含5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养。 [0037] 实施例2二次分离绒毛膜间充质干细胞的培养 向含有绒毛膜组织的T-75培养瓶中加入6ml间充质干细胞无血清培养基重悬组织，晃动培养瓶使组织平铺在细胞培养瓶底部，于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱静置培养，培养3- 4天，待细胞汇合度为50%以上时更换一次新鲜的间充质干细胞无血清培养基，期间注意观察细胞生长情况，更换培养基时，不要剧烈晃动，防止组织块漂起随培养上清移除，6-8天细胞汇合度达80%以上，如图1中的A图为分离获得的绒毛膜间充质干细胞，此时可进行传代。 [0038] 实施例3脐带组织的二次收集 脐带间充质干细胞的第一次分离采用组织贴壁法，每次换液要轻拿轻放，防止组织脱落，换液两次。每3-4天更换一次新鲜的间充质干细胞无血清培养基，细胞密度达30%可进行传代，将T-75培养瓶中悬浮的组织块连同少量培养上清移至50ml离心管，将50ml离心管于低温离心机中，300g离心5min，去上清，得到含有组织块的50ml离心管，备用。 [0039] 然后向T-75培养瓶中加入10ml DPBS缓冲液清洗细胞一次，移除DPBS，加入3ml重组型胰酶，轻轻晃动培养瓶，使细胞培养瓶底面的细胞充分接触重组型胰酶，静止2-5min，期间注意观察细胞消化情况，细胞开始收缩可以用手轻轻拍打细胞培养瓶侧壁，此时组织块也会随之脱落，加入10ml DPBS缓冲液终止重组型胰酶作用，用移液管轻轻吹打细胞悬液，吹打过程中组织块儿容易堵塞移液管，吹打时要小心污染，待细胞完全分散后，吸取细胞悬液至50ml离心管，将组织块遗留在T-75细胞培养瓶中；离心装有细胞悬液的50ml离心管，1200rpm，5min，离心结束后去上清，加入5ml间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并将细胞悬液移至T-25细胞培养瓶于含5%CO2、饱和湿度、 37℃培养箱培养； 取含有组织的50ml离心管，用巴氏吸管吸取1ml组织至之前有组织块遗留的T-75细胞培养瓶中，加入6ml间充质干细胞无血清培养基（若培养瓶中遗留的组织较多，可直接加入间充质干细胞无血清培养基），于含5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养。 [0040] 实施例4二次分离脐带间充质干细胞的培养 向含有脐带组织的T-75培养瓶中加入6ml间充质干细胞无血清培养基重悬组织，晃动培养瓶使组织平铺在细胞培养瓶底部，于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱静置培养，培养3-4天，待细胞汇合度为50%以上时更换一次新鲜的间充质干细胞无血清培养基，期间注意观察细胞生长情况，更换培养基时，不要剧烈晃动，防止组织块漂起随培养上清移除，6-8天细胞汇合度可达80%以上，如图2中的A图为分离获得的脐带间充质干细胞，此时可进行传代。 [0041] 实施例5二次分离间充质干细胞的传代培养 取细胞汇合度达80%以上的T-75培养瓶，弃掉原培养基及悬浮的组织，加入10ml DPBS缓冲液清洗贴壁的细胞及组织，弃DPBS缓冲液及悬浮的组织块，加入重组型胰酶溶液3ml，轻轻晃动培养瓶，使细胞培养瓶底面的细胞充分接触重组型胰酶，静止2-5min，期间注意观察细胞消化情况，细胞开始收缩后可以用手轻轻拍打细胞培养瓶侧壁，此时少量组织也会随之脱落，加入10mlDPBS缓冲液终止重组型胰酶作用，用移液管轻轻吹打细胞悬液，吹打过程中组织块儿容易堵塞移液管，吹打时要小心污染，待细胞完全分散后，吸取细胞悬液至 50ml离心管，1200rpm离心5min，弃上清，加入10ml间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，将细胞悬液平均分至2个新的T-75培养瓶中，每瓶5ml，再向每个T-75培养瓶补充9ml间充质干细胞无血清培养基，放入5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养，一般2-3天细胞汇合度可达 90%，此时可进行再次传代，通过以上步骤可完成间充质干细胞的传代培养，根据需要重复上述操作进行P2、P3、P4……传代，在传代的过程中残留的组织块会越来越少，传至第3代可完全清除组织块，如图1-B、C、D、E、F分别为应用本专利方法获得的绒毛膜间充质干细胞传代至第1代、第3代、第5代、第10代、第15代，随着传代的增加细胞形态差别不明显；如图2-B、C、D、E、F分别为应用本专利方法获得的脐带间充质干细胞传代至第1代、第3代、第5代、第10代、第15代，随着传代的增加细胞形态会有所改变，趋于老化。 [0042] 优选传代时，接种浓度为1×105个/ml。 [0043] 实施例6二次分离间充质干细胞的冻存 T-75细胞瓶中的细胞汇合度达90%时可进行间充质干细胞的冻存，首先配制含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，用移液枪吸取间充质干细胞无血清培养基4ml，加入500ul的二甲基亚砜（DMSO）和500ul的右旋糖酐，充分混匀备用； 移除T-75细胞培养瓶中的培养基，加入10ml的DPBS缓冲液清洗细胞一次，移除DPBS缓冲液，加入3ml重组型胰酶溶液，左右晃动细胞培养瓶，使细胞培养瓶底面的细胞充分接触重组型胰酶，静止2-5min，期间注意观察细胞消化情况，细胞开始收缩后可以用手轻轻拍打细胞培养瓶侧壁，将细胞消化成单个细胞，加入10mlDPBS缓冲液终止重组型胰酶作用，用移液管轻轻吹打细胞悬液，将细胞悬液移至50ml离心管，1200rpm，离心5min，去除上清液，加入事先配制好的含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基5ml重悬细胞，移液器反复吹打3次，将细胞吹散充分接触冻存保护剂，取1.6ml细胞悬液移至2ml冻存管中，共分为3支，拧紧冻存管的盖子，防止低温环境下冻存管盖子变松，导致细胞污染，将冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，迅速将冻存盒置于-80℃冰箱过夜，第二天取出冻存盒将细胞冻存管移至-196℃液氮罐中长期储存。 [0044] 实施例7二次分离间充质干细胞的复苏 取一个保温饭盒装入适量37℃温水，用镊子从液氮罐中取出1支之前冻存的细胞（即 2ml冻存管），迅速置于37℃温水中并不断晃动细胞冻存管，使冻存管中的液体迅速融化，将冻存管中的液体移至装有10ml DPBS缓冲液的50ml离心管中，混匀后1200rpm，离心5min，去上清（即去除了含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基），加5ml间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至T-25细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养，根据细胞生长密度进行传代。 [0045] 将得到的间充质干细胞进行流式细胞检测，方法如下：实验原理：利用流式细胞技术检测间充质干细胞特异性表面抗体表达情况。根据抗原抗体结合原理，选用BD公司人类间充质干细胞检测试剂盒，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性、定量分析。检测试剂盒配备了国际通用的MSC的五阴（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR）三阳（CD73、CD90、CD105）检测抗体和对应的对照抗体。 [0046] 检测步骤：（1）取7根流式管，分别为 ①空白对照 ②FITC-CD90 单染管 ③PE 单染管 ④PerCP-CD105单染管 ⑤APC-CD73单染管 ⑥Positive antibody isotype（阳性混合抗体的对照抗体） + Negative antibody isotype（阴性混合抗体的对照抗体） ⑦Positive antibody cocktail（阳性混合抗体）（CD73、CD90、CD105）+ Negative antibody cocktail（阴性混合抗体）（CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR） （2）各流式管分别加入相同量的传代细胞（有核细胞数2-5×105个），不可粘到管壁。 [0047] （3）各流式管加入对应抗体①不加任何抗体 ②加入CD90-FITC 5ul ③加入PE-Negative cocktail 5 ul ④加入CD105-Per CP 5ul ⑤加入CD73-APC 5 ul ⑥加入阳性混合抗体的对照抗体（Positive antibody isotype）和阴性混合抗体的对照抗体（Negative antibody isotype） ⑦加入阳性混合抗体（Positive antibody cocktail）和阴性混合抗体（Negative antibody cocktail） （4）涡旋振荡器混匀各检测管后，室温避光放置30min，加入1mL PBS/管，涡旋混匀后， 1200rpm/min，离心5min。 [0048] （5）弃上清，重复洗涤3次，最后加入0.5mL PBS重悬细胞，上机检测（若不能及时上机，应加入2%多聚甲醛溶液固定）。 [0049] （6）上机分析结果得：共收集10000个细胞，其中CD90阳性细胞占99.6%，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞占99.1%，CD105阳性细胞占98.5%，CD73阳性细胞占98.5%，所以CD73、CD90、CD105表达率在97%以上，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达率小于2%，为阴性；另外CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞中CD73、CD90、CD105共阳性细胞占91.7%。 [0050] 上述说明：按照实施例中的方法分离培养得到的人绒毛膜间充质干细胞，满足CD73、CD90、CD105 大于95%，为阳性；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR小于2%，为阴性的结果，经鉴定为间充质干细胞。 [0051] 组织贴壁法第一次分离获得细胞数量和本方法分离获得的细胞数量比较，方法及结果如下：从胎盘的靠近胎儿面剥离绒毛膜组织，清洗后剪碎，平铺在T-75细胞培养瓶底部，加入间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养，共培养10瓶，每4天更换一次间充质干细胞无血清培养基，培养过程中注意观察细胞长出情况，大概10天后进行传代，弃培养基，加入10ml DPBS清洗细胞一次，弃DPBS，加入3ml重组型胰酶消化细胞2min，用手轻轻拍打细胞培养瓶侧壁，使细胞脱落，加入10ml DPBS终止重组型胰酶作用，并用 10ml移液管吹打细胞，将细胞吹打成单细胞悬液并移至50ml离心管，组织遗留在培养瓶中，采用本专利方法二次分离间充质干细胞，50ml离心管1200rpm离心5min，弃上清，加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并混合在一起计数，将细胞悬液平均分至5个T-75培养瓶中，并将培养瓶中间充质干细胞无血清培养基补足14ml，于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养，两天后按照实施例3中所述步骤，按照1:3进行传代，共传代3次，每次传代均进行计数。利用本专利方法最开始同样培养10个T-75培养瓶，同样传代三次并计数。 [0052] 结果说明：将两种方法每次传代的计数结果进行比较，绘制柱状图，如图3所示，本发明方法分离获得的细胞数明显高于第一次分离的细胞量，而且随着传代次数的增加差别更显著。 [0053] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。 |
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