一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法

申请号 CN201611010468.4 申请日 2016-11-17 公开(公告)号 CN106676054A 公开(公告)日 2017-05-17
申请人 华南农业大学; 发明人 彭昌操; 杨紫薇; 刘思雯; 朱其金; 董甜甜; 宋亚男; 郑丹菁;
摘要 本 发明 属于细胞 生物 学、生物化学和分子生物学等技术领域,公开了一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。其中包括以下操作步骤:(1)将拟南芥 叶片 在Medium I中低速匀浆;(2)过滤之后1500g 4℃ 水 平离心5min;(3)叶绿体沉淀用Medium II悬浮后,在40%/80%percoll梯度中3000g 4℃水平离心30min。(4)吸出完整叶绿体,用SH buffer洗涤两次;(5)叶绿体沉淀用SH buffer悬浮后色素定量。
权利要求

1.一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(1)用具预冷;
(2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片,置于上;
(3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I),低速匀浆;
(4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤,1500g平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。
(5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮;
(6)配置40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min;
(7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处,将完整叶绿体吸出;用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min;
(8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。
2.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,用具预冷包括将组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂在冰上或者-20℃预冷。
3.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述Medium I的配方为:330mM sorbitol,30mM Tricine-KOH pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3。
4.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述Medium II的配方为:300mM sorbitol,20mM Hepes-KOH pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA。
5.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述SH buffer的配制方为:330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加。
6.根据权利要求1所述的提取方法,其特征在于,Percoll梯度配制方法为:首先配制含
6%(w/v)sorbitol的100%Percoll,然后配制Percoll梯度;40%组分为7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer,80%组分为4ml 100%Percoll+1ml SH buffer,5ml的80%组分用长针头缓慢注射到40%组分底部。
7.根据权利要求1所述的一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于:
使用3层miracloth或者8层纱布过滤至50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min。
8.根据权利要求1所述的一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于:
在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min。

说明书全文

一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法

技术领域

[0001] 本发明属于细胞生物学、生物化学和分子生物学等技术领域,特别涉及一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。

背景技术

[0002] 拟南芥(Arabidopsis thaliana),又名鼠芥,是目前已知植物基因组中最小的,也是一种应用十分广泛的模式生物。而叶绿体是植物细胞特有的细胞器,是植物进行光合作用的场所,除了光合作用外,还参与基酸、脂肪酸、植物生长物质、维生素等的合成。因而,植物叶绿体的发育与功能研究一直倍受人们关注。同时,获得高纯度的叶绿体用于蛋白质功能的研究成为先决条件。目前,关于拟南芥叶绿体提取的方法,大多数由提取菠菜和豌豆叶绿体的方法改进而来。1985年Riet等人的分离方法只用了一种浓度的percoll梯度,得到的叶绿体纯度不够;2008年Daniel Salvi的提取方法需要用到较高条件的高速平离心机。还有一些方法提取液的配方复杂,花费时间长。本发明提供了一种快速简易的完整叶绿体提取方法,提取时间短,配方简单,离心要求低,进行定量测定后,可以直接运用于叶绿体膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取等各种后续研究。

发明内容

[0003] 为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种快速简易的完整叶绿体的提取方法。
[0004] 本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0005] 一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
[0006] (1)用具预冷;
[0007] (2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片,置于上;
[0008] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I),低速匀浆;
[0009] (4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色;
[0010] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮;
[0011] (6)配置40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min;
[0012] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处,将完整叶绿体吸出;用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min;
[0013] (8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。
[0014] 更为具体地,一种快速简易的完整叶绿体提取方法,包括以下操作步骤:
[0015] (1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷,离心均在4℃条件下。
[0016] (2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片共20g,置于冰上。
[0017] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I)(330mM sorbitol(山梨糖醇),30mM Tricine-KOH(三甲基甘氨酸-氢)pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3),低速匀浆,时间不宜超过5min。
[0018] (4)使用3层miracloth(神奇滤布)或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。
[0019] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)(300mM sorbitol(山梨糖醇),20mM Hepes-KOH(4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾)pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。
[0020] (6)在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至4个percoll梯度上层,3000g水平离心30min。
[0021] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll(细胞分离液)组分的交界处(5ml刻度线),小心将完整叶绿体吸出,每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min。
[0022] (8)沉淀用适量SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。
[0023] (Percoll(细胞分离液)梯度配制:首先配制含6%(w/v)sorbitol(山梨糖醇)的100%Percoll(细胞分离液),然后配制Percoll(细胞分离液)梯度。40%组分,7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer;80%组分,4ml 100%Percoll+1ml SH buffer。)[0024] 与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
[0025] (1)本发明不需要将拟南芥暗处理过夜,节省步骤和时间。
[0026] (2)本发明的三个提取液配方简单,但是能提取到大量有活的叶绿体。
[0027] (3)本发明改进了步骤4、6离心力的大小,大大降低了对离心机的要求。
[0028] (4)本发明改进了步骤6离心的时间,使得获得尽可能多的完整叶绿体。附图说明
[0029] 图1是使用本发明提取的拟南芥完整叶绿体图,(注:Bar=5μm)。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
[0031] 实施例1一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法
[0032] (1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷,离心均在4℃条件下。
[0033] (2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片共20g,置于冰上。
[0034] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(330mM sorbitol,30mM Tricine-KOH pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3),低速匀浆,时间不宜超过5min。
[0035] (4)使用3层miracloth或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。
[0036] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(300mM sorbitol,20mM Hepes-KOH pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。
[0037] (6)在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll梯度,将样品上样至4个percoll梯度上层,3000g水平离心30min。
[0038] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处(5ml刻度线),小心将完整叶绿体吸出,每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min。
[0039] (8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。
[0040] (Percoll梯度配制:首先配制含6%(w/v)sorbitol的100%Percoll,然后配制Percoll梯度。40%组分为7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer,80%组分为4ml 100%Percoll+1ml SH buffer,5ml的80%组分用长针头缓慢注射到40%组分底部。)[0041] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
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