一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法 |
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申请号 | CN201611010468.4 | 申请日 | 2016-11-17 | 公开(公告)号 | CN106676054A | 公开(公告)日 | 2017-05-17 |
申请人 | 华南农业大学; | 发明人 | 彭昌操; 杨紫薇; 刘思雯; 朱其金; 董甜甜; 宋亚男; 郑丹菁; | ||||
摘要 | 本 发明 属于细胞 生物 学、生物化学和分子生物学等技术领域,公开了一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法。其中包括以下操作步骤:(1)将拟南芥 叶片 在Medium I中低速匀浆;(2)过滤之后1500g 4℃ 水 平离心5min;(3)叶绿体沉淀用Medium II悬浮后,在40%/80%percoll梯度中3000g 4℃水平离心30min。(4)吸出完整叶绿体,用SH buffer洗涤两次;(5)叶绿体沉淀用SH buffer悬浮后色素定量。 | ||||||
权利要求 | 1.一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于,包括以下操作步骤: |
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说明书全文 | 一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法技术领域背景技术[0002] 拟南芥(Arabidopsis thaliana),又名鼠耳芥,是目前已知植物基因组中最小的,也是一种应用十分广泛的模式生物。而叶绿体是植物细胞特有的细胞器,是植物进行光合作用的场所,除了光合作用外,还参与氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、维生素等的合成。因而,植物叶绿体的发育与功能研究一直倍受人们关注。同时,获得高纯度的叶绿体用于蛋白质功能的研究成为先决条件。目前,关于拟南芥叶绿体提取的方法,大多数由提取菠菜和豌豆叶绿体的方法改进而来。1985年Riet等人的分离方法只用了一种浓度的percoll梯度,得到的叶绿体纯度不够;2008年Daniel Salvi的提取方法需要用到较高条件的高速水平离心机。还有一些方法提取液的配方复杂,花费时间长。本发明提供了一种快速简易的完整叶绿体提取方法,提取时间短,配方简单,离心要求低,进行定量测定后,可以直接运用于叶绿体膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取等各种后续研究。 发明内容[0003] 为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种快速简易的完整叶绿体的提取方法。 [0004] 本发明的目的通过下述技术方案实现: [0005] 一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法,其特征在于,包括以下操作步骤: [0006] (1)用具预冷; [0008] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I),低速匀浆; [0009] (4)使用miracloth(神奇滤布)或者纱布过滤,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色; [0010] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)轻柔悬浮; [0011] (6)配置40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至percoll梯度上层,3000g水平离心30min; [0012] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处,将完整叶绿体吸出;用SH buffer(SH缓冲液)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min; [0013] (8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。 [0014] 更为具体地,一种快速简易的完整叶绿体提取方法,包括以下操作步骤: [0015] (1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷,离心均在4℃条件下。 [0016] (2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片共20g,置于冰上。 [0017] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(缓冲液I)(330mM sorbitol(山梨糖醇),30mM Tricine-KOH(三甲基甘氨酸-氢氧化钾)pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3),低速匀浆,时间不宜超过5min。 [0018] (4)使用3层miracloth(神奇滤布)或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。 [0019] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(缓冲液II)(300mM sorbitol(山梨糖醇),20mM Hepes-KOH(4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾)pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。 [0020] (6)在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll(细胞分离液)梯度,将样品上样至4个percoll梯度上层,3000g水平离心30min。 [0021] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll(细胞分离液)组分的交界处(5ml刻度线),小心将完整叶绿体吸出,每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min。 [0022] (8)沉淀用适量SH buffer(SH缓冲液)(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。 [0023] (Percoll(细胞分离液)梯度配制:首先配制含6%(w/v)sorbitol(山梨糖醇)的100%Percoll(细胞分离液),然后配制Percoll(细胞分离液)梯度。40%组分,7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer;80%组分,4ml 100%Percoll+1ml SH buffer。)[0024] 与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果: [0025] (1)本发明不需要将拟南芥暗处理过夜,节省步骤和时间。 [0026] (2)本发明的三个提取液配方简单,但是能提取到大量有活力的叶绿体。 [0027] (3)本发明改进了步骤4、6离心力的大小,大大降低了对离心机的要求。 [0029] 图1是使用本发明提取的拟南芥完整叶绿体图,(注:Bar=5μm)。 具体实施方式[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。 [0031] 实施例1一种快速简易的拟南芥完整叶绿体的提取方法 [0032] (1)本方法所有用具(组织捣碎匀浆机、烧杯、试管、试剂等)需在冰上或者-20℃预冷,离心均在4℃条件下。 [0033] (2)在培养箱光周期开始2-3h时,取3-4周的拟南芥叶片共20g,置于冰上。 [0034] (3)然后在匀浆机中加入200ml的Medium I(330mM sorbitol,30mM Tricine-KOH pH 8.4,5mM EGTA,5mM EDTA,10mM NaHCO3),低速匀浆,时间不宜超过5min。 [0035] (4)使用3层miracloth或者8层纱布过滤至4个50ml圆底离心管中,1500g水平离心5min,沉淀为墨绿色粗叶绿体,上清为浅绿色。 [0036] (5)尽量去除上清,沉淀用约5ml的Medium II(300mM sorbitol,20mM Hepes-KOH pH 7.6,5mM MgCl2,2.5mM EDTA)轻柔悬浮(枪头剪大口)。 [0037] (6)在50ml离心管中配置23ml 40%/80%percoll梯度,将样品上样至4个percoll梯度上层,3000g水平离心30min。 [0038] (7)完整叶绿体位于上下两个percoll组分的交界处(5ml刻度线),小心将完整叶绿体吸出,每一个percoll交界处可吸出5-10ml叶绿体。用SH buffer(330mM sorbitol,50mM Hepes-KOH pH 8.0,2mM DTT,DTT需现用现加)稀释3倍,1500g水平离心2min,沉淀重悬于25ml SH buffer,1000g离心1min。 [0039] (8)沉淀用适量SH buffer悬浮(约5-10ml),可以立即镜检观察叶绿体,并色素定量。 [0040] (Percoll梯度配制:首先配制含6%(w/v)sorbitol的100%Percoll,然后配制Percoll梯度。40%组分为7.2ml 100%Percoll+10.8ml SH buffer,80%组分为4ml 100%Percoll+1ml SH buffer,5ml的80%组分用长针头缓慢注射到40%组分底部。)[0041] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。 |