[0001] 本发明涉及原代细胞培养技术领域，尤其是涉及一种改良原代地鼠肾细胞传代培养方法。

[0002] 原代地鼠肾细胞是指从金黄地鼠肾脏组织中取出，并经过蛋白酶消化分解或者机械方法分离成单个细胞后，加以特殊配方并含有细胞因子、添加剂的培养基而得以生长和繁殖的细胞。

[0003] 传代培养是指当原代细胞培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，需将细胞培养物通过特殊消化液重新分散成单个细胞，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。

[0004] 原代地鼠肾细胞狂犬疫苗是我国最早大规模生产应用的狂犬病毒疫苗产品。1980年，中国武汉生物制品研究所林放涛教授领导的小组率先研制成功含铝佐剂的原代地鼠肾细胞狂犬疫苗，使我国狂犬病疫苗的生产赶上了国际先进水平。在随后的二十多年里，地鼠肾细胞狂犬疫苗为我国的狂犬病防治工作作出了极大贡献。

[0005] 原代地鼠肾细胞需要从活体金黄地鼠的体内分离获得，近些年由于生物制药行业对实验动物的监管越来越严格和动物饲养成本的上升，导致地鼠价格逐年升高，而地鼠的市场供应量却在减少。地鼠的价格和数量已成为制约狂犬疫苗生产企业发展的一大难题。为保证疫苗的正常生产，人们研究对原代地鼠肾细胞进行传代培养，利用传代后的地鼠肾细胞用于疫苗的生产。

[0006] 原代地鼠肾细胞作为生产狂犬疫苗的细胞基质，是狂犬疫苗生产中的基础和前提，能否培养出性状良好的地鼠肾单层细胞将直接决定狂犬疫苗的产量和质量。目前国内原代地鼠肾细胞狂犬疫苗生产工艺，对地鼠肾细胞的利用仅为解剖分散后的第一代细胞。主要原因为采用传统技术对原代地鼠肾细胞传代后，由于消化过程对细胞的损失大，造成传代扩增后细胞生长活性降低，难以生长成单层和再次传代，无法实现大规模生产应用。

[0007] 《中国药典》中对于原代细胞规定，原始细胞培养的细胞或5代以内的传代细胞均可用于疫苗生产。且采用原代细胞制备狂犬疫苗，可以避免使用传代细胞系中存在的致瘤性风险，提升疫苗产品的安全性。因此实现原代地鼠肾细胞的传代培养，将对狂犬疫苗生产企业的产品产量和质量的提升具有重要的意义。

[0008] 现有技术对原代细胞的传代培养方法为：待原代细胞长成单层后，采用含蛋白酶的消化液对细胞进行消化，分散成单个细胞后按比例接种于新的细胞瓶，加入适量含血清的细胞培养基，在一定温度下静置或转瓶培养成单层细胞。实际培养时，由于消化过程对细胞的损失大，难以生长成单层，无法实现原代细胞的大规模传代，具体体现在：1）细胞活性降低，形态变差，生长缓慢；2）难以生长成单程细胞，当接种狂犬病毒后，细胞脱落快，收获液毒力较低；3）细胞无法实现多次传代，一般传代至2 3次后细胞即停止生长，无法满足疫~苗生产使用。

[0009] 本发明的目的在于针对上述现有技术存在的缺陷，提供一种改良原代地鼠肾细胞传代培养方法，采用本发明的培养方法能使单层地鼠肾原代细胞传代后，细胞的数量和生长状态满足疫苗的生产要求。

[0010] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：本发明所述的改良原代地鼠肾细胞传代培养方法包括下述步骤：
第一步，选择生长72 96小时，细胞形态好、活力旺盛，在3L转瓶中已培养成致密单层的~
原代地鼠肾细胞作为母细胞；
第二步，弃去3L转瓶中的上清液，用PBS溶液洗去原代细胞上附着的组织块和残留血清；
第三步，在3L转瓶中加入0.02% EDTA溶液，轻轻转动瓶壁收集表层细胞；另取15L收集瓶，瓶内添加一定量含10-15%新生牛血清的MEM培养液，然后将从5 10个3L转瓶中收集的表~
层细胞加入到该15L收集瓶的培养液中备用；
第四步，在收集表层细胞后的3L细胞瓶中添加由终浓度0.1%胰酶和0.02%EDTA混合而成的消化液，并将消化液沿瓶壁轻轻转动，使消化液均匀浸润细胞表面，作用30 60秒后弃~
去消化液，残留在细胞表面的消化液继续起消化作用；
第五步，当3L细胞瓶内壁变得模糊，其上的细胞层开始松动，有裂纹和脱落时，向瓶内加入生长液，震荡瓶体使细胞分散均匀制得细胞悬液；
第六步，将5 10个3L细胞瓶内消化制得的细胞悬液收集到一个15L瓶中，与第三步在~
15L细胞瓶中收集的表层细胞合并在一个15L瓶中，补加适量的生长液，混合均匀后按400ml
500ml分装在灭菌后的3L细胞培养瓶中，包扎瓶口后放在转瓶机上；
~
第七步，将转瓶机送入37±1℃恒温室内，接通电源，调节转瓶机转速至6～8转/小时，培养至细胞长成单层，形成第一代传代细胞；
第八步，将第一代传代细胞按步骤三到步骤七的顺序操作，得到第二代传代细胞，依次类推，得到五代传代细胞。

[0011] 其中第四步中的消化液是由浓度1%胰酶和0.02%EDTA按1:9的比例混配而成。第五步中所用的生长液是由含10-15℅新生牛血清的MEM培养基组成，补加L-精氨酸至1.2 mmol/L，调节PH至 6.8-7.0。

[0012] 本发明的传代方法优化了细胞消化过程，将表层细胞和深层细胞分开消化，减小细胞消化时损伤，避免了细胞活性的降低；将多瓶细胞消化后混合，然后再行分装，可以使生长状态不同的细胞间相互补偿，减少了瓶间差异，使传代后细胞瓶间均质性更好，当生长成单层后即可达到疫苗的生产需求。本发明方法培养的传代细胞活性高，贴壁时间短，细胞形态良好，可支持原代地鼠肾细胞传代5次以上，能明显减缓细胞衰减，以1:2-1:3的分种率，均能生长成致密单层细胞，达到疫苗生产的要求。

[0013] 下面通过具体实施例对本发明的传代培养方法做更加详细的说明。

[0014] 选取健康的金黄地鼠，解剖取肾，消化分散，加入含8-10%新生牛血清的MEM培养基，在37℃条件下，在3L转瓶里培养成单层细胞，每个3L单瓶细胞数为1.8×108个以上（以每批100个3L细胞瓶为例），将其作为母细胞进行传代。

[0015] 1）弃去3L转瓶中的上清液，加入PBS溶液80 100ml，洗去原代细胞上附着的组织块~和残留血清；
2）加入0.02% EDTA溶液50 80ml，沿瓶壁适当晃动，然后将3L转瓶中易消化的表层细胞~
收集到一个15L收集瓶内，瓶内预先添加含10-15%新生牛血清的MEM培养液2000ml，备用；
3）在收集表层细胞后的3L转瓶中加入由0.1%胰酶和0.02%EDTA溶液（按1:9比例）混合而成的消化液50 80ml，并沿瓶壁轻轻转动，使表面均匀浸润有消化液的细胞贴附在瓶壁~
上，作用30 60秒后，弃去消化液，残留在细胞表面的消化液继续起消化作用；细胞消化时间~
会因温度不同差异较大，一般情况下，温度越高消化越快；
4）观察转瓶，当内壁变得模糊，其上的细胞层开始松动，有裂纹和脱落时将其从瓶壁上取下，加入生长液（由含10-15℅新生牛血清的MEM培养基组成，并补加L-精氨酸至1.2 mmol/L，调节PH至 6.8-7.0）200 300ml/瓶，沿同一方向震荡瓶体，使细胞分散均匀，制得细~
胞悬液；
5）将10个3L转瓶内的细胞悬液收集到一个15L的培养瓶中，并与第二步收集在15L收集瓶中的表层细胞悬液合并，补加生长液至10000 ml，摇匀后按400ml 500ml/瓶分装在灭菌~
后的3L细胞培养瓶中，包扎瓶口，轻摇混匀后放置在转瓶机上；按1:2的分种率，转瓶机上的
3L细胞培养瓶约为200个；
6）将转瓶机送入37±1℃恒温室内，接通电源，调节转瓶机转速至6～8转/小时，培养时间90 100小时，至瓶内细胞长成单层，形成第一代传代细胞，观察发现：24小时细胞贴壁达~
80%；72小时基本可长成单层，细胞密度达1.2-1.5×108个/瓶；96小时可长成致密单层，细胞密度可达1.8-2.0×108个/瓶；培养过程中死细胞数量较少，表明杂质少，无拉长、圆缩等不良病变；
7）将第一代得到的传代细胞200瓶，按照步骤2）6）的顺序，可以培养出第二代传代细~
胞400瓶，第二代传代细胞的细胞密度可达1.5-1.8×108个/瓶；依次类推，第五代传代细胞的细胞密度仍可达1.5×108个/瓶以上，可以满足疫苗生产需要。

[0016] 将第五代以后细胞继续进行传代培养，第六代以后细胞生长情况逐渐变差，细胞密度减小，不能满足疫苗的生产需要。