一种高效捕获细胞的方法 |
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| 申请号 | CN201611122625.0 | 申请日 | 2016-12-08 | 公开(公告)号 | CN106591236A | 公开(公告)日 | 2017-04-26 |
| 申请人 | 深圳市达科为生物工程有限公司; | 发明人 | 姜维; 吴庆军; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提出一种高效捕获细胞的方法，包括以下几个步骤：A1. 磁珠 的活化；A2.磁珠的修饰：使用特定的长链化合物对活化后的磁珠进行修饰，获得磁珠‑长链化合物复合物，形成的复合物具有立体网状结构，表面有大量的长链凸起；A3.免疫磁珠的制备：在所述的长链化合物外偶联 抗体 ；A4.特定细胞的捕获与分离富集。本发明捕获细胞的方法，通过使用特定的长链化合物对磁珠进行修饰，形成的磁珠‑长链化合物复合物具有立体网状结构，增加了抗体和细胞结合的概率，大大提高了免疫磁珠捕获细胞的效率和灵敏度，并且不会增加分离的难度，促进了其在临床上的应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高效捕获细胞的方法，其特征在于，包括以下几个步骤： |
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| 说明书全文 | 一种高效捕获细胞的方法技术领域背景技术[0002] 免疫磁珠技术是近年发展起来将固化试剂的优点和免疫学反应高度特异性结合于一体的一项新技术，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物。生化和分子遗传学等各个领域，在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到广泛应用。磁性高分子微球，简称磁性复合微球、磁性微球或磁珠，是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性，还能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基，如－OH、－COOH、－CHO、－NH2等，此外，磁性微球还具有磁响应性，能够在外加磁场作用下具有导向功能。免疫磁珠是具有活性基团的磁性微球，所述免疫磁珠既可结合活性蛋白质，又可被磁铁吸引，经处理后，抗体结合到磁珠上，与特异性抗原物质结合，形成磁珠-抗体-抗原免疫复合物。这种复合物能够在磁力作用下发生力学移动。 [0003] 免疫磁珠由三部分组成，核心是金属小颗粒，核心外层均匀包裹一层高分子材料，最外层为功能基层，如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、环氧基(-CH(O)CH-)等，磁珠呈均匀球形，具有超顺磁性和保护性外壳。免疫磁珠可以应用在免疫检测，细胞分离，生物大分子纯化，分子生物学应用及食品检验检测等方面，细胞分离是免疫磁珠最主要的应用，用免疫磁珠进行细胞分离只需要抗体和磁铁，具有简单、便捷、可靠的优点。目前免疫磁珠可以分离多种细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、内皮细胞、造血干细胞、循环肿瘤细胞等。 [0004] 目前免疫磁珠分离细胞最大的问题是分离效率的问题，现有技术将抗体固化在磁珠的表面，因抗体和细胞接触的机会有限，造成捕获特定细胞的效率较低。如何提高免疫磁珠捕获细胞的效率，尤其是稀有细胞的捕获率是限制其在临床应用的重要难题。 发明内容[0005] 本发明的目的是解决现有技术捕获细胞(尤其是稀有细胞)效率不高的问题，提供一种高效捕获细胞的方法。 [0006] 为了实现上述目的，本发明提供了一种高效捕获细胞的方法，其特征在于，包括以下几个步骤： [0007] A1.磁珠的活化； [0008] A2.磁珠的修饰：使用特定的长链化合物对活化后的磁珠进行修饰，获得磁珠-长链化合物复合物，形成的复合物具有立体网状结构，表面有大量的长链凸起； [0009] A3.免疫磁珠的制备：在所述的长链化合物外偶联抗体； [0010] A4.特定细胞的捕获与分离富集：通过抗体与特定细胞表面的抗原发生反应，实现对特定细胞的捕获与分离富集。 [0011] 优选地，所述步骤A1中磁珠的活化，具体为：取一定量的磁珠，用磷酸盐缓冲液冲洗后，制备磁珠与磷酸盐缓冲液的混合物，在所述混合物中加入EDC和NHS，室温反应一段时间。 [0012] 优选地，所述步骤A2中特定的长链化合物的相对分子量为1万-10万，分子链的末端均具有活性基团，其中一个末端与磁珠偶联，所述长链化合物在磁性微球的外面形成立体网状结构。 [0013] 优选地，所述步骤A2中所述特定长链化合物为单链或者支链化合物，链的一端通过共价偶联、疏水作用力或分子间作用力与磁珠偶联。 [0014] 优选地，所述步骤A2中特定的长链化合物末端均具有活性基团，是指长链化合物末端或支链末端均具有活性基团，该基团可以是羟基、羧基、氨基、对甲苯磺酰基、环氧基。 [0015] 优选地，所述步骤A3中在所述特定的长链化合物外偶联抗体，是指在所述特定的长链化合物末端或支链末端直接偶联抗体，形成磁珠-长链化合物-抗体复合物；或者在所述特定的长链化合物末端或支链末端先偶联亲和素，然后再和生物素化的抗体结合，形成磁珠-长链化合物-亲和素-生物素-抗体复合物。 [0016] 优选地，所述步骤A4中特定细胞的捕获具体为，通过抗体与特定细胞表面的抗原发生反应，形成磁珠-长链化合物-抗体-特定细胞复合物或者磁珠-长链化合物-亲和素-生物素-抗体-特定细胞复合物，从而实现对特定细胞的捕获。 [0017] 优选地，所述步骤A4中特定细胞的分离与富集具体为，通过磁分离和溶剂洗涤，将获得的产物重选于细胞保存液中，从而获得一定浓度的特定细胞。 [0018] 优选地，所述步骤A1中磁珠的核心是金属小颗粒，核心外均匀包裹一层高分子材料，磁性微球的表面具有功能基团。 [0019] 优选地，所述步骤A1中磁珠的直径为50nm-50μm，形状可以为任意形状，优选为球形。 [0020] 本发明的有益效果为： [0021] 本发明捕获细胞的方法，通过在磁珠外偶联特定的长链化合物，获得磁珠-长链化合物复合物，再在长链化合物外偶联抗体，通过抗体与特定细胞表面的抗原发生反应，从而实现对特定细胞的捕获。由于所形成磁珠-长链化合物复合物具有立体网状结构，表面有大量的长链凸起，极大增加了抗体和特定细胞表面抗原结合的机会，从而增加了抗体和特定细胞结合的概率，因此，大大提高了免疫磁珠捕获细胞的效率和灵敏度，并且不会增加分离的难度，促进了免疫磁珠在临床上的应用。附图说明 [0022] 图1是本发明实施例1捕获细胞方法的示意图。 [0023] 图2是本发明实施例1中单个单链化合物捕获细胞方法的示意图。 [0024] 图3是本发明实施例1中单个支链化合物捕获细胞方法的示意图。 具体实施方式[0025] 以下通过一个优选的实施例对本发明作详细阐述，下述实施例中：所使用的实验方法、检测方法或分析方法等如无特别说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特别说明，均可以从市购获得，所述的“常温”是指25-37℃。 [0026] 实施例1 [0027] 本实施例的捕获细胞方法的示意图，如图1所示。在图1中，1表示磁珠；2表示长链化合物；3表示亲和素；4表示生物素；5表示抗体；6表示特定细胞。由图1中可知，本实施例的捕获细胞的方法，具体包括以下几个步骤： [0028] 1、磁珠的活化 [0029] 取1mg的羧基磁珠，用磷酸盐缓冲液冲洗三次，用磷酸盐缓冲液定容到2ml，加入1mgEDC和3mg NHS，室温反应15min，活化磁珠。其中，EDC的中文全称为：1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS的中文全称为：N-羟基琥珀酰亚胺。 [0030] 2、磁珠的修饰 [0031] 在上述活化后的磁珠的混合溶液中，加入1mg的聚氨基葡萄糖羧酸钠，震荡反应3h，磁分离洗涤，获得磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠复合物，4℃储藏备用。其中，聚氨基葡萄糖羧酸钠是聚氨基葡萄糖羧酸的钠盐，聚氨基葡萄糖羧酸是聚氨基葡萄糖的一种衍生物，聚氨基葡萄糖也叫壳聚糖，其上有大量的氨基和羟基，氨基葡萄糖羧酸对壳聚糖进行了羧基化处理，在壳聚糖的基础上引入了羧基。聚氨基葡萄糖羧酸钠的分子量分布广泛，分子量从 4万-40万都可以直接购买到，推荐此处分子量范围可以为4万-6万。 [0032] 3、免疫磁珠的制备 [0033] 3.1修饰后的磁珠直接偶联抗体 [0034] 在制备得到的磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠复合物中加入2ml的PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，混匀。加入1mgEDC和3mg NHS，室温反应15min。加入100ug的EpCAM单克隆抗体，室温震荡反应12-16h，此分离去除上清液。PBS清洗磁珠2-3次，重悬后制得磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠-抗体复合物。 [0035] 3.2修饰后的磁珠先偶联亲和素，再偶联生物素化的抗体 [0036] 在制备得到的磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠复合物中加入2ml的PBS(磷酸盐缓冲液)重悬，混匀。加入20μg的链酶亲和素，震荡孵育6h，加入BSA(牛血清白蛋白)的质量分数为0.5％的PBS溶液，封闭1h，制备磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸-链酶亲和素复合物，4℃储藏备用。 [0037] 在制备得到的复合物中加入生物素化的EpCAM单克隆抗体(上皮粘附分子)，震荡混匀，室温孵育15min，获得磁性微球-聚氨基葡萄糖羧酸-链酶亲和素-生物素-抗体复合物，4℃储藏备用。 [0038] 使用亲和素和生物素系统优点：(1)处理过程更容易，整个免疫磁珠制备的时间可以缩短；(2)可以保证抗体的活性，抗体直接和磁珠偶联，可能会导致抗体效价降低或失活，影响效果；而亲和素-生物素系统已经被证实不会对抗体的活性产生影响；(3)可以制备成链酶亲和素化的免疫磁珠作为基础磁珠，只需要购买生物素化抗体进行简单的偶联即可获得针对不同靶标的免疫磁珠，灵活方便高效。 [0039] 4、循环肿瘤细胞的捕获与分离富集 [0040] 在含有循环肿瘤细胞的样本中加入适量的免疫磁珠复合物，室温震荡孵育15min，磁分离期分离，用PBS溶液洗涤三次，将获得的产物重选于细胞保存液中，获得浓度的循环肿瘤细胞。其中，所述的磁分离是指在磁场作用力下将免疫磁珠结合细胞样品分离。 [0041] 在本实施例中，磁珠外偶联的特定长链化合物为聚氨基葡萄糖羧酸钠，在其他实施例中，特定的长链化合物可以为聚L-乳酸(分子量1万-20万，根据需要可以自由选择，聚乳酸在链的两端分别有一个羟基和羧基)，聚丙烯酸(分子量1万-10万，根据需要可以自由选择)等。 [0042] 本实施例捕获细胞的方法，通过在磁珠外偶联特定的长链化合物聚氨基葡萄糖羧酸钠，获得磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠复合物，再在聚氨基葡萄糖羧酸钠外偶联抗体，通过抗体与循环肿瘤细胞表面的抗原发生反应，从而实现对循环肿瘤细胞的捕获。由于所形成磁珠-聚氨基葡萄糖羧酸钠复合物具有立体网状结构，表面有大量的长链凸起，极大增加了抗体和循环肿瘤细胞表面抗原结合的机会，从而增加了抗体和循环肿瘤细胞结合的概率，因此，大大提高了免疫磁珠捕获循环肿瘤细胞的效率和灵敏度，并且不会增加分离的难度，促进了免疫磁珠在临床上的应用。 [0043] 在本实施例中，磁珠外偶联的特定长链化合物为聚氨基葡萄糖羧酸钠，是单链化合物，在其他实施例中，磁性微球外偶联的特定长链化合物可以为单链化合物，也可以为支链化合物，也可以是二者的结合。为了更形象地表示单链或支链化合物偶联抗体进行细胞捕获，图2和图3分别对单个单链和支链化合物进行描述。在图2和图3中，各标号表示的物质与图1相同，同样为，1表示磁珠；2表示长链化合物；3表示亲和素；4表示生物素；5表示抗体；6表示特定细胞。 [0044] 从图2中可以看到，磁珠外偶联单链化合物，在单链化合物的末端直接偶联抗体，或者在单链化合物的末端先偶联亲和素，然后再和生物素化的抗体结合，最后再进行特定细胞的捕获。从图3中可以看到，磁珠外偶联支链化合物，支链化合物有多个支链末端，在各个支链末端直接偶联抗体，或者在各个末端先偶联亲和素，然后再和生物素化的抗体结合，最后再进行特定细胞的捕获。从图2和图3中可以看到，当磁珠外偶联支链化合物时，由于支链化合物具有多个支链末端，所形成的磁珠-长链化合物立体网状结构，表面有更多的长链凸起，各个支链末端都可以偶联抗体，大大增加了磁珠外抗体的负载量，同时也极大地提高了捕获细胞的概率。 [0045] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。 |
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