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一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法
申请号	CN201710004365.5	申请日	2017-01-04	公开(公告)号	CN106591232A	公开(公告)日	2017-04-26
申请人	安徽安龙基因医学检验所有限公司;			发明人	韦玉军; 陆宝石; 李航;
摘要	本发明公开了一种高效的PD‑1‑CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：提取TIL细胞；将TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD‑1‑CD8+ T细胞；将纯化的PD‑1‑CD8+ T细胞加入到G‑Rex透气瓶中，用完全培养基进行培养，培养一周；快速扩增PD‑1‑CD8+ T细胞。本发明具有有效降低微生物污染率、扩增效率高、细胞毒活性高等优点。
权利要求	1.一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm3的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm2的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳10-40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： k、每5×106或10×106个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD- 1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 2.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织不小于1cm3。 3.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 4.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 5.根据权利要求1所述的一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，其特征在于：所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入 5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。
说明书全文	一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法技术领域 [0001] 本发明涉及肿瘤过继免疫细胞治疗领域领域，具体来说是一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法。背景技术 [0002] TIL 细胞疗法是免疫疗法的一种，这些年正在逐步发展，它最初的提出者是Rosenberg，TIL(Tumor infiltrating lymphocytes)指肿瘤浸润的淋巴细胞，其中主要效应细胞为CD8+T细胞，在手术切除的肿瘤组织中，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞，这些淋巴细胞中有部分是针对肿瘤特异性突变抗原的T细胞，是能够杀伤肿瘤细胞的，但是由于一些原因，例如肿瘤微环境和PD-1，他们的功能受到了抑制，不能在肿瘤组织中有效的杀伤肿瘤细胞，但是，科学家通过一些体外培养方法把这些肿瘤组织中的某类型的淋巴细胞富集起来，再回输给患者，就能够发挥抗肿瘤作用，而且联合PD-1效果会更好。 [0003] 虽然TIL细胞治疗技术进入临床，对鼻咽癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、淋巴癌等晚期癌症有一定疗效，但是由于TIL细胞的获取受到局部肿瘤细胞活力、肿瘤来源及大小等因素的制约，难以获得大量增殖的且高纯度的CD8+T细胞，限制了TIL的临床疗效，另一方面，目前临床上的TIL细胞通常从肿瘤组织分离出来之后，通过IL-2、CD3抗体等细胞因子的诱导作用，扩增为CD8+T细胞，但是这样的细胞有很大一部分是表面高表达PD-1分子的细胞，其和肿瘤表面的PD-L1结合，启动了CD8+T的凋亡程序，从而抑制了CD8+T的肿瘤杀伤作用，导致肿瘤细胞的免疫逃逸，极大地影响了TIL的临床疗效，也限制了其在临床上的应用。 [0004] 目前，人们获得TIL细胞技术有诸多不足，要获得数量足够的用于临床治疗的PD-1-CD8+T细胞，是一项劳动和技术密集性地操作，而且目前主要使用24孔板、塑料透气平瓶和透气袋等容器，这就要求更多的人力、更多的时间、更多的培养基、更多的容器等等，也占用了更多培养箱空间，同时，比如24孔板属于一种开放式的培养系统，更容易被微生物污染，另外操作中多次扩增，也都增加了微生物污染的风险。发明内容 [0005] 本发明的目的是为了解决现有技术中的临床治疗效果差、易受到微生物污染以及扩增效率低下的缺陷，提供一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法来解决上述问题。 [0006] 本发明公开了一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm3的小块，置于容积为40ml、底部 2 面积为10 cm的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳10-40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： k、每5×106或10×106个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD- 1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 [0007] 作为优选，所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织不小于1cm3。 [0008] 作为优选，所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 [0009] 作为优选，所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 [0010] 作为优选，所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。 [0011] 本发明相比现有技术具有以下优点：1、本发明使用了流式细胞分选仪，筛选出高纯度的目的细胞，即PD-1-CD8+T细胞，大量扩增培养后，可显著增强TIL细胞的细胞毒活性，更特异的杀伤患者肿瘤细胞，显著改善临床疗效。 [0012] 2 、两步法中培养中都使用了G-Rex透气瓶，其中获得TIL细胞使用了G-Rex10透气瓶，快速扩增TIL细胞使用了G-Rex100透气瓶，本发明采用G-Rex 透气瓶进行培养，其扩增细胞效率更高，快速扩增目的细胞的同时，可以节省大量的培养基、透气袋、细胞因子等，也节约了培养箱空间，节省了人力，同时由于这种培养瓶的密闭性，减少了微生物污染的几率。 [0013] 3、本发明使用了两部法快速扩增TIL细胞，即先使用高浓度的IL-2诱导扩增，再使用Anti-CD3抗体和健康供者经50Gy辐照灭活的PBMC（人外周血单个核细胞）共同刺激TIL细胞，使之得以大量快速扩增。附图说明 [0014] 图1为本发明一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法的快速扩增PD-1-CD8+ T细胞的流程图。具体实施方式 [0015] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 [0016] 如图1所示，本发明公开了一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1～2mm3的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm2的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充10～40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳10-40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： k、每5×106或10×106个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD- 1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 [0017] 作为优选，所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织不小于1cm3。 [0018] 作为优选，所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 [0019] 作为优选，所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 [0020] 作为优选，所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。 [0021] 实施例1一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1.5mm3的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm2的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充25ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳10-40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： k、每5×106个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD-1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 [0022] 所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织不小于1cm3。 [0023] 所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 [0024] 所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 [0025] 所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。 [0026] 实施例2本发明公开了一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成1mm3的小块，置于容积为40ml、底部面积为10 cm2的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充10ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳25×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： k、每10×106个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm2、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD-1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 [0027] 所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织为1cm3。 [0028] 所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 [0029] 所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 [0030] 所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。 [0031] 实施例3本发明公开了一种高效的PD-1-CD8+T细胞的培养方法，具体步骤为：步骤一、获得TIL细胞：（1）、提取TIL细胞： a、取新鲜的病人肿瘤组织，在无菌条件下，将肿块周边的黄色脂肪组织及血块切除，留下中心部分备用； b、在无菌环境下，将步骤a处理后的肿块切碎成2mm3的小块，置于容积为40ml、底部面 2 积为10 cm的G-Rex10透气瓶中； c、向G-Rex10透气瓶中补充40ml消化液，并震荡1min，将G-Rex10透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中，孵育30min； d、重复步骤c两次,直至肿块消化完全，得到悬浮液； e、将步骤d制得的细胞悬浮液采用Ficoll通过密度梯度离心法进一步分离纯化细胞； f、将所有细胞悬浮液置于50ml离心管内，在1500rpm的条件下,离心10min； g、弃上清，加入50ml PBS重悬细胞，在1500rpm的条件下,离心10min，再用20ml PBS重悬细胞，得到细胞悬浮液； h、按1:1的比例，向50ml离心管内加入10ml 100%淋巴细胞分离液、10ml 75%淋巴细胞分离液，然后缓慢加入步骤g制备得到的20ml细胞悬浮液，在2000rpm的条件下，离心20min，此时得到的100%淋巴细胞分离液上的白膜层为淋巴细胞，75%淋巴细胞分离液的上层为肿瘤细胞； i、从100%淋巴细胞分离液表面吸取白膜层，即为TIL细胞，在1500rpm的条件下，离心 5min； j、弃上清，在50ml的离心管里，采用PBS洗涤细胞两次，即制备得到TIL细胞悬浮液；（2）、将步骤j制备得到的TIL细胞悬浮液，通过流式细胞分选仪筛选，获得纯化的PD-1-CD8+ T细胞；（3）、将纯化的PD-1-CD8+T细胞加入到G-Rex10透气瓶中，用含6000U/ml IL-2的40ml完全培养基进行培养,之后每隔三天更换一半完全培养基，同时补充完全培养基，并添加 6000U/ml IL-2,每个G-Rex10透气瓶可容纳40×106个细胞，培养一周；步骤二、快速扩增PD-1-CD8+ T细胞： 6 2 k、每10×10 个PD-1-CD8+ T细胞置于一个底部面积为100 cm 、容积为500ml 的G-Rex100透气瓶中，添加经过50Gy辐照灭活的同种异体健康供者的PBMC，按照PBMC: PD-1-CD8+ T细胞=100:1的比例，同时添加30ng/ml CD3抗体、400ml 50/50培养基； l、第5天，取250ml细胞悬液，在1500rpm的条件下离心10min，然后加入150ml 50/50培养基重悬细胞，并加入到步骤k中的G-Rex100透气瓶中，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养； m、第7天，把300ml细胞悬浮液平均分成3等分，加入三个底部面积为100 cm2、容积为 500ml 的G-Rex100瓶中，补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； n、第11天，向每一个G-Rex100透气瓶中补加150ml AIM-V培养基，加5%AB血清，3000IU/ml IL-2，将G-Rex100透气瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中继续培养； o、第14天后，收获PD-1-CD8+ T细胞。 [0032] 所述的步骤a中，所述的病人肿瘤组织为2cm3。 [0033] 所述的步骤c中，所述的消化液的组成为：RPMI1640培养基、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ug/ml硫酸庆大霉素、30U/mlDNA酶、1.0mg/ml胶原酶。 [0034] 所述的步骤（3）中，所述的完全培养基的组成为: RPMI1640培养基、10%人AB血清、25mmol/L HEPES、10ug/ml硫酸庆大霉素。 [0035] 所述的步骤k和步骤l中，所述的50/50培养基的组成为：50%完全培养基、50%无血清培养基，并加入5%人AB血清、3000IU/ml IL-2。 [0036] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

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