一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201611152814.2 | 申请日 | 2016-12-14 | 公开(公告)号 | CN106591217A | 公开(公告)日 | 2017-04-26 |
| 申请人 | 四川大学; | 发明人 | 甘雪琦; 张玲; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法，解决了 现有技术 中原代VECs体外培养难度较大，细胞活性较低，产量较少的问题。本发明包括：步骤1、获得小鼠胸主动脉段，对小鼠胸主动脉段进行分离纯化后制成主动脉环；步骤2、用Matrigel基质胶预处理培养容器底部；步骤3、将主动脉环接种到Matrigel基质胶表面，再在培养容器内加入含内皮细胞生长辅助因子和肝素的内皮细胞培养液进行培养；步骤4、培育3～7天后去除主动脉环，继续培育即可。本发明简便易行、经济适用，具有降低杂质细胞污染几率、提高细胞成活率和产量，使VECs具有高活性和高增殖率等优点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括： |
||||||
| 说明书全文 | 一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法技术领域[0001] 本发明属于血管内皮细胞的取材、分离、纯化及培养领域，涉及一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法。 背景技术[0002] 血管是生物体运送血液的管道，为机体正常的新陈代谢和生长提供必要的氧气和营养物质，并输送走有害物质。血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)作为铺陈于血管内壁的一层多功能细胞，具有相当活跃的内分泌和代谢功能，在血管通透性屏障、免疫防御及炎性反应中起着极其重要的作用，可谓是维持血管正常功能的关键因素。但在某些疾病如肿瘤、心血管疾病、炎性反应疾病中，VECs则成为诸多毒素、病毒、炎症因子等攻击的重要靶位，其功能的改变也成为上述疾病发病过程中的重要环节。鉴于VECs涉及多种疾病的发病机制，因而建立VECs体外分离培养方法对于研究内皮细胞特性、对作用于血管的药物及抗肿瘤药物的研发具有重要意义。但VECs原代分离时易受杂质细胞污染，对生长环境营养要求高，易老化，冻存后复苏难，故建立简单、有效、可重复的培养方法显得尤为重要。 [0003] 小鼠作为最常用的实验动物，其来源丰富，价格低廉，对其VECs的分离培养，在临床和基础研究中具有广泛的应用价值。目前报道小鼠VECs的取材来源较多，如从心脏、肺和眼球中分离纯化VECs，但这些部位的操作复杂、技术难度高，并需要专门的仪器，如连接有抗体的磁珠等。而小鼠的大血管，如胸主动脉，相较于上述部位，取材的操作难度明显降低，且不需要专门仪器。 [0005] 机械刮取法是在内膜外翻后借助剪刀或刀片刮取细胞，该操作对VECs损伤较大，严重影响细胞活性，培养效果不佳。 [0006] 血管内壁贴壁消化法是将内膜外翻并放入酶中消化，虽然可获得纯度较高的VECs，但是操作较繁琐，技术要求较高，同时需应用胶原酶等昂贵试剂。 [0007] 植块法是将血管剪成1-2mm2小块且内膜向下贴壁生长，虽然其实验操作过程虽最为简单，但纵向剖开血管过程中易损伤细胞，且获得的细胞纯度过低，同时传代后杂质细胞生长优势更为明显。 [0008] 瞬间热处理植环法是将游离的主动脉两端结扎后放入60℃无菌水中停留2s后立即取出，横向截断为1-2mm长的环后进行贴壁培养。虽然传统植环法，即瞬间热处理植环法的实验操作步骤较血管内壁贴壁消化法更为简便，且经过瞬间热处理杀伤了血管外壁的血管平滑肌细胞和成纤维细胞等杂质细胞，在一定程度上较植块法更降低了杂质细胞的污染几率，但是由于热处理的过程导致了细胞生长时间较长，并且对血管平滑肌细胞和成纤维细胞等杂质细胞的杀伤效率不能有效控制。在需要细胞数量较多且对细胞纯度要求较高的精密试验中，传统的瞬间热处理植环法仍无法满足实验要求，有待改进。 [0009] 因而，既往研究表明，现有技术中原代VECs体外培养难度较大，细胞活性较低，产量较少，尚不能满足对细胞需求量大的精密试验。 发明内容[0010] 本发明解决了现有技术中从主动脉中原代分离培养VECs的过程存在缺陷与不足的问题，提供了一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法，该方法克服了现有技术中原代VECs体外培养难度较大，产量较少的问题，使原代培养的VECs具有高增殖率。 [0011] 为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下： [0012] 一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法，包括： [0013] 步骤1、获得小鼠胸主动脉段，对小鼠胸主动脉段进行分离纯化后制成主动脉环； [0014] 步骤2、用Matrigel基质胶预处理培养容器底部； [0015] 步骤3、将主动脉环接种到Matrigel基质胶表面，再在培养容器内加入含内皮细胞生长辅助因子和肝素的内皮细胞培养液进行培养； [0016] 步骤4、培育3～7天后去除主动脉环，继续培育即可。 [0017] 本发明直接采用环状的血管接种到内皮细胞培养液中进行培养时，会导致杂质细胞污染，如成纤维细胞等，本发明通过在内皮细胞培养液中添加内皮细胞生长辅助因子和肝素，有效在促进VECs生长的同时抑制成纤维细胞，使VECs的纯度更高。同时，由于VECs和成纤维细胞在爬出时间上存在先后差异，VECs约在植环后第3天可爬出，而成纤维细胞约在植环后第6-7天才爬出。因而，本发明通过时间的优化，可有效利用细胞的爬出时间差更好地消除成纤维细胞的污染，以避免培育过程中成纤维细胞的爬出和引入，进一步提高VECs的纯度。 [0018] 同时，本发明采用Matrigel基质胶预处理培养容器底部。Matrigel基质胶是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出来的可溶性基底膜制备物，主要由层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)、巢蛋白和多种生长因子(如EGF、IGF、TGF-β、FGF)等组成。Matrigel基质胶形成的三维培养基质可促进VECs的贴壁与增殖，解决VECs较难从主动脉环中爬出的问题，有利于提高本发明的改良种环法中VECs的爬出率。 [0019] 并且，本发明中由于VECs源自小鼠胸主动脉。小鼠作为取材对象，价格低廉，来源丰富。此外，胸主动脉的解剖操作难度远低于心脏、大脑、肺和眼球，且无需特殊仪器的参与，技术难度较低，操作更加简便。 [0020] 进一步，所述小鼠胸主动脉段的分离纯化过程如下： [0021] 步骤1.1、在小鼠胸主动脉未从体内剪下之前，去除主动脉上附着的脂肪和结缔组织，然后再从主动脉上截取一段血管作为小鼠胸主动脉段； [0022] 步骤1.2、将小鼠胸主动脉段转移到含有双抗的培养基中进行处理，处理后转移至超净台内； [0023] 步骤1.3、将小鼠胸主动脉段置于显微镜下，然后充分去除血管周围的结缔组织，并去净血管内残余血液； [0024] 步骤1.4、将小鼠胸主动脉段进行漂洗； [0025] 步骤1.5、将漂洗后的小鼠胸主动脉段裁剪为主动脉环。 [0026] 上述步骤中，在小鼠体内未剪下胸主动脉之前，先用血管钳对胸主动脉进行钝性分离，去除主动脉上附着的脂肪和结缔组织，可以防止引入上述组织来源的杂质细胞污染，另一方面也尽可能的保证了组织的活性。 [0027] 优选地，所述含有双抗的培养基中双抗的浓度为1％。所述含有双抗的培养基中双抗的浓度为1％，该培养基包括DMEM、肝素和血清，该培养基中血清的浓度为15％，培养基中肝素的浓度为0.09mg/mL。本发明利用含1％双抗的培养基暂存样本。由于小鼠胸主动脉的解剖、初步纯化及获取等步骤是在有菌环境中进行的，样本难免会受到细菌污染。因此，将游离后的胸主动脉段迅速放置于含1％双抗的培养基中，并尽快转移至超净台内，可有效避免取材过程中造成的细菌污染问题。 [0028] 并且，本发明在体视显微镜下用显微器械进行进一步纯化，具体操作过程为：将样本转移至超净台内后，在体视显微镜下用尖头镊子充分去除血管周围的结缔组织，并去净血管内残余血液。通过体视显微镜下进一步清理后的血管，可见血管侧壁上伸出的侧支毛细血管。通过该方法能更好地针对分离过程中杂质细胞污染的问题，有效提高纯度。 [0029] 本发明中所述漂洗次数优选为四次，依次在不含有双抗的培养基、不含有双抗的培养基、含有双抗的培养基、和不含有双抗的培养基中处理。本发明采用含与不含1％双抗的培养基交替漂洗动脉段，在接种到Matrigel基质胶以前，可以有效降低双抗对细胞活力可能造成的不利影响，提高耐受性。 [0030] 本发明在体视显微镜下用眼科剪将小鼠胸主动脉段裁剪为主动脉环。本发明在体视显微镜下操作更为精确，加之眼科剪的工作端更为细小和锋利，可有效降低切取主动脉环时对细胞所造成的机械性损伤，因而可有效避免切取主动脉环过程中操作所致的细胞活性降低的问题。 [0031] 并且在分离纯化过程中，小鼠胸主动脉段以及主动脉环的转移过程均设置在冰上进行，冰的低温环境能更好地保持其活性。 [0033] 进一步，所述内皮细胞生长辅助因子在内皮细胞培养液中的浓度含量为60μg/mL，所述肝素在内皮细胞培养液中的浓度含量为0.09mg/mL。 [0034] 通过上述浓度的调节，不仅仅能在有效促进VECs生长，极大地增加细胞增殖，同时能抑制成纤维细胞，使VECs的纯度更高。并且，还能有效提高细胞的活力，效果十分显著。 [0035] 优选地，所述步骤2中将主动脉环接种到Matrigel基质胶表面之前，先采用含内皮细胞生长辅助因子和肝素的内皮细胞培养液进行润湿处理，具体过程是将培养基加入经Matrigel基质胶预处理后的培养容器内，轻轻晃动培养容器使内皮细胞培养液润湿培养容器底部，吸走但不吸尽培养容器内的内皮细胞培养液，仅保留薄薄一层培养基。然后将培养容器放置于37℃条件下孵育备用。本发明的Matrigel表面经过润湿处理后，相比干燥的Matrigel表面而言，用与浸泡主动脉环相同的内皮细胞培养液润湿后，Matrigel表面更易与主动脉环粘合，有效解决主动脉环在培养液中易漂浮、不易贴壁的问题。 [0036] 进一步，由于VECs对生存环境中营养要求严格的问题，本发明采用了改良型的内皮细胞培养液，内皮细胞培养液包括血清、双抗和DMEM，该内皮细胞培养液中血清的浓度为20％，双抗的浓度为1％。鉴于VECs在体外较难培养且对周围微环境中营养物质要求较高，因此在初期培养P0代细胞时，本发明特意采用了FBS并将其浓度提升至20％，有助于原代细胞的初期生长和增殖，保证了较高的细胞成活率和产量。当细胞生长状态稳定且传代至P1代后，再降至15％即可。 [0037] 更进一步地，所述培养容器内的内皮细胞培养液高度为主动脉环高度的90％～110％。通过该高度的设置，可避免主动脉环在培养基中出现漂浮、贴壁不牢等问题。并且，由于VECs自身可分泌生长因子，促进VECs的生长和增殖，过多的内皮细胞培养液会变向稀释生长因子的浓度，不利于VECs的爬出。因而，本发明通过上述在培养容器内设置高度仅刚好没过主动脉环的内皮细胞培养液，这样即可以避免主动环出现漂浮、贴壁不牢等问题，还能有效促进VECs的爬出，效果十分显著。 [0038] 优选地，主动脉环的长度约为2mm。所述Matrigel基质胶表面的主动脉环之间的距离为3mm。 [0039] 针对目前主动脉VECs原代分离培养过程中存在的缺陷与不足，本发明对取材、分离、纯化、培养等各个步骤进行相应的优化处理，通过优化后即可稳定获得高纯度、高活力的VECs，进而保证相关研究顺利开展的有效措施。本发明完成之前，目前仍无令人满意的小鼠主动脉VECs原代分离培养方法。 [0040] 本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果： [0041] 1、通过本发明方法的优化，能最大化降低杂质细胞污染几率，使原代分离培养所得的VECs的纯度和活性均有较大地提高，并且在原代培养过程中保证了VECs具有高增殖率，进而保证了原代VECs的培育具有较高的细胞成活率和产量； [0042] 2、本发明以传统植环法为基础进行了改良，经过反复探索与实践，建立了一种更为简便易行、经济适用的原代小鼠胸主动脉VECs的分离与培养方法，本发明方法的技术难度低、可重复性高，并且取材操作简便、耗时短，有利于维持VECs活性； [0044] 图1为VECs在培养初期自主动脉环中出芽图(放大倍数：10x)。 [0045] 图2为VECs在培养中期自主动脉环中出芽图(放大倍数：4x)。 [0046] 图3为VECs在培养中期自主动脉环中出芽图(放大倍数：10x)。 [0047] 图4为VECs在培养后期于Matrigel基质胶内出现小管形成图(放大倍数：10x)。 [0048] 图5为VECs在Gelatin表面呈“铺路石样”分布图(放大倍数：10x)。 [0049] 图6为VECs的AEC染色鉴定图(放大倍数：20x)。 [0050] 图7为本发明方法与传统培养方法的培育效果图。 [0051] 图8为本发明方法与传统培养方法的血管内皮细胞的活性示意图。 具体实施方式[0052] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。 [0053] 实施例 [0054] 一种原代小鼠胸主动脉血管内皮细胞的分离培养方法，具体如下： [0055] 一、Matrigel基质胶预处理孔板底部 [0056] 在首次植环前一天，提前将购买的整瓶Matrigel基质胶(购自美国BD公司)包埋于冰内并置于4℃过夜，使其充分由胶冻状变为溶液状。无菌环境下，用遇冷枪尖吹打混匀产品后，进行小管分装(500μL/管)，留一管置于冰上待用，其余保存在-20℃。 [0057] 本实施例以12孔板为例，将融化后的Matrigel基质胶加入孔内(200μL/孔)，倾斜孔板使基质胶均匀铺满孔底。鉴于取材量为两只小鼠，故仅预处理12孔板中央的两个孔即可，周边孔则加入无菌PBS(1mL/孔)，上述操作均在冰上进行。随后将孔板置于37℃孵育30min，后置于4℃保存。 [0058] 上述整个操作过程中，移液枪、枪尖、小管均需提前预冷，因为Matrigel基质胶在超过10℃的情况下就会开始成胶；此外，包被好的孔板最好当天使用，次日使用时应暂存在4℃。 [0059] 二、配置培养基 [0060] 本发明中共涉及4种培养基，依次标记为1号、2号、3号、4号培养基，各培养基成分及配置介绍如下： [0061] 1号培养基：各成分终浓度为：Heparin:0.09mg/mL,双抗:1％,ECGS:60μg/mL,FBS:15％。其中，Heparin为肝素、ECGS为内皮细胞生长辅助因子，FBS为小牛血清，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，该DMEM为现有技术，因此其具体组分不再赘述。以12mL总体积为例，将1.08mg Heparin和120μL双抗加入9.1mL DMEM中，枪尖吹打混匀后过滤，随后加入1mL ECGS(购自BD公司)和1.8mL FBS(血清浓度为15％)并吹打混匀。 [0062] 3号培养基：各成分终浓度为：Heparin:0.09mg/mL,FBS:15％。以40mL总体积为例，将3.6mg Heparin加入34mL DMEM中，枪尖吹打混匀后过滤，随后加入6mL FBS(血清浓度为15％)并吹打混匀。 [0063] 2号培养基：各成分终浓度为：Heparin:0.09mg/mL,FBS:15％，双抗:1％。取12mL的3号培养基，加入120μL双抗后吹打混匀。 [0064] 4号培养基：各成分终浓度为：Heparin:0.09mg/mL,双抗:1％,ECGS:60μg/mL,FBS:20％。取8mL的1号培养基，加入400μL FBS(血清浓度为20％)后吹打混匀。 [0065] 三、4号培养基预处理Matrigel基质胶包被的孔板 [0066] 在植环当天，取材之前，先用4号培养基(100μL/孔)润湿孔板底部，吸走但不吸尽孔板内的培养基，仅保留薄薄一层培养基，后置于37℃孵育备用。 [0067] 四、取材 [0068] 选取两只4周龄的小鼠，2％戊巴比妥钠麻醉后，经75％乙醇浸泡消毒后固定在手术板上，打开胸腹腔，找到胸主动脉(如图1所示，上至主动脉弓，下至膈肌，长约2cm)，用血管钳钝性分离管周附着的结缔组织和脂肪。然后再从主动脉上截取一段血管作为小鼠胸主动脉段，将截取的主动脉段迅速放在2号培养基中，冰上转移至无菌超净台内。在体视显微镜下用尖头镊子仔细去除小鼠胸主动脉段管周残余的结缔组织，并洗净管内血液。 [0069] 五、漂洗主动脉段 [0070] 将剥离干净的小鼠胸主动脉段进行四步漂洗，动作要轻柔，漂洗所用的培养基依次为3号、3号、2号、3号。漂洗结束后，将主动脉段置于4号培养基中。 [0071] 六、制备主动脉环 [0072] 在体视显微镜下用眼科剪将主动脉段横向裁剪为长约2mm的环，故从每只小鼠胸主动脉上可获取10个左右的主动脉环。 [0073] 七、植环 [0074] 用尖头镊子轻轻夹住主动脉环并接种在Matrigel基质胶表面，此过程中需动作轻柔，避免镊子尖端划破基质胶。主动脉环在胶上的位置分布应适当，彼此间距约以3mm为宜，每个孔约接种10个左右的主动脉为宜，故12孔板的两个孔即可满足两只小鼠来源的主动脉环接种需求。随后，微微倾斜孔板，侧壁加入4号培养基(120μL/孔)后缓慢放平孔板，仅需培养基没过主动脉环即可。注意此过程中动作应轻柔缓慢，避免加液时主动脉环出现漂浮或移位。 [0075] 八、37℃静置孵育3天 [0076] 植环后，将孔板平稳转移至37℃5％CO2的湿润环境中培养3天，期间切忌移动孔板，保证静置培养，无须换液。 [0077] 九、换液及观察 [0078] 静置孵育3天后，倒置显微镜下观察可见有少量细胞自主动脉环中爬出，如图1所示，此现象称之为“出芽(aorta ring sprouting)”。之后，每隔2天便向孔板内补充4号培养基(200μL/孔)。VECs起初在Matrigel基质胶表面生长，随后便可侵入胶内部进行三维生长。 [0079] 十、去除主动脉环 [0080] 在细胞培养第6～7天时，去除孔板内的主动脉环，以避免成纤维细胞的爬出和引入。显微镜下观察可见基质胶内生长的VECs呈长梭形，细胞数量增加，如图2和图3所示。 [0081] 十一、继续培养 [0082] 在细胞培养第10天时，显微镜下观察可见VECs数量增加且彼此首尾连接交织成蜘蛛网状，此现象称之为“小管形成(vessel formation)”，如图4所示。 [0083] 十二、传代 [0084] 待细胞密度达到90％左右时，吸走孔板内的培养基和无菌PBS，用无菌PBS漂洗细胞2次后，加入适量Dispase分散酶(购自美国BD公司)使之覆盖住Matrigel基质胶表面表面即可，将孔板置于37℃孵育10min。孵育中期将孔板取出，拍打孔板侧壁促进细胞消化，动作不要太剧烈，避免污染。孵育结束后向孔板内加入3号培养基(1mL/孔)终止消化，并用枪尖反复吹打孔板底部，以促进细胞脱壁。将单个孔内的细胞混合物富集至一个15mL离心管中，并加入3号培养基(8mL/管)，990r/min转速下离心10min。弃掉上清液，加入4号培养基(3mL/管)后吹打混匀，得到源自两只小鼠胸主动脉的VECs悬液共计6mL。 [0085] 十三、铺板及培养 [0086] 以6孔板为例，提前用Gelatin(购自Sigma-Aldrich公司)处理孔板底部，其加入量以覆盖住孔底即可，待Gelatin凝固后便可使用。将所得的6mL细胞悬液吹打混匀后接种在一个6孔板中，每孔接种1mL细胞悬液。随后每隔2天进行半换液，用4号培养基培养，显微镜下观察可见此种培养方式下的VECs形态较之前发生变化，表现为多角形或不规则形，核清晰，呈圆形或椭圆形，细胞单层排列，密度较大时互相嵌合且细胞间界限不清晰，折光性强，呈现为内皮细胞典型的“铺路石样”分布，如图5所示。待细胞密度达到试验设计要求时，可进行相应处理。 [0087] 十四、使用AEC染色法对VECs进行VEGF蛋白的染色鉴定 [0089] 本实施例采用传统培养方法与本发明方法进行对比，本实施例中所述的传统培养方法为瞬间热处理植环法。本发明方法与传统培养方法相比，本发明方法能较大程度地提高血管内皮细胞的产量和成活率，如图7所示。同时，采用本发明方法和传统方法获得VECs进行MTT检测，通过MTT检测得知，与传统培养方法相比，本发明方法可显著提高血管内皮细胞的活力，如图8所示，图8中所示的改良方法即为本实施例中所述的方法。 [0090] 此外，图8中还给出了当上调或下调本发明方法中ECGS或Heparin的给定浓度时，采用本发明方法获得的VECs进行MTT检测的检测结果，如图8所示。图8中其他方法即为本实施例中上调或下调ECGS或Heparin的给定浓度时的检测结果，该其他方法中所述的ECGS给定浓度为70μg/mL，Heparin的给定浓度为50μg/mL。通过该检测结果得知，其他方法获得的血管内皮细胞的活力较本实施例所述改良方法获得的血管内皮细胞的活力明显下降，且与传统方法所得结果无显著性差异。 [0091] 以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈