获得羊膜上皮干细胞的方法及试剂盒 |
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| 申请号 | CN201610983737.9 | 申请日 | 2016-11-08 | 公开(公告)号 | CN106566798A | 公开(公告)日 | 2017-04-19 |
| 申请人 | 华南生物医药研究院; | 发明人 | 裴雪涛; 岳文; 贾雅丽; 苏如玉; 黄媛媛; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了获得羊膜上皮干细胞的方法及 试剂 盒 。所述方法包括：利用混合酶制剂将羊膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述羊膜上皮干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶‑EDTA 混合液 ；以及分散酶II。利用本发明的方法或试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种获得羊膜上皮干细胞的方法，其特征在于，包括： |
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| 说明书全文 | 获得羊膜上皮干细胞的方法及试剂盒技术领域背景技术[0002] 羊膜是胎膜的一部分，由发源于胚泡内细胞团的羊膜上皮和羊膜间充质构成。近年来的研究证明，人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)具有部分胚胎干细胞特性，可分化为三个胚层不同类型的细胞，因此，hAECs作为再生医学的细胞资源已受到极大关注。 [0003] 然而，目前获得羊膜上皮干细胞的方法仍有待改进。 发明内容[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。 [0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的： [0006] 目前尚缺少有效的关于获得羊膜上皮干细胞的方法，传统的单一酶消化法分离的羊膜上皮干细胞得率低，且活性低，不利于进一步扩增和应用。 [0007] 发明人发现，酶消化处理过程中，酶的种类、用量、消化时间等因素显著影响酶消化处理效果，尤其是酶的种类，进而影响羊膜上皮干细胞的得率及活性。发明人经深入研究发现，单一酶的消化效果不佳，难以获得大量且纯度较高的羊膜上皮干细胞，而混合酶能够有效地对羊膜进行消化，从而获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。进一步地，发明人惊奇地发现，胰酶-EDTA混合液(Trypsin-EDTA)及分散酶II(Dispase II)的混合酶的消化效果最佳。 [0008] 为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种获得羊膜上皮干细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用混合酶制剂将羊膜进行消化处理，得到消化产物；以及从所述消化产物中分离所述羊膜上皮干细胞，其中，所述混合酶制剂包括：胰酶-EDTA混合液；以及分散酶II。 [0009] 利用消化处理方法，能够将羊膜组织中细胞之间的蛋白质降解，从而分离出单个细胞。发明人发现，单一酶很难将羊膜消化完全，所得到的羊膜上皮干细胞量较少。进而，发明人发现，采用混合酶制剂进行消化的效果较好，以减少对细胞的损伤。发明人意外地发现，采用包括胰酶-EDTA混合液以及分散酶II的混合酶制剂进行消化，能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。然而，利用其他种类酶的效果不佳。 [0010] 根据本发明的实施例，所述获得羊膜上皮干细胞的方法还可以具有下列附加技术特征： [0011] 根据本发明的实施例，所述混合酶制剂包括：0.05体积％～0.25体积％的胰酶-EDTA混合液；以及2U/mL～2.5U/mL的分散酶II。发明人意外地发现，胰酶-EDTA混合液及分散酶II的浓度显著影响消化效率，进而影响羊膜上皮细胞的得率、纯度及活性。在上述最优浓度下，羊膜上皮干细胞的得率、纯度及活性较高。根据本发明的具体实施例，混合酶制剂中胰酶浓度可以为0.08质量％、0.10质量％、0.13质量％、0.18质量％或0.21质量％。当胰酶-EDTA混合液和/或分散酶II的浓度过高，将对羊膜上皮干细胞造成损伤，使其活性下降，若胰酶-EDTA混合液和/或分散酶II浓度过低，无法充分消化，从而使得到的羊膜上皮干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本发明实施例的获得羊膜上皮干细胞的方法能够获得大量、纯度较高且活性较好的羊膜上皮干细胞。 [0012] 根据本发明的实施例，所述混合酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1。发明人发现，混合酶制剂的添加量显著影响消化处理效果，进而影响羊膜上皮干细胞的产率及活性。发明人意外地发现，当混合酶制剂与羊膜的用量比为0.5～2:1，优选1:1时，能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。若添加量过多，容易造成细胞损伤，活性下降；若添加量过少，酶消化不充分，从而导致羊膜上皮干细胞得率较低。 [0013] 根据本发明的实施例，所述消化处理包括：将所述羊膜进行第一消化处理，弃消化液，得到第一消化产物；将所述第一消化产物进行第二消化处理，弃消化液，得到第二消化产物；将所述第二消化产物进行第三消化处理，弃消化液，得到第三消化产物；以及将所述第三消化产物进行第四消化处理，弃消化液，得到所述消化产物。 [0014] 发明人发现，羊膜的组织结构较致密，需要进行长时间的消化。若一次性地进行长时间消化，消化液中的组织碎片、消化产物等会影响酶活性，进而降低消化效率，从而导致羊膜上皮干细胞得率降低。进一步地，发明人发现，采用多次消化处理方式，将每次消化处理后的消化液弃去，换入新鲜的混合酶制剂。由此，经过4次消化处理，能够较大程度的消化组织，使得羊膜上皮干细胞得率较高，且活性较高。 [0015] 根据本发明的具体实施例，每次消化处理后，通过向消化反应体系中加入胎牛血清(FBS)，以终止消化反应。 [0016] 根据本发明的实施例，所述第一消化处理是在37℃的温度、120r/min的转速下震荡10min～20min，优选10min；所述第二消化产物是在37℃的温度、150r/min的转速下震荡30min～40min，优选40min；所述第三消化产物是在37℃的温度、150r/min的转速下震荡 30min～40min，优选40min；所述第三消化产物是在37℃的温度、150r/min的转速下震荡 30min～40min，优选30min。发明人经过大量实验得到上述最优消化处理条件，在此条件下能够有效地得到羊膜上皮干细胞，且得率较高、纯度较大以及活性较强。 [0017] 需要说明的是，对于从消化产物中分离羊膜上皮干细胞的方法不作严格限定，只要能够获得羊膜上皮干细胞即可。根据本发明的实施例，为了得到纯度较高的羊膜上皮干细胞，所述分离包括：将所述消化产物进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行离心，收集细胞；以及将所述细胞进行清洗，以便获得所述羊膜上皮干细胞。由此，能够有效地除去附着于细胞上的消化液，且避免对细胞造成损伤，从而获得纯度较高且活性较强的羊膜上皮干细胞。 [0018] 根据本发明的实施例，所述方法包括：利用混合酶制剂将尺寸为2cm×2cm的所述羊膜进行消化处理，得到消化产物；将所述消化产物用300目筛网过滤，收集滤液；将所述滤液在2000r/min的转速下离心5min，收集细胞；以及将所述细胞用生理盐水清洗2次，以便获得所述羊膜上皮干细胞。 [0019] 发明人发现，将羊膜裁剪至尺寸为2cm×2cm，使得进行消化反应的面积较大，促使消化反应充分发生。接着，将消化产物过筛，以除去大块组织。此外，将滤液在2000r/min下离心5min，既能够沉淀细胞，便于收集，同时较小地破坏细胞的结构及活性。从而，能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。 [0020] 根据本发明的实施例，所述方法进一步包括扩增处理，所述扩增处理包括：将所述羊膜上皮干细胞重悬于培养基中，得到混合液；以及将所述混合液接种于所述培养基中，37℃下培养至出现克隆，长至传代。根据本发明的具体实施例，所述培养基为alpha-MEM培养基。发明人发现，分离获得的羊膜上皮干细胞为单个细胞，将其进行扩增以得到大量的羊膜上皮干细胞。在上述最优扩增处理条件下，扩增的同时还可以使其活性进一步提高。 [0021] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：胰酶-EDTA混合液；以及分散酶II。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。 [0022] 根据本发明的实施例，所述试剂盒用于获得羊膜上皮干细胞。 [0023] 利用消化处理方法，能够将羊膜组织中细胞之间的蛋白质降解，从而分离出单个细胞。发明人发现，单一酶很难将羊膜消化完全，所得到的羊膜上皮干细胞量较少。进而，发明人发现，采用混合酶制剂进行消化的效果较好，以减少对细胞的损伤。发明人意外地发现，采用包括胰酶-EDTA混合液以及分散酶II的混合酶制剂进行消化，能够获得大量、纯度较高且活性较高的羊膜上皮干细胞。 [0024] 根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：0.05体积％～0.25体积％的胰酶-EDTA混合液；以及2U/mL～2.5U/mL的分散酶II。 [0025] 发明人意外地发现，胰酶-EDTA混合液及分散酶II的浓度显著影响消化效率，进而影响羊膜上皮细胞的得率、纯度及活性。根据本发明的具体实施例，混合酶制剂中胰酶浓度可以为0.08质量％、0.10质量％、0.13质量％、0.18质量％或0.21质量％。当胰酶-EDTA混合液和/或分散酶II的浓度过高，将对羊膜上皮干细胞造成损伤，使其活性下降，若胰酶-EDTA混合液和/或分散酶II浓度过低，无法充分消化，从而使得到的羊膜上皮干细胞的得率及纯度较低。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较好的羊膜上皮干细胞。 [0026] 根据本发明的实施例，所述胰酶-EDTA混合液中胰酶与EDTA的用量比为2.5:1，根据本发明的优选实施例，所述胰酶-EDTA混合液含有0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA。由此，根据本发明实施例的试剂盒能够获得大量、纯度较高且活性较好的羊膜上皮干细胞。 [0028] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： [0029] 图1显示了根据本发明一个实施例的细胞活力分析图。 具体实施方式[0030] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 [0031] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0032] 实施例 [0033] 在该实施例中，按照下列方法获得羊膜上皮干细胞： [0034] (1)从新鲜胎盘中剥离的羊膜，剪至2cm×2cm大小，生理盐水洗三次，尽量将血洗净； [0035] (2)把5g剪碎的羊膜装入50ml离心管中，加入5mL 0.25％胰酶-EDTA混合液(含0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA)与2.5U/mL分散酶II，37℃的温度、120r/min的转速下震荡 10min，加入FBS终止Trypsin消化，并将所得到的第一消化产物在2000r/min的转速下离心 5min，获得的消化液弃去； [0036] (3)向离心管中加入5mL 0.25％胰酶-EDTA混合液(含0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA)与2.5U/mL分散酶II，37℃的温度、150r/min的转速下震荡40min，加入FBS终止Trypsin消化，并将所得到的第二消化产物在2000r/min的转速下离心5min，获得的消化液弃去； [0037] (4)向离心管中加入5mL 0.25％胰酶-EDTA混合液(含0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA)与2.5U/mL分散酶II，37℃的温度、150r/min的转速下震荡40min，加入FBS终止Trypsin消化，并将所得到的第三消化产物在2000r/min的转速下离心5min，获得的消化液弃去； [0038] (5)向离心管中加入5mL 0.25％胰酶-EDTA混合液(含0.5mg/mL胰酶和0.2mg/mL EDTA)与2.5U/mL分散酶II，37℃的温度、150r/min的转速下震荡30min，加入FBS终止Trypsin消化，并将所得到的第四消化产物用300目筛网过滤，收集滤液； [0039] (6)将滤液在2000r/min的转速下离心5min，收集细胞，用生理盐水清洗2次，以便获得羊膜上皮干细胞； [0040] (7)将羊膜上皮干细胞用2ml alpha-MEM培养基重悬后接种，37℃下培养，每隔48h换液一次，直至克隆出现，长至传代，得到扩增后的羊膜上皮干细胞。 [0041] 对比例 [0042] 按照实施例的方法获得羊膜上皮干细胞，区别在于，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中，利用0.25％胰酶-EDTA混合液进行消化。 [0043] 对实施例扩增后的羊膜上皮干细胞进行活力测定 [0044] 比较实施例和对比例的步骤(6)所得到的羊膜上皮干细胞的活力，具体步骤如下： [0045] 分别将实施例和对比例的步骤(6)所得到的羊膜上皮干细胞用生理盐水洗2遍，加入不含动物成分的TrypLE Express消化约30s，镜下可见短梭形贴壁细胞变圆并悬浮起来后，加入生理盐水吹打细胞并将细胞转移至离心管，1200rpm离心5min，弃掉上清液，用2ml的生理盐水重悬，通过细胞活力分析仪检测细胞的活力。 [0046] 实施例步骤(6)所得到的羊膜上皮干细胞活力为92.1％。说明利用本发明的方法获得羊膜上皮干细胞过程中，消化处理条件温和，对羊膜上皮干细胞损伤较小，使得到的羊膜上皮干细胞活性较强。对比例所得到的羊膜上皮干细胞的活力仅为70.7％(如图1所示)，且实施例步骤(6)的羊膜上皮干细胞的得率为对比例的3倍。说明本发明的方法所得到的羊膜上皮干细胞的得率及活性均较高。 [0047] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。 |
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