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抗Ttyh1单克隆抗体及其应用
申请号	CN201610916107.X	申请日	2016-10-20	公开(公告)号	CN106543285A	公开(公告)日	2017-03-29
申请人	中国人民解放军第四军医大学;			发明人	郑敏化; 曹秀丽; 韩骅;
摘要	本发明涉及抗Ttyh1单克隆抗体及其应用。本发明用重组小鼠Ttyh1分子免疫BALB/c小鼠，制备一组小鼠抗鼠Ttyh1单克隆抗体，并筛选出具有高亲和力和特异性的抗Ttyh1单克隆抗体。本发明的抗体可进行免疫印迹、免疫细胞荧光染色、免疫组织荧光染色多种检测，并可特异性标识小鼠神经干细胞，为标记、分离、纯化及鉴定小鼠神经干细胞提供有利工具，为神经干细胞相关的基础与转化医学研究提供技术支持；基于所选抗原与人TTYH1分子的同源性，该抗体还可以标识人类神经胶质瘤组织中的TTYH1分子，有利于揭示TTYH1在胶质瘤发生发展中的作用，以及在诊断治疗中的应用前景，并在此基础上发展基因工程抗体。
权利要求	1.一种抗Ttyh1单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为： CDR1：Glu-Ser-Val-Asp-Asn-Tyr-Gly-Ile-Ser-Phe； CDR2：Ala-Ala-Ser； CDR3：Gln-Gln-Ser-Lys-Glu-Val-Pro-Arg-Thr；所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为： CDR1：Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Arg-Tyr-Trp； CDR2：Ile-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-Ile； CDR3：Ala-Arg-Arg-Tyr-Ala-Tyr-Asp-Asp-Tyr。 2.如权利要求1所述的抗Ttyh1单克隆抗体，其特征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。 3.如权利要求1所述的抗Ttyh1单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。 4.权利要求1、2或3所述抗体用于标记、分离、纯化或鉴定小鼠神经干细胞的应用。 5.权利要求1、2或3所述抗体用于识别人类神经胶质瘤组织中的TTYH1蛋白的应用。 6.权利要求1、2或3所述抗体用于制备诊断神经胶质瘤试剂的应用。 7.权利要求1、2或3所述抗体用于制备治疗神经胶质瘤药物的应用。 8.权利要求1、2或3所述抗体用于在蛋白水平检测Ttyh1 siRNA分子对Ttyh1 mRNA干涉作用的应用。 9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA分子序列如SEQ.ID.NO.5所示。
说明书全文	抗Ttyh1单克隆抗体及其应用技术领域 [0001] 本发明属于干细胞技术领域，涉及一种抗Ttyh1单克隆抗体(FMMU-Ttyh1-11#)及其应用，本发明的抗体可特异性标记小鼠神经干细胞，并标记人胶质瘤组织中的TTYH1蛋白。背景技术 [0002] 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)基于其多向分化潜能，以及神经元损伤后的不可再生性，可望成为干细胞移植或诱导分化后回输等治疗手段的主要细胞来源，对中枢神经系统损伤及退行性变等疾病的治疗具有重要意义。因此，神经干细胞特异性标志物的筛选，可为神经干细胞的标识、分离、纯化和鉴定奠定基础，成为生命科学和医学研究领域的研究热点。此外，在神经胶质瘤组织中，也会存在一些具有干细胞特性的肿瘤细胞，被称为胶质瘤干细胞，其在自我更新、增殖和分化方面具有某些和神经干细胞类似的特性，可能受到共同的分子机制调控，并具有相同的标志物。寻找到这些新的肿瘤干细胞标志物，有望为神经系统肿瘤的治疗提供新方法和新靶点。发明内容 [0003] 发明人在研究中发现Ttyh1基因特异性表达于小鼠神经干细胞。该基因在果蝇中的同源基因命名为tweety，最初是在flightless基因组位点上发现的。果蝇中的基因缺失研究表明tweety与其他两个邻近的基因dodo和penguin的同时缺失，会显著降低果蝇生存能力，具有重要的生理意义。脊椎动物基因组中含有Ttyh1、Ttyh2、Ttyh3三种基因，它们进化上高度保守。其中，人、大鼠和小鼠的Ttyh1基因所编码的氨基酸序列具有高度一致性，并且N端糖基化位点也是保守的，提示其具有相似的生物学功能。人类Ttyh1基因位于19q13.4，预测含5个跨膜区。编码的蛋白包含450个氨基酸，C端含有丰富的带负电荷的氨基酸残基，可结合钙离子。小鼠Ttyh1基因位于7号染色体，在脑、眼、脊髓和睾丸中高表达，在胰腺、垂体、乳腺和肝脏中表达较低。多项研究表明该基因家族对包括人类在内的脊椎动物的生理、病理活动具有重要调控作用。 [0004] 抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基端(N)和羧基端(C)，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位。本发明抗体选择的抗原片段位于预测的Ttyh1蛋白第二跨膜区与第三跨膜区之间，理论上暴露于质膜外，更容易与抗体结合。 [0005] 发明人使用本发明抗体进行的体内、体外染色实验显示：抗体在体内可以特异性标识小鼠神经干细胞，在细胞染色后位于小鼠源性的原代神经干细胞的胞浆与胞膜。采用小鼠原代神经组织的蛋白提取物行免疫印迹实验显示抗体可识别内源性Ttyh1蛋白(54KD)。另一方面，由于所选抗原的氨基酸序列与人类TTYH1蛋白序列高度同源，本发明抗体可在人类神经胶质瘤组织中标识TTYH1蛋白，有利于进一步揭示TTYH1在胶质瘤发生发展中的作用与机制，并在此基础上发展具有诊断与治疗价值的基因工程抗体。 [0006] 本发明提供的抗Ttyh1单克隆抗体，包括重链和轻链，所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为： [0007] CDR1：Glu-Ser-Val-Asp-Asn-Tyr-Gly-Ile-Ser-Phe； [0008] CDR2：Ala-Ala-Ser； [0009] CDR3：Gln-Gln-Ser-Lys-Glu-Val-Pro-Arg-Thr； [0010] 所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为： [0011] CDR1：Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Arg-Tyr-Trp； [0012] CDR2：Ile-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-Ile； [0013] CDR3：Ala-Arg-Arg-Tyr-Ala-Tyr-Asp-Asp-Tyr。 [0014] 本发明的编码Ttyh1单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。 [0015] 本发明的抗Ttyh1单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。 [0016] 本发明的抗体可特异性标识小鼠神经干细胞，为标记、分离、纯化及鉴定小鼠神经干细胞提供有利工具。本发明抗体同时可标识胶质瘤组织中的人源性TTYH1蛋白，为TTYH1在胶质瘤中的基础与转化医学研究提供支持。 [0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： [0018] 1、本发明所述的抗Ttyh1单克隆抗体可特异性的标识组织中的小鼠神经干细胞，且能与体外培养的原代神经干细胞表达的Ttyh1分子特异性结合。与现有商品化单抗(Abcam ab57582)相比，后者只能用于免疫印迹检测，而本发明提供的Ttyh1抗体除应用于免疫印迹实验外，还可用于免疫细胞荧光和免疫组织荧光染色，具有更好的特异性、更高的亲和力，和更广泛的应用范围，为标记、分离、纯化及鉴定神经干细胞提供了良好的生物学工具。 [0019] 2、本发明所述抗Ttyh1抗体可识别人类神经胶质瘤组织中的TTYH1蛋白，有利于揭示TTYH1在胶质瘤发生发展中的作用，以及在诊断治疗中的应用前景，并在此基础上发展基因工程抗体。 [0020] 3、本发明获得抗Ttyh1单克隆抗体的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的唯一性。 [0021] 4、本发明分析获得轻链、重链可变区的CDR区序列，在此基础上为构建高特异性、高亲和力的抗Ttyh1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。附图说明 [0022] 图1为FMMU-Ttyh1-11抗体的Western blot鉴定结果，A.293T细胞转染pCAG-Ttyh1-IRES-EGFP(含HA标签)表达质粒后，HA抗体与Ttyh1抗体检测结果一致，B.对不同发育阶段及成年的脑组织提取蛋白进行Ttyh1抗体Western blot检测，可见Ttyh1蛋白(54kDa)条带，E，embryonic(胚胎期的)；P，postnatal(出生后的)；svz，subventricular zone(脑室下带区)。 [0023] 图2为FMMU-Ttyh1-11抗体的细胞免疫荧光检测结果，A.对原代神经干细胞进行细胞免疫荧光染色，荧光显微镜下观察，可见神经干细胞阳性染色，阳性信号位于胞膜与胞浆，B.以IgG1κ同型对照抗体作为阴性对照进行染色，未见任何阳性信号。 [0024] 图3为FMMU-Ttyh1-11抗体的组织免疫荧光检测，A.E14.5小鼠胚胎脑组织免疫荧光染色，荧光显微镜下观察，可见阳性染色细胞位于侧脑室的脑室下带，箭头指示Ttyh1抗体染色为点状、斑块状分布，B.以IgG1κ同型对照抗体作为阴性对照进行染色，未见任何阳性信号。 [0025] 图4为FMMU-Ttyh1-11抗体的Western blot检测，用本发明中描述的siRNA转染原代神经干细胞，以随机干涉序列(Scramble siRNA)转染组为对照，用FMMU-Ttyh1-11抗体进行Western blot检测，可见siRNA转染组Ttyh1蛋白水平较Scramble组显著降低，同时证明了Ttyh1siRNA干涉的有效性及FMMU-Ttyh1-11抗体检测干涉效果的有效性。 [0026] 图5为所选用抗原序列与人TTYH1蛋白序列的同源性分析，可见同源性高达88％。 [0027] 图6为FMMU-Ttyh1-11抗体在人神经胶质瘤组织中的免疫组织化学染色结果，B图可见Ttyh1抗体染色阳性信号在胶质瘤组织中分布不均匀，在肿瘤细胞内位于胞膜和胞浆，A图为以IgG1κ同型对照抗体作为阴性对照进行胶质瘤组织切片染色，未见任何阳性信号。 [0028] 图7为FMMU-Ttyh1-11mAb(monoclonal antibody)轻链可变区基因同源性序列检测结果。 [0029] 图8为FMMU-Ttyh1-11mAb重链可变区基因同源性序列检测结果。 [0030] 图9为FMMU-Ttyh1-11mAb轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果。 [0031] 图10为FMMU-Ttyh1-11mAb重链可变区氨基酸同源性序列检测结果。具体实施方式 [0032] 本发明提供一种抗鼠Ttyh1单克隆抗体，用重组Ttyh1抗原片段免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗Ttyh1的单克隆抗体，从中筛选出能稳定分泌高亲和力抗Ttyh1抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力抗Ttyh1单克隆抗体；为神经干细胞及神经胶质瘤相关的基础与转化医学研究提供支持。 [0033] 下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体活性检测，以及抗体特异性的鉴定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 [0034] 1.抗小鼠Ttyh1高亲和力抗体的制备 [0035] 1.1单克隆抗体的制备、纯化 [0036] 重组小鼠Ttyh1分子包含天然小鼠Ttyh1分子第111到124位氨基酸，其氨基酸序列与小鼠Ttyh1mRNA isoform 1编码蛋白的111到124位氨基酸一致，氨基酸及碱基序列如下。 [0037] 抗原氨基酸序列： [0038] 111-GNSETSDGVSQLSSALLHANHTLSTIDDVVLETVERLGEAVKTELTTLEEVLSVRMELVAATRGARRQAEAAAQYLQGLAFWQGVSLSPVQVAEDVTFVEEYRW-124 [0039] 编码抗原的碱基序列： [0040]ggtaacagcgagaccagcgatggggtgtcccagctcagctcagcactgctgcacgccaaccacacgctcagcaccatcgatgacgtggtgctggaaacggtggagaggctgggtgaggcagtgaagacggagctgaccaccctggaggaagtgctgtcagtccgcatggagctggtggctgccaccaggggagcccgaaggcaggctgaagctgctgctcagtacctgcaaggactggccttctggcaaggagtgtccctgagccccgtacaggtggctgaagatgtgactttcgtggaggagtacaggtgg [0041] 按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)，用重组小鼠Ttyh1抗原免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)，初次免疫，使用福氏完全佐剂，后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫7-10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2-3周后，经腹腔注射抗原再加强免疫，3天后处死动物取脾进行细胞融合。 [0042] 取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞(正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔板，37℃、5％CO2孵箱培养。待克隆出现后，间接ELISA检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。 [0043] 从杂交瘤细胞株FMMU-Ttyh1-1-23号中选择能分泌高亲和力的抗鼠Ttyh1单克隆抗体，发现FMMU-Ttyh1-11杂交瘤细胞株分泌的抗体具有较高的亲和力和与细胞表面天然表达的小鼠Ttyh1分子结合的能力。 [0044] 在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法制备包含单克隆抗体的腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。腹水经45％饱和硫酸铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的FMMU-Ttyh1-11号纯度达到95％以上。 [0045] 1.2抗鼠Ttyh1单克隆抗体效价测定实验 [0046] 用IgG亚类检测试剂盒(美国Sigma公司)分别检测制备的FMMU-Ttyh1-1-23号单克隆抗体的IgG亚类，间接ELISA法(细胞和分子免疫学实验技术，第一版，P44-46)检测FMMU-Ttyh1-1-23号杂交瘤细胞株的腹水效价。 [0047] 以重组小鼠Ttyh1为抗原，检测FMMU-Ttyh1-1-23号单克隆抗体在免疫印迹法(分子克隆实验指南，第二版，P888-P897)中结合抗原的能力。 [0048] 腹水效价实验结果如表1所示，23株杂交瘤细胞株产生的腹水效价均较高(在10-6以上)，表明其与抗原亲和力较高；将上述23株单克隆抗体用于免疫印迹实验，均得到阳性结果；其中第11株杂交瘤细胞产生的单抗在细胞免疫荧光、组织免疫荧光检测中同时获得强阳性结果，表明其能够很好的识别神经干细胞表面的天然Ttyh1分子，有利于神经干细胞的标识、分离和纯化。另一方面，利用其可变区制备的基因工程抗体更有可能与神经干细胞或神经胶质瘤组织中天然的Ttyh1分子结合并进一步发挥生物学作用。 [0049] 表1小鼠Ttyh1单抗的效价及应用鉴定 [0050] [0051] 注：-表示阴性结果，+表示阳性结果，++表示强阳性结果。 [0052] 1.3抗Ttyh1单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11的Western blot鉴定 [0053] 分别提取E14.5、E18.5、P0、P7、P14、P60全脑和P60脑室下带区脑组织，将组织剪碎后，加入RIPA裂解液，经研磨器研磨至无碎片后，收集液体冰上放置30min，4℃12000rpm离心15min，收集上清进行BCA(Pierce)蛋白定量测试。加入loading buffer煮沸10min，制备蛋白样品。另一方面，293T细胞转染pCAG-Ttyh1-IRES-EGFP(含HA标签)表达质粒后，制备蛋白样品。上述样品经SDS-PAGE后，转膜到(100V，1.5h)PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭2h，4℃孵育抗Ttyh1单克隆抗体和抗HA标签抗体过夜，PBST洗膜5min(三次)，孵育羊抗小鼠IgG-HRP二抗室温2h，PBST洗膜5min(三次)。利用ECL(Bio-Rad)化学发光试剂进行结果检测。 [0054] 检测结果如图1所示，293T细胞转染后，HA抗体与Ttyh1抗体检测结果一致，说明Ttyh1抗体可特异识别人工表达的Ttyh1蛋白。对不同发育阶段及成年的脑组织提取蛋白进行Ttyh1抗体Western blot检测，可见Ttyh1蛋白条带，说明Ttyh1抗体可特异识别组织中内源性的Ttyh1蛋白。 [0055] 在此基础上，发明人设计合成了针对Ttyh1的RNA干涉序列(SEQ.ID.NO.5)。培养原代神经干细胞，向其分别转染Ttyh1siRNA和对照Scramble siRNA，48h后收集细胞提取蛋白质，Western blot检测Ttyh1表达变化。一抗使用自制FMMU-Ttyh1-11抗体，后续步骤与上述Western blot检测相同。如图4所示，转染Ttyh1siRNA后，Ttyh1蛋白的表达水平显著下降。上述实验证明了Ttyh1siRNA干涉的高效性，以及FMMU-Ttyh1-11抗体检测的有效性。 [0056] 1.4抗鼠Ttyh1单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11检测体外培养神经干细胞和小鼠胚胎脑组织中Ttyh1的表达 [0057] 以FMMU-Ttyh1-11单克隆抗体为一抗，用细胞和组织免疫荧光染色方法检测。细胞免疫荧光染色步骤如下：取E12-14胎鼠大脑皮层，培养原代神经干细胞。24孔板提前4h挂PLL胶，无菌水洗3次。将原代神经干细胞形成的克隆球消化为单细胞悬液，以密度为5×105细胞/孔接种细胞。次日将培养液弃掉，4％PFA室温固定细胞20min，PBS洗5min(三次)，1％BSA室温封闭15min，将封闭液弃掉，加入抗Ttyh1单克隆抗体，4℃过夜。次日PBS洗10min(三次)，Cy3标记羊抗小鼠抗体为二抗，室温孵育2h，PBS洗10min(三次)。Hoechst衬染细胞核5min，75％甘油封片，镜下观察。 [0058] 组织免疫荧光染色步骤如下：E14.5胎鼠大脑半球组织O.C.T冷冻剂包埋，液氮冻存，冰冻切片。室温晾干，4％PFA固定切片20min，PBS洗5min(三次)，抗Ttyh1单克隆抗体孵育4℃过夜，PBS洗10min(三次)，Cy3标记羊抗小鼠抗体为二抗，室温孵育2h，PBS洗10min(三次)。Hoechst衬染细胞核5min，75％甘油封片，镜下观察。 [0059] 上述检测实验发现，FMMU-Ttyh1-11可特异结合原代培养神经干细胞表达的Ttyh1蛋白，阳性信号位于胞膜和胞浆(图2)。同时，FMMU-Ttyh1-11抗体识别小鼠胚胎脑组织中Ttyh1蛋白，染色阳性信号位于胚胎期神经干细胞聚居的脑室下带区(图3)。 [0060] 1.5抗Ttyh1单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11的免疫组化鉴定 [0061] 在抗原设计阶段，发明人选取了人鼠同源性较高的Ttyh1氨基酸序列。经同源性比对，如图5所示，二者的序列同源性高达88％。因此发明人在人胶质瘤组织中进行了TTYH1蛋白的免疫组织化学染色。 [0062] 胶质瘤组织切片脱蜡、水化。PBS洗5min。将切片浸入0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，电磁炉水浴加热至沸腾，自然冷却，PBS洗；切片放于3％双氧水孵育10min；PBS洗切片；滴加FMMU-Ttyh1-11一抗，37℃水浴箱中孵育2h。PBS洗3次；滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育40min。PBS洗3次；DAB显色1-3min；苏木素衬染，脱水、透明、封片、光镜观察。实验中以IgG1κ同型对照抗体作为阴性对照，以确保阳性信号的特异性和可靠性。 [0063] 胶质瘤组织染色结果如图6所示：FMMU-Ttyh1-11mAb与胶质瘤组织中的TTYH1分子特异性结合(B图)，阳性染色主要出现在胶质瘤细胞膜和胞浆中，而同型对照抗体没有任何阳性信号(A图)。 [0064] 2.FMMU-Ttyh1-11mAb轻链和重链可变区基因的克隆 [0065] 2.1FMMU-Ttyh1-11杂交瘤细胞的培养 [0066] 按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88)FMMU-Ttyh1-11细胞，用含20％小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2孵箱中培养。 [0067] 2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成 [0068] 用TRIZOL(invitrogen)试剂按说明书提取总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒(Takara)说明书进行反转录合成cDNA第一链。 [0069] 2.3PCR法扩增FMMU-Ttyh1-11V L和FMMU-Ttyh1-11V H基因 [0070] PCR法扩增试剂盒购自Takara公司，以cDNA第一链为模板进行PCR。反应体积50μl，反应条件为：95℃45s，55℃45s，72℃1min，循环35次；VL、VH的正、反向引物核苷酸序列分别为： [0071] VL F:gacat tcagc tgacc cagtc tcca [0072] VL B:gatct ccagc ttggt ccctc ca [0073] VH F：tgagg agacg gtgac cgtgg tccct tggcc ccag [0074] VH B：aggts marct gcags agtcw gg(s:c/g；m:a/c；r:a/g；w:a/t)[0075] 2.4PCR扩增产物的克隆和筛选 [0076] PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(Axygen)回收抗体重链和轻链可变区片段，用pMD18T试剂盒(Takara)将该片段按说明书插入pMD18T载体中。转化E.coli XL-10(购自北京中国普通微生物菌种保藏中心)，用EcoRⅠ和Hind III限制性核酸内切酶(Takara)酶切法筛选重组阳性克隆。用双脱氧核酸末端终止法测定基因序列，由北京奥科生物技术有限责任公司完成，测定结果如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。 [0077] 3.FMMU-Ttyh1-11抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列及同源性分析 [0078] 3.1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。分析结果表明，FMMU-Ttyh1-11单抗轻链可变区基因与编号为NC000072.6的小鼠Ig轻链可变区基因同源性最高，同源性为294/298，同源性百分比为99％(图7)；FMMU-Ttyh1-11单抗重链可变区基因与编号为NT114985.3的小鼠Ig重链可变区基因同源性最高，同源性为269/273，同源性百分比为99％，(图8)。 [0079] 3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示。在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析结果表明，FMMU-Ttyh1-11单抗轻链氨基酸序列与编号为AFR53773.1的小鼠Ig轻链氨基酸序列同源性最高，同源性为108/110，同源性百分比为98％(图9)；FMMU-Ttyh1-11单抗重链氨基酸序列与编号为AGW15829.1的小鼠Ig重链可变区氨基酸序列同源性最高，同源性为101/109，同源性百分比为93％(图10)。 [0080] 编码FMMU-Ttyh1-11单抗的轻链和重链可变区基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明：未发现与本发明相同的基因和蛋白质序列。 [0081] 3.3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定CDR区。 [0082] 将测序所得FMMU-Ttyh1-11抗体轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)分析，得出其CDR区。 [0083] 轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为： [0084] CDR1：Glu-Ser-Val-Asp-Asn-Tyr-Gly-Ile-Ser-Phe； [0085] CDR2：Ala-Ala-Ser； [0086] CDR3：Gln-Gln-Ser-Lys-Glu-Val-Pro-Arg-Thr； [0087] 重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为： [0088] CDR1：Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Arg-Tyr-Trp； [0089] CDR2：Ile-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-Ile； [0090] CDR3：Ala-Arg-Arg-Tyr-Ala-Tyr-Asp-Asp-Tyr。 [0091] 4.基因工程抗体设计 [0092] 基于抗Ttyh1单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11的表达、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制品。 [0093] 4.1抗人FMMU-Ttyh1-11单链抗体的构建 [0094] 将本发明的单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11的轻链和重链可变区基因插入表达载体pCantab 5E中，获得单链抗体基因转化表达菌株，通过诱导该基因的表达，制备抗人FMMU-Ttyh1-11单链抗体，对神经胶质瘤可能具有潜在的诊断、治疗作用。 [0095] 4.2人源化抗体的构建 [0096] 将本发明的单克隆抗体FMMU-Ttyh1-11单链抗体轻链和重链可变区的CDR区移植到人源可变区的FR中，形成CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)也称重构抗体(reshaping antibody)或人源化抗体(humanized antibody)。利用CDR移植技术改造抗体，可以获得保持鼠源性亲本单克隆抗体的特异性，同时更加接近人源抗体的新型抗体，用于制备对恶性肿瘤有潜在治疗作用的人源化抗体。 [0097] 4.3根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人TTYH1功能表位的人鼠嵌合抗体、Fab抗体、疫苗或其他生物制品。

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