一种何首乌叶原生质体的制备方法 |
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申请号 | CN201611120704.8 | 申请日 | 2016-12-08 | 公开(公告)号 | CN106520667A | 公开(公告)日 | 2017-03-22 |
申请人 | 陕西易阳科技有限公司; | 发明人 | 张俊; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种何首乌叶原生质体的制备方法,其特征在于包括以下步骤:何首乌 叶片 经过质壁分离后切成0.5厘米宽的长条,转入到25% 蔗糖 溶液中放置8min,在35℃ 水 浴锅中处理何首乌叶片30win,过滤后得到原生质体溶液;本发明所述方法制备的何首乌叶原生质体,活性强,融合效率高,可工业化生产,实用性强。 | ||||||
权利要求 | 1.一种何首乌叶原生质体的制备方法,其特征在于包括以下步骤: |
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说明书全文 | 一种何首乌叶原生质体的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及一种何首乌叶原生质体的制备方法。 背景技术[0002] 何首乌为双子叶蓼科多年生草本植物,分布在我国广东、四川、湖南等省区,生长于灌木丛中、山脚阴处或石隙中。茎缠绕,基部中空,多分枝,基部木质化。叶心形,两面光滑,有膜质短筒状的托叶鞘,圆锥状花序。瘦果椭圆形,光滑,黑色。块茎供药用,有滋补强壮作用,茎藤可治失眠症。野生何首乌的块茎生长缓慢,不能满足人类对药物的开发利用。 [0003] 植物原生质体培育和融合是植物育种的重要技术之一。目前分离原生质体的方法有机械法和酶法,常用的方法是酶法。笔者用机械法制备何首乌叶片的原生质体,用PEG结合高pH诱导融合法来融合其原生质体,以期为何首乌多倍体植株的培育奠定基础。 发明内容[0004] 本发明提出一种何首乌叶原生质体的制备方法。 [0005] 本发明所述方法制备的何首乌叶原生质体,活性强,融合效率高,可工业化生产,实用性强。 具体实施方式[0006] 实施例1。 [0007] 一种何首乌叶原生质体的制备方法,包括以下步骤:(1)何首乌叶片经过质壁分离后切成0.5厘米宽的长条,转入到25%蔗糖溶液中放置 8min,在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win,过滤后得到原生质体溶液; (2)原生质体经过27%蔗糖溶液洗涤一次,再用13%甘露醇CPW溶液悬浮; (3)悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合; (4)原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw); (5)经过质壁分离法获得的原生质体溶液,l500r/rain下离心8win,沉淀用少量13%甘露醇CPW溶液悬浮,为原生质体溶液; (6)用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上,静置几分钟,使原生质体在载玻片上产生一薄层; (7)取PEG融合液两滴,缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中,再静置一定时间,观察载玻片原生质体问的粘连; (8)每隔5min,用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液,共3次; (9)盖上盖玻片,用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可。 [0008] 实施例2。 [0009] 一种何首乌叶原生质体的制备方法,包括以下步骤:(1)何首乌叶片经过质壁分离后切成0.5厘米宽的长条,转入到25%蔗糖溶液中放置 8min,在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win,过滤后得到原生质体溶液; (2)原生质体经过27%蔗糖溶液洗涤一次,再用13%甘露醇CPW溶液悬浮; (3)悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合; (4)原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw); (5)经过质壁分离法获得的原生质体溶液,l500r/rain下离心8win,沉淀用少量13%甘露醇CPW溶液悬浮,为原生质体溶液; (6)用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上,静置几分钟,使原生质体在载玻片上产生一薄层; (7)取PEG融合液两滴,缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中,再静置一定时间,观察载玻片原生质体问的粘连; (8)每隔5min,用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液,共3次; (9)盖上盖玻片,用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可; (10)所述渗透剂为0.9mol/LNaCI、6%KN03和5%蔗糖溶液的混合液; (11)原生质体质壁分离的蔗糖浓度为25%、30%、35%、40%、45%。 [0010] 实施例3。 [0011] 一种何首乌叶原生质体的制备方法,包括以下步骤:(1)何首乌叶片经过质壁分离后切成0.5厘米宽的长条,转入到25%蔗糖溶液中放置 8min,在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win,过滤后得到原生质体溶液; (2)原生质体经过27%蔗糖溶液洗涤一次,再用13%甘露醇CPW溶液悬浮; (3)悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合; (4)原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw); (5)经过质壁分离法获得的原生质体溶液,l500r/rain下离心8win,沉淀用少量13%甘露醇CPW溶液悬浮,为原生质体溶液; (6)用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上,静置几分钟,使原生质体在载玻片上产生一薄层; (7)取PEG融合液两滴,缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中,再静置一定时间,观察载玻片原生质体问的粘连; (8)每隔5min,用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液,共3次; (9)盖上盖玻片,用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可; (10)所述渗透剂为0.9mol/LNaCI、6%KN03和5%蔗糖溶液的混合液; (11)原生质体质壁分离的蔗糖浓度为25%、30%、35%、40%、45%。 |