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一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法
申请号	CN201610994328.9	申请日	2016-11-11	公开(公告)号	CN106399230A	公开(公告)日	2017-02-15
申请人	深圳职业技术学院;			发明人	林峰;
摘要	本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及成纤维细胞的分离培养方法。本发明提供一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。用DMEM/F12(1:1)培养基可有效促进成纤维细胞的增殖，保持成纤维细胞原有细胞形态，提高细胞前期胶原蛋白表达，EGF和bFGF能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。
权利要求	1.一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤： 1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞； 2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的酶消化法采用0.25％胰蛋白酶和 0.02M EDTA消化人皮肤组织，再加入1mg/ml II型胶原蛋白酶。 3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)为无菌条件下取人皮肤组织，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃过夜处理；第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/ml II型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心。 4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的人皮肤组织为人耳后皮肤。 5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中的细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为75U/ml，bFGF活力单位为100U/ml。 6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中成纤维细胞在37℃、5％CO2培养24h。 7.一种成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤： 1)无菌条件下取人耳后皮肤，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃过夜处理；第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/ml II型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心； 2)将上述成纤维细胞加入比例为1:1的DMEM培养基和F12培养基中，37℃、5％CO2培养 24h，弃去培养液，并添加细胞生长因子活力单位为75U/ml的EGF和/或100U/ml的bFGF，继续 37℃、5％CO2培养24h，获得培养的成纤维细胞。
说明书全文	一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法技术领域 [0001] 本发明涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及成纤维细胞的分离培养方法。背景技术 [0002] 医疗技术的发展及人们生活水平的提高，使人类平均寿命得到有效延长的同时，也使延缓衰老渐渐进入人类视野。而皮肤作为人体最大的器官，其结构完整、美观不仅影响着心情，也体现其生活质量的高低。因此，越来越多的爱美人士渴望通过医疗技术干预皮肤老化。然而，目前市场主流的抗衰老产品多以化学药物或激光疗法为主，其短期效果明显，但长期效果及安全性却一直备受质疑。自体细胞回输技术，其采用体外培养自体成纤维细胞达一定数目及活性后，将其回输入人体执行特定皮肤部位老化细胞的功能，从而对延缓皮肤衰老起到促进作用，具有更高的安全性及有效性。然而，如何快速获得活性细胞在一定程度上制约了自体细胞回输技术的临床应用。 [0003] 衰老是人类生命历程中不可缺少的环节，且往往从一个细胞群的老化为起点。而成纤维细胞作为是皮肤中重要的细胞之一，其不仅能合成及分泌胶原蛋白来维持皮肤弹性及韧性，同时也可在皮肤受到损伤时，参与组织修复。而目前研究证实，成纤维细胞活性减弱，胶原蛋白分泌量减少是皱纹产生的重要因素。目前抗皱化妆品种多含有人表皮神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等，这类生长因子也主要作用于成纤维细胞。此外，针对皮肤性疾病或烧伤等意外引起的皮肤缺损，单靠自体皮肤移植已不能满足临床应用需求，若能在短时间内，通过体外培育出大量的人表皮成纤维细胞或将为临床应用提供新的思路。由此可见，表皮成纤维细胞的培养具有极高的临床应用价值。 [0004] 生长因子(Growth factor)存在于体内并对机体细胞的生长发育具有调节作用的一类细胞因子，在体内含量极微，但是生物活性极高。然而随着年龄的增长，皮肤生长因子自身分泌不断下降，作用减弱，因此外源生长因子的导入来赋予细胞新的活力成为了生物美容的新热点和突破口。其中人表皮细胞生长因子(human epidermal growth factor,EGF)能够启动与细胞分裂有关的基因，促使细胞进行有丝分裂，有效的促进和调节皮肤细胞的生长和增殖。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可刺激多种细胞进行有丝分裂、增殖和迁移，在皮肤和创面修复中有重要作用。 [0005] 此外EGF和bFGF具有多种生物活性，改善细胞生长的微环境，促进羟脯氨酸的合成，促使胶原和弹性纤维合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，从而使肌肤富有弹性，更加嫩滑有光泽，并减少皱纹的产生，延缓皮肤衰老。 [0006] 以往研究中多采用包皮组织作为实验用皮肤，虽其具有取材方便的优点，但皮肤来源均为男性，在实际应用中并不能广泛代表所有人群皮样特点。采用植块法，不仅操作步骤繁琐如及时翻转细胞培养瓶等，且细胞需培养14天以上才可顺利进行传代，且远离组织块处细胞已明显变大、老化，使得获得细胞质量及数量均不如酶消化法。而鉴于大多数人群的耳后皮肤在实际生活中均较少受到摩擦，皮肤细胞更替慢，其个体间差异较小，从而能更具有广泛性结果。发明内容 [0007] 本发明的目的是提供一种成纤维细胞的培养方法，该方法用两步酶消化法从耳后皮肤中获得的成纤维细胞，采用DMEM和F12完全培养基并加入EGF、bFGF细胞生长因子，有助于成纤维细胞的增殖、胶原蛋白的分泌及延缓衰老。 [0008] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案： [0009] 本发明提供了一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤： [0010] 1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞； [0011] 2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。 [0012] 优选地，步骤1)中的酶消化法采用0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA消化人皮肤组织，再加入1mg/ml II型胶原蛋白酶。 [0013] 更优选地，步骤1)为无菌条件下取人皮肤组织，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/ml II型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心。 [0014] 优选地，步骤1)中的人皮肤组织为人耳后皮肤。 [0015] 优选地，步骤2)中的细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为75U/ml，bFGF活力单位为100U/ml。 [0016] 优选地，步骤2)中成纤维细胞在37℃、5％CO2培养24h。 [0017] 本发明还提供了一种成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤： [0018] 1)无菌条件下取人耳后皮肤，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02M EDTA，4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/ml II型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心； [0019] 2)将上述成纤维细胞加入比例为1:1的DMEM培养基和F12培养基中，37℃、5％CO2培养24h，弃去培养液，并添加细胞生长因子活力单位为75U/ml的EGF和/或100U/ml的bFGF，继续37℃、5％CO2培养24h，获得培养的成纤维细胞。 [0020] 本发明对耳后皮肤中成纤维细胞进行提取，传代，研究不同培养基并在之中添加生长因子对成纤维细胞细胞增殖、胶原分泌以及细胞传代中的稳定性进行分析，本发明特以人耳后皮肤作为实验用组织。另外，本发明采用酶消化法替代植块法。对于0.5cm0.5cm皮肤块，经酶消化后24小时即可见成纤维细胞贴壁，消化后72-96小时可见大量成纤维细胞贴壁，不仅保证细胞数目及细胞正常形态，同时减少细胞增殖次数，缩短实验周期。此外，针对酶消化法中的残留的表皮细胞，表皮细胞较成纤维细胞更加耐受胰酶，但贴壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替换培养液的方法可获得高纯度的成纤维细胞。 [0021] 采用两步酶消化法从健康人耳后皮肤中获得成纤维细胞，依据培养基种类不同分为A组(FM无血清培养基)、B组(DMEM+10％FBS)、C组(RPMI-1640+10％FBS)、D组(DMEM/F12(1:1)+10％FBS)，并将细胞生长因子(EGF、bFGF)加入到培养基中，采用MTT法、细胞划痕实验、酶联免疫吸附实验、β-半乳糖苷酶试验、软琼脂克隆形成试验比较不同培养基和细胞因子对细胞增殖、迁移、胶原分泌、老化、变异的影响。 [0022] 本发明的有益效果是： [0023] 用DMEM/F12(1:1)培养基可有效促进成纤维细胞的增殖，保持成纤维细胞原有细胞形态，提高细胞前期胶原蛋白表达，EGF和bFGF能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。附图说明 [0024] 图1表示细胞原代培养中，B、D组在培养72h后的示意图，B组为DMEM+10％FBS，D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0025] 图2表示细胞原代培养中，B、D组通过3次传代后的示意图，B组为DMEM+10％FBS，D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0026] 图3表示MTT实验，A、B、C、D组细胞增殖曲线，A组为FM无血清培养基，B组为DMEM+10％FBS，C组为RPMI-1640+10％FBS,D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0027] 图4细胞迁移实验，A组为FM无血清培养基，B组为DMEM+10％FBS，C组为RPMI-1640+10％FBS,D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0028] 图5细胞衰老实验，A组为FM无血清培养基，B组为DMEM+10％FBS，C组为RPMI-1640+10％FBS,D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0029] 图6表示D组成纤维细胞在体外培养30代后，接种在软琼脂上培养15天，以A549肺癌细胞为阳性对照品，图6A为皮肤成纤维细胞，图6B为A549肺癌细胞，D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。 [0030] 图7表示EGF和bFGF对成纤维细胞增殖的影响。 [0031] 图8表示EGF和bFGF对成纤维细胞胶原蛋白分泌的影响。具体实施方式 [0032] 1材料和方法 [0033] 1.1材料 [0034] 正常耳后皮肤组织由深圳市君焯医疗美容整形研究所提供，采用无菌手术采集耳后1平方厘米的表皮。 [0035] A549肺癌细胞由深圳市大规模细胞培养技术和细胞资源库公共技术服务平台提供。 [0036] 0.25％胰蛋白酶，II型胶原蛋白酶、人胶原蛋白酶I型酶联免疫分析试剂盒购自sigma公司； [0037] MTT试剂盒、β-半乳糖苷酶购自碧云天公司； [0038] FM无血清培养基购自sciencell公司； [0039] 重组人表皮生长因子(EGF)购自上海昊海生物科技股份有限公司，重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自北京双鹭药业股份有限公司； [0040] DMEM培养基、RPMI-1640培养基、F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司,按照说明书配制成基础培养基，添加10％的胎牛血清配制成完全培养基。 [0041] 消化液I：0.25％胰酶(购自sigma公司)加入0.02M EDTA混合。 [0042] 消化液2：II型胶原酶(购自sigma公司)，用PBS配成浓度为1mg/ml。 [0043] 统计学分析 [0044] 采用SPSS19.0统计分析软件，对其中计量资料以表示，并进行重复资料方差分析或成组t检验。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。 [0045] 分组：A组FM无血清培养基，B组DMEM+10％FBS，C组RPMI-1640+10％FBS，D组DMEM/F12(1:1)+10％FBS； [0046] 【实施例1】成纤维细胞原代培养：无菌条件下取正常耳后皮肤约2cm3cm，将其放入无菌PBS中迅速带回实验室，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入消化液1(0.25％胰酶+0.02M EDTA)，4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入消化液2(1mg/ml II型胶原酶)，37℃，2h处理。将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，并将其等分成4份进行离心500rpm，10min，补加相应培养基重悬后，加到T25细胞培养瓶中，37℃5％CO2过夜培养，并镜下观察细胞是否呈现放射状或漩涡状生长。 [0047] 皮肤组织经消化液1及消化液2处理后，各组均在37℃，5％CO2培养条件下培养。其中B、D组在培养72h后均可见大量成纤维细胞及少量上皮样细胞(见图1)，依据两种细胞对消化酶I耐受度不同，通过3次传代后，视野下即无上皮样细胞(见图2)。而A、C组则需培养96h以上才可达到细胞融合度80％以上并进行传代。采用酶消化法可在短时间内获得大量成纤维细胞。 [0048] 【实施例2】细胞增殖实验：单层成纤维细胞经消化液1消化后，依据分组情况，加入相应培养基稀释细胞密度至约5×103个/ml，以100μl/孔接种于6块96孔板中，每组12个孔，且96孔板外围不设实验孔。随后将6块96孔板放入37℃5％CO2培养箱中培养，并在12h、24h、48h、72h、96h、120h时间点取一块96孔板弃去培养液，加入MTT(50μl/孔)，37℃、5％CO2培养 4h，缓慢吸取培养液并用清水沿孔壁吸取未反应的MTT，滤纸拍干，随后加入DMSO(150μl/孔)，室温振荡10min，在波长490nm下读取各孔吸光度值，并计算各组吸光度平均值。 [0049] 其结果显示，培养24h后，四组细胞均开始增殖。其中B组、D组细胞在培养48h-72h间细胞增殖最快，而A、C组在72h-96h增殖快。经统计分析，四组在培养72h后，OD值差异存在统计学意义(F＝14.353,P＝0.034)(见图3)。 [0050] 采用D组(DMEM/F12)培养基可有效促进细胞的增殖，采用C组(RPMI-1640)培养基时，细胞增殖速度相对缓慢，而MTT实验进一步证实了，即使是相同细胞密度下，DMEM及DMEM/F12对于细胞的促增殖作用也明显高于RPMI-1640及FM无血清培养基。贴壁类细胞采用DMEM培养时可获得较快生长速度，其高浓度的细胞增殖成分使得刚分离的成纤维细胞可快速适应体外培养环境。此外，考虑临床应用细胞的部位多为受损或老化部位，因此通过人为创造创面，来模拟细胞在注射入人体内后的迁移情况。其结果显示，成纤维细胞填充创面速度为：DMEM/F12≥DMEM＞FM＞RPMI-1640。但对细胞形态进行观察发现，DMEM细胞形态变大，而DMEM/F12仍保持原有细胞形态。由于细胞衰老时多出现细胞核增大现象，以便利于细胞吸收更多物质。而衰老细胞在分泌胶原蛋白、纤维粘连蛋白、弹性蛋白等细胞外基质能力明显减弱，而这类物质不仅对细胞起到支撑、连接作用，同时也是细胞间信号传导的重要桥梁。因此，在保证细胞增殖速度的同时，更要防治细胞过早衰老。虽然DMEM细胞营养成分浓度较高，但其营养成分种类较少，而F12培养基似乎可以弥补DMEM在此方面的缺陷，从而在促进细胞增殖过程中，避免了细胞过度老化。 [0051] 【实施例3】细胞划痕实验：将四种培养基培养的成纤维细胞，按2105cell/孔，接种至6孔板中，37℃、5％CO2培养过夜至细胞铺满六孔板，采用无菌枪头在六孔板底部人为划出几道横，PBS清洗3次后，加入相应培养基，每隔2小时在同一部位拍照观察细胞迁徙情况。 [0052] 自细胞划痕后24小时内，每隔2小时对细胞迁徙情况进行拍照，其结果显示，当采用D组培养液细胞迁移速度明显快于其余各组。见图4。 [0053] 【实施例4】胶原蛋白分泌：将各组细胞转移至T25细胞培养瓶中培养，每次传代前，吸取细胞上清液-20℃冻存，PBS清洗一次，加入消化酶1消化3min，离心，取出消化酶1,加入培养基重悬，吸取一半补加入原瓶37℃5％CO2继续培养，共收集各组在传代前、传代1次、传代2次、传代3次、传代4次上清液，离心3000rpm,10min，将样品存于-20℃冰箱备用，并按照试剂盒说明书进行人胶原蛋白酶I酶联免疫试验。 [0054] 胶原蛋白检测：各组均先扣除传代前胶原蛋白含量，其中A组细胞分泌胶原含量相对稳定，而B、D组在传代3次后胶原分泌达到最大后胶原分泌量逐渐减少，因此，FM无血清培养基可使细胞稳定表达胶原蛋白，而DMEM/F12则有利于提高细胞前期胶原蛋白表达。见表1。 [0055] 表1各组细胞胶原蛋白分泌检测 [0056] [0057] 【实施例5】细胞衰老 [0058] 采用β-半乳糖苷酶检测试剂盒，大致步骤如下：将细胞传代按5104cell/孔接种至6孔板中，PBS清洗，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温放置15min，吸弃固定液，PBS清洗3次，3min/次，加入1ml染色液放置于不含CO237℃培养箱中孵育过夜，隔日显微镜下观察细胞染色情况。 [0059] 自细胞传代至38代时，对四组细胞分别进行β-半乳糖苷酶检测，其中B组细胞衰老明显，而C组次之，A、D组较不明显,可见，DMEM培养下的细胞衰老速度明显快于其余三组细胞，而其余三组未见明显差异，见图5。 [0060] 【实施例6】软琼脂克隆形成实验 [0061] 配置2×DMEM-F12完全培养基(含2×FBS)，并与等体积1.2％低熔点琼脂混合加入6孔板中，每孔1.6ml，常温放置待其凝固。将传代30次的成纤维细胞经胰酶消化、离心，添加 2×DMEM-F12完全培养基稀释细胞浓度至1*105cell/ml；另将2×DMEM-F12完全培养基与等体积0.7％低熔点琼脂糖混合后，并加入100μl细胞悬液混匀，添加至含有下层凝固的琼脂完全培养基中，放入37℃，5％CO2培养箱10-14天后，每孔加入1ml(0.01％)结晶紫，室温染色10min，拍照计数。其中，本实验以A549肺癌细胞作为阳性对照。 [0062] 以A549肺癌细胞为阳性对照品，其结果显示，皮肤成纤维细胞在体外培养30代后，细胞暂时可保持正常生长状态，无明显肿瘤化生长迹象。接种在软琼脂上培养15天后，不形成克隆且细胞均死亡，见图6。 [0063] 【实施例7】细胞生长因子实验：将细胞均匀接种于96孔板中(1500cell/孔)，37℃、5％CO2培养24h后，弃去培养液。将EGF、bFGF用培养基稀释成梯度浓度(浓度梯度为0、25、 50、75、100、200、400U/ml)，按每孔200μl加入至96孔板，每个梯度做3组重复，以加200μl培养基设为对照组。继续37℃、5％CO2培养24h后，每孔取100μl上清培养液进行人胶原蛋白酶I酶联免疫试验(见实施例4)；将96孔板剩余培养液弃净，用MTT法进行细胞增殖实验(见实施例2)。 [0064] 培养基中分别加入一定梯度浓度的EGF和bFGF(浓度梯度为0、25、50、75、100、200、400U/ml)，培养24h后，较未加生长因子的对照组(细胞OD值仅为0.2)，成纤维细胞有明显的增殖(见图7)。其中EGF组细胞增长更为突出，当EGF为100U/ml，成纤维细胞增殖达到峰值，细胞OD值为0.38，是对照组的1.9倍。成纤维细胞胶原蛋白的分泌量在加入生长因子后也有明显的增加(见图8)，EGF和bFGF确实促进了成纤维细胞I型胶原蛋白分泌的增加。在EGF和bFGF活力单位为75U/ml和100U/ml时分别达到峰值，峰值后随活力单位的增加分泌量逐渐减少。 [0065] 但是细胞所需的细胞生长因子是相对较少的，其活性在一定范围内对细胞的增殖和胶原蛋白的分泌有促进作用，超过一定量，作用反而减弱甚至会反向抑制。也说明在人体内所需的生长因子量并不多，但是生物活性非常高。 [0066] 综上所述，采取酶消化法有助于快速从人皮肤组织中获得成纤维细胞，而采用DMEM/F12培养基并添加一定量的EGF(75U/ml)和bFGF(100U/ml)则有助于成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的分泌。

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