一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201610833378.9 | 申请日 | 2016-09-20 | 公开(公告)号 | CN106244536A | 公开(公告)日 | 2016-12-21 |
| 申请人 | 新乡医学院; | 发明人 | 常玉巧; 郭康; 马洁; 郭志坤; 李辞霞; 付海鹏; 郭永龙; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于动物细胞培养技术领域，涉及一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法。步骤如下：脾脏样品的预处理；酶解样品，获得终隔细胞悬液；终隔细胞悬液的细胞接种，制备原代细胞；原代细胞的传代扩大培养，制备传代细胞；固定传代细胞，完成大鼠脾脏终隔细胞的原代分离培养。本发明针对脾脏组织的结构特点，采用0.1%胶原酶I、0.125%胰蛋白酶和0.002%I型脱 氧 核糖核酸酶，联合消化法分离培养脾脏中的TCs，该方法得到的细胞纯度高，活 力 好，且传代后细胞形态稳定，活力高，可广泛用于后续相关TCs形态和功能实验的有效开展。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法，其特征在于：步骤如下： |
||||||
| 说明书全文 | 一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法技术领域[0001] 本发明属于动物细胞培养技术领域，涉及一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法。 背景技术[0002] 终隔细胞（Telocytes，TCs)，是近年来新发现并被命名的一种间质细胞，广泛分布于皮肤、心、肾、胃肠道、膀胱、腮腺、胎盘、肺和支气管等。在心肌层、心内膜层、心外膜的结缔组织间质及心肌干细胞池的间质、肺静脉肌袖中均证实其存在。终隔细胞具有典型的形态学特征：胞体较小，自胞体伸出一个或多个长短不一的细长突起（telopodes，TPs），突起上有缩窄部(podomer)和膨大部(podom)交替排列，呈现出念珠状结构。对于TCs的研究，目前主要集中在透射电镜观察各种组织及组织的不同部位TCs的形态学观察上，缺乏各个器官TCs有效分离培养大大限制了对TCs的深入研究。作为一种特殊形态的间质细胞，目前并未发现其自身的特异抗原，因此研究者们尚不可能通过流式细胞分选技术来获取纯化的终隔细胞用于科研。随着人们对其生物学特点的深入认识，以及原代细胞培养技术的发展，研究者们也在逐渐探索终隔细胞分离和原代培养较好的方法以获得较高纯度的细胞用于形态和功能学的深入研究。如可使用高通量生物技术对终隔细胞进行基因组、蛋白质组的测量和分析，研究其在结缔组织中与其他特殊类型细胞（内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞和免疫细胞等）的相互联系，寻找终隔细胞特异性抗体等。因此，为研究终隔细胞诸多未知功能，分离纯化培养TCs无疑是我们现阶段的一个重要研究方向。 [0003] 目前，在心脏、皮肤、食管和肾脏中原代分离培养TCs已有报道。但消化液的成分不尽相同。如在食管中，为II型胶原酶和脱氧核糖核酸酶配置成消化液，细胞离心速率为2000rpm，细胞培养差速贴壁时间为60-90 min，细胞培养液为高糖DMEM培养基，在实际的操作步骤中也不尽相同。关键是这些方法原代分离培养的各个组织TCs数量少，纯度较低，不利于开展相关的细胞实验。目前，针对TCs的分离培养，脾脏中尚未有报道。 发明内容[0004] 本发明为解决从脾脏细胞中分离培养终隔细胞的技术问题，公开了一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法。 [0005] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种脾脏终隔细胞原代分离培养方法，步骤如下： （1）脾脏样品的预处理； （2）酶解样品，获得终隔细胞悬液； （3）终隔细胞悬液的细胞接种，制备原代细胞； （4）原代细胞的传代扩大培养，制备传代细胞； （5）固定传代细胞，完成大鼠脾脏终隔细胞的原代分离培养。 [0006] 所述步骤（1）中预处理的步骤为，取脾脏样品，用预冷的PBS缓冲液冲洗后将脾脏组织剪成0.5-1.5mm3小块。 [0007] 所述步骤（2）中酶解的步骤为加入与脾脏组织小块相同体积的混合酶，于37℃下处理5min，用吸管吹打80-120次，37℃静置5min，吸取上清液，重复酶解吹打步骤3-5次。 [0008] 所述步骤（3）中终隔细胞悬液的接种步骤为，向上清液中加入等体积含低糖的完全培养基，终止消化，得细胞悬液，用200目滤网过滤细胞悬液，滤除未消化完的组织块；1200 rpm离心5 min，用完全培养基重悬沉淀，细胞计数，以1×105个/mL的浓度接种至培养瓶中。 [0009] 所述步骤（3）中原代细胞培养的步骤为40 min差速贴壁除去培养瓶上贴壁的成纤维细胞，翻转培养瓶，加入完全培养基继续培养；24 h后首次更换培养基，以去除未贴壁的细胞及细胞碎片，以后每48 h换液，细胞汇集接近85%时，以胰酶细胞消化液消化贴壁细胞。 [0010] 所述步骤（3）中传代细胞的步骤为以1:3接种传代扩大培养，2-3代细胞接种于孔板中，行细胞爬片，当细胞汇集接近70%时，4%多聚甲醛在避光条件下固定备用。 [0011] 本发明的有益效果在于：本发明针对脾脏组织的结构特点，采用0.1%胶原酶I、0.125%胰蛋白酶和0.002%I型脱氧核糖核酸酶，联合消化法分离培养脾脏中的TCs，该方法得到的细胞纯度高，活力好，且传代后细胞形态稳定，活力高，可广泛用于后续相关TCs形态和功能实验的有效开展。 附图说明 [0012] 图1为光镜下不同培养时期的终隔细胞，其中A为原代培养3天；B为原代培养5天；C为传代培养第一代细胞，5天；D为传代培养第二代细胞，3天。 [0013] 图2为扫描电镜下分离培养的脾脏终隔细胞。 [0014] 图3为透射电镜下的脾脏终隔细胞。 [0015] 图4体外分离培养的脾脏终隔细胞免疫荧光双标图。 具体实施方式[0016] 无菌条件下取大鼠脾脏样品，预冷含有1%青-链霉素的PBS冲洗，用眼科剪将脾脏组织剪成约1 mm3小块，加入与组织块等体积的消化酶混合物：0.1%胶原酶I（购于Roche公司）、0.125%胰蛋白酶（购于Sigma公司）和0.002%I型脱氧核糖核酸酶（购于Sigma公司）；消化酶的配置：分别称取100mg的粉末状的I型胶原酶，12.5mg胰蛋白酶和0.2mg I型脱氧核糖核酸酶，溶于100ml PBS（pH 7.2），搅拌混匀，0.22微米滤器过滤除菌，冻存管1mL分装，20℃保存备用；组织块与等体积的混合消化酶于37℃， 5 min内用吸管吹打100次，37℃、静置5 min，吸取上清；重复以上步骤3-5次，直到组织块消化完全。收集的上清液加入等体积含低糖完全培养基[DMEM（Hyclone公司）+10%胎牛血清（Hyclone公司）]终止消化；细胞悬液用200目滤网过滤，滤除未消化完的组织块；1,200 rpm离心5 min，完全培养基重悬沉淀，细胞计数，1×105个/mL的浓度接种至25 cm2培养瓶中，40 min差速贴壁去除成纤维细胞，加入完全培养基继续培养。24 h后首次更换完全培养基，以去除未贴壁的细胞及细胞碎片，每日在倒置显微镜下观察TCs典型形态特征和生长状态，并拍照记录如图1所示。 [0017] 以后每48 h换液，细胞汇集接近85%时，胰酶细胞消化液（含0.25%胰酶、0.02%EDTA），37℃、2 min，消化贴壁细胞，以1:3接种传代扩大培养，2-3代细胞接种于孔板中，行细胞爬片，当细胞汇集接近70%时，4%多聚甲醛在避光条件下固定备用，结果如图2所示，其中A为一个胞体拥有六个突起的终隔细胞，B为终隔细胞的突起与相邻细胞相互连接，交织成网状，且突起呈二分枝状生长；C为分离培养的脾脏终隔细胞，突起长短不一，从数十微米至数百微米不等；D为有两个突起的终隔细胞，其中一个突起长达297.5微米。其中↑表示胞体，多呈梭行，较小，▲表示呈念珠状分布在突起上的膨大部分。透射电镜下的脾脏终隔细胞如图3所示，其中A为通过突起与淋巴细胞相连的终隔细胞；B为突起包绕着白细胞的终隔细胞；C为终隔细胞的突起呈二分枝状分布；D为在白细胞和血细胞之间成簇分布的终隔细胞。 [0018] 针对以上实验结果，证实了采用0.1%胶原酶I、0.125%胰蛋白酶和0.002%I型脱氧核糖核酸酶联合消化法，我们首次分离培养脾脏中的TCs，也具有典型的形态学特征如图4所示，其中A、E、I为波形蛋白染色（A为Cy3荧光标记，呈红色，E和I，为FITC荧光标记，呈绿色）； B、F、J.分别为CD34、 nanog 和 sca-1染色（B为FITC荧光标记，呈绿色，F和J，为Cy3荧光标记，呈红色）；C、G、K为细胞核（DAPI染色，呈蓝色）；D、H、L分别为前三列图片叠加图，标尺：20μm；胞体较小，自胞体伸出一个或多个长短不一的TPs，突起上有（podomer)和（podom)交替排列，呈现出念珠状特征性结构。免疫荧光染色，与心脏中TCs类似，脾脏TCs表达骨架蛋白vimentin，多能转录因子nanog和跨膜糖蛋白CD34，进而证实了该方法分离的脾脏TCs的性状。 [0019] 总之，采用0.1%胶原酶I、0.125%胰蛋白酶和0.002%I型脱氧核糖核酸酶联合消化法，首次分离培养脾脏中的TCs，得到的细胞纯度高，活力好，可广泛用于后续实验。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈