一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法 |
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| 申请号 | CN201610527144.1 | 申请日 | 2016-07-05 | 公开(公告)号 | CN106085952A | 公开(公告)日 | 2016-11-09 |
| 申请人 | 四川华皓生物科技有限公司; | 发明人 | 黄海森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种胎盘绒毛板间充质干细胞，其提取方法包括以下步骤：(1)获取胎盘绒毛板；(2)去除血管和绒毛组织；(3)清洗绒毛板至没有血色；(4)将绒毛板剪成0.5‑5mm2的组织微 块 ，清洗；(5)加入含胰酶、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶的组织消化液消化；(6)过滤，离心；(7)培养；(8)当细胞融合度达到70‑90％时，用0.25％胰酶消化细胞；(9)传代培养；(10)检测；(11)冻存；(12)建库。该方法步骤简单，能快速从胎盘组织获取大量的间充质干细胞，分离过程中不需要太多清洗操作，也避免了抗生素的使用，分离得到的胎盘绒毛板间充质干细胞的纯度较高。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法技术领域[0001] 本发明涉及间充质干细胞的制备技术领域，具体涉及一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法。 背景技术[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的诱导条件下可以分化形成多种组织来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成神经细胞等。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，而且还具有自我更新、归巢、免疫调节、造血支持、分泌多种细胞因子、促进干细胞移植等多种生物学特性，是参与组织损伤修复和组织再生的重要细胞组成部分。目前，可以从多种成体组织(如骨髓)或围产期组织(如胎盘)提取间充质干细胞。 [0003] 骨髓来源的间充质干细胞生物学特性研究最为详尽，该类间充质干细胞在美国、加拿大、韩国都开发出用于疾病治疗的生物制品。但骨髓间充质干细胞不仅含量相当低，约为骨髓单个核细胞的0.0001-0.001％，而且随着供者年龄的增加间充质干细胞的质量和含量都会大幅度降低。此外，从骨髓组织获取间充质干细胞会给供者带来巨大痛苦。因此，寻找一种新的组织来源提取间充质干细胞是目前间充质干细临床应用的一个研究热点。这种组织来源须具有以下几个特点：1)组织获取不存在伦理争议；2)组织容易获取；3)不会给供者带来痛苦；4)间充质干细胞的获取量应足够大；5)获取的间充质干细胞容易分离、纯化。研究表明，围产期胎盘组织获取不存在伦理争议，组织获取相对容易，也不会给供者带来痛苦；从胎盘组织获取的间充质干细胞不仅数量大而且分离纯化也容易。因此，就间充质干细胞提取的材料来源而言，胎盘可作为骨髓组 织的理想替代物。 [0004] 胎盘由绒毛板、绒毛层、基板组成。绒毛膜绒毛从绒毛板长出形成一个个树枝样结构悬挂于绒毛板上，形成所谓的胎盘绒毛层。绒毛间隙是绒毛板和基板形成的闭合腔隙，其中含有大量的母血，而绒毛层中的绒毛就悬浮于绒毛间隙的母血中。基板由胎盘底蜕膜发育而成，属于母体成分；基板向绒毛间隙突起形成胎盘隔，胎盘隔与绒毛将绒毛间隙分隔成一个个小叶形成胎盘小叶。此外，绒毛末梢连接到基板上以防止悬浮于绒毛间隙母血中的绒毛随意移动，起到保护作用。但现有的胎盘间充质干细胞提取方法存在诸多缺点，如细胞不纯、工艺操作复杂等。例如中国专利CN101270349A公开了胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，该方法采用Ⅳ型胶原酶消化胎盘母体侧蜕膜组织得到胎盘间充质干细胞，而该蜕膜组织实际上为胎盘基板，而绒毛层与基板难以区分，得到的间充质干细胞可能包含了母体和胎儿两种来源的细胞成分。中国专利CN104560869A公开了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，该方法通过剪取羊膜下0-1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后通过胶原酶消化获取绒毛膜间充质干细胞。该方法所获得的胎盘组织包含绒毛板、绒毛层、母血细胞成分，所获得的绒毛膜间充质干细胞实际上是绒毛板间充质干细胞、绒毛间充质干细胞、母血细胞的混杂成分，因此并不能单纯地认为是绒毛膜间充质干细胞，而且绒毛层胎盘组织的引入使得组织分离过程中红细胞需要大量清洗液和清洗过程，增加了操作过程的难度。中国专利CN102676451A公开了从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法采用组织消化酶从胎盘小叶获取间充质干细胞。该方法中的胎盘小叶实际上包括了胎盘绒毛板、绒毛层、基板、母血细胞成分，提取的间充质干细胞是多种细胞的混杂成分，需要后续的纯化工艺进行分离。 发明内容[0005] 针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法，该方法步骤简单，能快速从胎盘组织获取大量的间充质干细胞，分离过程中不需要太多清洗操作，也避免了抗生素的使用，分离得到的胎盘绒毛板间充质干细胞的纯度较高。 [0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： [0007] 一种胎盘绒毛板间充质干细胞的提取方法，包括以下步骤： [0008] (1)采集足月胎盘组织，剥离覆盖在胎盘绒毛板外侧的羊膜，并剪取绒毛板组织； [0009] (2)使用无菌止血钳或组织镊去除附着在绒毛板上的绒毛和血管组织； [0010] (3)用生理盐水或PBS清洗步骤(3)所得的绒毛板至没有血色； [0011] (4)将清洗后的绒毛板剪成0.5-5mm2的组织块，然后用生理盐水或PBS清洗2-5次； [0012] (5)收集步骤(4)中的组织块，将其加入组织消化液中，于37℃恒温摇床中，100-200r/min消化1-2h； [0013] (6)组织消化完毕后加入适量完全培养基终止消化，并用100-200μm筛网过滤去除未消化完全的胎盘组织，于20℃、2000r/min条件下离心3min，弃上清；完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM(Hyclone)，15％的胎牛血清(Gibco)； [0014] (7)将步骤(6)所得细胞按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基(与步骤(6)中完全培养基成分相同)，于37℃、5％CO2培养箱中培养； [0015] (8)每隔3-5天更换一次培养基，当细胞融合度达到70-90％时，用0.25％ 胰酶(Hyclone)消化细胞； [0016] (9)传代培养：消化后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，按1×104-2×104个细胞/cm2的密度(此处密度为细胞个数与培养瓶底表面积的比计算得来)接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，得胎盘绒毛板间充质干细胞； [0017] (10)针对步骤(9)所得的胎盘绒毛板间充质干细胞，检测以下项目中的至少一项：细胞活性、无菌检测、细胞表面标志物检测、核性检测、HLA-ABC/DR配型； [0018] (11)冻存：将传代培养后的胎盘绒毛板间充质干细胞按2×106-8×106个细胞/mL密度重悬冻存于1mL冻存液(2mL冻存管)中，冻存细胞经程序降温至-80℃后转入液氮罐中长期保存； [0019] (12)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(9)的冻存细胞进行关联。 [0020] 进一步地，步骤(1)中对胎盘的处理需在采集后72h内进行。 [0021] 进一步地，步骤(5)中组织消化液成分为：0.0625-0.125mg/mL胰酶、1-2mg/mL胶原酶Ⅱ、1-2mg/mL胶原酶Ⅳ、1-2mg/mL透明质酸酶。 [0022] 进一步地，步骤(5)中组织块与消化液的质量体积比为1:5-6(g/mL)。 [0023] 进一步地，步骤(5)中组织消化液成分为：0.125mg/mL胰酶、1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ、1.5mg/mL透明质酸酶。 [0024] 进一步地，步骤(11)中冻存液为含体积分数为10％的DMSO(Origen)的完全培养基。 [0025] 按上述提取方法提取的胎盘绒毛板间充质干细胞。 [0026] 本发明提供的一种胎盘绒毛板间充质干细胞及其提取方法，具有以下几种 有益效果： [0027] (1)本发明所选材料为胎盘绒毛板，绒毛板由羊膜覆盖，有效地阻断了病原微生物的侵入绒毛板组织，在采集和细胞培养都避免了抗生素的使用，适合于临床级胎盘间充质干细胞的开发和建库；绒毛板下层存在着一层细胞滋养层，使得胎盘绒毛板与母血保存相对独立，同时绒毛板分离过程中也不需要太多的清洗操作就可以将红细胞去除；绒毛层的绒毛仅绒毛茎与绒毛板相连，在组织分离时较易去除绒毛层，使得分离的胎盘间充质干细胞纯度较高。 [0028] (2)本发明采用含0.125mg/mL胰酶、1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ、1.5mg/mL透明质酸酶的组织消化液消化绒毛板组织块，能有效消化组织，分离得到胎盘绒毛板间充质干细胞，并且不会对细胞造成损害，也不会增加细胞悬浮液的粘度，有利于后期过滤，过得纯度高、产率高的细胞。 附图说明 [0029] 图1为胎盘绒毛板组织在组织消化液中的消化情况；其中图1-1为a组组织消化液结果，图1-2为b组组织消化液结果，图1-3为c组组织消化液结果，图1-4为d组组织消化液结果，图1-5为e组组织消化液结果，图1-6为对照组。 [0030] 图2为胎盘绒毛板间充质干细胞多向诱导分化图；其中图2-1为对照组；图2-2为成脂诱导分化；图2-3为成软骨诱导分化；图2-4为成骨诱导分化。 [0031] 图3为胎盘绒毛板间充质干细胞表面标志物检测结果图。 [0032] 图4为胎盘绒毛板间充质干细胞核型分析图；其中图4-1为P3代细胞核型分析；图4-2为P15代细胞核型分析。 [0033] 图5为胎盘绒毛板间充质干细胞干性标志物检测结果图。 [0034] 图6为胎盘绒毛板间充质干细胞分泌的细胞因子检测结果图。 [0035] 图7为P1-P3代细胞生长特性测定结果图。 [0036] 图8为P1-P10代细胞倍增时间的测定结果图。 具体实施方式[0037] 实施例1 胎盘绒毛板间充质干细胞的分离 [0038] (1)与供者签订知情同意书，采集足月胎盘，72h内对其进行如下处理：用无菌止血钳剥离覆盖绒毛板外侧的羊膜；用无菌手术剪剪取足量的胎盘绒毛板组织； [0039] (2)使用无菌组织镊剔除附着在胎盘绒毛板上的血管和绒毛组织； [0040] (3)用无菌生理盐水清洗步骤(2)所得的胎盘绒毛板至没有血色； [0041] (4)使用无菌手术剪将清洗后的绒毛板组织剪成2mm2的组织块，用无菌生理盐水清洗2-5次，清洗过程中避免使用抗生素； [0042] (5)收集步骤(4)中的组织块，分为6份，每份2g，将其中5份分别加入以下组织消化液中，并置于37℃恒温摇床中，150r/min条件下消化1h；以完全培养基代替组织消化液作为对照组(第6份)；消化结果见图1。 [0043] 其中5种组织消化液分别为： [0044] a)含1.5mg/mL胶原酶Ⅰ(Gibco)的组织消化液10mL； [0045] b)含1.5mg/mL胶原酶Ⅱ(Gibco)的组织消化液10mL； [0046] c)含1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ(Gibco)的组织消化液10mL； [0047] d)含0.125mg/mL胰酶、1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ的组织消化液10mL； [0048] e)含0.125mg/mL胰酶(Hyclone)、1.5mg/mL胶原酶Ⅱ、1.5mg/mL胶原酶Ⅳ、1.5mg/mL透明质酸酶(Sigma)的组织消化液10mL； [0049] 由图1可知，单独使用胶原酶Ⅰ(a组)或胶原酶Ⅱ(b组)都能分离得到胎盘间充质干细胞，但还有大部分组织未被消化，同时由于胶原酶Ⅰ的作用过 于强烈对细胞存在一定程度损害；将胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅳ(c组)进行联合消化，也存在大部分组织未被消化，向c组加入少量胰酶(d组)，虽然大部分组织都被消化，但细胞悬液含有的透明酸增加了其粘稠度，增加了细胞悬液的过滤难度；向d组中加入少量透明质酸酶(e组)能够很好解决这一问题。 [0050] (6)e组组织消化完毕后加入适量完全培养基终止消化，并用100μm筛网过滤去除未消化完全的胎盘组织，将所得的细胞悬液于20℃、2000r/min离心3min，弃上清；完全培养基由以下体积分数的组分组成：85％的DMEM(Hyclone)，15％的胎牛血清(Gibco)； [0051] (7)将步骤(6)所得密度为1×104个细胞/cm2的细胞置于T175培养瓶中，然后加入20mL完全培养基(与步骤(6)中完全培养基成分相同)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔 3-5天更换一次培养基； [0052] 实施例2 胎盘绒毛板间充质干细胞的传代培养及冻存 [0053] 将分离出的胎盘绒毛板间充质干细胞培养至细胞融合度达到70％-90％后，用含EDTA的0.25％(v/v)胰酶(Hyclone)消化细胞，消化完毕后进行离心处理，2000r/min离心3min，收集细胞，检测细胞存活率，并进行细胞计数，按照1×104个细胞/cm2密度接种于T175培养瓶中，然后添加20mL完全培养基传代培养，然后将传代后的细胞按密度2×106个细胞/mL重悬于冻存液，冻存液成分为含10％DMSO的完全培养基，冻存体积为1mL，然后经程序降温到-80℃后放置于液氮罐中长期保存。 [0054] 实施例3 胎盘绒毛板间充质干细胞生物学特性鉴定 [0055] 1、多向诱导分化潜能的鉴定 [0056] 将P3代胎盘绒毛板间充质干细胞接种于六孔板中，每孔接种1×105个细胞，每孔加入2mL完全培养基，每个样本设置3个重复，每两天更换一次培养基， 待细胞融合度为70％时分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基(Cyagen)各2mL，以添加完全培养基作为空白对照，每2-3天更换一次诱导培养基，持续培养2-3周后，去除诱导培养基并用PBS清洗一次，加入2mL多聚甲醛溶液(4％，v/v)固定30min，然后去除多聚甲醛溶液并用PBS清洗两次，采用染色液染色，成骨诱导、成软骨诱导染色时间为2-3min；成脂诱导染色时间为30min，然后移除染色液并加入1mL PBS溶液清洗一次，最后置于倒置显微镜下观察、拍摄照片，结果见图2。 [0057] 由图2可知，经过2-3周的诱导培养，胎盘绒毛板间充质干细胞能够进行成脂、成骨、成软骨诱导分化。 [0058] 2、表面标志物检测 [0059] 将融合度为90％的P3代胎盘绒毛板间充质干细胞用含EDTA的0.25％胰酶(Hyclone)消化处理后，计数并调整细胞密度为1×106个细胞/mL，100μm细胞筛网过滤后，分别加入10μL荧光标记的细胞表面标志物抗体于1mL细胞悬液中，置于4℃、避光条件下孵育20min，并以未进行抗体标记的等量细胞悬液作为空白对照；所使用的抗体有：CD11b-FITC、CD19-ECD、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PC7、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-PC7、HLA-G-PE抗体；孵育完成后，用冷的生理盐水(4℃)清洗一次，1200r/min离心5min，弃上清，加入250μL生理盐水混匀，并加入250μL的1％多聚甲醛固定，标记后的细胞采用Beckman公司的流式细胞分析仪进行检测分析，结果见图3。 [0060] 由图3可知，表面含标志物的细胞率分别为：CD11b：0.70％；CD19：0.00％；CD34：1.4％；CD45：3.0％；HLA-DR：1.6％；HLA-G：25.6％；CD29：99.90％；CD44：98.60％；CD73： 99.80％；CD90：93.20％；CD105：99.60％。 [0061] 经流式检测分析发现胎盘绒毛板间充质干细胞不表达造血细胞表面标志如CD19，几乎不表达CD11b、CD34、CD45、HLA-DR；表达间充质干细胞阳性标志物如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105；同时还低表达一类具有免疫调节作用的Ⅰ类白细胞抗原分子(HLA-G)。 [0062] 3、胎盘绒毛板间充质干细胞核型分析 [0063] 将5×105个P3代细胞、5×105个P15代细胞分别接种于T75培养瓶中，胎儿性别为男性，然后加入10mL完全培养基，放置于37℃、5％CO2培养箱内，培养46-72小时后收获，收获前加入0.2％浓度的秋水仙素，37℃，孵育4小时后收获，收获后通过离心、弃上清、低渗、固定、滴片，最后染色显带，结果见图4。 [0064] 经核型分析，胎盘绒毛板来源的间充质干细胞在连续传代后均未出现明显的染色体核型异常，所测胎盘干细胞均为胎儿来源的细胞成份，而无母体来源细胞的污染。 [0065] 4、胎盘绒毛板间充质干细胞干性标志物检测 [0066] 将P3代胎盘绒毛板间充质干细胞接种于六孔板中，每孔接种1×105个细胞，每孔加入2mL完全培养基，每两天更换一次培养基，待细胞融合度达到80-90％时，去掉培养基并用PBS清洗一次后加入0.5mL RNAiso Plus，从细胞中提取总RNA，通过反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，设定反应体积为25μL、模板含量为100ng、2×Pfu PCR MasterMix 12.5μL、待测基因正反引物各1μL，其余为去离子水，β-Actin作为内参；PCR反应程序设置为：94℃预变性3min；94℃变性30s，适合温度退火30s，72℃延伸1min，共35个扩增循环；72℃延伸5min。 [0067] 其中，待测基因有Oct-4、Nanog、Sox2、TERT、β-Actin， Oct-4的引物： [0068] F(正向引物)5’-3’：AGTGAGAGG CAACCTGGAGA；具体见SEQ IDNO：1； [0069] R(反向引物)5’-3’：GTGAAGTGAGGGCTCCCATA；具体见SEQ IDNO：2； [0070] 退火温度为54℃，产物大小为273bp； [0071] Nanog的引物： [0072] F(5’-3’)：TTCTTGACTGGGACCTTGTC；具体见SEQ IDNO：3； [0073] R(5’-3’)：GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA；具体见SEQ IDNO：4； [0074] 退火温度为54℃，产物大小为260bp； [0075] Sox2的引物： [0076] F(5’-3’)：GGGCAGCGTGTACTTATCCT；具体见SEQ IDNO：5； [0077] R(5’-3’)：AGAACCCCAAGATGCACAAC；具体见SEQ IDNO：6； [0078] 退火温度为52℃，产物大小为200bp； [0079] TERT的引物： [0080] F(5’-3’)：GAGCTGACGTGGAAGATGAG；具体见SEQ IDNO：7； [0081] R(5’-3’)：CTTCAAGTGCTGTCTGATTCCAATG；具体见SEQ IDNO：8； [0082] 退火温度为55℃，产物大小为300bp； [0083] β-Actin的引物： [0084] F(5’-3’)：TCCTTCTGCATCCTGTCAGCA；具体见SEQ IDNO：9； [0085] R(5’-3’)：CAGGAGATGGCCACTGCCGCA；具体见SEQ IDNO：10； [0086] 退火温度为58℃，产物大小为300bp。 [0087] 取5μL扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％，g/v)。电泳结束后 将凝胶置于紫外照射仪上观察，拍照，结果见图5。 [0088] 由结果可知，胎盘绒毛板间充质干细胞表达干性标志物如Oct-4、Nanog、Sox2、TERT。 [0089] 5、胎盘绒毛板间充质干细胞分泌的细胞因子检测 [0090] 按每个T175培养瓶接种2×106个P3代胎盘绒毛板间充质干细胞，加入20mL完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到85％时去除培养基，加入10mL DMEM(Hyclone)并放置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，收集培养液，20℃、4000r/min离心20min，吸取上清液，参照ELISA检测试剂盒说明书(R&D)检测各个细胞因子(IGF-1、PDGF-AA、HGF、EGF、FGF、VEGF)的表达量，结果见图6。 [0091] 由结果可知，绒毛板来源的胎盘间充质干细胞分泌较高的HGF(肝细胞因子)，少量分泌PDGF-AA(血小板生长因子AA)、FGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)，仅能检测到极少量的IGF-1(胰岛素样生长因子)和EGF(表皮生长因子)。 [0092] 6、胎盘绒毛板间充质干细胞生长特性测定 [0093] 将P1、P2、P3代细胞分别接种于T75细胞培养瓶(Coring)中，每瓶接种细胞量为1×105个细胞，并加入12mL完全培养基，每3天更换一次培养基，连续培养3周，其中每3天检测一次培养瓶中细胞的数量，每个检测样本重复3次，结果见图7。 [0094] 将1×106个胎盘绒毛板间充质干细胞P1-P10代分别接种于T75细胞培养瓶中，加入12mL完全培养基，待细胞融合度达到85-90％时消化细胞，计算细胞的倍增时间，每个检测样本重复3次。细胞倍增时间计算公式为T＝t×ln2/(lnNt-lnN0)，其中t为细胞接种到细胞收获的时间，N0为接种时的细胞 数量，Nt为收获时的细胞数量，结果见图8。 [0095] 由结果可知，胎盘绒毛板间充质干细胞(P1-P3为代表)的生长对数期约为3-5天，而P1-P10为代表细胞的倍增时间为25-40小时。 [0096] 实施例4 胎盘绒毛板间充质干细胞数据库的建立 [0097] 1、细胞活性的检测 [0098] 利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。 [0099] 2、细胞感染的检测 [0100] 利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半(HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、Hbe Ab)、丙肝(HCVAb)、艾滋(HIV-1/2Ab)、巨细胞病毒(CMV-IgA)、EB病毒和梅毒感染。 [0101] 3、遗传病的检测 [0102] 利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。 [0103] 4、HLA-ABC/DR配型 [0104] 检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。 [0105] 5、细胞来源的调查 [0106] 记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。 [0107] 6、胎盘绒毛板间充质干细胞数据库的建立 [0108] 在保存正常的胎盘绒毛板间充质干细胞后，建立胎盘绒毛板间充质干细胞的数据库，其中包括前五项资料，并建立与冻存细胞的关联。 [0109] [0110] [0111] [0112] |
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