一种衰老肾小管细胞的分选方法 |
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| 申请号 | CN201610470775.4 | 申请日 | 2016-06-23 | 公开(公告)号 | CN106047794A | 公开(公告)日 | 2016-10-26 |
| 申请人 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院; | 发明人 | 陈佳; 何娅妮; 付碧琼; 陈客宏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种分选衰老细胞的方法，特别涉及一种应用DcR2 抗体 偶联免疫 磁珠 分选衰老肾小管细胞的分选方法。所述的方法是首先向待分选的细胞液中加入DcR2抗体，使DcR2抗体与细胞结合，得预处理的分选细胞液；然后向预处理的分选细胞液中加入免疫磁珠，用免疫磁珠分离方法进行分离，免疫磁珠 吸附 的部分为衰老肾小管细胞。该方法可分选出高纯度的衰老肾小管细胞，并进一步证实分选出的衰老肾小管细胞具有 生物 学活性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种衰老肾小管细胞的分选方法，其特征在于，包括如下进行的步骤： |
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| 说明书全文 | 一种衰老肾小管细胞的分选方法技术领域背景技术[0002] 各种病理性应激刺激下，可引发细胞发生与增龄无关的细胞周期停滞状态，即应激性衰老（ Stress-induced premature senescence ）。衰老细胞表现为细胞扁平肥大，脂褐素沉积，特异性的标志是SA-β-gal、p16、p21、SAHF等。细胞衰老后细胞增殖与再生能力丧失，还通过释放衰老相关分泌表型（SASP）等机制，不仅导致器官加速衰老，同时也是引发肿瘤、心脑血管疾病以及糖尿病等重大慢性疾病进展的重要机制。 [0003] 慢性肾脏病（CKD）已被证实是一种组织器官早衰的临床模型。大量研究发现细胞应激衰老是高血压肾病、移植性肾病、糖尿病肾病等CKD重要的组织学改变特征之一。糖尿病肾病（DN）作为最常见的CKD之一，亦是导致终末期肾衰竭的主要原因。肾小管间质损伤在DN进展发挥十分重要作用。肾小管上皮细胞富含线粒体，是高能耗、高代谢细胞，在物质代谢紊乱和血流动力学异常条件下易发生氧化应激进而导致细胞应激衰老。在DN患者肾组织中发现，肾小管细胞衰老最为显著，并且衰老肾小管细胞与肾小管间质损伤及肾功能损害密切关联。因此，研究衰老肾小管细胞的病理生理学意义在DN进展中具有重要意义。 [0004] 为了研究衰老细胞的病理生理学效应，我们需要高纯度且具有生物学活性的衰老细胞。既往采用流式细胞分析技术基于衰老细胞肥大和脂褐素分选衰老细胞，虽然可以获得具有一定生物学活性的衰老细胞，但纯度并不高。此外，在流式细胞仪高压条件下，可损伤细胞活性。而如果利用流式细胞分选技术基于其他经典的核蛋白衰老标志如p16分选衰老细胞，虽可获得高纯度衰老细胞，但因为通透细胞膜而生物学活性丧失。因此，开发出一种新型的损伤性小的分选衰老细胞的技术方法尤为必要。 [0005] 发明内容[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种衰老肾小管细胞的分选方法，该方法可分选出高纯度具有生物学活性的衰老肾小管细胞。 [0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种衰老肾小管细胞的分选方法，包括如下进行的步骤： （1）向待分选的细胞液中加入DcR2抗体，使DcR2抗体与细胞结合，得预处理的分选细胞液； （2）向预处理的分选细胞液中加入免疫磁珠，用免疫磁珠分离方法进行分离，免疫磁珠吸附的部分为衰老肾小管细胞。 [0008] 免疫磁珠细胞分选（MACS）是细胞分选的新型技术方法。分选细胞具有纯度高、对细胞无毒性，不影响细胞生物学特异的特点。免疫磁珠分选细胞是基于细胞膜上特异性抗原进行细胞分选。 [0009] DcR2（Decoyreceptor2）作为跨膜受体，近年被证实为衰老细胞的膜性生物标志，本申请的发明人研究发现DN肾组织中DcR2特异性表达于肾小管细胞。因此，基于DcR2利用免疫磁珠分选出高纯度且具有活性的衰老细胞是可行的方案。在本申请中，发明人通过构建高糖刺激原代肾小管细胞的衰老模型（衰老细胞阳性率约30-40%），采用免疫磁珠分选出DcR2阳性细胞，并进一步证实DcR2阳性细胞具有生物学活性，并且是高纯度的衰老细胞。 [0010] 进一步，所述的分选方法，所述步骤（2）中，免疫磁珠为抗兔IgG免疫磁珠。 [0011] 进一步，所述的分选方法，所述步骤（1）中DcR2抗体的浓度与待分选的细胞液的体积比为1μg/μl：100-500μl。 [0012] 进一步，优选的，DcR2抗体的浓度与待分选的细胞液的体积比为1μg/μl：100μl。 [0013] 进一步，所述的分选方法，所述步骤（2）中，免疫磁珠与细胞的比例为：每107-8个细胞加入20-50ul免疫磁珠。 [0014] 进一步，所述的分选方法，所述步骤（1）的具体方法是：向待分选的细胞液中加入DcR2抗体，充分混匀，4℃±2℃孵育0.5-1.5小时，离心，去上清，加入缓冲液洗涤1-3次，离心，去上清，加入缓冲液重悬，得预处理的分选细胞液。 [0015] 进一步，所述的分选方法，所述步骤（2）的具体方法是：向预处理的分选细胞液中加入免疫磁珠，充分混匀，4℃±2℃孵育0.5-1.5小时，离心，去上清，加入缓冲液洗涤1-3次，离心，去上清，加入缓冲液重悬，然后过免疫磁珠分选柱，用缓冲液重复洗涤免疫磁珠分选柱1-3次，然后取下免疫磁珠分选柱，免疫磁珠吸附的部分为衰老肾小管细胞。 [0016] 进一步，所述的分选方法，所述缓冲液为含0.5%BSA和2.0mmol/L EDTA的磷酸缓冲盐溶液。优选所述缓冲液的pH值为7.2。 [0017] 本发明还保护DcR2抗体偶联免疫磁珠在衰老肾小管细胞分选中的应用。 [0019] 图1 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞的DcR2表达情况。 [0020] 图2 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞形态及增殖能力评估结果。 [0021] 图3 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞SA-β-gal染色结果。 [0022] 图4 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞CyclinD1染色结果。 [0023] 图5 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞p16染色结果。 [0024] 图6 DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞p21染色结果。 具体实施方式[0025] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述，但是本发明的保护范围并不限于此。 [0026] 以下实施例中所涉及的主要实验仪器及试剂有：主要实验仪器： 免疫磁珠分选器、免疫磁珠分选柱（LS柱）、试管混匀器（德国Miltenyi），激光共聚焦显微镜、倒置显微镜(德国Leica)，超净工作台（苏州净化设备），细胞培养箱（美国Thermo Form）、恒温孵箱、恒温水浴箱、手术器械（上海跃进），微量加样器(美国Gilson)。 [0027] 实验试剂：抗兔IgG免疫磁珠（德国Miltenyi），肾小管上皮细胞生长培养基（美国 promocell），2型胶原酶、BSA（美国sigma），标准胎牛血清、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），SA-β-gal 检测试剂盒、荧光二抗Cy3、荧光二抗FITC、DAPI工作液（碧云天），p16抗体、p21抗体（美国santacruz）、DcR2抗体、cylinD1抗体（英国Abcam公司）、葡萄糖等其他常用化学试剂（重庆试剂）。 [0028]实施例1 构建高糖刺激原代肾小管细胞的衰老模型 1、原代肾小管上皮细胞培养 （1）将2-3周龄C57/BL6雄性小鼠断颈处死，无菌获取双肾，用含1%胎牛血清的枸橼酸缓冲液反复冲洗双肾 。 [0029] （2）将肾皮质切成小块，用含1%胎牛血清的枸橼酸缓冲液反复冲洗，然后1500 转离心5分钟。 [0030] （3）取离心后的固体部分加胶原酶于37℃消化肾组织30min。 [0032] （5）1%BSA 溶液反复冲洗筛网和过滤肾组织碎片，然后1500转离心5分钟。 [0033] （6）取离心后的组织接种至培养皿，室温静置2小时，放入培养箱继续培养。 [0034] （7）48小时后首次更换培养基，此后每两天更换1次，所述培养基为市售的进口成品培养基。 [0035] 2、消化传代至第二代肾小管细胞取第1步中培养的原代肾小管上皮细胞进行消化，传代培养至第二代肾小管细胞。 [0036] 3、高糖(30mmol/L)诱导肾小管细胞衰老待第2步中培养的第二代肾小管细胞增殖至覆盖率约为 30%时，更换为30mmol/L的高糖培养基（成品培养基中加入50%葡萄糖配置成30mmol/L高糖培养基）诱导72h，建立高糖诱导的肾小管细胞衰老模型。 [0037]实施例2 免疫磁珠分选DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞 （1）取实施例1中建立的肾小管细胞衰老模型，进行细胞消化，制备细胞悬液，并计数。 然后1500 转离心5分钟，去掉上清液即得待分选的细胞液。 [0038] （2）向待分选的细胞液中加入DcR2抗体，充分混匀，4℃孵育1小时，1500 转离心5分钟，去上清，加入缓冲液（磷酸缓冲盐溶液，其中含0.5%BSA和2.0mmol/L EDTA，pH值为7.2）洗涤1-3次，1500 转离心5分钟，去上清，加入缓冲液重悬，得预处理的分选细胞液。 DcR2抗体的浓度与待分选的细胞液的体积比为1μg/μl：100μl。 [0039] （3）向预处理的分选细胞液中加入免疫磁珠，免疫磁珠的加入量按照每107个细胞加20ul免疫磁珠进行加入，然后充分混匀，4℃孵育1小时，1500 转离心5分钟，去上清，加入缓冲液（磷酸缓冲盐溶液，其中含0.5%BSA和2.0mmol/L EDTA，pH值为7.2）洗涤1-3次，1500 转离心5分钟，去上清，加入缓冲液重悬得细胞混悬液（108个/ul）。 [0040] （4）LS柱上免疫磁珠分选器，加入3ml缓冲液（磷酸缓冲盐溶液，其中含0.5%BSA和2.0mmol/L EDTA，pH值为7.2）润湿，取500微升细胞混悬液待分选，细胞混悬液过免疫磁珠分选柱。然后用缓冲液（磷酸缓冲盐溶液，其中含0.5%BSA和2.0mmol/L EDTA，pH值为7.2）重复洗涤免疫磁珠分选柱2次，同时所收集的细胞为DcR2阴性细胞。 [0041] （5）然后取下免疫磁珠分选柱，3ml缓冲液大力冲洗2遍，所收集的细胞为DcR2阳性细胞。 [0042]实施例3 免疫磁珠分选DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞的鉴定 （1）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞形态学观察 待细胞悬液接种2小时后，将培养瓶置于倒置显微镜下观察DcR2阴性细胞和DcR2阳性细胞贴壁能力。分别于接种第1d，第3d，第5d于倒置显微镜下观察细胞形态及计数细胞数量增加情况。 [0043] （2）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞衰老表型检测1）细胞固定，然后用PBS冲洗3次，每次冲洗 5min。 [0045] 3）然后再用PBS冲洗3次，每次冲洗 5min。 [0046] 4）滴加相应种属荧光二抗，37℃孵育1小时。 [0047] 5）用PBS冲洗3次，每次冲洗 5min。 [0048] 6）滴加DAPI工作液，常温下静置10min，然后用PBS冲洗3次，每次冲洗 5min，最后用PBS浸泡备用。 [0049] （3）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞DcR2表达情况免疫荧光共染发现DcR2阳性细胞均表达DcR2，而DcR2阴性细胞不表达DcR2。表明免疫磁珠分选可获得高纯度的DcR2阳性细胞和DcR2阴性细胞。结果如图1所示。 [0050] （4）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞形态及增殖能力评估通过连续培养观察细胞至第5天发现，DcR2阳性细胞呈现扁平肥大状，通过计数发现DcR2阳性细胞基本不增殖。而DcR2阴性细胞呈铺路石样，折光性好，增殖能力强。表明DcR2阳性细胞不具有增殖能力。结果如图2所示。 [0051] （5）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞衰老表型检测1）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞SA-β-gal染色 SA-β-gal染色发现，DcR2阳性细胞阳性率较非分选细胞明显增高，DcR2阴性细胞阳性率较非分选细胞明显降低。表明免疫磁珠分选可将衰老细胞纯度提高。结果如图3所示。 [0052] 2）DcR2阳性细胞与DcR2阴性细胞CyclinD1、p16、p21染色激光共聚焦染色发现DcR2阳性细胞CyclinD1、p16、p21阳性率较DcR2阴性细胞明显增高，表明DcR2阳性细胞具有衰老表型。结果如图4-图6所示。 [0053] 由上述结果可知，基于DcR2利用免疫磁珠分选技术可分选出高纯度（80%以上）具有生物学活性的衰老肾小管细胞，能够为后续研究DN进展中衰老肾小管细胞的病理生理学意义奠定了夯实的基础。 [0054]实施例4 免疫磁珠分选衰老肾小管细胞 （1）取待分选的细胞液，向待分选的细胞液中加入DcR2抗体，DcR2抗体的浓度与待分选的细胞液的体积比为1μg/μl：300μl然后充分混匀，4℃±2℃孵育0.5-1.5小时，离心，去上清，加入缓冲液洗涤1-3次，离心，去上清，加入缓冲液重悬，得预处理的分选细胞液。 [0055] （2）向预处理的分选细胞液中加入免疫磁珠，免疫磁珠与细胞的比例为：每108个细胞加入40ul免疫磁珠，然后充分混匀，4℃±2℃孵育0.5-1.5小时，离心，去上清，加入缓冲液洗涤1-3次，离心，去上清，加入缓冲液重悬，然后过免疫磁珠分选柱，用缓冲液重复洗涤免疫磁珠分选柱1-3次，然后取下免疫磁珠分选柱，免疫磁珠吸附的部分为衰老肾小管细胞。 |
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