一种原代小鼠或大鼠神经元的分离培养方法 |
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| 申请号 | CN201610277888.2 | 申请日 | 2016-04-28 | 公开(公告)号 | CN105907717A | 公开(公告)日 | 2016-08-31 |
| 申请人 | 王晓冰; | 发明人 | 王晓冰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，开创性的采用了 活检针 采取处理后的组织，使得 采样 直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了表面包膜细胞以及细菌的混入，降低了细胞、细菌污染的同时，大大提高了目的细胞的纯度。同时，本发明的原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，使用特殊制备的复合酶消化液，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。采用预贴壁以及原代培养早期加入Laminin的方式，可以极大地促进神经元的贴壁、神经突触的生长以及神经网络的形成，从而进一步提高神经元的得率及长期存活率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种原代小鼠或大鼠神经元的分离培养方法技术领域[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法。 背景技术[0002] 中枢神经系统由两大类细胞构成，即：神经元和神经胶质细胞。神经元是大脑的结构、功能和营养单位。尽管神经元的大小和形状存在很大差异，但是所有神经元都拥有共同的形态学特点，即：构成了极为复杂的互联网络。作为神经系统主要的信号单位，神经元属于一种动态去极化细胞。人脑拥有1×1011个神经元，每个神经元可以至少联系其它10000个神经元。 [0003] 目前，国内外已经有大量的研究者进行了小鼠/大鼠神经元的培养和药理学特性方面的研究，既往的研究多采用胰酶消化法培养。其缺点在于，胰酶对神经元的伤害极大，很难控制消化时间和吹打的力度，容易导致的结果往往是，细胞活力差，死细胞特别多，贴壁细胞少，且混杂的胶质细胞比较多。 发明内容[0004] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法。 [0005] 为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为： [0006] 一种原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，包括以下步骤： [0007] 步骤1：小鼠或大鼠大脑组织的获取和预处理 [0008] 将小鼠或者大鼠断头获取大脑组织，将离体的大脑组织用PBS溶液洗涤后，放置在冰上待用； [0009] 步骤2：取神经元细胞 [0010] 使用活检针刺入步骤1处理后的大脑组织，切取神经元细胞； [0011] 步骤3：酶消化 [0012] 将步骤2获得的神经元细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶； [0013] 步骤4：分离培养神经元细胞 [0014] 将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后再次用预贴壁培养基重悬，然后预贴壁4h后更换至神经元培养基，细胞放置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。 [0015] 优选地，上述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针。 [0016] 优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。 [0017] 优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液消化4-20h或者37℃复合酶消化液消化10min-2h。 [0018] 优选地，上述步骤4中预贴壁培养基为含Laminin和10％FBS的DMEM/F12培养基。 [0019] 优选地，上述步骤4中预贴壁培养基中Laminin浓度为1ug/ml。 [0020] 优选地，上述步骤4中神经元培养基为含B27、L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基。 [0021] 优选地，上述步骤4中离心条件为400g，离心5分钟。 [0022] 本发明另一方面还提供根据上述的原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法所培养的小鼠和大鼠神经元细胞。 [0023] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果： [0024] (1)本发明开创性的采用了活检针采取处理后的组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了表面包膜细胞以及细菌的混入，降低了细胞、细菌污染的同时，大大提高了目的细胞的纯度，分离细胞时即可接近100％； [0025] (2)本发明的原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，采用复合酶消化法获得了单个的神经元，避免了以往用胰酶消化法对组织过度消化，过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，尤其是针对神经元这种对缺血缺氧比较敏感的组织细胞。并使用4℃条件过夜消化(4-20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻； [0026] (3)采用预贴壁以及原代培养早期加入1ug/ml Laminin的方式，可以极大地促进神经元的贴壁、神经突触的生长以及神经网络的形成，从而进一步提高神经元的得率及长期存活率； [0027] (4)制备方法简便，技术稳定，重复性好。 [0029] 图1为本发明的分离培养方法得到的大鼠神经元细胞拍摄的显微照片(10X)； [0030] 图2为本发明的分离培养方法得到的大鼠神经元细胞拍摄的显微照片(20X)； 具体实施方式[0031] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。 [0032] 实施例1 [0033] 本发明实施例1提供了一种原代大鼠神经元细胞的分离培养方法，具体步骤如下： [0034] 1.大鼠大脑组织的获取 [0035] 首先处死新生(出生48小时以内)大鼠(冰冻10分钟或者颈椎脱臼)，酒精浸泡5分钟，超净台内，断头取脑。全程都要在冰上进行。将取下的大脑组织置于盛有预冷PBS的培养皿内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于含2％青链霉素的预冷L-15培养基内，放在冰上保存，待所有组织取材完毕，统一进行处理。 [0036] 2.取神经元细胞 [0037] 使用活检针刺入步骤1处理后的大脑组织，切取神经元细胞。 [0038] 3.酶消化 [0039] 将处理后变白的大脑皮质剪碎，加入自制的复合酶(I型胶原酶+II型胶原酶+IV型胶原酶+Dispase酶＝1:1:1:1)，4种酶的初始浓度均为1mg/ml。37度消化30分钟，稍微吹打几次，根据情况，再次37度消化30分钟，然后轻微吹打不超过5次，过70um筛网。 [0040] 4.分离培养神经元细胞 [0041] 将步骤3消化完毕的骨骼肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，由于神经元培养的特殊性，分离获得的单个神经元悬液需要经过一个预贴壁的过程。即：在含10％FBS的DMEM/F12培养基中，预贴壁4个小时。4个小时后，更换至神经元培养基，即：含B27(1:50)、L-谷氨酰胺(0.5um/ml)的Neurobasal培养基。细胞放置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。 [0042] 5.二维培养 [0043] 将纯化的大鼠神经元，先用预贴壁培养基重悬，接种在明胶预处理过夜的T25培养瓶中进行培养，接种密度为5×105/瓶。为了促进神经元更好的贴壁，加入1ug/ml的Laminin。置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养。4个小时后，弃预贴壁培养基，更换为神经元培养基，同时加入1ug/ml的Laminin。置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养。以后每3天更换新的神经元培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，根据情况，可加入终浓度为10umol/L的阿糖胞苷，抑制胶质细胞等非神经元的生长。 [0044] 6.细胞形态观察 [0045] 显微镜下观察原代分离培养神经元细胞的细胞形态，如图1-2所示。 [0046] 7.其他相关指标测定 [0047] 培养期间测定细菌及真菌污染情况、细胞污染情况、统计细胞活率等。 [0048] 在本发明的大鼠神经元培养方法中，所用大脑组织、复合酶、细胞培养基、细胞因子和胎牛血清等，均应符合无菌要求。 [0049] 对比实施例 [0050] 对比实施例采用传统的方法，大鼠大脑组织的获取后，在解剖显微镜下，用无菌镊子仔细剥离大脑皮层，全程都要在冰上进行。并且，在预冷的PBS里，仔细剥除软脑膜和血丝，尽量完整剥离，以免软膜脑残留，导致大量的成纤维细胞增生。剥离干净后，用预冷的PBS洗涤2-3遍。大脑皮层处理成功的标志为，脑组织变成白色，外表面没有任何的血丝残留。然后将处理后变白的大脑皮质剪碎，加入酶溶液，37度消化30分钟，稍微吹打几次，根据情况，再次37度消化30分钟，然后轻微吹打不超过5次，过70um筛网。取过筛后的细胞滤液，根据体积加入对等的PBS，400g离心5分钟，即可获得纯化的小鼠或大鼠神经元，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。细胞计数后，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为5× 5 10/瓶，置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养并观察和测定相关指标。 [0051] 上述的实施例和对比例实验，申请人进行了多次实验，并进行了相关指标的比较和数据统计。如表1所示： [0052] 表1 [0053] [0054] 同时申请人使用小鼠进行了若干次实验，实验结果同大鼠相同，证明本发明的方法对大鼠和小鼠的神经元分离培养的良好效果真实有效。 [0055] 综上所述，本发明的原代小鼠或大鼠神经元细胞的分离培养方法，采用特制的复合酶进行长期消化，使得获得细胞总量大，分离度高，活率高；由于采集方式的不同，本发明的方法获得的神经元细胞细菌、真菌和其他细胞的污染概率极低，同时还能够进行传代培养，为以神经元培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方案。 [0056] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。 |
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