줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 방법

줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 방법{METHOD OF INDUCING THE DIFFERENTIATION OF STEM CELLS INTO MYOCARDIAL CELLS}

본 발명은 ES 세포 등의 전능성줄기세포로부터, 선택적이고 고비율로 심근세포를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 수득된 재생 의료용 세포에 관한 것이다.

일반적으로, 심근세포는 출생 전에는 자율 박동하면서 활발하게 세포 분열을 하지만, 출생 직후부터 분열 기능을 상실하게 되며, 또한 미분화된 전구 세포를 가지지 않기 때문에, 심근경색이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심근세포가 사멸하더라도 소실된 심근세포는 보충되지 않는다. 그 결과, 남아있는 심근세포는 대상성 비대에 의해 심장 기능을 유지하려고 하지만, 각종 스트레스가 지속되어 그 허용 범위를 넘어서게 되면 새로운 심근세포의 쇠퇴 및 사멸을 유발하여 심근 기능이 저하된다(즉, 심부전).

심부전을 시작으로 하는 심장병은, 일본에서 사망 원인의 2위를 차지하며, 그 예후도 지극히 나빠, 심장 질환자의 5년 생존율은 50% 정도에 불과하다. 따라서, 치료 효과가 높은 심부전 치료법의 개발이 의료복지의 큰 전진 및 의료 경제의 개선으로 이어진다고 생각할 수 있다. 심부전의 치료제로, 종래에는 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제 등의 강심제가 사용되어 왔으나, 이들 약제를 장기간 투여하는 경우 심근 에너지의 과잉 소비로 인해 병의 용태를 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 교감신경계나 레닌-안지오텐신계의 항진에 의한 과잉 심부하를 경감시키는 β 차단제나 ACE 저해제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하며, 상해를 입은 심조직 자체를 회복시키는 방법은 아니다. 이러한 방법들에 비해, 심장이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 제공자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적, 경제적 부담 등의 문제가 있어, 심장이식 방법을 일반적인 치료법으로 자주 사용하기 어려운 실정이다.

이로 인하여, 쇠퇴 또는 상실된 심근세포를 보충적으로 이식하는 방법이 심부전 치료에 매우 유용한 것으로 여겨지고 있다. 실제, 동물 실험에서 태아로부터 미성숙 심근세포를 취하여, 이를 성체 심조직에 이식하면 이식된 세포는 심근세포로서 유효하게 기능하는 것으로 확인된바 있다(비특허문헌 1 참조). 그러나, 상기 방법으로는 심근세포를 대량으로 취득하기 어렵고, 윤리적인 관점에서도 임상 의료로의 적용이 곤란하다.

따라서, 미분화된 줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하고, 이것을 이식용 세포로서 이용하는 방법이 최근에 특히 주목을 받고 있다. 현재, 성체 심장조직에서 심근세포를 생산할 수 있는 전구 세포 또는 줄기세포로 명확히 동정할 수 있는 세포 집락이 발견되고 있지 않기 때문에, 상기 방법을 실시하기 위해서는 보다 미분화되고 다양한 분화 기능성을 가지고 있는 전능성줄기세포의 사용을 고려할 수 있다.

전능성줄기세포(pluripotent stem cells)는 시험관내 배양에 의해 미분화 상태로 유지된, 거의 영속적 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적당한 조건에서 삼배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로 정의된다. 현재, 전능성줄기세포로는, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cells: ES 세포), 배아기의 원시 생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cells: EG세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체 줄기세포(multipotent adult progenitor cells: MAPC)의 3종이 가장 잘 알려져 있다.

특히, 이전부터 ES 세포는 시험관내 배양에 의해 심근세포로 분화를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 연구 초기에는, 대부분 마우스 유래의 ES 세포가 사용되었다. ES 세포를 단일 세포 상태(효소 처리 등을 실시한 것으로, 세포끼리 접착하지 않고 개개의 세포가 분산된 상태)로 백혈병 저해 인자(leukemia inhibitory factor: LIF) 등의 분화 억제 인자가 결핍된 조건에서 부유 배양하면, ES 세포끼리 접착 및 응집하여 배양체(embryoid body: EB)라고 하는 초기 배아와 유사한 구조체가 형성된다. 그 후, EB를 부유 또는 접착 상태로 배양하면, 자립 박동성을 가지는 심근세포가 발생되는 것으로 알려져 있다.

상기와 같이 제작된 ES 세포 유래 심근세포는, 배아 심장 유래의 미성숙 심근세포와 매우 유사한 형질을 나타낸다(비특허문헌 2,3 참조). 또한, 실제로 ES 세포 유래의 심근세포를 성체 심장 조직에 이식한 동물 실험에서는, 배아 심근을 이식한 경우와 거의 동일하게, 매우 유효성이 높은 것으로 확인되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조).

1995년, 톰슨 등이 최초로 영장류로부터의 ES 세포 수립에 성공함으로써 다능성 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 이용한 심근재생치료법의 실용화가 현실성을 가지게 되었다(특허문헌 2, 비특허문헌 5 참조). 그들은 계속하여 인간 초기 배아로부터 인간 ES 세포주의 분리 및 수립에도 성공하였다(비특허문헌 6 참조). 또한, 게르하트 등이 인간의 원식 생식 세포로부터 hEG 세포주를 수립하였다(비특허문헌 7, 특허문헌 3 참조).

마우스 ES 세포와 마찬가지로, 인간 ES 세포로부터 심근세포의 분화를 유도할 수 있는 것으로, 케하트 등(비특허문헌 8 참조) 및 준후이 등(특허문헌 4, 비특허문헌 9 참조)이 보고하였다. 이들 연구에 따르면, 인간 ES 세포로부터 분화가 유도된 심근세포는, 자립 박동 기능을 가질 뿐만 아니라, 미오신 중쇄(heavy chain)/경쇄(light chain), α-액티닌, 트로포닌 I, 심방성 이뇨 펩티드(artial natriuretic peptide; ANP) 등의 심근 특이 단백질과, GATA-4, Nkx 2.5, MEF-2c 등의 심근 특이적 전사인자를 발현 및 생산하며, 또한 미세 해부학적 관찰 및 전기 생리학적 해석상 태생기의 미성숙한 심근세포의 형질을 유지하고 있는 것으로 확인되어, 이의 재생 의료로의 이용이 기대되고 있다.

한편, 전능성 줄기세포로부터 유래된 심근세포를 세포 이식 치료나 그 외 목적으로 사용하는 경우 발생될 수 있는 중요한 문제점은, 종래 방법에 의해 ES 세포 또는 EG 세포로부터 형성된 EB가 심근세포 이외에도 혈구계 세포나, 혈관계 세포, 신경계 세포, 장관계 세포, 뼈?연골 세포 등의 다른 종류의 세포가 혼재된 형태로 발생된다는 것이다. 또한, 이들 분화된 세포에서 심근세포가 차지하는 비율이 그다지 높지 않으며, 전체의 5 - 20% 정도에 지나지 않는다.

다른 종류의 세포가 혼재하고 있는 상태에서 심근세포만을 선택적으로 선별하는 방법으로는, ES 세포의 유전자에 인위적인 수정을 가하여 약제 내성 또는 이소성 발현성(ectopic expression)을 부여함으로써 심근세포 또는 그 전구 세포의 형질을 가지는 세포를 회수하는 방법이 있다. 예를 들면, 필드 및 공동 연구자들은 α형 미오신 중쇄 프로모터의 조절하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현할 수 있는 유전자 카세트를 마우스 ES 세포에 도입함으로써, 상기 ES 세포가 심근세포로 분화하고 그에 따라 α형 미오신 중쇄 유전자를 발현하였을 때만 G418를 첨가한 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조). 상기 방법에 따라 G418 내성 세포로서 선별된 세포 중 심근세포일 확률은 99% 이상인 것으로 확인되었다. 그러나, 상기 방법에 따르면 심근세포의 순도는 매우 높아지지만, 최종적으로 얻어지는 심근세포의 수는 전체 세포 수의 몇 퍼센트에 불과하고, 이식 치료에 필요한 심근세포를 얻기가 용이하지 않다.

최근, 준후히 등은 인간 ES 세포를 5-아자사이티딘(5-azacytidine)으로 처리하여 EB내 트로포닌I 양성(심근)세포가 15%에서 44%로 증가함을 보고하였으나(비특허문헌 9 참조), 이 방법에서도 심근세포가 차지하는 비율이 EB의 50%를 넘지 않는다. 또한, 탈메틸화제인 5-아자사이티딘은 DNA에 결합한 메틸기를 이탈시킴으로써 유전자의 발현 상태를 변화시키는 약제로, 약제가 직접 염색체에 작용하기 때문에 이식용 세포를 제작하는 약제로서는 부적절하다.

그 외, ES 세포로부터 심근세포를 보다 고비율로 발생시키는 방법으로는, 예컨대, 마우스 ES 세포에 레티노익산(비특허문헌 10 참조), 아스코르빈산(비특허문헌 11 참조), TGFβ, BMP-2(비특허문헌 12 참조), PDGF(비특허문헌 13 참조), 디노르핀(Dynorphin) B(비특허문헌 14 참조)를 첨가하거나, 또는 세포 내 활성 산소종(reactive oxygen species: ROS)(비특허문헌 15 참조)이나 Ca ^{2 +} (비특허문헌 16 참조)를 증가시키는 방법이, 심근세포의 분화 유도를 촉진하는 것이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법으로도 심근세포 특이적 또는 선택적인 분화를 유도하지는 못하였다.

분비성 단백질인 노긴(Noggin) 및 코르딘(Chordin)은, 처음에 아프리카 발톱 개구리 배아의 신경 유도 인자로 동정되었다(비특허문헌 17, 18, 특허문헌 5-8참조). 그 후 연구를 통해, 노긴 및 코르딘이 신경세포의 발생 및 분화를 저해하는 효과를 가지는 BMP(Bone Morphogenic Protein; 골형성 인자)계 분자와 결합하여 신호 전달을 차단함으로써, 신경 유도 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(비특허문헌 19-21 참조). 실제로 마우스 ES 세포를 이용한 실험에서도, 노긴 유전자 또는 코르딘 유전자를 계속적으로 발현시키면 신경 세포로의 분화가 유도되는 것으로 나타났다(비특허문헌 22 참조).

또한, 인간 ES 세포를 노긴 첨가 배지에서 배양하면, ES 세포가 내인적으로 생산하는 BMP-2의 작용이 억제됨으로써, ES 세포의 배아체 이외의 내배엽세포로의 분화가 억제되어 ES 세포의 미분화 상태가 유지되며, 계속하여 신경 분화 배양 조 건하에서 배양하면 신경 세포로의 분화 유도가 촉진되는 것으로 개시되어 있다(특허문헌 9 참조).

또한, 닭의 배아(비특허문헌 23 참조), 아프리카 발톱 개구리의 배아(비특허문헌 24 참조) 또는 마우스 배아 암세포(비특허문헌 25 참조)를 이용한 종래의 연구들에서는, 심근세포의 발생 및/또는 분화에 BMP계 분자가 촉진적으로 작용하여, 그 작용을 노긴 자극에 의해 저해하면 심근세포의 발생 및/또는 분화가 억제되는 것이 보고되고 있다.

이와 같이, 노긴 또는 코르딘, 또는 그 외의 BMP 신호 억제 인자를 이용하여 심근세포의 발생 및 분화를 촉진시키고자 하는 시도는 지금까지 이루어지지 않았다.

특허문헌 1: 미국특허 제 6,015,671호 명세서

특허문헌 2: 미국특허 제 5,843,780호 명세서

특허문헌 3: 미국특허 제 6,090,622호 명세서

특허문헌 4: 국제 특허 공개 제03/06950호 팜플렛

특허문헌 5: 국제 특허 공개 제94/05791호 팜플렛

특허문헌 6: 미국특허 제 5,679,783호 명세서

특허문헌 7: 미국특허 제 5,846,770호 명세서

특허문헌 8: 미국특허 제 5,986,056호 명세서

특허문헌 9: 국제 특허 공개 제01/98463호 팜플렛

비특허문헌 1 : Soonpaa 등, 「사이언스」("Science"), 264: 98, 1994

비특허문헌 2: Maltsev 등, 「발생 기작」("Mech. Dev."), 44: 41, 1993

비특허문헌 3: Maltsev 등, 「순환 연구」("Circ. Res."), 75: 233, 1994

비특허문헌 4: Klug 등, 「임상 연구학술지」("J.Clin.Invest."), 98: 216, 1996

비특허문헌 5: Thomson 등, 「미국 국내 과학 아카데미 학회지」("Proc. Natl. Acad. Sci. USA"), 92: 7844, 1995

비특허문헌 6: Thomson 등, 「사이언스」("Science"), 282: 114, 1998

비특허문헌 7: Shamblott 등, 「미국 국내 과학 아카데미 학회지」("Proc. Natl. Acad. Sci. USA"), 95: 13726, 1998

비특허문헌 8: Kehat 등, 「임상 연구학술지」("J. Clin. Invest."), 108: 407, 2001

비특허문헌 9: Chunhui 등, 「순환 연구」("Circ. Res."), 91: 508, 2002

비특허문헌 10: Wobus 등, 「분자세포 심장학 학술지」("J. Mol. Cell. Cardiol."), 29: 1525, 1997

비특허문헌 11: Takahashi 등, 「순환」("Circulation"), 107: 1912, 2003

비특허문헌 12: Behfar 등, 「FASEB 저널」("FASEBJ.J"), 16; 1558, 2002

비특허문헌 13: Sachinidis 등, 「심혈관 연구」("Cardiovasc. Res." ), 58: 278, 2003

비특허문헌 14: Ventura 등, 「순환 연구」("Circ. Res."), 92: 623, 2003

비특허문헌 15: Sauer 등, 「FEBS 지」("FEBS Lett."), 476: 218, 2000

비특허문헌 16: Li 등, 「세포생물학술지」("J. Cell Biol."), 158: 103, 2002

비특허문헌 17: Smith & Harland, 「세포」("Cell"), 70: 829, 1992

비특허문헌 18: Sasai 등, 「세포」("Cell"), 79: 779, 1994

비특허문헌 19: Re'em-Kalma 등, 「미국 국내 과학 아카데미 학회지」("Proc. Natl. Acad. Sci. USA"), 92: 12141, 1995

비특허문헌 20: Zimmerman 등, 「세포」("Cell"), 86: 599, 1996

비특허문헌 21등, Piccolo 등, 「세포」("Cell"), 86: 589, 1996

비특허문헌 22: Gratsch & O'Shea, 「발생학」("Dev. Biol."), 245: 83, 2002

비특허문헌 23: Schultheiss 등, 「유전자 발생학」("Genes Dev."), 11: 451, 1997

비특허문헌 24: Sparrow 등, 「발생 기작」("Mech. Dev."), 71: 151, 1998

비특허문헌 25: Monzen 등, 「분자생물학」("Mol. Cell. Biol."), 19: 7096, 1999

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은, 미분화된 줄기세포를 고비율 및 선택적으로 심근세포로의 분화를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 심근세포, 상기 세포를 심장병을 표적으로 한 세포 이식, 주입, 및 그 외의 치료에 이용하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 주된 내용은 다음과 같다.

(1) 줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 방법으로서, 분화를 유도하기 위해 BMP의 신호 전달 억제 물질의 존재하에 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

(2) 분화를 유도하기 위하여 줄기세포를 부유 응집 배양하여 배양체(embryoid)를 형성시키는 단계를 포함하는, 상기(1)에 기재된 방법.

(3) 분화를 유도하기 위하여 줄기세포를 공급자 세포(feeder)와 공배양하는 단계를 포함하는, 상기(1)에 기재된 방법.

(4) 분화를 유도하기 위하여 줄기세포를 배양 용기 상에서 평면 배양하는 단계를 포함하는, 상기(1)에 기재된 방법.

(5) 상기 BMP의 신호 전달 억제 물질을 분화 유도기 개시일로부터 수 일간만 첨가하는 단계를 포함하는, 상기(1) 내지 (4)중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(6) 상기 BMP의 신호 전달 억제 물질을 분화 유도기 이전의 줄기세포에 미리 처리하는 단계를 포함하는, 상기(1) 내지 (4)중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(7) 상기 BMP의 신호 전달 억제 물질을 분화 유도기 이전의 줄기세포에 미리 처리하는 단계 및 상기 BMP의 신호 전달 억제 물질을 분화 유도기 개시일로부터 수 일간 첨가하는 단계를 포함하는, 상기(1) 내지 (4)중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(8) 상기 BMP 신호 전달을 억제하는 물질은 BMP 길항제(antagonist)인, 상기(1) 내지 (7)중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(9) BMP 길항제가, 노긴, 코르딘, 페투인(fetuin), 폴리스타틴(follistatin), 스크렐로스틴(sclerostin), DAN, 세르베러스(cerberus), 그렘린(gremlin), 단테(dante) 및 그들의 관련 단백질로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것인, 상기(8)에 기재된 방법.

(10) 상기 줄기세포는 시험관내 배양에서 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포인, 상기(1) 내지 (9)중 어느 한 항목에 기재된 방법.

(11) 상기 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 포유동물 유래의 세포는 전능성 줄기세포 또는 해당 세포의 기원 세포인, 상기(10)에 기재된 방법.

(12) 상기 전능성 줄기세포는 배아 줄기세포, 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 세포, 배아 생식세포 또는 성체 다능성 줄기세포인, 상기(11)에 기재된 방법.

(13) 상기 전능성 줄기세포는 배아 줄기세포인, 상기(12)에 기재된 방법.

(14) 줄기세포는 인간 유래 세포인, 상기(1) 내지 (13)에 기재된 방법.

(15) 상기(1) 내지 (14)중 어느 한 항목에 기재된 방법을 포함하는, 심근세포의 제조 방법.

(16) 상기(1) 내지 (14)중 어느 한 항목에 기재된 방법에 의해 수득되는 심근세포.

(17) 심근세포의 쇠퇴, 기능 정지 또는 사멸로 인한 심질환의 치료 방법에 있어서, 상기(16)에 기재된 심근세포를 심근세포가 쇠퇴, 기능 정지 또는 사멸한 부위 또는 그 주변에 투여(이식)하는 단계를 포함하는, 상기 심질환의 치료 방법.

(18) 심근세포의 쇠퇴, 기능 정지 또는 사멸로 인한 심질환의 치료에 유용한 물질의 스크리닝 방법에 있어, 피시험 물질을 상기(16)에 기재된 심근세포와 접촉시켜, 상기 세포의 심근세포로의 분화 효율 또는 상기 세포 기능의 질적 또는 양적인 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 심근세포의 쇠퇴, 기능 정지 또는 사멸로 인한 심질환의 치료에 유용한 물질의 스크리닝 방법.

(19) 상기(16)의 심근세포를 유효 성분으로 포함하는, 심근세포의 쇠퇴, 기능 정지 또는 사멸로 인한 심질환 치료용 의약 조성물 또는 지지체.

본 발명자들은 심근세포를 제작하는 줄기세포원으로 전능성 줄기세포, 특,히 가장 흔히 사용되는 세포인 ES 세포를 사용하여, 심근세포 또는 그 전구 세포로의 분화 유도 조건에 대하여 여러가지 검토를 거듭한 결과, 배양 중 특정 기간에 뼈 형성 인자(Bone Morphogenic Protein; BMP)의 신호 전달을 억제하는 물질을 첨가함으로써, 박동 기능을 가지는 심근세포로 인정되는 세포를 종래 방법에 비해 매우 선택적이며 고비율로 생산할 수 있으며, 또한, 과잉의 BMP를 첨가하면 BMP 신호 전달을 억제하는 물질 처리에 의한 심근 분화 유도 효과가 현저하게 저감된다는 것을 발견하여, BMP 신호의 억제가 전능성 줄기세포의 심근세포로의 분화 유도를 촉진한다는 것을 명확히 한 바, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, BMP의 신호 전달 억제 물질은 BMP의 신호 전달을 저해 또는 차단하는 작용을 가지는 물질을 의미하며, 예컨대, BMP 길항제나 BMP계 분자에 대한 특이 중화 항체, 가용화형(세포막 비결합형) BMP 수용체 분자 등을 들 수 있다. 또한 다른 예로는, BMP계 분자 또는 그 수용체 유전자의 기능성 유전자 산물의 발현을 억제 또는 정지시키거나, 또는 BMP 신호 전달 경로의 트랜스 작용 성분을 규정하는 유전자의 발현을 억제 또는 정지시키는 유전자 발현 벡터, 특이 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임, RNA 간섭성 안티센스 RNA, 저분자 화합물 등이 있다.

본 발명의 방법에 따라 전능성 줄기세포로부터 제조한 박동성 세포는, "심근세포"의 특징을 가지는 세포로, 예를 들면, GATA-4, TEF-1, Tbx-5, MEF2 및 MLC-2v 등의 심근 특이 전사 인자의 유전자 발현이나, 심근 특이 마커인 근육원섬유마디(sarcomere)?미오신, 트로포닌 I,α-액티닌, ANP 등의 단백질의 발현을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 전능성 줄기세포의 분화 유도방법은, 일반적으로 자주 사용되는 부유 응집 배양법 뿐만 아니라, 현적(hanging drop) 배양법, 및 공급자 세포(feeder)를 이용한 공배양법에서도 동일한 효과를 얻을 수 있다.

또한, BMP 신호 전달을 억제하는 물질의 첨가 시기 및 기간을 검토한 결과, 전능성 줄기세포를 단일 세포 또는 수개의 세포로 이루어지는 세포덩어리로 분산시켜 부유 응집 배양 또는 공급자 세포와의 공배양 등의 방법에 의해 분화를 유도하는 경우, 미리 전능성 줄기세포를 BMP 길항제로 전처리해 두거나, 분화를 유도하기 위한 배양을 개시한 직후 수 일간만 첨가하거나, 또는 이의 조합 처리가 효과적이다. 또한, 부유 세포 또는 공급자 세포와 공배양 등의 배양 중에 BMP 길항제를 계속 존재시키는 경우, 전능성 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 유도 효율이 극히 저하되는 것으로 나타났다.

즉, 본 발명은 BMP 신호 전달을 억제하는 물질의 일시적인 자극하에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 전능성 줄기세포로부터 심근세포로의 분화를 유도하는 방법 및 심근세포의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 심근 분화능을 가지는 줄기세포는 시험관내 배양시 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미하며, 예를 들어, 전능성 줄기세포, 중간엽계 줄기세포, CMG 세포 및 Spoc 세포 등이 있다. 또한, 전능성 줄기세포는 시험관내 배양시 미분화 상태를 유지한 상태로 거의 영속적 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적정 조건하에서 삼배엽(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미하며, 예를 들어, ES 세포, ES 유사 세포, EG 세포 및 MAPC 등이 있다.

다른 실시예에 있어서, 본 발명은 전능성 줄기세포의 분화를 유도함으로써 제조한, 심근세포의 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특징을 나타내는 세포에 관한 것이다. 생리학적 및/또는 면역학적 특징은, 특히 이로 한정되지 않으나, 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포가 심근세포로 인식되는, 심근세포에 특이적인 하나 또는 그 이상의 마커를 발현하는 것이다.

또한, 본 발명은 심근세포의 발생 유도, 분화 유도, 재생, 생존 등을 촉진하는 신규 인자, 또는 가능성 있는 화학요법제를 동정하기 위하여, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 전능성 줄기세포를 심근 전구 세포 또는 심근세포의 형태학적, 생리학적 및/또는 면역학적 특징을 가지는 세포로 분화 유도하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 유용하다.

다른 실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는, 심질환 상태에 있는 심장의 치료 방법, 및 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포를 유효 성분으로 하는 심장 질환 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 이점이나, 그외 이점 및 특징은, 이하의 바람직한 실시예의 상세한 설명에서 구체적으로 설명한다.

또한, 본 발명의 실시에 있어서, 전능성 줄기세포를 이용한 세포 배양 및 발생, 세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대해 실시자는 당업계의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로는, Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman 등 편저, Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(MV Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual(Hogan 등 편저, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells(Turksen 편저, Humana Press, 2002)가 포함된다. 본 명세서에서 참조되는 세포 배양, 발생?세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Invitrogen/GIBCO 사나 Sigma 사 등의 시판사로부터 입수 가능하다.

발명의 상세한 설명

본 개시에 있어서, "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포의 모든 분화 단계의 세포를 포함하여, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의해, 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준을 확인할 수 있는 세포로 정의된다.

심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출한다. 이러한 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은, 면역화학적 방법을 사용한다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체가 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c 등을 들 수 있다.

또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으며, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.

또한, 전능성 세포의 심근세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용한다. 즉, 전능성 세포 유래의 세포가 자립적 박동성을 가지거나, 각종 이온 채널을 발현하고 있고 전기 생리적 자극에 반응할 수 있는 것 등도, 유용한 지표가 된다.

본 발명에 이용되는 전능성 줄기세포는, 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유동물 유래 ES 세포, EG 세포, MAPC 등이 있다. 마우스 유래 ES 세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포, J1 세포 등을 들 수 있다. 또한, ES 세포, EG 세포, MAPC의 제조, 계대, 보존 방법에 대한 표준적인 프로토콜이 이미 확립되어 있어, 실시자는 상술한 참고서적와 복수의 참고 문헌(Matsui 등, Cell 70: 841, 1992; Shamblott 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; 미국특허 제 6,090,622호; Jiang 등, Nature 418: 41, 2002; 국제 특허 공개 01/11011)을 참조하여 이들 전능성 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 이용가능한 세포는, 상기 3종으로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 또는 혈액 등으로부터 유래된, 모든 전능성 줄기세포를 포함한다. 구체적인 예로, 모근 초세포나 표피 세포에 5-아자사이티딘 등의 약제를 처리하여 수득한 줄기세포(Sharda & Zahner, 국제 특허 공개 제02/051980호)나, 단핵구 세포에 CR3/43 항체를 처리하여 수득한 줄기세포(Abuljadayel, Curr. Med. Res. Opinion 19: 355, 2003), 또는 성체내 귀세포 유래 줄기세포(Li 등, Nature Med., Advance online publication) 등의 ES 세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 들 수 있다. 이 경우, ES 세포와 유사한 형질이란, ES 세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, ES 세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마(teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 ES 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로 정의할 수 있다.

또한, ES 세포와 유사한 형질을 갖지 않는 세포, 또는 전능성 줄기세포가 아닌 세포라도, 적어도 시험관내 배양에서 심근세포형의 형질을 가지는 세포로 분화할 수 있는 성질을 가진 세포라면, 본 발명에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 이와 같은 세포의 예로는, 골수 세포에 유래하는 골수중간엽계 줄기세포(Bruder 등, 미국특허 제 5,736,396호; pittenger 등, Science 284: 143, 1999)나 CMG 세포(Makino 등, J. Clin. Invest. 103: 697, 1999; 국제 특허 공개 제 01/048151호), 근조직에 유래하는 Spoc 세포(국제 특허 공개 제03/035382호)를 들 수 있다.

본 발명의 전능성 줄기세포로부터 심근세포를 제조하는 배양 방법에 있어서, 심근세포로의 분화 유도에 적절한 방법은 모두 사용할 수 있으며, 예컨대, ES 세포를 사용하는 경우, 부유 응집 배양법, 현적 배양법, 공급자 세포와의 공배양법, 선회 배양법, 연질 한천 배양법, 마이크로 캐리어 배양법 등을 사용할 수 있다. 구체적인 방법의 예로는, 부유 응집 배양법의 경우, 단일 세포 상태(효소 분해 등을 실시하여 세포끼리 접착되지 않은 개개의 세포가 액상에 분산된 상태)의 ES 세포를, 바람직하게는, 배지에 10 cell/mL 내지 1x10 ⁷ cell/mL의 세포 밀도로, 보다 바람직하게는 10O cell/mL 내지 1x10 ⁶ cell/mL의 세포 밀도로 현탁하고, 이를 배양 플레이트에 접종한 다음, 4 내지 30일간, 바람직하게는 6 내지 15일간, 37 ℃에서 5%의 이산화탄소를 통기한 CO ₂ 조건하에서 배양하는 방법이 있을 수 있다.

또한, 다른 예로, 공급자 세포와의 공배양법에서, 공급자 세포는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 중간엽계 세포의 성질을 가지는 세포, 보다 바람직하게는, ST2 세포, OP9 세포, PA6 세포 등의 골수 간질 세포형의 형질을 가지는 세포를 들 수 있다. 이들 공급자 세포를 고밀도로 배양, 미토마이신 C 처리, 또는 방사선 조사 등의 방법으로 영양 공급화하고, 또한 배지에 1 cell/mL - 1x10 ⁶ cell/mL, 바람직하게는 10O cell/mL - 1x10 ⁵ cell/mL, 보다 바람직하게는 1x10 ³ cell/mL - 1x10 ⁴ cell/mL의 세포 밀도로 현탁한 단일 세포 상태의 ES 세포를 접종한 다음, 4-30일간, 바람직하게는 6-15일간, 37℃에서 5%의 이산화탄소 통기의 CO ₂ 조건하에서 배양할 수 있다.

본 발명에서, BMP의 신호 전달 억제 물질은 BMP의 신호 전달을 저해 또는 차단하는 작용을 하는 물질을 의미하며, 예를 들면, BMP 길항제나 BMP계 분자에 대한 특이 중화 항체, 가용화성(세포막 비결합성) BMP 수용체 분자 등을 들 수 있다. 다른 예로는, BMP계 분자 또는 그 수용체 유전자의 기능성 유전자 산물의 발현을 억제 또는 정지시키거나, 또는 BMP 신호 전달 경로의 트랜스 작용성 성분을 규정하는 유전자의 발현을 억제 또는 정지시키는, 유전자 발현 벡터, 특이적 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 라이보자임, RNA 간섭성 안티센스 RNA, 저분자 화합물 등을 들 수 있다.

또한, BMP 길항제는 BMP계 분자(예, BMP-2, BMP-4, BMP-7 등)에 결합하여 BMP 분자와 세포 표면의 BMP 수용체간의 결합을 저해 또는 억제하는 물질, 또는 BMP 수용체에 결합함으로써 BMP 신호 전달을 억제 또는 차단하는 물질로 정의된다. 본 발명에 따른 바람직한 BMP 길항제로는, 예컨대, 노긴이나 코르딘 등이 있으며, 또한 해당 단백질과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, BMP 길항제 활성을 가지는 노긴 관련 단백질 또는 코르딘 관련 단백질도 들 수가 있다. 또한, 노긴 또는 코르딘을 코딩하는 염기와 엄격 조건하(예, 2x SSC)에서 혼성화하는 염기에 의해 코딩되는 노긴 관련 단백질 또는 코르딘 관련 단백질도 동일하게 포함된다.

본 발명은 전능성 줄기세포를 일시적으로 BMP 신호를 억제하는 물질의 자극하에 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 자극 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 재조합 단백질 정제물을 배지 중에 첨가하는 방법을 들 수 있다. 그 밖에도, BMP 신호를 억제하는 물질을 재조합 단백질 정제물을 배지에 첨가하는 방법과 동일한 효과를 나타내는 모든 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 조직으로부터 추출, 정제한 노긴 등의 BMP 길항제를 첨가하는 방법, 노긴 등의 BMP 길항제의 유전자 발현 벡터를 전능성 줄기세포에 도입하는 방법, 노긴 등의 BMP 길항제의 유전자 발현 벡터를 공급자 세포에 도입하고, 도입된 세포를 공배양 세포로서 이용하는 방법, 또는 상기 동입된 세포의 배양 상청액 등의 세포 산물을 이용하는 방법 등이 있으며, 본 발명에 따른 방법은 어떠한 방법도 BMP 길항제의 배지내에 첨가하는 실시예로 포함한다.

본 발명의 실시에 사용되는 BMP 신호를 억제하는 물질의 단백질 및 유전자는, 전능성 줄기세포가 유래된 종과 동종의 동물로부터 유래된 것이 바람직하며, 예를 들면, 마우스 전능성 줄기세포를 이용하여 본 발명을 실시하는 경우, 마우스의 노긴 cDNA를 면역글로블린의 정상(Fc)영역의 cDNA와 연결시킨 융합 유전자를 마우스 세포에 도입하고, 이를 발현시켜 제조한 재조합 단백질 정제물(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera; R&D systems 사, Genzyme Technology 사)이 시판되고 있으며, 이를 마우스 유래 노긴 단백질로서 용이하게 사용할 수 있다. 또한, 이종 동물 유래의 것도 사용할 수 있어, 인간의 노긴 cDNA를 대장균에 도입하여 이를 발현시켜 제작한 재조합 단백질 정제물(PeproTech 사에서 시판)로 대용할 수 있다. 또한, 돼지, 양, 말, 조류(예, 닭 등), 또는 양서류(예, 아프리카 발톱개구리 등) 유래의 노긴 단백질도 사용할 수 있다. 코르딘 및 그 외의 BMP 길항제도 동일하게 적용하여 사용할 수 있다. 또한, 이들 인자를 코딩하는 유전자의 염기 서열은, 미국 국립 바이오테크롤러지 센터(National Center for Biotechnology, NCBI) 등의 공공 DNA 데이터 베이스로부터 제공받을 수 있으며, 당업자라면 각각의 유전자 cDNA를 취득 및 사용할 수 있다. 그 예로, 노긴 및 코르딘 유전자는 이미 인간이나 마우스에서 동정되어, 인간의 노긴, 마우스의 노긴, 인간의 코르딘, 마우스의 코르딘의 염기 서열은 각각 액세스 번호: NM#005450, NM#008711, NM#073411, NM#009893로 NCBI의 데이터 베이스에 등록되어 있다.

본 발명의 BMP 길항제는, BMP 분자(예, BMP-2, BMP-4, BMP-7 등)에 결합하여 BMP 분자와 세포 표면의 BMP 수용체와의 결합을 저해 또는 억제하는 물질, 또는 BMP 수용체에 결합함으로써 BMP 신호 전달을 억제 또는 차단하는 물질이 적합하며, 대표적인 예로 노긴(Re'em-Kalma 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12141, 1995; Zimmerman 등, Cell 86: 599, 1996), 및 코르딘(Piccolo 등, Cell 86: 589, 1996; De Robertis 등, 미국 특허 제 5,679,783호; LaVallie 등, 미국 특허 제 5,846,770호; Lavallie 등, 미국 특허 제 5,986,056호)을 들 수 있다. 그 외 BMP 길항제의 구체예로는, 폴리스타틴, 페투인, 스클레로스틴, DAN/세르베러스계 분자 등이 있으며, 상기 분자로는 DAN, 세르베러스, 그렘린, 단테 등이 알려져 있다(Balemans & Hul, Dev. Biol. 250: 231, 2002). 또한, 천연에 존재하는 BMP 길항제의 합성 또는 대체 유사체 역시 본 발명에 따른 방법의 실시에 있어 유용하다.

또한, 본 발명의 실시에 있어서, 전능성 줄기세포의 처리 방법은 노긴 등의 BMP 길항제를 이용하는 방법에만 한정되지 않으며, BMP 길항제와 동일한 효과, 즉, BMP 신호 전달을 억제하는 모든 방법을 사용할 수 있다. BMP 신호 전달의 억제 방법의 구체적인 예로는, BMP계 분자에 대한 특이적 중화 항체를 이용하는 방법, 가용화성(세포막 비결합성) BMP 수용체 분자를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 다른 예로는, BMP계 분자 또는 그 수용체 유전자의 기능성 유전자 산물의 발현을 억제 또는 정지시키거나, 또는 BMP 신호 전달 경로의 트랜스 작용 성분을 규정하는 유전자 발현을 억제 또는 정지시키는, 유전자 발현 벡터, 특이 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 라이보자임, RNA 간섭성 안티센스 RNA, 저분자 화합물 등을 세포 내에 도입하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 전능성 줄기세포에 BMP의 신호 전달을 억제하는 물질(예, 노긴, 코르딘 등의 BMP 길항제)을 사용하는 경우, 이들 인자를 적용시키는 시기는 두가지 시기로 나눌 수 있다. 즉, 전능성 줄기세포를 단일 세포 또는 수개의 세포로 이루어진 세포 덩어리로 분산하여, 부유 응집 배양 또는 공급자 세포와의 공배양 등을 행하는 시점의 전후이며, 이하에서는 공배양 시기 이전을 전처리기, 그 이후의 시기를 분화 유도기라고 한다.

전처리기에서, 전능성 줄기세포에 BMP 신호 전달 억제 물질의 적용 시기는 분화 유도기 개시하기 1-2일 전부터, 보다 바람직하게는 개시하기 적어도 3일 전부터가 바람직하다.

또한, 전처리기에는 ES 세포를 미분화 상태로 유지하기 위하여 ES 세포의 동물 종에 따라, 통상적인 조건하에서 배양하는 것이 바람직하다. 즉, 마우스 ES 세포의 경우, 배지에 100 - 10000 U/mL, 바람직하게는 500 - 2000 U/mL 농도의 백혈병 저해 인자(Leukemia inhibitory factor: LIF)를 첨가하는 것이 바람직하다.

BMP의 신호 전달 억제 물질을 적용할때 배양 기간 전반에 거쳐 상기 물질을 존재시킬 필요는 없으며, 예컨대, BMP의 신호 전달 억제 물질로서 노긴 또는 코르딘 등의 BMP 길항제를 이용하는 경우, BMP 길항제가 활성을 가지는 상태로 존재하는 배지에서의 배양은 분화 유도기 개시로부터 5일 이내, 보다 바람직하게는 3일 이내가 바람직하다. 단, BMP의 신호 전달 억제 물질의 적용 기간은, 이용 세포의 기원 동물 종, 이용 세포주, 이용하는 분화 유도 및 이용하는 BMP의 신호 전달 물질 등의 조건에 따라 적정 일 수로 변경할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, BMP의 신호 억제 물질로서, BMP 길항제(예, 노긴 단백질, 코르딘 단백질 등)를 사용하는 경우, 사용한 배지는 무균적으로 제거하고, 1 ng/mL - 2μg/m1, 바람직하게는 5 ng/mL- 1000 ng/mL, 보다 바람직하게는 10 ng/mL - 500 ng/mL 농도의 노긴 단백질 또는 코르딘 단백질을 함유하는 배지로 치환하여, 바람직하게는 수일간 계속 배양한다. 다른 BMP의 신호 억제 물질을 사용하는 경우에는, 그 종류에 따라 적정 농도를 변경하여 사용할 수 있다.

상기 방법에 의해, ES 세포를 시작으로 하는 전능성 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포는, 공지 방법에 따라 계속적으로 세포 회수, 분리, 정제함으로써, 고순도의 심근세포를 효율적이면서도 다량으로 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 심근세포를 이하에서는 본 발명에 의해 제조된 심근세포라고 기재한다.

심근세포의 정제 방법은, 공지된 세포 분리 및 정제 방법을 모두 적용할 수 있으며, 그 구체적 예로는 유세포 측정기나 자석비드, 패닝법 등의 항원-항체 반응에 준한 방법(Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition (Acad. Press, 1993); Antibody Engineering: A Practical Approach(IRL Pressat Oxford University Press, 1996)이나, 슈크로스, 페르콜(Percoll) 등의 담체를 이용한 밀도 구배 원심에 의한 세포 분화법을 들 수 있다. 또한, 다른 심근세포의 선별법으로, 근본이 되는 ES 세포 등의 전능성 줄기세포의 유전자에 미리 인위적인 수정을 가하여 약제 내성 또는 이소성 단백질의 발현능을 부여함으로써 심근세포로서의 형질을 가지는 세포를 회수하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면, Field 및 공동 연구자들은, α형 미오신 중쇄 프로모터의 조절하에 네오마이신(G418) 내성 유전자를 발현할 수 있는 유전자 카세트를 마우스 ES 세포에 도입함으로써, 상기 ES 세포가 심근세포로 분화되면서 그에 따라 α형 미오신 중쇄 유전자를 발현하였을때에만 G418가 첨가된 배지에서 생존할 수 있는 시스템을 구축하였고, 이러한 방법으로 G418 내성 세포로서 선별된 세포의 99% 이상이 심근세포로 확인하였다(미국특허 제 6,015,671호; J.Clin.Invest. 98: 216, 1996).

본 발명에 의해 제조된 심근세포는, 각종 생리 활성물질(예, 약물)이나 기능이 알려지지 않은 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다. 예를 들면, ES 세포 등의 전능성 줄기세포로부터 심근세포로의 분화 제어에 관여하는 물질이나 약제, 또는 심근세포의 기능 조절과 관련된 물질이나 약제, 또는 심근세포에 독성이나 장애성을 나타내는 물질이나 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 특히, 현재, 인간 심근세포를 이용한 스크리닝 방법은 거의 없으므로, 본 발명에 의해 제조된 심근세포는 이러한 스크리닝 방법을 실시하기 위한 유용한 세포 재료가 된다. 다른 예로, 본 발명에 의해 제조된 심근세포를 포함하는 평가 키트는, 상기 스크리닝에 유용하다.

스크리닝에 제공되는 피시험 물질은, 배양 시스템에 첨가가능한 임의의 종류의 것일 수 있으며, 예를 들면, 저분자 화합물, 고분자 화합물, 유기 화합물, 무기 화합물, 단백질, 펩티드, 유전자, 바이러스, 세포, 세포 배양액, 미생물 배양액 등이 있다. 유전자를 효율적으로 배양 시스템에 도입하는 방법으로는, RNA 종양 바이러스, 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터를 이용한 배양 시스템에 첨가하는 방법, 또는 리포솜 등의 인공적 구조물에 밀봉하여 배양 시스템에 첨가하는 방법 등이 있다.

피시험 물질의 평가는, ES 세포 등의 전능성 줄기세포에서 심근세포의 분화를 유도하는 효율이나, 또는 심근세포 기능의 질적 또는 양적인 변화를 측정함으로써 수행할 수 있다. 예를 들면, 피시험 물질의 심근 분화 유도 효율은, 본 발명에 기재된 방법을 이용하여 배양중인 전능성 줄기세포를, 배양 개시 후 5-15일째, 바람직하게는 7-12일째에 심근세포 특이적인 각종 마커의 발현을 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출함으로써 측정할 수 있다. 생화학적 또는 면역화학적 방법은 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법에서는, 심근세포에 결합하는 마커 특이적 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이 마커를 표적으로 하는 항체가 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 심근세포에 특이적인 마커의 예로는, 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP,GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c 등이 있다.

또한, 피시험 물질을 평가하는 지표인 심근세포 기능은 일예로 심근세포의 생존성을 들 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조된 심근세포를 적절한 세포 밀도로 배양 플레이트에 접종하고, 혈청 무첨가 배지에서 배양하면, 세포자살(apoptosis)가 유도될 수 있지만, 이 때, 적당량의 피시험 물질을 배지에 첨가하여 심근세포의 생존률 또는 사망률을 측정하면 된다. 심근세포의 생존률 또는 사망률은, 트리팬블루 등의 색소의 취입을 지표로 하는 육안 관찰에 의해 측정할 수 있으며, 탈수소 산소의 활성(환원 활성)을 지표로 하는 방법, 또는 세포자살 세포에 특이적인 카스파제 활성이나 아넥신 V의 발현을 지표로 하는 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 기작을 이용하는 키트들이, Sigma 사나 Clonetech 사, Promega 사 등의 많은 브랜드에서 시판되고 있으므로, 용이하게 사용할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 의해 수득된 물질 또는 약제는, 심근세포의 분화 유도 작용이나 기능 조절 작용을 가지므로, 예를 들면, 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등의 심질환의 예방제 또는 치료제로 사용할 수 있다. 이들 화합물은 신규 화합물일 수도 잇으며, 공지된 화합물일 수도 있다.

또한, 본 발명에 의해 제조된 심근세포는, 심근재생제 또는 심장 질환 치료제로 사용할 수 있다. 심장 질환은 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등을 예시할 수 있다. 심근 재생제 또는 심장 질환 치료제는, 본 발명에 의해 제조된 심근세포를 높은 순도로 포함하는 것이면, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시킨 것, 세포를 생체 분해성 기질 등의 지지체에 내포시킨 것, 또는 단층 또는 다층의 심근세포 시트(Shimizu 등, Circ. Res. 90: e40, 2002)로 가공한 것 등의, 어떤 형상이든 사용할 수 있다.

상기 치료제는 개흉한 뒤 주사기를 이용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등(Murry 등, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 67: 519, 2002; Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75: S20, 2003; Dowell 등, Cardiovasc. Res. 58: 336, 2003)으로 장해 부위에 수송할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 방법으로, 태아 심장으로부터 회수한 심근세포를 심장 상해 동물의 심장에 이식하면, 상당히 양호한 치료 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Menasche, Ann. Thorac. Surg. 75: S20, 2003; Reffelmann 등, Heart Fail. Rev. 8: 201, 2003). ES 세포 유래의 심근세포는 태아 심장 유래의 심근세포와 상당히 유사한 형질을 나타낸다(Maltsev 등, Mech. Dev. 44: 41, 1993; Circ. Res. 75: 233, 1994). 또한, 실제로 ES 세포 유래의 심근세포를 성체 심장에 이식한 동물 실험예에서, 태아 심근을 이식한 예와 거의 동일하게 매우 높은 생착성을 나타낸다는 것도 확인되었다(Klug 등, J. Clin. Invest. 98: 216, 1996). 따라서, 심근세포의 쇠퇴 및 소실로 인한 상기의 심질환에 있어서, 본 발명에 기재된 방법에 의해 제조한 심근세포를 질환성 심장 조직에 보충적으로 이식함으로써, 심기능 개선의 촉진을 기대할 수 있다.

도 1A는 부유 배양법을 이용한 ES 세포(EB3)의 심근 분화 유도 시스템에서, 노긴 단백질(500 ng/mL)의 첨가로 인한 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다.

도 1B는 현적 배양법을 이용한 ES 세포(EB3)의 심근 분화 유도 시스템에서, 노긴 단백질(500 ng/mL)의 첨가로 인한 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다.

도 2는 박동성 EB의 출현율에 있어서 노긴의 첨가 농도 차이에 따른 영향을 나타낸다. ES 세포(EB3 세포 및 R1세포)로부터 EB를 형성시켜, 부유 배양 후 10일 째에 박동성 EB의 출현율을 산출하였다.

도 3은 심근에 특이적인 마커 유전자의 발현에 있어서 노긴 첨가에 따른 영향을 나타낸다. 부유 배양 0, 5, 10, 15일 경과 후, EB(EB3 세포 유래)를 회수하여 각 유전자의 발현을 조사하였다. TEF-1: 전사 인핸서 인자-1(transcription enhancer factor-1), MEF-2c: 근육 강화 인자-2c(muscle enhancement factor-2c), α-MHC: α-미오신 중쇄, MLC-2v: 미오신 경쇄-2v, GAPDH: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제.

도 4는 부유 배양 후 10일된 노긴 (+)군 EB(EB3 세포 유래)로부터 분리 및 회수한 심근세포의 면역 염색 결과이다. a: 근육원섬유마디/미오신, b: 트로포닌 I, c: α-엑티닌, d: ANP

도 5는 부유 배양 후 10일된 노긴 (+)군 및 노긴 (-)군 EB(EB3 세포 유래)내 심근세포의 면역 염색 결과이다. a, b: 근육원섬유마디/미오신, c, d: 트로포닌 I, e, f: α-엑티닌, g, h: ANP

도 6은 심근 분화 유도 작용에 있어서의 노긴의 BMP 저해 효과를 나타낸다.

도 7A는 공급자 세포를 이용한 심근 분화 유도 시스템에서의 노긴 처리 효과를 나타낸다. ST2 공급자 세포상에 ES 세포(R1)를 접종하여, 심근 분화를 확인하였다. 접종 후 8일 경과시 항근육원섬유마디/미오신 항체(MF20)에 의한 염색 이미지이다. n>5. ※: 노긴(-) 군에 대해 p< 0.01.

도 7B는 공급자 세포를 이용한 심근 분화 유도 시스템에서의 노긴 처리 효과를 나타낸다. ST2 공급자 세포상에 ES 세포(R1)를 접종하여 심근 분화를 확인하였 다. 접종 후 8일 경과시의 MF20 양성 콜로니의 출현율이다. n>5. ※: 노긴(-) 군에 대해 p< 0.01

도 7C는 공급자 세포를 이용한 심근 분화 유도 시스템에서의 노긴 처리 효과를 나타낸다. ST2 공급자 세포상에 ES 세포(R1)를 접종하여 심근 분화를 확인하였다. 접종 후 12일 경과시의 박동성 콜로니의 출현율이다. n>5. ※: 노긴(-) 군에 대해 p< 0.01

도 8은 현적 배양법을 이용한 ES 세포(R1)의 심근 분화 유도 시스템에서의 코르딘 단백질(500 ng/mL)의 첨가가 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을, 노긴 단백질(500 ng/mL) 첨가시와 비교한 결과이다. 배양 일수는 현적 배양을 개시한 날부터의 일 수이다. n=8. ※: 무첨가군(-)에 대해 p< 0.01

도 9는 부유 배양법을 이용한 ES 세포(R1)의 심근 분화 유도 시스템에서의 코르딘 단백질(150 ng/mL)의 첨가가 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다. C: 코르딘 첨가, N: 노긴(150 ng/mL) 첨가, (-): 무첨가. EB 형성 전 및 형성 후의 처리를 「전처리」→ 「후처리」의 표시 형식으로 나타낸다.

도 10은 부유 배양법을 이용한 ES 세포(R1)의 심근 분화 유도 시스템에서의, 각종 BMP 길항제 단백질(각 150 ng/mL)의 첨가가 박동성 EB의 출현에 미치는 영향을 나타낸다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 단순히 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1: 노긴 처리에 의한 ES 세포 유래 심근세포의 출현 증강 효과)

ES 세포를 부유 응집 배양(이하, 본원 실시예에서는 부유 배양이라 함)에 의해 EB로 형성시키고, 심근세포로의 분화를 유도하는 실험 시스템을 이용하여, 배지에 노긴 단백질 첨가가 심근세포의 출현율에 미치는 영향을 검토하였다.

이하의 실험에서는, ES 세포로서 EB3 세포(니와 히토시 박사, 이과학연구소 제공), R1 세포(Andrew Nagy 박사, Mount Sinai 병원; 캐나다, 제공), 및 129SV 세포(다이니혼 제약 주식회사로부터 구입)를 사용하였으나, 대체로 ES 세포종의 차이에 따른 실험 결과 차이는 없었다. 이들 ES 세포는, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액, 2 mM L-글루타민 및 0.1 mM 2-머캅토 에탄올을 포함하는 GMEM(Glasgow Minimum Essential Medium; Sigma 사) 배지에 2000 U/mL 백혈병 억제 인자(LIF)(ESGRO; Chemicon 사)가 첨가된 배지를 사용하여, Manipulating the Mouse Embryo: ALaboratory Manual(Hogan 등 편저, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols(Turksen 편저, Humana Press, 2002) 등에 기재된 방법에 따라 미분화된 형질을 유지하면서 계대배양한 것을 실험에 제공하였다.

부유 배양을 개시하기 3일 전에, 상기 조건으로 배양하여 콜로니를 형성하고 있는 ES 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 1 mM의 EDTA를 포함하는 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 단일 세포 상태로 만든 다음, 2000 U/mL의 LIF가 첨가된 10%의 소 태아 혈청, 0.1 mM의 MEM 비필수 아미노산 용액, 2 mM의 L-글루타민 및 0.1 mM의 2-머캅토 에탄올을 포함하는 α-변형 최소 필수 배지(α-MEM; Sigma 사)(이하, "분 화 배지"라 함)를 사용하여, 2.5 x 10 ⁵ cell/mL의 세포 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액에 500 ng/mL의 재조합 노긴-Fc 키메라 단백질(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera; R&D systems 사)(이하, "노긴 단백질"이라 함)을 첨가 또는 무첨가한 후, 공급자 세포 비의존적 ES 세포주인 EB3 세포는, 젤라틴으로 코팅된 시판 세포 배양용 플레이트(T75 플라스크; 그라이너사 제품)상에 접종하였다. 또한, 공급자 세포 의존적 ES 세포주인 R1 세포 및 129SV 세포는, 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 미토마이신을 처리한 초대 마우스 배아 섬유아세포(다이니혼 제약사)를 미리 접종한 플레이트의 영양 공급화한 세포 상에 세포 현탁액을 접종하였다.

ES 세포로부터 EB를 형성시키기 위한 부유 배양을 다음과 같이 수행하였다. 노긴을 첨가 또는 무첨가한 분화 배지에서 3일간 배양한 ES 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 1 mM의 EDTA를 포함하는 0.25%의 트립신 용액으로 처리하여 단일 세포화하고, 이어 분화 배지로 채워진 시판되는 세포 접착성이 약한 박테리아용 플레이트(직경 10O mm; Valmalk 사 제품)에 1 x 10 ² cell/mL, 또는 2 x 10 ⁵ cell/mL의 농도로 접종하였다. 이 때, 노긴 단백질을 첨가한 세포군의 배지에는, 부유 배양을 개시하기 3일 전에 노긴 단백질 500 ng/mL을 첨가하였다. 그 후, 세포가 플레이트에 정착되지 않는 상태로, 4-14일간 부유 배양하였다. 본 실험 조건에서, 부유 배양 직후부터 ES 세포가 응집하여 EB가 형성되는 것이 확인되었으며, 부유 배양 후 7-8일째경부터 일부의 EB에서 자립 박동성이 관찰되었다.

한편, ES 세포로부터 EB를 형성시키는 다른 방법으로, 다음과 같은 현적 배 양을 수행하였다. 노긴 첨가 또는 무첨가한 분화 배지에서 3일간 배양한 ES 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 1 mM의 EDTA를 포함하는 0.25%의 트립신 용액으로 처리하여 단일 세포화하였다. 연이어, 분화 배지 15μL내에 500개의 세포를 포함하는 현탁물을 준비하고 이를 배양 플레이트의 뚜껑에 현적하여, 4일간 배양하였다. 이때, 노긴 단백질을 첨가한 세포군의 배지에는 현적 배양을 개시하기 3일전에 노긴 단백질 500 ng/mL을 첨가하였다. 현적 배양 후, 현적 중에 형성된 EB를 분화 배지로 채워진 시판 세포 배양용 접시(4구 멀티 접시; Nunc 사 제품)에 접종하고, 계속해서 부착 배양을 수행하여 심근세포로의 분화를 유도하였다. 부착 배양 후, 2일마다 배지 용량의 반을 신선한 배지로 교체하였다. 본 실험 조건에서는 부유 배양시와 동일하게, 현적 배양 직후부터 ES 세포가 응집하여 EB로 형성되는 것이 확인되며, 회수한 EB의 부착 배양을 개시한지 3-4일째(현적 배양 후 7-8일째)부터 일부의 EB 유래 콜로니에서 자립 박동성이 관찰된다.

ES 세포로부터 심근세포의 분화 및 발생 지표로서, 자립 박동성을 나타내는 EB의 출현율을 시간에 따라 조사하였다. ES 세포로서 EB3 세포를 이용하고, 1 x 10 ² 개/mL의 세포 농도로 부유 배양을 수행한 결과, 노긴 무처리한(노긴 (-)군) ES 세포로부터 유래된 EB에서는 부유 배양 후 14일째에도 박동성이 거의 관찰되지 않았다(도 1A). 반면에, 노긴 처리한(노긴 (+)군) ES 세포로부터 유래된 EB에서는 부유 배양 후 7일째부터 박동성이 관찰되는 것이 나타났으며, 14일째에는 80%이상의 EB에서 박동성을 확인할 수 있었다. 2 x 10 ⁵ 개/mL의 세포 농도로 부유 배양을 실시한 경우에서도 동일한 경향이 관찰되어, 노긴 (-)군 EB에서는 최종적으로 10%에도 못 미친 EB에서만 박동이 확인되었으나, 노긴 (+)군 EB에서는 부유 배양 후 10일째에는 30% 이상, 14일째에는 90% 이상의 EB가 박동성을 나타내었다. 또한, 노긴 (-)군 EB에서는, 박동하는 영역이 EB의 일부로 한정되었으나, 노긴 (+)군 EB에서는 놀랍게도 EB 표층의 거의 전역에 걸친 세포가 박동하고 있는 것을 관찰할 수 있었다.

현적 배양 조건에서도, 노긴 (+)군 ES 세포에서의 심근 분화능은 노긴 (-)군 ES 세포에 비해 현저히 높았으며, 분화 유도 후 7일째(부착 배양 후 3일째)에는 40% 이상, 10일째에는 80% 이상, 또한 14일째에는 거의 모든 EB 유래 콜로니에서 박동을 볼 수 있었다(도 1B). 또한, 부유 배양 조건에서 관찰된 바와 동일하게, 노긴 (-) 군에서는 EB를 배양 접시에 부착하여 형성시킨 콜로니의 일부 영역의 세포에서만 박동성을 볼 수 있던 것에 반해, 노긴 (+)군에서는 EB 유래 콜로니의 거의 전체 세포에서 박동이 확인되었다.

또한, 양쪽 배양 시스템에서 노긴과 동일한 처리 조건에서, 예를 들면 IGF(insulin-like growth factor)-1, FGF(fibroblast growth factor)-2, BMP-2 등의 각종 증식 인자 또는 사이토카인의 재조합 단백질을 배지에 첨가하였으나, 노긴과 동일하거나 또는 노긴에 비해 우수한 심근 유도 활성을 나타내는 것은 확인되지 않았다.

또한, 노긴 단백질의 첨가 농도 차이에 따른 ES 세포에서 심근세포로의 분화 유도 효과를 검토하였다. 첨가하는 노긴 단백질의 농도를 0.5 - 1500 ng/mL으로 하고, 그외는 도 1의 조건과 동일하게 부유 배양수행하였고, 그 결과는 도 2에 나타낸다. EB3 세포 및 R1 세포는 거의 동일한 농도 의존성을 나타내었으며, 5 ng/mL - 1500 ng/mL 농도의 노긴 단백질 첨가시 노긴(-) 군과는 유의한 높은 박동성 EB의 출현이 확인되었다. 특히, 50 ng/mL - 150 ng/mL 농도로 노긴 단백질을 첨가할때 매우 양호한 박동성 EB가 출현하였다.

(실시예 2: 노긴 처리에 의해 분화 유도된 ES 세포 유래의 심근세포의 형질)

실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 노긴 처리를 행함으로써 ES 세포로부터 제조한 EB의 박동성이 유의하게 높아졌으나, 이 박동성 EB에의 박동성 세포가 심근세포인지를 확인하기 위하여 각종 심근 특이적 마커 분자의 유전자 발현, 및 단백질 생산을 검토하였다.

도 3에는 노긴 (+)군, 또는 노긴 (-)군 EB에서의 각종 심근세포 특이적 마커 유전자의 발현을 나타낸다. 도 1의 부유 배양법으로 형성시킨 EB를 시간에 따라 회수하고, RNeasy(Qiagen 사 제품)를 사용하여 전체 RNA를 수득하였다. 이어서, 통상의 방법으로 SUPERSCRIP Ⅱ(Invitrogen 사 제품)를 사용하여 cDNA로부터 역전사를 실시하고, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 심근세포에 특이적인 유전자의 발현을 검출하였다. GATA-4, TEF-1, Tbx-5, MEF-2c, αMHC, MLC-2v,α-심장 액틴, GAPDH 각각의 전사 산물을 검출하기 위해 사용한 프라이머는 다음과 같다.

GATA-4(정방향) 5'-CTGTCATCTC ACTATGGGCA-3'(서열번호 1),

GATA-4(역방향) 5'-CCAAGTCCGA GCAGGAATTT-3'(서열번호 2);

TEF-1(정방향) 5'-AAGACGTCAA GCCCTTTGTG-3'(서열번호 3),

TEF-1(역방향) 5'-AAAGGAGCAC ACTTTGGTGG-3'(서열번호 4);

Tbx-5(정방향) 5'-GGAGCCTGAT TCCAAAGACA-3'(서열번호 5),

Tbx-5(역방향) 5'-TTCAGCCACA GTTCACGTTC-3'(서열번호 6);

MEF-2c(정방향) 5'-AGCAAGAATA CGATGCCATC-3'(서열번호 7),

MEF-2c(역방향) 5'-GAAGGGGTGG TGGTACGGTC-3'(서열번호 8);

αMHC(정방향) 5'-GGAAGAGTGA GCGGCCATCA AGG-3'(서열번호 9),

αMHC(역방향) 5'-CTGCTGGAGA GGTTATTCCT CG-3'(서열번호 10);

MLC-2v(정방향) 5'-GCCAAGAAGC GGATAGAAGG-3'(서열번호 11),

MLC-2v(역방향) 5'-CTGTGGTTCA GGGCTCAGTC-3'(서열번호 12);

α-심장 액틴(정방향) 5'-CTGAGATGTC TCTCTCTCTC TTAG-3' (서열번호 13),

α-심장 액틴(역방향) 5'-ACAATGACTG ATGAGAGATG-3' (서열번호 14);

GAPDH(정방향) 5'-TTCAACGGCA CAGTCAAGG-3' (서열번호 15),

GAPDH(역방향) 5'-CATGGACTGT GGTCATGAG-3' (서열번호 16).

PCR은 내열성 DNA 중합효소인 TaKaRa Taq(타카라 주식회사 제품)를 사용하였고, GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer사 제품)로 수행하였다. 먼저, cDNA를 포함하는 PCR 반응액을 94℃에서 3분간 가열한 후, 94℃:1분 - 55℃:1분 - 72℃:1분의 가열 사이클을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 가열한 다음 4℃로 냉각하였다. PCR 산물을 3%의 폴리아크릴아미드 겔상에 전기영동한 후, SYBR Green I(타카라 주식회사 제품)로 염색하여, Molecular Imager FX(Bio-Rad 사 제 품)로 검출하였다.

그 결과, GATA-4, TEF-1, Tbx-5, MLC-2v 등의 유전자는, 노긴 (-)군 EB에서는 부유 배양 개시 후 5 내지 10일째부터 비교적 약하게 발현되는 것으로 확인되었으며, 노긴 (+)군 EB에서는 부유 배양 개시한 당일(0일)부터 발현이 확인되어, 그 후, 5-15일에 걸쳐 강한 발현이 지속되는 것으로 확인되었다. MEF-2c 또는 심근 특이적 α-엑틴의 발현은, 모든 부유 배양 후 5일째부터 볼 수 있었으나, 발현량은 노긴 (+)군 EB 쪽이 유의하게 강하였다. 또한,αMHC(미오신 중쇄)유전자의 경우, 노긴 (+)군 EB에서는 10, 15일째에 강한 발현이 확인되었으나, 노긴 (-)군 EB에서는 발현을 확인할 수 없었다. 이상의 결과로부터, 노긴 처리에 의해 EB 내의 심근세포의 분화 및 발생이 신속하고 또한 강하게 촉진된다는 것이 밝혀졌다.

또한, 노긴 (+)군 EB에서 발생된 박동성 세포가, 심근세포 특이적 마커 단백질을 생산하고 있음을, 면역조직 화학적 염색법으로 확인하였다. 도 1과 같은 부유 배양법으로 준비한 노긴 (+)군 EB를 부유 배양 후 12일째에 회수하고, 1 mM의 EDTA를 포함하는 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 세포를 분산시켰다. 분산 시킨 세포는 젤라틴으로 코팅된 커버 슬립에 개개의 세포가 서로 접착되지 않을 정도의 낮은 밀도로 접종하고, 분화 배지가 채워진 세포 배양용 시판 플레이트내에서 배양하였다. 다음날, 커버 슬립상의 세포를 4%의 파라포름알데히드 용액으로 고정하고, 1차 항체로서 항근육원섬유마디?미오신 항체(MF20; American Type Culture Collection), 항트로포닌 I 항체(#sc-8120; Santa Cruz Biotechnology 사), 항α-엑티닌 항체(#sc-15335; Santa Cruz 사), 항ANP 항체(#AB5490; Chemicon 사)와 반 응시키고, 또한 Alexa488 표지 2차 항체(Molecular Probes 사)와 차례로 반응시킨 다음, 형광 현미경하에서 관찰하였다.

그 결과, 심근세포에 특이적인 마커 단백질인 근육원섬유마디?미오신, 트로포닌 I,α-엑티닌, ANP의 양성 세포가 다수 확인되어(도 4), ES 세포 유래의 박동성 세포가 심근세포인 것으로 입증되었다.

계속하여, 상기와 같은 면역조직 화학적 염색법을 사용하여 EB 내에서의 심근세포의 분포 및 발생 빈도를 확인하였다. 부유 배양 후 12일째에 회수한 EB를 동결 절편 제작용 포매제(OCT Compound, Sakura Finetek USA Inc.)로 신선한 상태로 포매하고, 액체 질소로 동결하여 제작한 다음, 동결 표본을 크리오스타트(LEICA CM3050-S)로 자른(5 μm) 후, 슬라이드 글라스에 첨부하였다. 이 동결 절편을 상기 심근세포 특이적 마커 항체와 반응시켜, 상기와 같은 방법으로 마커 단백질에 대한 양성 세포를 검출하였다.

그 결과를 도 5에 나타낸다. 노긴 (-)군 EB에서는, 심근세포에 특이적인 마커 단백질에 대한 양성 세포는 EB의 매우 한정된 영역에서만 관찰되었으나, 노긴 (+)군 EB에서는 EB 표층 영역의 거의 전 주변에 걸쳐 심근 마커 양성 세포가 확인되었다. 이러한 결과는, 노긴 (-)군 EB에서의 박동 영역이 EB의 일부에만 한정된데 반해, 노긴 (+)군 EB에서는 EB의 거의 전역에서 박동이 확인된 실시예 1의 관찰 결과와 상당히 일치한다.

(실시예 3: 노긴 처리 시기 및 기간 차이가 심근세포의 분화 유도 효과에 미치는 영향)

노긴 처리의 최적 시기 및 기간을 검토하기 위해, 상기 부유 배양 시스템에서의 노긴 단백질의 첨가 시기를 변경하여 그 후의 심근 분화 유도 효과에 미치는 영향을 검토하였다.

결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

표 1은 부유 배양 개시 전 및 개시 시점의 노긴 자극의 필요성을 각 배양 조건에서의 박동성 EB(EB3 세포 유래)의 출현율로 나타낸다. 표 1에서, "전처리기"는 부유 배양을 개시하는 3일 전부터 당일까지의 배양 조건, "분화 유도 개시기"는 부유 배양을 개시하는 시점의 배양 조건을 나타낸다. 또한, 표 1의 "+"는 배지에 노긴(150 ng/mL)을 첨가한 것, "-"는 첨가하지 않은 것을 나타낸다.

먼저, 부유 배양 전의 노긴 처리의 필요성을 검토하였다. 즉, 실시예 1 및 2의 경우와 마찬가지로, 부유 배양 전 3일간, 노긴 단백질(150 ng/mL)을 포함하는 배지에서 배양힌 ES 세포에서, 또한 부유 배양 개시일(0일째)에 노긴 단백질(150 ng/mL)을 첨가한 ES 세포에서 높은 비율로 박동성 EB가 나타났지만, 부유 배양 전 3일간 노긴 단백질을 포함하지 않는 배지에서 배양한 ES 세포에서는 부유 배양 개시일에 노긴 단백질을 첨가하여도 박동성 EB의 출현율은 현저하게 저하되었다. 그 리고, 부유 배양 전의 마우스 유래의 ES 세포의 배양에는 ES 세포의 미분화를 유지하기 위한 목적으로 배지 중에 첨가된 LIF의 존재도 중요하며, 부유 배양 전에 LIF(2000 U/mL)를 첨가하지 않고 ES 세포를 배양한 경우, 노긴을 처리하더라도 박동성 EB의 출현이 유의하게 감소되었다.

또한, 노긴 단백질(150 ng/mL)을 5일째 이후도 배지내에 존재시킨 경우, 박동성 심근세포의 출현이 현저하게 억제되었다. 또한, 부유 배양 후 7일이상, 계속 존재시킨 경우에서도 박동성 심근세포의 출현이 거의 없었으며, 기존 논문(Gratsch & O'Shea, Dev. Biol. 245: 83, 2002)와 같이 신경세포 모양의 세포 분화 유도가 관찰되었다.

이상의 결과로부터, ES 세포를 심근세포로 효율적으로 분화를 유도하는데에는, 부유 배양 전 및 부유 배양 개시일에 노긴 처리를 실시하는 것이 중요하며, 또한 부유 배양 후에 고농도 노긴 단백질이 계속 잔존하는 것은 반대로 심근세포의 발생을 저해한다는 것이 확인되었다.

(실시예 4: 노긴의 심근 분화 유도 작용에 대한 BMP의 저해 효과)

노긴 처리에 의한 ES 세포의 심근 분화 유도 촉진 효과가, 노긴의 BMP 길항제로서의 활성에 의한 것일 가능성을 확인하기 위해, 노긴 처리와 동시에 BMP-2를 배지에 첨가하여 그 효과를 검토하였다.

실시예 1 및 2에서와 같은 조건으로 부유 배양을 수행하고, 노긴 단백질(150 ng/mL)과 여러 농도의 BMP-2를 공존시켜, 그 영향을 조사하였고, 그 결과는 도 6에 나타낸다. BMP-2는 농도 의존적으로 노긴 처리에 의한 ES 세포의 심근 분화 유도 효과를 저해하였으며, 5 ng/mL 이상의 BMP-2 첨가시 거의 완전하게 박동성 EB는 출현하지 않는 것으로 확인되었다.

(실시예 5: 공급자 세포를 이용한 심근 분화 유도 시스템에서의 노긴 처리 효과)

ES 세포를 배양 플레이트에 미리 접종한 ST2 세포나 OP9 세포 등의 간질 세포계 세포를 공급자 세포(공급자 세포)로서 공배양함으로써, 부유 배양법이나 현적 배양법과 같은 삼차원 배양없이도 심근세포의 분화를 유도할 수 있는 것이 보고된 바 있다(Yamane 등, Methods Mol. Biol. 184: 261, 2002; Schroeder 등, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100: 4018, 2003). 그래서, ST2 세포(이화학 연구소 세포 은행으로부터 구입)를 공급자 세포로서 이용한 분화 유도 시스템에서의 노긴 처리 효과를 검토하였다. ST2 세포는 시판중인 세포 배양용 6웰 플레이트(CORNING 사 제품)에 접종하고, Dulbecco MEM 배지(Invitrogen/GIBCO 사 제품)에 10%의 소태아 혈청(Invitrogen/GIBCO 사 제품)가 첨가된 배지를 사용하여 컨플르엔트 상태로 배양한 것을 공급자 세포로 사용하였다. 상기와 같은 방법으로 단일 세포 상태의 ES 세포의 현탁액을 제조하고, 공급자 세포를 PBS로 2회 세정한 후, 2000 세포/2 mL 배지/1웰로 접종하였다. 그 후, 시간에 따른 박동성 심근세포의 출현을 현미경 관찰하고, 동시에 배양 후 8일째에 일부의 세포를 70% 에탄올 용액으로 고정하고, 1차 항체로서 항근육원섬유마디/미오신 항체(MF20; American Type Culture Collection 사 제품) 및 이후 호르세라디쉬 페록시다제 표지된 2차 항체(히스토파인 심플스테인 PO(M); 니치레이사 제품)와 차례로 반응시킨 다음 마지막으로 ACE(3-amino-9-ethylcarbazole) 기질용액(니치레이사 제품)으로 발색 반응을 실시하여 광학 현미경하에서 관찰하였다.

상기 배양 조건에 있어서, ST2 세포 상에 접종한 ES 세포는 배양 개시 후 수 일 내에 육안으로 관찰할 수 있는 크기의 콜로니를 형성하였고, 배양 후 8 일째에는 심근세포 마커의 일종인 항근육원섬유마디/미오신 항체에 대한 양성(이하, MF20 양성) 세포(콜로니)가 확인되었으며, 그 후 배양 12일째 전후로부터 박동성 심근세포가 출현하였다. 이어, 공배양 3일 전부터 노긴 단백질(150 ng/mL)을 포함하는 배지에서 배양한 ES 세포를 ST2 세포 상에 접종하고, 공배양 개시 후 2일간 노긴(150 ng/mL)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 그 결과를 도 7에 나타낸다. 노긴(-)군 ES 세포를 접종한 경우, 공급자 세포 상에서 형성된 ES 세포 유래의 콜로니 60%가 MF20 양성이었으며, 노긴( +) 군에서는 90% 이상의 콜로니가 양성이었고, 또한 콜로니 중에 MF20 양성 세포가 차지하는 비율도 노긴(-) 군과 비교하여 현저하게 높았다. 또한, 노긴 (+)군에서는 박동성 심근세포도 높은 비율로 출현하여, 노긴(-) 군에서는 공급자 세포 상에서 형성된 ES 세포 유래 콜로니의 30% 정도가 박동한데 반해, 노긴 (+)군에서는 대략 70%의 콜로니에서 박동이 관찰되었다.

(실시예 6: 코르딘 처리에 의한 ES 세포 유래 심근세포의 출현 증강 효과)

노긴과 마찬가지로, BMP 길항제로서의 작용하는 것으로 알려져 있는 코르딘의 심근 유도 효과에 대하여, 노긴의 효과와 비교 및 검토하였다. 코르딘 단백질은 시판중인 재조합형 코르딘-Fc 키메라 단백질(Recombinant Mouse Chordin /Fc Chimera; R&D systems 사)(이하, "코르딘(단백질)"이라 한다)을 사용하였다. 노 긴(500 ng/mL), 또는 코르딘(500 ng/mL)을 첨가한 배지, 또는 상기 2가지 인자 어느 것도 첨가하지 않은 배지에서 3일간 배양한 ES 세포를 사용하여, 실시예 1과 동일한 현적 배양을 수행하였다. 현적 배양 4일째에 EB를 회수한 후, 세포 배양용 접시에 접종하고, 계속해서 부착 배양하여 심근세포로의 분화를 유도하였다. 그 결과, 코르딘 처리한 ES 세포에서는 노긴 처리한 ES 세포와 거의 필적할 정도의 박동성 심근세포가 출현하는 것으로 확인되었으며(도 8), 코르딘은 ES 세포에서 노긴과 동일한 심근 분화 유도 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 다른 EB 형성법/심근 분화 유도법을 사용하여 코르딘의 효과를 검토하였다. 노긴(150 ng/mL) 또는 코르딘(150 ng/mL)을 첨가한 배지 또는 어느 인자도 첨가하지 않은 배지에서 3일간 배양한 ES 세포를, 시판중인 부유 배양용 플레이트(96-웰 멀티 플레이트; 스미토모 베이크 라이트 사 제품)에 접종하여 EB를 형성시켜, 심근세포로의 분화를 유도하였다. 이 때, 코르딘(150 ng/mL) 첨가군과 무첨가군을 설정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 코르딘 처리한 ES 세포(도면에서 C→C)에서 노긴 처리한 ES 세포(도면의 N→N)와 마찬가지로, 매우 분명한 박동성 심근세포의 출현이 확인되었고, 코르딘은 ES 세포에 대해 노긴과 동일한 심근 분화 유도 효과를 나타낸다는 것을 재차 확인할 수 있었다. 또한, EB 형성 전 3일간 코르딘 처리하고, EB 형성 후에는 코르딘을 첨가하지 않은 군(도면의 C→(-)), 및 EB 형성 전 3일간 코르딘을 처리하지 않고 EB 형성 후에 코르딘을 첨가한 군(도면의 (-)→C)에서도, 무첨가군(도면의 (-)→(-))에 비하여 강한 심근 분화 촉진 효과가 확인 되었다. 동일한 효과는, 코르딘 대신 노긴을 사용한 경우에도 볼 수 있으고, 상기 배양 조건에서 EB 형성 전 3일간 노긴을 처리하고 EB 형성 후에는 노긴을 첨가하지 않은 군이나, 이와는 반대로 EB 형성 전에는 노긴을 처리하지 않고 EB 형성 후에 노긴을 첨가한 군에서도, 노긴 미처리 군보다 명백히 강한 심근 분화 촉진 효과가 있는 것으로 확인되었다.

다음으로, 인간 세포에 대한 노긴 및 코르딘 처리의 유효성을 검토하기 위하여, ES 세포의 유사 세포인 배아 종양 세포(Embryonal carcinoma cells; 이하, EC 세포라 함)를 사용하였다. 인간 EC 세포주인 NCCIT 세포(American Type Culture Collection에서 구입)를, 상기 마우스 ES 세포를 사용한 경우와 동일하게 노긴(15 ng/mL), 또는 코르딘(15 ng/mL)을 첨가한 배지나 또는 어느 인자도 첨가하지 않은 배지에서 3일간 배양하였다. 그 후, 시판중인 부유 배양용 플레이트에 접종하여 EB로 형성시키고, 14일간 배양하였다. 이 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 심근세포 특이 마커의 유전자 발현 또는 단백질 생산을 PCR 방법 또는 면역조직 화학적 염색법으로 확인하였다. 그 결과, 노긴 또는 코르딘 처리한 NCCIT 세포에서는 심근 마커의 하나인 미오신의 발현 및 생산 유도가 확인되었다.

(실시예 7: 다른 BMP 길항제 처리에 의한 ES 세포로부터 유래된 심근세포의 출현 증강 효과)

BMP 길항제 처리에 의한, 폴리스타틴, DAN, 카론트(Caronte; 닭의 세르베러스 유사 인자), 그렘린의 4종의 BMP 길항제(모두 R&D systems 사 제품의 Fc 키메라형 재조합형 단백질을 사용)의 효과를 검토하였다. 상기 각종 BMP 길항제(150 ng/mL)를 첨가한 배지나 또는 BMP 길항제를 첨가하지 않은 배지에서 3일간 배양한 ES 세포를, 시판중인 부유 배양용 플레이트(96웰 멀티 플레이트; 스미토모베이크 라이트 사 제품)에 접종하여 EB로 형성시키고, 심근세포로의 분화를 유도하였다.

그 결과, 상기 인자들 모두 노긴 및 코르딘과 동일하거나 또는 그 이상으로 강한 심근 분화 유도 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 또한, BMP 리셉터 1A의 세포 외 영역에 해당되며, BMP계 분자와 내인성 리셉터의 결합을 경쟁적으로 저해하는 재조합 단백질(Recombinant Mouse BMPR-1 A/Fc Chimera; R&D systems사)을 첨가한 경우도, 거의 동일한 촉진 효과가 나타났다.