本发明宽泛的概述为涉及将分化的灵长类体细胞重编程为多潜能细胞，具体说是iPS细胞的方法。本文所用“iPS细胞”指与其各自来源的分化体细胞在遗传学上基本相同并表现出与更高潜能细胞如本文所述ES细胞特征相似的细胞。可从多种分化(即非多潜能和多能)体细胞获得这种细胞。
iPS细胞表现出与ES细胞类似的形态(即圆形、大核仁并少细胞质)以及生长特性(即倍增时间；ES细胞的倍增时间约为17～18小时)。此外，iPS细胞表达多潜能细胞特异性标记物(如Qct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81，但是没有SSEA-1)。然而iPS细胞并不直接源于胚胎，并且至少到该细胞变成多潜能细胞，它能瞬时或稳定表达一个或多个拷贝的所选潜能决定因子。如本文所用术语“不直接源于胚胎”指产生iPS细胞的起始细胞类型是非多潜能细胞，例如多能细胞或终末分化细胞，如获自出生后个体的体细胞。
如本文所述方法，可将至少两种潜能决定因子引入分化体细胞并表达，于是在培养物中将体细胞转化为具有多潜能细胞如ES细胞特征(即表达至少Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60或TRA-1-81，但不表达SSEA-1，表现出具有高核质比和明显核仁的致密集落)、能分化为所有三胚层的特征性细胞并具有出生后个体体细胞的遗传互补性的细胞。除了引入编码潜能决定因子的遗传材料，重编程(即转化)细胞与其起源的体细胞在遗传上基本相同。
如本文所用“潜能决定因子”指用于增加体细胞潜能，使体细胞变成多潜能性的因子，如基因或其它核酸、或其功能片段以及编码因子或其功能性片段。任选地，潜能决定因子可在重编程细胞中仅仅瞬时出现或在重编程细胞的基因组中维持转录激活或失活状态。同样，在重编程细胞中可出现不止一个拷贝的潜能决定因子，其中潜能决定因子可整合入细胞基因组或在染色体外或出现在两处。潜能决定因子包括但不限于Stella(SEQ ID NO：1)、POU5F1(Oct-4；SEQID NO：2)、Sox2(SEQ ID NO：3)、FoxD3、UTF1、Rex1、ZNF206、Sox15、Mybl2、Lir28(SEQ ID NO：4)、Nanog(SEQ ID NO：5)、DPPA2、ESG1、Otx2及其子集。在一些实施方式中，少至两种潜能决定因子如Oct-4和Sox2就足够。然而可通过加入其它潜能决定因子如Lin28、Nanog或两者提高获得重编程细胞的效率。
在第一个方面，本发明涉及从出生后个体，特指活体但任选死亡个体中获得的可补充的、富集的多潜能细胞群。富集细胞群中的细胞表达至少一种细胞类型特异性标记物，包括但不限于Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81或其组合，并具有多潜能细胞如ES细胞的其它特点。此外，多潜能细胞可表达碱性磷酸酶(ALP)。此外，多潜能细胞的基因组与来自个体的预先存在的分化细胞的基因组在遗传上基本相同。同样，多潜能细胞可具有编码至少一种潜能决定因子的基因组，其在重编程后提有转录活性或无转录活性。此外，潜能决定因子可为重编程序列的形式，其中编码潜能决定因子的多核苷酸可操作地连接于异源启动子。如本文所用“异源启动子”指可操作地连接于通常该启动子不启动转录的多核苷酸的启动子。
在第二方面，本发明涉及鉴定将体细胞重编程为多潜能细胞所需潜能决定因子的方法和组合物。
除非另有定义，本文所用所有科技术语具有本发明所属领域一般技术人员通常所理解的意思。尽管下文描述了实践或检测本发明的合适方法和材料，但也可使用其它本领域所熟知的相似或等同的方法和材料。
联系下文说明书详述及附图时，能更明显看出本发明的其它目的、优势和特点。
附图简述
图1显示人Oct4启动子下游的一个位点，可将敲入构建物引入该位点。在含有敲入构建物的细胞中，当Oct4启动子有活性时，表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)和新霉素磷酸转移酶(NEO)。可使用这些细胞评价哪种因子可将体细胞重编程为多潜能细胞。
图2A-B显示人H1 ES细胞的分化。图2A是从人ES细胞中衍生并纯化骨髓前体细胞的图解。图2B显示Percoll分离后所获分化细胞的表型分析。灰色线：同种型对照；黑色线：抗体染色。缩略词：hESC，人胚胎干细胞；MPO，髓过氧化物酶；pHEMA，聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯。
图3显示含图1敲入构建物的Oct区域。
图4A-C显示体细胞的慢病毒转导。图4A显示了慢病毒构建物的示意图。图4B显示以不同MOI用EGFP慢病毒表达载体转导Percoll纯化细胞。在转导后三天(未进行药物筛选)，用流式细胞术分析EGFP表达。图4C显示在基质胶上继续培养数天后用慢病毒转导Percoll纯化细胞。在慢病毒转导后两天分析EGFP表达。
图5显示在基质胶上分化7天后细胞中转基因的过表达。在过表达Nanog或EGFP(对照)的细胞中未观察到显著的形态学变化。Oct4表达细胞的形态发生显著变化，许多这类细胞在新霉素筛选中存活，但这类细胞均不显示典型的人ES细胞形态，表明表达Oct4的ES细胞的药物可选择群体未能渡过骨髓分化所需的培养期。
图6A-B显示通过引入14种潜能决定因子使Oct4KICD45+A细胞重编程。图6A显示建立的克隆，表现出未分化人ES细胞形态并在内源性Oct4启动子的作用下表达EGFP。图6B显示在建立克隆中人ES细胞特异性细胞表面抗原表达的流式细胞术分析。灰色线：同种型对照；黑色线：抗体染色。
图7A-C显示以引入不同潜能决定因子集合后的集落形成表示的重编程效率。图7A显示将标明的14种潜能决定因子的集合以组合形式引入细胞，其中每一组合不包括14种因子中的一种。通过评价潜能决定因子将受试细胞重编程为ES样状态的能力，发明人确定被排除的潜能决定因子是否是重编程所必需。例如，缺少Oct-4的名为M1的潜能决定因子集合(记为M1-Oct-4)不能形成显著数目的ES样集落。因此结论是Oct-4对于体细胞重编程很重要。图7B显示为进一步测试评价的潜能决定因子集合(比图7A范围小)范围从14种缩小到4种(M4，为Oct-4、Sox2、Lin28和Nanog)。通过依次从组合中排除四种中的一种测试这四种潜能决定因子。当三种潜能决定因子组合(如M4-Oct-4)无法重编程受试细胞形成显著数目的ES样克隆，发明人得出略去的基因对于体细胞重编程很重要的结论。在图7B中，浅灰色柱表示最小分化大克隆的数目。图7C显示为进一步测试评价的潜能决定因子集合(比图7B范围缩小)范围从4种缩小到2种(即Oct-4和Sox2)。通过依次从组合中排除Oct-4、Sox2、Lin28和Nanog中的两种测试这四种潜能决定因子。
图8A-B显示成年人皮肤成纤维细胞重编程。图8A显示成年人皮肤细胞(p5)(左)以及重编程细胞(右)的明视场图像。图8B显示成年人皮肤细胞(p5)(下)和重编程细胞(上)中人ES细胞特异性标记物的流式细胞术分析。灰色线：同种型对照；黑色线：抗体染色。
图9A-B显示Oct4和Sox2的相对表达对于重编程的影响。图9A显示293FT细胞中Oct-4和Sox 2的Western印迹分析；泳道1，pSin4-EF2-Oct4-IRES1-Sox2(OS-IRES1)；泳道2，pSin4-EF2-Oct4-IRES2-Sox2(OS-IRES2)；泳道3，pSin4-EF2-Oct4-F2A-Sox2(OS-F2A)；泳道4，pSin4-EF2-Oct4-IRES1-puro(O)；泳道5，pSin4-EF2-Sox2-IRES1-puro(S)；泳道6，无质粒(对照)。图9B显示使用连接的(linked)潜能决定因子使衍生自敲入OCT4的人ES细胞的间充质细胞重编程；基因组合与图9A相同，另外还有pSin4-EF2-Nanog-IRES 1-puro(N)和pSin4-EF2-Lin28-IRES I-puro(L)。
优选实施方式详述
本发明假设灵长类ES细胞中的潜能决定因子在维持多潜能性中扮有重要角色，并且通过表达潜能决定因子可使分化的体细胞重编程为多潜能状态。
分化过程中细胞经历不同的潜能水平，如全能、多潜能和多能。本文尤感兴趣的是多潜能细胞。如本文所用“多潜能细胞”指能分化成所有三胚层(如内胚层、中胚层和外胚层)的细胞群体。多潜能细胞表达多种多潜能细胞特异性标记物，并具有以未分化细胞为特征的形态(即致密集落、高核质比以及明显核仁)，在引入免疫缺陷型动物如SCID小鼠上能形成畸胎瘤。畸胎瘤通常含有具有三胚层特征的细胞或组织。本领域一般技术人员能使用本领域常用技术评定这些特征。参见Thomson等，同上。多潜能细胞既能在细胞培养中增殖，也能分化为表现多能特性的多种种系限制细胞群。多能体细胞相对于多潜能细胞进一步分化，但并非终末分化。因此多潜能细胞比多能细胞具有更高的潜能。如本文所用“重编程多潜能灵长类干细胞”(以及相似表述)指体细胞重编程方法的多潜能产物。此类细胞可用于目前考虑使用人ES细胞的研究和治疗应用中。
本发明广泛涉及将分化体细胞重编程为具有更高潜能的细胞如多潜能细胞的新方法，这些方法通过将至少两种潜能决定因子给予体细胞，而在重编程细胞中得到比体细胞水平更高的潜能。本发明可方便从体细胞中产生多潜能细胞，如iPS细胞，而无需加入用于将潜能决定因子引入体细胞的细胞表面受体。如本文所用“重编程”指一种遗传学过程，其将分化体细胞转化为去分化的多潜能细胞，因此比其起源的细胞具有更高的潜能。即重编程细胞表达至少一种下列多潜能细胞特异性标记物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60或TRA 1-81。重编程细胞优选表达所有这些标记物。
能重编程体细胞的潜能决定因子包括但不限于：Oct-4、Sox2、FoxD3、UTF1、Stella、Rex1、ZNF206、Sox15、Mybl2、Lin28、Nanog、DPPA2、ESG1、Otx2或其组合。在实施例中，含有14种因子中少至2种的集合就足以重编程受试细胞；该集合包括Oct-4和Sox2。然而除Oct-4和Sox2外加入其它潜能决定因子能提高获得重编程细胞的效率。然而，c-Myc和Klf4不是必需的潜能决定因子。潜能决定因子优选为转录因子。
任意体细胞均可为合适的体细胞，虽然当起始体细胞倍增时间约为24小时时，观察到更高的重编程频率。用于本发明的体细胞是获自胎儿、新生儿、青少年或成年灵长动物包括人的非胚胎细胞。可用于本文所述方法的体细胞的例子包括但不限于骨髓细胞、上皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肠细胞、间充质细胞、骨髓前体细胞和脾细胞。体细胞的另一类型是贴于基板的CD29+CD44+CD166+CD105+CD73+和CD31-间充质细胞。此外，体细胞可为能自我增殖并分化为其它类型细胞的细胞，包括血液干细胞、肌肉/骨骼干细胞、脑干细胞和肝脏干细胞。多能造血细胞、合适的骨髓前体或间充质细胞特别适用于本发明方法。
同样，合适的体细胞可接受，或使用科学文献中通常所知的方法使其可接受以摄取潜能决定因子，包括编码这些因子的遗传材料。摄取增强方法根据细胞类型和表达系统有所不同。本领域了解制备具有合适转导效率的接受性体细胞所用的示例性条件，并在下文实施例中进行描述。下文描述的一种使细胞接受潜能决定因子的方法与电穿孔方法有关。
可将潜能决定因子作为重编程序列引入，其中潜能决定因子的编码多核苷酸序列可操作地连接于异源启动子，该序列可能在体细胞重编程后无活性。异源性启动子为在体细胞中驱动潜能决定因子编码多核苷酸序列表达的任何启动子序列，如Oct4启动子。
可调整潜能决定因子的相对比例以提高重编程效率。例如，与向细胞提供独立的构建物和载体形式的潜能决定因子的重编程效率(这时无法控制每个潜能决定因子进入单一细胞的摄取比例)相比，将Oct-4和Sox2以1∶1比例连接在单一载体上使细胞的重编程效率提高四倍(图9A-B)。尽管根据所用潜能决定因子集合的不同，潜能决定因子的比例可能不同，但掌握本公开内容的一般技术人员易于决定潜能决定因子的最优比例。
可在任意支持多潜能细胞生长的培养基中培养多潜能细胞。典型的培养基包括但不限于成分确定的培养基，如TeSRTM(加拿大温哥华，干细胞技术公司)(StemCell Technologies，Inc.；Vancouver，Canada)、mTeSRTM(干细胞技术公司)和无血清培养基(密苏里州圣路易斯，西格玛公司)(Sigma；St.Louis，MO)，以及条件培养基，如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基。如本文所用“成分确定的培养基”指仅含生化明确组分的生化明确的制剂。成分确定的培养基也仅包括具有已知化学组成的组分。成分确定的培养基还可包含源于已知来源的组分。如本文所用“条件培养基”指还补充有来自培养基中培养细胞的可溶性因子的生长培养基。此外，细胞可维持于培养基中的MEF上。
发明人使用基因表达连续分析(SAGE)文库获取ES细胞中富集基因的转录组概况。具体说，使用SAGE文库鉴定调节ES细胞多能性和自我更新的潜能决定因子。SAGE文库为本领域一般技术人员所知，可从公开渠道获得或可由某些公司，如马萨诸塞州贝弗利的安进科生物科技公司(Agencourt Bioscience Corp.，Beverly，MA)具体构建。
另一方面，本发明提供了遗传学上与出生后个体细胞基本一致的多潜能细胞的富集群体，。可通过将分离自出生后个体的体细胞重编程获得这种细胞。在一些实施方式中，细胞群是纯化的群体，占群体细胞的至少60％、70％、80％甚至多于95％，或介于其间的任意和所有整数或分数。重编程细胞是整倍体，表现出多潜能细胞的形态学特征并表达多潜能细胞特异性标记物，如Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81或其组合，并在引入免疫缺陷动物时形成畸胎瘤。
另一方面还提供了鉴定并使用足以将体细胞重编程为多潜能细胞的潜能决定因子的方法和组合物。如本文所注明的，重编程的多潜能细胞包含与获自出生后个体的体细胞在遗传学上基本相同的遗传补充物。通常，鉴定潜能决定因子的方法包括以下步骤：将编码一种或多种推定的潜能决定因子的遗传材料引入体细胞，该体细胞能在有效表达引入遗传材料编码因子的条件下接受摄取遗传材料，其表达水平足以将该细胞重编程为低分化、高潜能状态；以及在引入遗传材料后观察多潜能细胞群体。多潜能细胞可通过细胞形态、多潜能细胞特异性标记物或两者进行表征。多潜能细胞可方便地通过细胞中提供的标记物在处理细胞中的表达进行鉴定，以便仅当将细胞重编程为多潜能状态时才表达。通过这个方法可鉴定能将体细胞重编程为多潜能细胞的潜能决定因子，如下面实施例所述。
使用载体如整合或非整合载体通过转染或转导将编码潜能决定因子的遗传材料引入体细胞。本文尤感兴趣的是逆转录病毒载体。在接触细胞前将载体包装到病毒体中，以便转导逆转录病毒载体，尤其是慢病毒载体。在引入后，编码潜能决定因子的DNA片段可位于染色体外(如附加型质粒)或稳定整合入细胞的染色体。
基于病毒的基因转移和表达载体是一种遗传构建物，该构建物能够体外或体内高效和强效地将遗传材料递送到多数细胞类型中，包括非分裂以及难转染细胞(原代、血液、干细胞)。整合入基因组DNA的基于病毒的构建物引起高水平表达。除了编码感兴趣潜能决定因子的DNA片段，载体还包含分别可操作地连接于DNA片段上游和下游的转录启动子和多聚腺苷酸化信号。该载体可包含编码单一潜能决定因子的单一DNA片段，或编码多种潜能决定因子的DNA片段。可将多种载体引入单个体细胞。该载体可任选编码用于鉴定摄取并表达该载体的细胞的选择性标记物。如，当载体使细胞具有抗生素抗性时，可在培养基中加入抗生素以鉴定成功引入载体的细胞。如在实施例中，可使用整合载体以验证概念。逆转录病毒(如慢病毒)载体是整合载体；然而也可以使用非整合载体。根据需要，此类载体在重编程后可通过稀释从细胞中丢失。EB病毒(EBV)是一种合适的非整合载体。Ren C等，Acta.Biochim.Biophys.Sin.37：68-73(2005)；和Ren C等，Stem Cells 24：1338-1347(2006)，通过引用每一文献的全文纳入本文。
使用本领域公认的技术可构建并工程改造本文所述载体，以增加其用于治疗的安全性以及使其包含合适的表达元件和治疗基因。本领域一般技术人员了解适用于本发明的构建表达载体的标准技术，并能参考如Sambrook J等，“分子克隆：实验室手册”(第三版)，纽约冷泉港市冷泉港出版社，2001(″Molecular cloning：a laboratory manual，″(3rd ed.Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.2001)，通过引用将其全文纳入本文。
在体细胞中提供处于仅在体细胞转化为多潜能状态后有活性的启动子控制下的非致死性标记物有利于鉴定和富集多潜能细胞的能力，这些标记物包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(EGFP)或萤光素酶。通过可见细胞选择技术，如荧光细胞分选技术，使用选择性标记物基因鉴定表达该标记物的重编程细胞。此外，可生产不含选择性标记物的重编程细胞。在下面的实施例中，在体细胞的基因组中调节Oct-4表达的启动子下游提供了一个标记物。在未分化的多潜能ES细胞中内源性的Oct4启动子有活性。表达Oct-4的药物选择性ES细胞群未能渡过骨髓细胞分化所需的培养时期。但是，因为一些Oct-4表达能够持续至早期分化阶段，所以适合通过选择具有特征性ES细胞形态的集落并在ES细胞维持培养条件下维持以富集多潜能细胞群。并无意于使重编程细胞培养物中所有细胞均具有所需潜能水平。考虑到细胞分选技术的效率低下，以及基因表达水平和其它生物学效应的不同，富集群体里面的一些细胞并非多潜能性细胞。然而，在实践水平上，来源于体细胞的重编程细胞群中富含多潜能细胞。
利用本领域公认的多种技术，如通过Cre-介导的定点基因剪切移除，可构建非致死性标记物使其能够后续移除。例如，也许需要在获得多潜能细胞群后删除标记物基因以避免标记物基因产物对细胞实验或操作的干扰。靶向删除可通过在标记物基因附近提供易于剪切的结构完成。即可使用Cre/Lox遗传元件。可将Lox位点构建到细胞中。如果需要从多潜能细胞中移除标记物，可在细胞中加入Cre试剂。也可使用其它相似体系。因为Cre/Lox剪切可引入不需要的染色体重排并可能在剪切后留下残余遗传材料，发明人意识到需使用非整合的附加型基因载体将潜能决定因子引入体细胞中，并获得在随后撤去重编程步骤中用于维持载体的药物选择后附加型载体会丢失(如以每代5％的速度)的细胞。
提供下列实施例以便进一步非限制性地说明鉴定将体细胞转化为多潜能细胞的潜能决定基因或因子的方法。在一些实施例中，敲入H1 Oct4的人ES细胞在与基质细胞共培养时分化并产生合适用作可重编程的体细胞的细胞。这些细胞作为分离自出生后个体的细胞的模型用于体细胞重编程方法。
用其它分化的细胞类型重复这些方法。一种细胞类型是人胚肺成纤维细胞IMR-90。参见Nichols W等，Science 196：60-63(1977)，通过引用全文纳入本文。ENCODE协会(ENCODE Consortium)已对IMR-90细胞进行详细表征，该细胞可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC；弗吉尼亚洲马纳萨斯(Manassas，VA)；目录号CCL-186)，并具有公开DNA指纹可用于独立确认重编程克隆的起源。此外，这些细胞在伊格尔极限必需培养基(Eagle′s Minimal Essential Medium)-10％FBS中生长旺盛，在衰老前可进行多于20次传代，但在人ES细胞培养条件下生长缓慢，这种差异为重编程克隆提供了增殖优势并有助于仅通过形态学标准进行选择。其它适用于本方法的分化细胞类型包括人出生后包皮成纤维细胞(ATCC；目录号CRL-2097)和成年人皮肤细胞(ATCC；目录号CRL-2106)。
使细胞接受下述病毒表达系统的转导。用被认为与多潜能性相关的潜能决定因子的编码多核苷酸转导体细胞，从而将体细胞重编程为多潜能细胞。尚未测定在转导载体中提供的所有14种潜能决定因子是否均被摄取并在体细胞中表达。本发明已鉴定足以重编程体细胞的14种潜能决定因子的集合以及这14种因子中至少2种的子集后，本发明使本领域一般技术人员具有鉴定也能够进行体细胞重编程的潜能决定因子的一种或多种特定子集的能力，从而利于鉴定此类潜能决定因子的其它子集。因此，下文所述方法利于鉴定参与体细胞重编程为多潜能细胞的潜能决定因子。
可明确预知足以重编程体细胞的潜能决定因子集合根据体细胞类型有所不同。值得注意的是，接触14种潜能决定因子的集合导致在所示体细胞培养物中转变成多潜能状态。如下所示，可通过利用不同潜能决定因子的组合重复下文所示方法来鉴定足以对其它细胞重编程的潜能决定因子集合，可包含14种因子种的一些或全部以及其它潜能决定因子。因此，可产生与已存在的分化体细胞遗传学基本相同的多潜能细胞系/群。
实施例
在下列实施例中，分化细胞接收编码不同潜能决定因子的载体。一些细胞的基因组中含有编码EGFP的标记物基因，其位于受调节的Oct4启动子下游，其只在在多潜能细胞中有活性。Yu等，同上描述了这种有用工具的产生，表明将分化细胞和人ES细胞融合可使分化细胞具有多潜能性。
实施例1：慢病毒载体的包装和产生
在293FT细胞系(英杰公司(Invitrogen))中产生表达转基因的慢病毒载体。293T是一种源于转化的293胚肾细胞的快速生长易于转染的克隆变体，它包含大T抗原用于高水平表达包装蛋白，得到更高的病毒滴度。对于日常维持和扩增，将这些细胞培养于含500μg/ml遗传霉素的293FT培养基中(DMEM/10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和0.1mM MEM非必需氨基酸)。包装时，通过胰酶消化收集293FT细胞。离心去除胰酶后，将这些细胞分装于装有不含遗传霉素的293FT培养基的T75培养瓶中(15x106个细胞/瓶，每一构建物6瓶)。
在细胞分装后立即使用转染试剂(凯杰公司)(Qiagen)进行慢病毒载体和两种辅助质粒的共转染(每瓶中慢病毒：MD.G：pCMVdeltaR8.9：混合于400μl Iscove改良的Dulbecco培养基中(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)(IMDM)(1X)，室温下孵育10分钟)。第二天用含1mM丙酮酸钠的新鲜293FT培养基替换含有转染混合物的培养基(8毫升/瓶)。转导后约48-72小时收集含慢病毒的上清液(每一构建物～48ml)。4℃3000rpm(1750g)离心15分钟去除上清中的293FT细胞碎片。为了浓缩慢病毒，用0.4μM醋酸纤维素(CA)膜过滤上清液(康宁顿公司(Cornington)，115ml低蛋白结合)，并且在70ml无菌瓶(贝克曼公司(Beckman)，货号355622，聚碳酸酯，仅用于45Ti转头)中，4℃33,000rpm(50,000g)超速离心2.5小时。慢病毒及剩余细胞碎片在离心管底部形成可见团块。去除上清后，加入PBS(每一构建物～300μl)在4℃振荡离心管8-12小时，或在室温下振荡2小时以重悬团块。5000rpm(2700g)离心5分钟去除剩余细胞碎片，将重悬的慢病毒分装并储存于-80℃。浓缩后获得的滴度范围通常是107-108病毒颗粒(vp)/ml。序列表中提供了含有Stella(SEQ IDNO：1)的慢病毒序列(pSIN4-EF2-Stella-puro；SEQ ID NO：6，含有Stella序列3604-4083)。所有其它潜能决定因子(如SEQ ID NO：2-5)使用相同序列，但用其它潜能决定因子序列替代Stella序列(SEQ ID NO：1)。
为了有效地将潜能决定因子引入骨髓细胞，发明人改造了慢病毒表达系统(图4A)。发明人通过连续删除分析去除5′和3′LTR相邻序列，降低了原始慢病毒构建物(＞11kb)的大小。这些改造尽量减少了对于包装效率的负面影响。常规获得的滴度范围在105-106vp/ml上清，浓缩后为107-108vp/ml(通过超速离心)。在骨架中引入限制性位点以便于交换特定转基因的编码区。
实施例2：慢病毒转导和潜能决定因子表达后重编程骨髓前体细胞
为了鉴定能使分化细胞重编程回到多潜能状态的基因，需要有效的细胞转导。首先，发明人在纯化敲入H1 Oct4的人ES细胞后立即检测慢病毒转导效率(图2)。
将H1.1人ES细胞(WiCell研究所，威斯康星麦迪逊；WiCell ResearchInstitute；Madison，WI)维持于DEME/F12培养基中经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，所述DEME/F12培养基含80％Dulbecco改良的伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)(无丙酮酸盐，高葡萄糖配方；英杰公司；加州卡尔斯巴德(Invitrogen；Carlsbad，CA))、20％敲除血清替代物、1％非必需氨基酸(吉布科公司)(Gibco)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇(西格玛公司)(Sigma)以及4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(除非另有所述，所有试剂来自于英杰公司)，如前所述(参见Amit等，Dev Biol.227：271-278(2000)；Thomson等，Science 282：1145-1147(1998)，通过引用将每一参考文献全文纳入本文)。如Ludwig等所述在基质(BD生物科学公司，马萨诸塞贝尔福德)(BD Biosciences，Bedford，MA)上用化学成分确定的TeSRTM培养基(干细胞技术公司)(StemCell Technologies，Inc.)进行无饲细胞培养。Ludwig T等Nat.Methods.3：637-646(2006)；Ludwig T等，Nat.Biotechnol.24：185-187(2006)，通过引用将每一参考文献全文纳入本文。
根据Zwaka和Thomson所述的方法，从H1.1人ES细胞产生敲入H1Oct4的ES细胞系。美国专利公开号2006/0128018以及Zwaka T和ThomsonJ，Nat.Biotechnol.21：319-321(2003)，通过引用将每一参考文献全文纳入本文。简要说，通过在人Oct-4(八聚体结合转录因子4)基因的第5个外显子的3’非翻译区(也称作POU结构域第五类转录因子1(POU5F1))中插入盒、IRES-EGFP、IRES-NEO和猴病毒多聚腺苷酸化序列(约3.2千碱基(kb))构建基因靶向载体。该盒在5’方向上侧接于6.3kb同源臂，在3’区侧接于1.6kb(在另一靶向载体中为6.5kb)同源臂(图1)。在Oct-4基因(SEQ ID NO：2)的31392位上插入该盒。长臂含有25054-31392的序列。短臂含有31392-32970的序列。在另一靶向载体中，短臂被一较长同源区域取代(基因登录号AC006047中的31392-32970以及AC004195中的2387-7337)。通过长距离基因组PCR和亚克隆获得等基因同源DNA。将所有基因组片段和盒克隆入克隆载体SK II(GenBank登录号X52328；加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))的多克隆位点(MCS)中。
对于电穿孔，用胶原酶IV(1mg/ml，英杰公司)37℃作用细胞7分钟，用培养基洗涤并重悬于0.5ml培养基中(1.5-3.0x107细胞)，以收集细胞。为了准备电穿孔的细胞，将细胞加入含有40mg线状靶向载体DNA的0.3ml磷酸盐缓冲盐水中(PBS；英杰公司)。然后在室温下用伯乐基因脉冲器II(0.4cm裂隙杯)中使细胞暴露于单个320V，200μF脉冲。在室温下孵育细胞10分钟并在基质上高密度铺板。在电穿孔后48小时开始G418选择(50mg/ml；英杰公司)。一周后，将G418浓度加倍。三周后，通过PCR单独分析存活集落，其中分别使用NEO盒的特异性引物以及3′同源区下游的POU5F1基因的特异性引物。使用BamHI消化DNA以及靶构建物之外的探针通过Southern印迹分析复筛PCR阳性克隆。
敲入H1 Oct4的ES细胞系使用双内部核糖体进入位点(IRES)从内源性Oct4启动子/调节区域表达EGFP和新霉素磷酸转移酶(neo)(图3)。敲入H1Oct4的ES细胞中EGFP和neo的表达表明具有活性的内源性Oct4启动子/调节区域。
在维持过程中，敲入H1 Oct4的ES细胞与小鼠OP9骨髓基质细胞在明胶包被的10cm塑料培养皿(BD生物科学公司)上共培养(图2A)，培养皿中包含含有20％非热灭活胎牛血清(FBS；海克隆实验室公司，尤他州罗根市)(HyClone Laboratories；Logan，UT)的DMEM培养基(英杰公司)(10毫升/皿)。OP9培养物每四天以1∶7比例传代。当用于人ES细胞分化时，当第四天OP9细胞达到汇合时，换掉一半培养基，将细胞再培养四天。
对于重编程，敲入H1Oct4的ES细胞分化为贴壁细胞(即CD29+CD44+CD166+CD105+CD73+CD31-)。简要说，将敲入H1 Oct4的人ES细胞(p76-110)加入OP9单层(1.5x106/10-cm皿)，该皿包含20ml DMEM培养基，其中补充有10％FBS(海克隆实验室公司)和100μM硫代甘油(MTG；西格玛公司，密苏里州圣路易斯)(Sigma；St.Louis，MO)。将人ES/OP9细胞共培养物孵育9天，在第4、6、8天换掉一半培养基。孵育后，用胶原酶IV(1mg/ml，用DMEM培养基配制，英杰公司)37℃处理20分钟，然后用胰酶(0.05％胰酶/0.5mM EDTA，英杰公司)37℃处理15分钟将共培养物分散为单细胞。用培养基洗涤细胞两次并以2x106/ml的密度重悬于添加10％FBS、100μM MTG和100ng/ml GM-CSF(Leukine；波来克斯实验室公司)(Berlex Laboratories Inc.)加州理士满市(Richmond，CA)的DMEM培养基中。然后将细胞培养于包被有聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯(pHEMA；西格玛公司)的培养瓶中10天，每三天换掉一半培养基。在防贴壁的pHEMA培养中，一般情况下贴壁的细胞则形成悬浮聚集体，而感兴趣的细胞则在悬液中以单个细胞存在。大细胞聚集体通过100μM细胞滤网(BD生物科学公司)滤除，而小聚集体和死细胞则通过25％(西格玛公司)离心去除。从表达CD33、MPO、CD11b和CD11c分子的细胞团块中回收分化细胞，表达CD33、MPO、CD11b和CD11c分子是骨髓细胞的特征(图2B)。发明人通常从1x106H1 ES细胞(敲入H1 Oct4的人ES细胞)中产生6-10x106分化细胞。参见Yu J等，Science 318：1917-1920(2007)，包括Science万维网网站上的补充材料，通过引用将其整体纳入本文。
在加入聚凝胺载体至终浓度6μg/ml(西格玛公司)后，将编码潜能决定因子的慢病毒(MOI：3-10)加入到细胞培养物中。第二天将含慢病毒培养基换为新鲜培养基，在合适培养基中继续培养细胞。根据需要在转导后第三天开始药物选择。如图5B所示，转导效率很低(在MOI 10时～18.4％)。此外，EGFP的表达也仅仅略高于背景。用常规质粒或基于EB病毒核抗原(EBNA)的质粒转染得到相似的结果(数据未显示)。
另一方面，根据下列方法制备高转导效率的细胞：如上所述，在基质上GM-CSF存在下再培养7天可使纯化的敲入H1 Oct4的ES细胞分化为间充质样细胞。培养期间很多细胞贴附在平板上。贴壁的细胞(下文作称作Oct4KICD45+A细胞，或简称为CD45+A细胞)显示更高的转导效率(图4C)，并用于该重编程实验。虽然实验时细胞并非CD45+，但这些细胞获自CD45+细胞。如本文它处所述，贴壁细胞上表面标记物的特征是CD29+、CD44+、CD166+、CD105+、CD73+和CD31-。
发明人检验了关于通过在细胞Oct4KICD45+A细胞中表达潜能决定因子，可将分化细胞重编程为多潜能状态的假说(图3)并获得了有希望的结果。因为Nanog和Oct-4是最充分表征的潜能决定因子，所以发明人检测了它们在细胞中过表达的效应。
首先用胰酶消化Oct4KICD45+A细胞使其分散为单个细胞并在TeSRTM培养基中以～105细胞/孔的密度重新铺板于6孔板中的基质上。第二天转导表达转基因的慢病毒。表达Nanog的Oct4KICD45+A细胞与转染EGFP的细胞表现出相似的形态(图5)。然而过表达Nanog显著增强了Oct4KICD45+A细胞的增殖，这与人ES细胞中观察到的类似。在用新霉素选择有活性的内源性Oct4启动子/调节区域后，Nanog或EGFP转染的细胞无法存活。重要的是，这些结果表明药物可选择的表达Oct-4的ES细胞群未能渡过分化所需的培养时间。Oct-4的表达引起明显的形态变化(图5)，许多这类细胞在新霉素选择中存活。但这些细胞中没有表现出人ES细胞的典型形态。共表达Nanog和Oct-4的Oct4KICD45+A细胞显示出与仅表达Oct-4的细胞相似的形态变化。因此，看起来仅仅这两个关键的潜能决定因子Nanog和Oct-4不足以将分化细胞转变成具有多潜能性。
在体细胞接触因子之前或之后用细胞分选方法对细胞进行分析。用胰酶(0.05％胰酶/0.5mM EDTA，英杰公司)处理贴壁细胞使之分散为单个个体，室温下在2％多聚甲醛中固定20分钟。用40-μm滤网过滤细胞并将其重悬于FACS缓冲液(含有2％FBS和0.1％叠氮钠的PBS)。在含有1mMEDTA和1％正常小鼠血清(西格玛公司)的FACS缓冲液中进行悬浮细胞的染色。使用Fix&试剂(卡尔台革实验室公司，加州伯林格姆)(CaltagLaboratories；Burlingame，CA)进行胞内髓过氧化物酶(MPO)染色。每一次标记使用约100μl含5x105细胞的细胞悬液。一抗和二抗孵育(若需要的话)均在室温下进行30分钟。用同种型匹配的对照抗体染色对照样品。洗涤后将细胞重悬于300-500μl FACS缓冲液中，并在FACSCalibur流式细胞仪(BDIS公司，加州圣何塞)(BDIS；San Jose，CA)上使用CellQuestTM获取和分析软件(BDIS)进行分析。共获取20,000个事件。表1列出了流式细胞术分析中用到的所有抗体。用FlowJo软件(TS公司，俄亥俄州阿什兰)(Tree Star，Inc.；Ashland，OR)分析和准备最终数据和图表。
表1：流式细胞术所用抗体。

BD法明基公司(加州圣地亚哥)(BD Pharmingen(San Diego，CA))
BD免疫细胞术系统公司(BDIS)(加州圣何塞)(BD ImmunocytometrySystems(BDIS)(San Jose，CA))
卡尔台革实验室公司(加州伯林格姆)(Caltag Laboratories；(Burlingame，CA))
开米康国际公司(加州特曼库拉)(Chemicon International(Temecula，CA))
AbD赛罗泰克公司(北卡罗来纳州罗利)Serotec AbD Serotec(Raleigh，NC)
NA-无。
为了进一步评价参与这些细胞的重编程的潜能决定因子，发明人研究了富含不同潜能决定因子组合的ES细胞库的转导。用于重编程骨髓前体细胞的示例性潜能决定因子库包括下列表2中的14种潜能决定因子。
表2：人ES细胞富集基因。

在Oct4KICD45+A细胞中表达这14种因子中至少一些因子得到了具有典型多潜能细胞(如人ES细胞)形态的集落(图6A-左图)。在对～105起始Oct4KICD45+A细胞进行新霉素选择后，开始出现约10个具有独特ES细胞形态的集落。这些集落中超过一半随后丢失并分化，表明一种或多种引入基因的过表达对细胞具有副作用，或者细胞继续依赖于外源基因和基因沉默。不过存活集落表达内源性Oct4启动子驱动的EGFP(图7A-右图)，表明内源性Oct4启动子/调节区域被重新激活。
在本实施方式中，当天然Oct4启动子/调节区域有活性时发生EGFP的表达。换句话说，通过绿色鉴定未分化细胞，而细胞分化时绿色消失。因此，在灵长类ES细胞中内源性Oct-4的表达是可选择的。这些集落也表达Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81多潜能细胞特异性标记物(图6B)。在使用化学成分确定的TeSRTM培养基获得的重编程集落中得到相似的结果。
发明人从用相同的14种ES细胞富集潜能决定因子库进行的两次分别转染中随机选择了6个集落，并将5个稳定克隆集落至少8周。因此，发明人发现了一种新的方法，该方法通过给予体细胞14种潜能决定因子使灵长类体细胞重编程变为具有更高潜能的细胞。
当使用本文所述慢病毒递送系统使细胞接触其它潜能决定因子组合(即Sox2、c-Myc、Oct 3/4和Klf4)时，未观察到细胞的重编程和转化。
发明人使用本文所述技术筛选足以重编程受试细胞的14种受试因子的子集。发明人的14种充足因子的集合后续缩小范围至6种因子的集合，然后是足以重编程这些细胞的4种基因的集合(图7A-B；详见下文)。如图7B所示，这4种基因Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28的组合足以产生稳定的多潜能细胞。
实施例3：慢病毒转导后用4种潜能决定因子的有限集合重编程间充 质样细胞。
为了鉴定能够将分化细胞重编程回到多潜能状态的更有限的潜能决定因子集合，用Pou5F1(Oct-4)、Nanog、Sox2和Lin28的组合重复上述鉴定方法。发明人使用上述方法筛选这些潜能决定因子重编程细胞的能力。
本实施例中使用不同的细胞类型进一步说明该方法的应用。该细胞类型是直接分化自上述敲入H1Oct4的人ES细胞的间充质样克隆细胞。如本文所用“克隆”指源于共同祖先的细胞群的特征(即来源于单个细胞，而非细胞聚集体)。即在“克隆群体”中，细胞表现出表面标记物和形态学特征的单一模式，遗传学上基本相同。
简要说，将敲入H1 Oct4的人ES细胞(p76-p110)与小鼠OP9骨髓基质细胞共培养以诱导前者的分化。参见，Vodyanyk M等，Blood 105：617-626(2005)，通过引用将其整体纳入本文。在含10％FCS和100μM MTG(西格玛公司)的αMEM中，将敲入H1 Oct4的人ES细胞的小聚集体加入到OP9细胞中。在培养后次日(第1天)更换培养基，并在下示天数时收集培养物。
在共培养第2天，用(威斯康星州麦迪逊)微阵列检测到中内胚层转录因子(GSC、MIXL1和T(短尾基因(BRACHYURY)))和早期中胚层转录因子(EVX1、LHX1和TBX6)的峰值表达，表明确定为中胚层。在第3-5天，观察到内胚层和中胚层谱系的特化。该阶段伴随着参与表皮-间充质细胞转换的基因(EMT、SNAIL和SLUG)和细胞扩增基因(HOXB2-3)的持续表达。这与敲入H1 Oct4的人ES细胞/OP9共培养物的最大细胞增殖速度同时出现。
在共培养第5-7天观察到特定中内胚层谱系的分化，这时检测到发育中的内胚层细胞标记物(AFP和SERPINA1)、间充质细胞标记物(SOX9、RUNX2和PPARG2)和造血内皮细胞标记物(CDH5和GATA1)。然而，肌肉诱导因子(MYOD1、MYF5和MYF6)在共培养的7天中未表达。此外，未检测到神经外胚层标记物(SOX1和NEFL)或滋养外胚层标记物(CGB和PLAC)，表明OP9细胞提供了hESC向中内胚层通路定向分化的有效诱导环境。
同样在第2天，通过连续酶作用：37℃用DMEM/F12培养基配制的1mg/ml胶原酶IV(吉布科-英杰公司)消化15分钟，37℃用0.05％胰酶-0.5mM EDTA(吉布科-英杰公司)消化10分钟，得到人ES细胞衍生细胞的单细胞悬液。用PBS-5％FBS洗涤细胞3次，通过70μM和30μM细胞滤网(BD实验用品公司，麻省贝德福德)(BD Labware；Bedford，MA)过滤，并用抗小鼠CD29-PE(AbD赛罗泰克公司，北卡罗来纳州罗利)(AbD Serotec；Raleigh，NC)和抗-PE顺磁单克隆抗体(美天旎生物技术公司，加州奥本)(Miltenyi Biotech；Auburn，CA)标记。用磁性活化细胞分选(MAC)纯化细胞悬液，具体是将其通过连接于Midi-MACS分离单元的LD磁柱(美天旎生物技术公司)以获得耗尽OP9的敲入H1 Oct4的人ES细胞衍生细胞的负组分。用总的抗人TRA-1-85单克隆抗体(R&D系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯)(R&D Systems；Minneapolis，MN)检验敲入H1 Oct4的人ES细胞衍生细胞的纯度。
将纯化的敲入H1 Oct4的人ES细胞衍生细胞以2x104细胞/毫升的密度铺板于半固体无血清培养基中，该培养基包含添加5-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；派普洛泰克公司，新泽西州洛基山)(PeproTech；Rocky Hill，NJ)、1％甲基纤维素(干细胞技术公司)(StemCell Technologies，Inc.)、含或者不含10-20ng/mlPDGF-BB(派普洛泰克公司)的StemLineTM无血清培养基(西格玛公司)。PDGF-BB提高间充质细胞的生长，但并非集落形成所必需。在培养后的14-21天，形成大的紧密的间充质细胞集落，类似胚状体(EB)。第7天检测到间充质细胞集落；然而需要14-21天展示主动生长的集落。
将单个间充质细胞集落转移到胶原或纤连蛋白包被的96孔板的孔中，每孔中预先加入0.2ml含5-100ng/ml bFGF的无血清培养基。培养3-4天后，通过胰酶处理收集单个孔中的贴壁细胞并在胶原或纤联蛋白包被的平皿中扩增，所述平皿中包含补充有5-100ng/ml bFGF的无血清培养基。
然后按照上述方法进行表达转基因的慢病毒转导。发明人检验了通过表达潜能决定因子的有限集合(如Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28)可以使分化间充质样细胞重编程为多潜能状态的假设。表达至少这4种潜能决定因子得到具有多潜能细胞如人ES细胞典型形态的细胞集落(图7B；深灰色柱)。如图7B所示，使用所有Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28补充物得到的具有典型多潜能细胞形态的细胞集落数目最多。然而，当缺少Oct-4、Nanog、Sox2或Lin28中的一种时，ES样集落的数目显著减少(如Nanog或Lin28)或为零(如Oct-4或Sox2)。
在本实施方式中，当天然Oct4启动子/调节区域有活性时发生EGFP表达。换句话说，通过绿色鉴定未分化细胞，而细胞分化时绿色消失。因此，细胞中内源性Oct-4的表达是可选择的。重编程集落也表达Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81多潜能细胞特异性标记物(数据未显示)。
发明人从用相同的14种ES细胞富集潜能决定因子库进行的两次分别转染中随机选择了6个集落，并将5个稳定集落增殖至少8周。因此，发明人发现了一种新的方法，该方法通过给予体细胞4种潜能决定因子使灵长类体细胞重编程变为具有更高潜能的细胞。
当使用本文所述慢病毒递送系统使这些细胞接触其它潜能决定因子组合(即Sox2、c-Myc、Oct 3/4和Klf4)时，未观察到细胞的重编程和转化。
实施例4：慢病毒转导后用2种潜能因子的有限集合重编程间充质样 细胞。
为了鉴定能够将分化细胞重编程回到多潜能状态的更有限的潜能决定因子集合，用以下四种因子Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28中两种因子的组合在实施例3的间充质样细胞中重复上述方法。发明人使用上述方法筛选潜能决定因子重编程细胞的能力。
然后，如上所述进行表达转基因的慢病毒转导。发明人检验了通过表达少于4种潜能决定因子能够使分化间充质样细胞重编程为多潜能状态的假设。表达至少Oct-4和Sox2得到具有多潜能细胞如人ES细胞典型形态的细胞集落(图7C)。单独或组合的Nanog和Lin28通过提高人ES细胞衍生的间充质细胞到多潜能状态的重编程效率而有益于克隆回收，但对于重编程细胞最初外观或重编程细胞的扩增都不是必需的。
实施例5：慢病毒转导后和表达4种潜能决定因子后重编程分化细胞。
为了进一步证明潜能决定因子有限集合在将分化细胞重编程为多潜能状态中的用途，用ATCC目录号人胚肺成纤维细胞CCL-186(IMR-90；ATCC)重复上述方法(参见，Birney E等，Nature 447：799-816(2007))。
按照上述方法进行表达转基因的慢病毒转导。即用Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的组合转导IMR-90细胞(0.9x106/孔)。发明人检验了通过表达有限潜能决定因子集合(如Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28)能够使分化的成纤维细胞重编程为多潜能状态的假设。转导后，将细胞转移到3个种有经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的10-cm平皿中。转导后12天看到具有人ES细胞形态的小集落。转导后20天，3个平皿共观察到198个集落。挑选出41个集落，其中35个在接下来的3周中成功扩增。选择其中6个集落继续进行扩增和分析，将其余29个冻存。
引入至少Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28得到具有多潜能细胞，如具有正常核型的人ES细胞的典型形态的集落。每一集落的细胞都表达端粒酶活性并表达人ES细胞特异性表面抗原(即SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra1-81)。各集落中内源性OCT4和NANOG的表达水平和多潜能细胞的水平类似，尽管这些基因的外源性表达不同。此外，形成EB和畸胎瘤表明这些重编程细胞具有产生所有三个原始胚层的分化衍生物的发育潜能。
DNA指纹分析确认了这些集落起源于IMR-90细胞而非人ES细胞系(如H1、H7、H9、H13和H14)。
与分化间充质细胞得到的数据相似，使用所有Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28补充物得到的具有多潜能细胞如人ES细胞的典型形态的细胞集落数目最多。然而，当缺少Oct-4、Nanog、Sox2或Lin28时，ES样集落的数目显著减少(如Nanog或Lin28)或为零(如Oct-4或Sox2)。
尽管在重编程中未对多潜能特异性基因的激活进行选择，但选择用于扩增和详细鉴定的集落增殖了至少12周并保持正常多潜能细胞的典型特征。
仅基于形态学鉴定重编程细胞(即具有高核质比和显著核仁的致密集落)。重编程细胞也表达Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81多潜能细胞特异性标记物。
实施例6：慢病毒转导和表达3种潜能决定因子后重编程分化细胞。
为了进一步证明潜能决定因子有限集合在将分化细胞重编程为多潜能状态中的用途，用上述IMR-90重复上文鉴定的方法。这一组实验中使用比实施例5更少的潜能决定因子。
按照上述方法进行表达转基因的慢病毒转导。用Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28中3种因子的组合转导IMR-90细胞。发明人检验了通过表达更有限的潜能决定因子集合能够使分化成纤维细胞重编程为多潜能状态的假设。表达至少3种因子得到具有多潜能细胞如人ES细胞的典型形态的集落。使用所有Oct-4、Sox2和Nanog补充物，包含或不包含Lin28的情况下，得到具有多潜能细胞的典型形态的重编程集落。因此，Lin28存在或不存在不影响重编程。然而，当缺少Oct-4、Nanog或Sox2之一时，重编程集落的数目显著减少或为零。
为了检验重编程细胞中是否存在Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28前病毒，使用来自IMR-90克隆的基因组DNA作为模板，以转基因特异性引物对(参见表3；一个基因特异性引物和一个慢病毒载体特异性引物)进行PCR。反应使用pfx DNA聚合酶(英杰公司，扩增缓冲液使用2X，增强溶液使用3X)，条件如下：最初95℃变性1分钟；进行35个下述循环：94℃30秒，55℃30秒，68℃2分钟；最后68℃7分钟。转基因的PCR分析表明在接触表达转基因的慢病毒载体后，无论是所有4种转基因还是3种转基因(即Oct-4、Sox2和Nanog)均整合入多潜能细胞。
表3：评价前病毒整合的引物组。

仅基于形态学鉴定重编程细胞(即具有高核质比和显著核仁的致密集落)。重编程细胞也表达Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81多潜能细胞特异性标记物。
实施例7：慢病毒转导和表达3种潜能因子后重编程分化细胞。
为了进一步证明潜能决定因子有限集合在将分化细胞重编程为多潜能状态中的用途，用ATCC目录号CRL-2097(ATCC)的出生后人包皮成纤维细胞重复上文鉴定的方法。
按照上述方法进行表达转基因的慢病毒转导。即用Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的组合转导出生后成纤维细胞(0.6x106/孔)。发明人检验了通过表达潜能决定因子有限集合能够使分化的出生后成纤维细胞重编程为多潜能状态的假设，并得到了理想的结果。转导后，将细胞转移到3个种有经辐射的MEF的10-cm平皿中。转导后第15天看到具有多潜能细胞形态的小集落。转导后第20天，在平板上共观察到57个集落。挑选出29个集落，其中27个在接下来的3周中成功扩增。选择其中4个集落继续扩增和分析，将其余23个冻存。
Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到具有多潜能细胞如人ES细胞的典型形态并具有正常核型的集落。重编程集落都表达端粒酶活性并表达多潜能细胞特异性标记物(即SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra1-81)。各集落中内源性OCT4和NANOG的表达水平和人多潜能细胞的水平类似，尽管这些基因的外源性表达不同。此外，形成EB和畸胎瘤表明这些重编程细胞具有产生所有三个原始胚层的分化衍生物的发育潜能。然而，与获自IMR-90细胞的iPS细胞相反，获自CRL-2097细胞的iPS细胞在第5周检验的畸胎瘤中的谱系方面具有差异。两个iPS细胞集落显示神经分化；而另两个集落则显示柱状上皮细胞的多点增生(multiple foci)，使人联想到原始外胚层。
DNA指纹分析确认了这些集落起源于原始细胞系而非人ES细胞系(如H1、H7、H9、H13和H14)。
与分化间充质细胞转导后得到的数据相似，使用所有Oct-4、Nanog、Sox2和Lin28补充物得到的具有人多潜能细胞典型形态的细胞集落数目最多。有趣的是，有一种细胞系缺少Lin28，确认了Lin28对于重编程体细胞并非必需。
尽管在重编程中未对多潜能特异性基因的激活进行选择，但所选用于扩增和详细鉴定的集落增殖了至少12周并保持正常人多潜能细胞的典型特征。
仅基于形态学鉴定重编程细胞(即具有高核质比和显著核仁的致密集落)。重编程细胞也表达Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81多潜能细胞特异性标记物。
当使用本文所述慢病毒递送系统使这些细胞接触因子的其它组合(即Sox2、c-Myc、Oct 3/4和Klf4)时，未观察到细胞的重编程和转化。
实施例8：慢病毒转导和表达4种潜能决定因子后重编程分化细胞。
为了进一步证明潜能决定因子有限集合在将分化细胞重编程为多潜能状态中的用途，用ATCC目录号CCL-2106(SK46；ATCC)的成年人皮肤细胞重复上述鉴定方法。
按照上述方法进行表达转基因的慢病毒转导。即用Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的组合转导皮肤细胞(2.0x105/孔)。发明人检验了通过表达潜能决定因子有限集合能够使成人皮肤细胞重编程为多潜能状态的假设并得到理想结果。转导后，将细胞转移到3个种有经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的10-cm平皿中。在人ES细胞培养基中培养10天后，使用辐射MEF条件化的人ES细胞培养基支持细胞生长。转导后18天看到具有多潜能细胞形态的小集落。
Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28的表达得到具有多潜能细胞(参见图8A)如人ES细胞的典型形态的集落(即具有高核质比和显著核仁的致密集落)。如图8B所示，重编程细胞也表达多潜能细胞典型的细胞表面标记物；而SK46细胞(对照)不表达。然而，来自成人皮肤细胞的重编程集落较实施例7中的细胞出现得晚且重编程效率较实施例7中的细胞低。
实施例9：将潜能决定因子连接到单一载体上提高重编程效率。
为了提高重编程效率，使用如图4A所示构建物重复上述方法；然而，将Oct-4或Sox2插入到转基因部分，并用Sox2任选替换新霉素抗性基因。然后在293FT或敲入OCT4的人H1 ES细胞(p6)中表达该构建物。
如上所述进行表达转基因的慢病毒转导。即，用不同的转基因组合转导293FT细胞或间充质细胞(6孔板～2x105细胞/孔，接种过夜)。与慢病毒孵育过夜后，将细胞转移到10cm MEF平皿(6孔板的1孔至1x10cmMEF平皿)中。在转导后11-15天进行基因霉素选择(50μg/ml)，用于挑选具有活性的内源性OCT4启动子。第16天进行iPS集落计数。
图9A显示转染后293FT细胞中Oct-4和Sox2的表达(参见，如1-3泳道)。在图9A-B中，pSin4-EF2-Oct4-IRES1-Sox2简写为OS-IRES1；pSin4-EF2-Oct4-IRES2-简写为OS-IRES2；pSin4-EF2-Oct4-F2A-Sox2简写为OS-F2A  ；pSin4-EF2-Oct4-IRES1-puro简写为OpSin4-EF2-Sox2-IRES1-puro简写为S。
图9B显示了当在同一构建物中提供Oct-4和Sox2时，衍生自敲入OCT4的人H1 ES细胞(p6)的间充质细胞中重编程效率增加(IRES1是极低效的内部核糖体进入位点；而IRES2是高效的内部核糖体进入位点)。与O+S、O+S+N+L或OS-IRES1(低效IRES)+N+L相比，OS-IRES2+N+L(高效IRES)的重编程效率约高4倍。因此，在同一构建物中提供表达水平大致相等的潜能决定因子能提高重编程效率。
应理解本公开文本所述发明的某些改变实为本领域熟练技术人员所作的常规优化，在不背离本发明精神或所附权利要求范围内可进行实施。
上说说明书中所提及的所有公开物和专利均通过引用纳入本文。本领域熟练技术人员了解在不背离本发明范围和精神的情况下，可对本发明所述方法和系统进行不同改进和变化。然而，应理解，上述本发明的实施例和实施方式仅作为说明而不应限制本发明。本发明包括权利要求书范围内的实施例、实施方式的所有改进形式。
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年3月23日提交的美国临时专利申请号60/919,687、2007年9月25日提交的美国临时专利申请号60/974,980以及2007年11月19日提交的美国临时专利申请号60/989,058的优先权，并将每一申请整体纳入本文作参考。
关于联邦资助研究或开发的申明
无。