【発明の詳細な説明】 【０００１】 本出願は、1998年4月24日出願の同時係属中の出願第09/066,072号の一部継続出願である。 【０００２】 発明の分野 本発明は、一般に、診断微生物学の分野に関し、より具体的には、検体中に存在する1つまたは複数のウイルス又はその他の細胞内寄生体を検出し識別するための組成物および方法に関する。 本発明は、抗微生物剤に対する生物の感受性を評価するための組成物および方法も提供する。 【０００３】 発明の背景 分子的方法を使用したウイルス検出法の最近の進歩にも関わらず、細胞培養物におけるこれらの生物の検出および同定は、依然として「最高標準」であり、大部分のウイルス性疾患がこの方法により決定的に診断されており、より新しい方法がこの方法と比較されている。 （例えば、WiedbraukおよびJohnston、「臨床ウイルス学マニュアル（Manual of Clinical Virology）」、Raven Press,Inc.
、New York、NY[1993]、1-17頁参照）。 細胞培養物は、その他の細胞内寄生体、
特にクラミジア（Chlamydia）およびリケッチア（Rickettsia）のような絶対細胞内寄生体の検出および同定にも使用されている。 【０００４】 ウイルス同定のために使用される細胞培養法には、二つの一般的な型が存在する。 第一の方法は、ウイルス検出のための終点として、ウイルスによって誘導された細胞変性効果（CPE）の同定を使用する。 第二の方法は、感染した培養物中にCPEが出現する前に、ウイルスの存在を同定するための分子的方法を利用する。 いずれの方法も、細胞培養法の技術、スペース、資金、装置、および備品に限界がある小規模な研究室にとっては困難な場合もある細胞培養物を利用する。 使用される細胞により、細胞培養物は、維持が困難である場合があり、熟練した研究者の努力を必要とする場合が多い。 さらに、細胞培養物は、細胞培養フード、
倒立顕微鏡（細胞の観察用）、CO 2ラインを有するインキュベーター、および多くの研究所において容易には利用可能でないその他の装置のような装置を必要とする。 【０００５】 CPEに基づく試験 ウイルスにより誘導されるCPEは、ウイルスが複数回複製され、ウイルスが近隣細胞（即ち、細胞は、ウイルス感染に対し許容性である）へと伝播した後に初めて出現するため、CPEに基づく試験は、長いインキュベーション時間を必要とする場合が多い。 ウイルス伝播は、最初に感染した細胞の周囲の細胞の破壊をもたらす。 CPEに基づく試験は、伝統的には、チューブ又はフラスコの側面および/
又は底面に付着又は固着した単一細胞型を含有しているチューブ又はフラスコにおいて実施されている。 ウイルスが細胞へと感染し、複製され、近隣細胞へ伝播し、この過程が反復されなければならないため、結果が得られるまでには少なくとも28日を要しうる。 実際、ウイルス懸濁物の細胞培養物への接種の後、7〜28
日間は、結果が得られない場合が多い（例えば、Leland、「臨床ウイルス学（Cl
inical Virology）」、WBSaunders、Philadelphia[1996]、60-65頁参照）。 可視CPEを確立するために必要な時間は、細胞型およびウイルスによって変動しうるウイルス複製速度に依存する。 従って、試料中のウイルスを検出するために必要な時間の量は、大きく変動しうる。 【０００６】 前（pre）CPE試験 CPEに基づく試験とは対照的に、前CPE試験は、感受性宿主細胞へのウイルスの侵入、および少なくとも一つの初期ウイルス特異的抗原又は核酸の検出可能な発現のみを必要とする。 ウイルス特異的分析物又はその他の指標の検出は、多数の方法（例えば、標識された抗体、ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、又はELVIS（登録商標）系のような他のレポーターの使用）によって達成されうる。 初期ウイルス遺伝子の発現は、インビトロの多くのウイルス-宿主細胞系において極めて迅速であることが示されている。 従って、前CPEに基づくウイルス試験の使用は、臨床検体中のウイルスを検出し同定するために必要な時間を有意に減少させる。 【０００７】 ウイルスの前CPE検出は、1ドラムのシェルバイアル（shell vials）の中に含まれる12mmの丸形カバーガラス上で増殖させた付着細胞の単層を使用することにより達成される場合が多い（即ち、「シェルバイアル」法又は「シェルバイアル」技術）。 シェルバイアル技術は、細胞へウイルスを導入し、ウイルスの単離を増強するために、検体の遠心分離を使用する。 これらのバイアルは、カバーガラスを含有している無菌のシェルバイアルへ細胞を分注することにより調製される。 バイアルは、細胞がカバーガラス上に単層を形成するまで、直立状態でインキュベートされる。 シェルバイアル接種のためには、バイアルを傾けて培養培地を捨て、加工された試料（即ち、臨床検体）を、細胞単層に添加し、バイアルを、
多くは1時間、低速で遠心分離する。 遠心分離の後、新鮮な培養培地を各バイアルに添加する。 次いで、バイアルを所望の時間インキュベートする。 インキュベーション時間の終了後、抗原検出法（例えば、免疫蛍光）を使用してカバーガラスを染色するか、又は分子的診断技術によって細胞を評価する。 【０００８】 ウイルスに加え、クラミジアの検出および同定にも、シェルバイアルは一般的に使用されている。 これらの生物の検出および同定のため利用可能なその他の方法は、極めて煩雑であり、多くの時間および試薬を浪費するためである（例えば、Wiedbrauk and Johnston（前記）64-76頁参照）。 【０００９】 これらの前CPE試験法の主な利点とは、しばしば迅速な試験結果が可能である点である。 シェルバイアル培養物の前CPE試験の一つの主な短所は、1個又は少数のウイルス性病原体の同定が求められており、かつ検体の大部分が陽性である可能性が高い場合にのみ、この型の試験が実施可能であり、費用効果が高いという点である（例えば、SchmidtおよびEmmons、「ウイルス、リケッチア、およびクラミジア感染の実験診断法の一般原理（General Principles of Laboratory Dia
gnostic Methods for Viral,Rickettsial,and Chlamydial Infections）」Schmi
dtおよびEmmons編、「ウイルス、リケッチア、およびクラミジア感染の診断手順（Diagnostic Procedures for Viral,Rickettsial and Chlamydial Infections
）」American Public Health Association、Washington,DC、[1989]、4頁参照）。 【００１０】 臨床検体 例えば、患者の生殖器部分に皮膚小胞が存在する場合には、単純ヘルペスウイルス（HSV）による感染が強く疑われる。 典型的には、医師は、患部（即ち、小胞）から検体を得て、単一のHSV感受性細胞系におけるCPEウイルス試験又は前CP
Eウイルス試験を指示すると考えられる。 これらの細胞系は、チューブ、シェルバイアル、又はマルチウェルプレート（例えば、マイクロタイタープレート）の中に供給される場合が多い。 細胞系の接種および適切なインキュベーション時間の後、試料中のHSVの存在の確認が、多くの分析法（例えば、免疫蛍光、免疫ペルオキシダーゼ、核酸プローブ、又はウイルスによって誘導されるレポーター遺伝子の基質）のうちの一つ以上を使用して達成されうる。 【００１１】 サイトメガロウイルス（CMV）の検出のためには、単一の細胞系（例えば、肺[
MRC-5]細胞又は包皮[HFF]細胞のようなヒト繊維芽細胞系）に由来する細胞を含有しているシェルバイアルが使用される場合が多い。 細胞を、バイアル内のカバーガラス上でコンフルエントな状態になるまで増殖させ、試料をバイアルに添加し、バイアルを24時間〜48時間又はそれ以上インキュベートし、免疫蛍光法を使用して、CMV初期抗原の発現を検出する。 【００１２】 多くの病原性ウイルスが類似の症状を誘発することができるため、又は感染が無症状性である（即ち、兆候および症状が容易には出現しない）ため、呼吸器、
胃腸、生殖器、又は非経口の伝播経路によるウイルス性疾患を正確に識別診断することは、非常に困難である。 【００１３】 呼吸器ウイルスのうち、ライノウイルス（rhinovirus）およびコロナウイルス（corona virus）は、上気道感染の大部分の原因である。 これらのウイルスは、
上気道粘膜に達した後、上皮細胞に接着し、それらに感染する。 典型的には、これらの感染は数日しか持続せず、自己消散する。 インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、および様々なアデノウイルスのようなその他の呼吸器ウイルスは、繊毛円柱上皮細胞に接着し、それらに感染する。 ウイルスが感染した細胞は、溶解して酵素を放出し、補体を活性化して局所的な単核炎症応答をもたらす。 上皮細胞が正常な機能を果たすことができないために、
正常な気道クリアランスメカニズムは起こり得ない。 これらの細胞は、脱落する場合もある。 死細胞および瀕死の細胞に由来する細胞片は、気道を閉塞する場合が多く、宿主は、二次細菌感染および/又は重感染に対して極めて高い感受性を有するようになる。 これらのウイルスは、全て、下気道での併発および肺炎への進行をもたらす。 気道上皮細胞における複製の後、アデノウイルスは、血液を介して全身のリンパ組織に移動し、全身性の感染又は疾患を引き起こしうる。 【００１４】 特定の細胞型に対する各ウイルス型の向性は極めて狭い（即ち、単一の細胞型においては、ただ一つのウイルス型が最適に増殖しうる）場合が多いため、標準的な臨床ウイルス学の実務は、多数の細胞培養物チューブに検体（例えば、喉スワブ、鼻咽頭スワブ、又は痰検体）を接種することである。 この限られた数の細胞型に対する狭いウイルスの向性は、CPEウイルス試験および前CPEウイルス試験の両方において、少なくとも二つの主要な実務上の問題を与える。 【００１５】 第一に、現在、インフルエンザウイルスの単離のため選択される細胞系は、初代サル腎細胞である。 これらの細胞の製造は、屠殺および細胞培養物調製の前に、長期間にわたる起源動物の隔離を必要とする。 この隔離期間は、良好な健康に関して動物をモニタリングするために使用され、泡沫状ウイルス（foamy virus
）、SV5、およびSV40のような内因性サルウイルスによる感染に関して動物を試験するための時間を与える。 隔離期間はまた、ヒトにとって高度に致死性のヘルペスウイルスであるサルBウイルス（Monkey B Virus）がサルに感染する可能性を消失させないが、大きく減少させる。 また、輸入の問題およびサル個体数の考慮による、適当な動物のストックの減少を含む、初代細胞培養物の作製のためのサルの使用に関係したその他の問題が存在する。 【００１６】 第二に、インフルエンザウイルス以外の呼吸器ウイルスを検出するためには、
付加的な連続細胞系が必要とされる。 従って、複数の細胞系が、各患者のウイルス感染/疾患を診断するために使用される。 個々の細胞系の複数ユニットの必要性は、呼吸器ウイルスの検出および同定のために前CPE試験を使用する方法において増大する。 呼吸器ウイルスに関する前CPE試験は、カバーガラスの取り扱いにおける相当の労力の消費、陽性検体および陰性検体のため複数の細胞系と共に使用される分子的試薬の追加的な費用、ならびに細胞系パネルの中の接種された複数の細胞系の各々の顕微鏡による読み取りに関連した相当の労力を必要とする。 【００１７】 しかしながら、これらの欠点にも関わらず、多数のユニット（チューブ、シェルバイアル等）において単一細胞型を使用するシェルバイアル技術は、確立された方法であるため、呼吸器ウイルスを検出するために現在依然として使用されている。 例えば、HEp-2細胞のみを含有しているシェルバイアルを使用した16時間のRSVの検出は、臨床検体に直接適用される抗原検出法より多くの陽性体を与え、従来の細胞培養物と同等の数の陽性体を与える（Smithら、J.Clin.Microbiol.
、29：463-465[1991]）。 単一細胞型の単層を含有しているシェルバイアル培養物を用いた、その他の呼吸器ウイルスの単離も可能となっている。 例えば、40時間インキュベートされた初代サル腎細胞およびA549細胞のバイアルを使用し、アデノウイルスの83％、インフルエンザBの94％、パラインフルエンザウイルス1型、2型、および3型の80％が同定された（Rabalaisら、J.Clin.Microbiol.、30：1
505-1508[1992]）。 もう一つの報告では、初代アカゲザル腎細胞のシェルバイアルにおいてアデノウイルスの50％、インフルエンザA型ウイルスの94％、インフルエンザB型ウイルスの100％、パラインフルエンザウイルスの100％、そして2〜
4日間インキュベートされたHEp-2細胞のシェルバイアルにおいてRSVの92％（例えば、Olsenら、J.Clin.Microbiol.、31：422-425[1993]；およびLeland、「臨床ウイルス学（Clinical Virology）」、WBSaunders Company、Philadelphia
、PA[1996]、85-86頁参照）。 【００１８】 これらの方法は、比較的迅速な結果を提供するが（即ち、CPE試験にしばしば必要である長いインキュベーション期間とは対照的である）、費用効果の高い様式で迅速な検出および同定を提供すると共に、診断アッセイ系の高い感度をも提供する、操作が容易な単一のユニットにおける、信頼性の高いウイルスの検出および同定のための細胞培養法および組成物が、臨床研究室および委託ウイルス学研究室において依然として必要とされている。 【００１９】 発明の概要 本発明は一般に、診断微生物学の分野に関し、より具体的には、検体中に存在する1つまたは複数のウイルス又はその他の細胞内寄生体を検出し識別するための組成物および方法に関する。 本発明は、抗微生物剤に対する生物の感受性を評価するための組成物および方法も提供する。 【００２０】 特に、本発明は、CPEに基づく方法および前CPE法を使用したウイルスの検出に適した方法および組成物を提供する。 好ましい態様は、少なくとも2個の異なる細胞型を含有している混合細胞培養物を包含する。 いくつかの好ましい態様において、混合細胞培養物は2個の異なる細胞型を含有しており、他の態様において、混合細胞培養物は3個以上の異なる細胞型を含有している。 従って、本発明は、一つの容器（例えば、フラスコ、チューブ、シェルバイアル、又は細胞の増殖に適したその他の任意の容器）の中で少なくとも2個の細胞型が混合された組成物を包含することが意図される。 重要なことに、単一細胞培養物（即ち、当分野において既知のようなただ一つの細胞型を含有している細胞培養物）の中に存在する場合と同様に、これらの混合細胞培養物中の各細胞型は、ウイルスおよびその他の細胞内寄生体に対する感受性を保持している。 さらに、本発明の混合細胞培養物は、診断アッセイ法におけるそれらの使用に必要とされる時間、生存を維持する。 特に好ましい態様において、混合細胞培養物の中に含まれる細胞型は、
ほぼ同じ比率で存在する（即ち、2個の細胞型が混合される場合、50：50の比率で細胞型が存在する）。 しかしながら、本発明は混合培養物の中の特定の細胞比率に限定されるものではなく、種々の比率を使用して、様々な検出系が最適化されうる。 例えば、いくつかの状況においては、45：55、40：60、又は35：75という2細胞混合物が、50：50の比率よりも好適でありうる。 【００２１】 本発明は、クラミジア目（Chlamydiales）およびリケッチア目（Ricketsiales
）のメンバーのような非ウイルス性の絶対細胞内寄生体および細胞内寄生体の検出および同定に適した方法および組成物も提供する。 【００２２】 本発明は、少なくとも1個の細胞内寄生体による感染に対する感受性を有する少なくとも2個の細胞型を含む、細胞内寄生体の検出に適した細胞培養物を含む組成物も考慮する。 組成物のいくつかの好ましい態様において、細胞型は、第一の細胞型および第二の細胞型を含む。 いくつかの態様において、第一の細胞型は、バッファローグリーンザル（buffalo green monkey）腎細胞からなり、第二の細胞型は、ミンク肺細胞からなる。 他の態様において、第一の細胞型は、ミンク肺細胞からなり、第二の細胞型は、ヒト粘膜表皮細胞からなる。 さらに他の態様において、第一の細胞型はヒト肺癌細胞からなり、第二の細胞型はヒト粘膜表皮細胞からなる。 さらに他の態様において、第一の細胞型はバッファローグリーンザル腎細胞からなり、第二の細胞型はヒト胎児肺細胞からなる。 さらなる態様において、細胞型はヒト表皮喉頭癌細胞からなり、第二の細胞型はMcCoy細胞からなる。 さらなる態様において、第一細胞型はミンク肺細胞からなり、第二の細胞型はヒト二倍体肺細胞からなる。 【００２３】 いくつかの好ましい態様において、組成物の細胞型は、任意の型（例えば、インフルエンザA、インフルエンザB、およびインフルエンザC）および/又は株のインフルエンザウイルス、RSV、サイトメガロウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、コロノウイルス、ならびにアデノウイルス（これらに限定されることはない）を含む呼吸器ウイルスに対する感受性を有する。 さらに他の態様において、細胞型の組成物は、任意の型および/
又は株のエコーウイルス、ポリオウイルス、およびコクサッキーウイルス（例えば、コクサッキーAウイルスおよびコクサッキーBウイルス）、ならびに一部のEV
株（これらに限定されることはない）を含むエンテロウイルスに対する感受性を有する。 エンテロウイルスに加え、本発明は、A型肝炎のようなピコルナウイルスに対する感受性を有する細胞型を包含することが考慮される。 【００２４】 本発明は、1つまたは複数の細胞内寄生体を含有すると推測される試料、および少なくとも2個の細胞型を含む混合細胞培養物を提供する段階；接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびに1つまたは複数の細胞内寄生体の存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中の細胞内寄生体の検出および同定のための方法も提供する。 【００２５】 本方法のいくつかの態様において、細胞内寄生体はウイルスである。 いくつかの特に好ましい態様において、ウイルスは、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、コロノウイルス、およびアデノウイルスからなる群より選択される。 方法のさらに他の態様において、ウイルスはエンテロウイルスである。 他の特に好ましい態様において、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、およびエコーウイルス（例えば、コクサッキーAウイルスおよびコクサッキーBウイルス）、ならびに一部のEV株からなる群より選択される。 本発明は、
エンテロウイルスに加え、A型肝炎のようなピコルナウイルスに対する感受性を有する細胞型を包含することが考慮される。 さらに他の好ましい態様において、
ウイルスはヘルペスウイルスである。 他の特に好ましい態様において、ヘルペスウイルスは、1型単純ヘルペスウイルス、2型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella-Zoster virus）、エプスタインバーウイルス（Epstein-Barr virus）、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群より選択される。 さらに他の好ましい態様において、細胞内寄生体は、クラミジア属のメンバーである。 さらに他の特に好ましい態様において、細胞内寄生体はC.トラコマチス（trachoma
tis）である。 【００２６】 本方法のいくつかの好ましい態様において、細胞型は第一の細胞型および第二の細胞型を含む。 いくつかの好ましい態様において、第一の細胞型はミンク肺細胞であり、第二の細胞型はヒト粘膜表皮細胞である。 他の好ましい態様において、第一の細胞型はバッファローグリーンザル腎細胞であり、第二の細胞型はヒト粘膜表皮細胞である。 さらにもう一つの別の態様において、第一の細胞型は遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞であり、第二の細胞型はミンク肺細胞である。 さらに他の態様において、第一の細胞型は第一の遺伝学的に操作された細胞型であり、第二の細胞型は第二の遺伝学的に操作された細胞型である。 【００２７】 本発明の方法は、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスおよび/又はその他の細胞内生物についての既知の陽性対照および陰性対照と合わせて使用されると考えられる。 【００２８】 本発明は、1つまたは複数の細胞内寄生体を含有すると推測される試料、および第一の細胞型と第二の細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；接種された培養物を作製するため、試料に混合細胞培養物を接種する段階；ならびに1
つまたは複数の細胞内寄生体の存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中の細胞内寄生体の検出および同定のための方法も提供する。 【００２９】 いくつかの特に好ましい態様において、細胞内寄生体はウイルスである。 いくつかの特に好ましい態様において、ウイルスは、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、コロノウイルス、およびアデノウイルスからなる群より選択される。 方法のさらに他の態様において、ウイルスはエンテロウイルスである。 他の特に好ましい態様において、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、およびエコーウイルス（例えば、コクサッキーAウイルスおよびコクサッキーBウイルス）、ならびに一部のEV株からなる群より選択される。 本発明は、エンテロウイルスに加え、A型肝炎のようなピコルナウイルスに対する感受性を有する細胞型を包含することが考慮される。 さらに他の好ましい態様において、ウイルスはヘルペスウイルスである。 他の特に好ましい態様において、ヘルペスウイルスは、1型単純ヘルペスウイルス、2型単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群より選択される。 さらに他の好ましい態様において、細胞内寄生体は、クラミジア属のメンバーである。 さらに他の特に好ましい態様において、細胞内寄生体はC.トラコマチスである。 【００３０】 本方法のいくつかの好ましい態様において、細胞型は第一の細胞型および第二の細胞型を含む。 いくつかの好ましい態様において、第一の細胞型はミンク肺細胞であり、第二の細胞型はヒト粘膜表皮細胞である。 他の好ましい態様において、第一の細胞型はバッファローグリーンザル腎細胞であり、第二の細胞型はヒト粘膜表皮細胞である。 さらにもう一つの別の態様において、第一の細胞型は遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞であり、第二の細胞型はミンク肺細胞である。 さらに他の態様において、第一の細胞型は第一の遺伝学的に操作された細胞型であり、第二の細胞型は第二の遺伝学的に操作された細胞型である。 【００３１】 本発明の方法は、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスおよび/又はその他の細胞内生物についての既知の陽性対照および陰性対照と合わせて使用されると考えられる。 【００３２】 本発明は、インフルエンザウイルスを含有していると推測される試料、およびミンク肺細胞を提供する段階；試料をミンク肺細胞に接種する段階；ならびにミンク肺細胞内のインフルエンザの存在を検出する段階を含む、インフルエンザウイルスの検出のための方法をさらに提供する。 特に好ましい態様において、ミンク肺細胞はMv1Lu細胞である。 別の態様において、インフルエンザウイルスは、
インフルエンザA、インフルエンザB、およびインフルエンザCからなる群より選択される。 【００３３】 本発明の方法は、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスおよび/又はその他の細胞内生物についての既知の陽性対照および陰性対照と合わせて使用されると考えられる。 【００３４】 一つの態様において、本発明は、a）ウイルスを含有すると推測される検体、
ウイルス感染に対して許容性の細胞系、およびウイルスに由来するプロモーター配列（プロモーター配列はレポーター遺伝子と機能的に連結されており、レポーター遺伝子の発現はウイルスの存在に依存し、量的に比例している）を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを含有している遺伝学的に操作された細胞系を提供する段階；b）混合細胞培養物を作出するため、許容性細胞系と遺伝学的に操作された細胞系とを混合する段階；c）混合細胞培養物のウイルス感染を許容する条件の下で、標的を混合細胞培養物へ接種する段階；ならびにd）レポーター遺伝子の発現を検出し、それにより検体中のウイルスの存在を検出する段階を含む、検体中の感染性ウイルスの検出のための方法を提供する。 一つの好ましい態様において、混合細胞培養物は、80％〜99％の許容性細胞系と、1％〜20％の遺伝学的に操作された細胞系とからなる混合物である。 他の好ましい態様において、
混合細胞培養物は、混合物中に等しい割合で使用された細胞型からなる混合物である。 【００３５】 本方法の一つの態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、大腸菌lacZ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含む群より選択されるレポーター遺伝子と機能的に連結されたヘルペスウイルス誘導可能プロモーターを含む配列を有するオリゴヌクレオチドを含有している。 方法の一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、BHKICP10LacZである。 別の好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系はBHKICP6LacZである。 しかしながら、レポーター遺伝子は、lacZ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子に限定されないことが意図される。 実際、当業者に既知の任意の適当なレポーター遺伝子が、本発明の方法において有用であると考えられる。 【００３６】 また、様々な許容性細胞系が本発明の方法において有用であると考えられる。
一つの態様において、許容性細胞系は、ヘルペスウイルス感染に対して許容性である。 特に好ましい態様において、許容性細胞系はMRC-5である。 【００３７】 本発明の方法は、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスについての既知の陽性対照および陰性対照と合わせて使用されると考えられる。 従って、遺伝学的に操作された細胞系が使用される混合培養物の場合、（例えば、臨床検体に由来する）試験試料の中に存在するレポーター遺伝子発現のパターンが、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスについて陽性および陰性であることが既知の対照試料の中のレポーター遺伝子発現のパターンと比較されると考えられる。 CPE（
これに限定されることはない）を含む、レポーター遺伝子の発現と無関係な効果が検出されると考えられる。 これらの効果は、単独で、そしてレポーター遺伝子発現と組み合わされて、ウイルス感染の存在を検出するために使用されうる。 【００３８】 本発明は、a）ヘルペスウイルス科の1つまたは複数のメンバーを含有していると推測される検体、ヘルペスウイルス科の1つまたは複数のメンバーによる感染に対して許容性の細胞系、ヘルペスウイルス科のメンバーに由来するプロモーター配列（プロモーター配列はレポーター遺伝子と機能的に連結されており、レポーター遺伝子の発現はヘルペスウイルスの存在に依存し、量的に比例しており、
レポーター遺伝子の発現はヘルペスウイルス科の種々のメンバーの存在の結果として区別可能な様式で変動する）を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを含有している遺伝学的に操作された細胞系を提供する段階；b）混合細胞培養物を作出するため、許容性細胞系と遺伝学的に操作された細胞系とを混合する段階；c
）ヘルペスウイルス科のメンバーの混合細胞培養物への感染を許容する条件の下で、検体をこの混合細胞培養物に接種する段階（感染は、レポーター遺伝子による区別可能な発現パターンをもたらす）；d）レポーター遺伝子の発現を検出し、それにより検体中のヘルペスウイルス科の1つまたは複数のメンバーの存在を検出する段階；ならびにe）得られた区別可能なパターンに基づき、ヘルペスウイルス科の特定のメンバーの存在を同定する段階を含む、検体中の感染性ヘルペスウイルスのタイピングのための方法も提供する。 この発現パターンは、眼による視覚的観察、分光光度的観察等を含む、様々な補助付きの方法および補助なしの方法によって、観察可能と考えられる。 （1つまたは複数の）区別可能なパターンの検出は、特定の検出法に限定されないことが意図される。 【００３９】 本発明のタイピング法の好ましい態様において、混合細胞培養物は、80％〜99
％の許容性細胞系と、1％〜20％の遺伝学的に操作された細胞系とからなる混合物である。 さらに他の好ましい態様において、細胞型は、ほぼ等しい割合で混合細胞培養物中に存在する。 記載された第一の方法と同様に、本発明は、特定のヘルペスウイルスに限定されないことが意図される。 一つの特定の態様において、
本発明の方法を使用して検出されタイピングされるヘルペスウイルス科のメンバーは、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、EBV、ならびにHHV-6、HHV-7、およびHHV-8のようなヒトヘルペスウイルスを含む群より選択される。 1個の検体において、1つまたは複数のヘルペスウイルスが検出されタイピングされうることが意図される。
このように、複数のヘルペスウイルスによる重感染が診断されうる。 例えば、本発明の方法を使用して、HSV-1およびHSV-2による混合感染が検出され、感染が区別されうることが考慮される。 【００４０】 タイピング法の一つの態様において、レポーター遺伝子は、大腸菌lacZ遺伝子を含む。 しかしながら、レポーター遺伝子はlacZに限定されないことが意図される。 実際、任意のレポーター遺伝子がこの方法において使用されうることが考慮される。 一つの特に好ましい態様において、レポーター遺伝子の検出は、組織化学的染色の使用によって達成される。 ヘルペスウイルス科のあるメンバーは、ヘルペスウイルス科の他のメンバーによってもたらされる組織化学的パターンと区別可能な組織化学的発現パターンをもたらすと考えられる。 このように、異なるヘルペスウイルスの感染を区別するため、本発明の方法を使用することが可能である。 【００４１】 本発明の方法は、関心対象の（1つまたは複数の）ウイルスについての既知の陽性対照および陰性対照と合わせて使用されると考えられる。 従って、（例えば、臨床検体に由来する）試験試料の中に存在する発現パターンが、関心対象の（
1つまたは複数の）ウイルスについて陽性および/又は陰性であることが既知の対照試料の中の発現パターンと比較されると考えられる。 CPE（これに限定されることはない）を含む、レポーター遺伝子の発現と無関係な効果が検出されると考えられる。 これらの効果は、単独で、そしてレポーター遺伝子発現と組み合わされて、ウイルス感染の存在を検出するために使用可能であり、さらに、ウイルス間を区別するための情報を提供する。 【００４２】 さらに他の態様において、本発明は、ウイルスに由来するプロモーター配列（
プロモーター配列はレポーター遺伝子と機能的に連結されており、レポーター遺伝子の発現はウイルスの存在に依存し、量的に比例している）で形質転換された遺伝学的に操作された細胞系と、ウイルス感染に対して許容性の操作されていない細胞系との組み合わせを含む混合細胞培養物を含む組成物を提供する。 【００４３】 組成物の一つの態様において、混合細胞培養物は、1％〜20％の遺伝学的に操作された細胞系と、80％〜99％の許容性細胞系とからなる混合物である。 さらに他の好ましい態様において、細胞型は混合細胞培養物中にほぼ等しい割合で存在する。 組成物の一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系成分は、リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子のためのプロモーターを含みうる。 別の好ましい態様において、プロモーターは、リボヌクレオチドレダクターゼの1つまたは複数のサブユニットをコードする遺伝子を含みうる。 一つの特に好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、BHKICP10LacZであり、もう一つの特に好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系はBH
KICP6LacZである。 組成物の別の態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、ウイルス誘導可能プロモーターの3'側に配置された大腸菌lacZ遺伝子を含む。
このlacZ遺伝子は、このウイルス誘導可能プロモーターの3'側の近傍に配置されることが考慮される。 しかしながら、これらの配列が連続しているであろうことは意図されない。 実際、レポーター遺伝子とプロモーター遺伝子とが機能的に連結されていることのみが考慮される。 さらに、組成物は、ヘルペスウイルス科のメンバー（これらに限定されることはない）を含む任意のウイルスに由来するプロモーター配列を含むと考えられる。 操作されていない細胞系は、ヘルペスウイルス科のメンバー（これらに限定されることはない）を含む任意の数のウイルスによる感染に対して許容性であることも考慮される。 【００４４】 一つの好ましい態様において、組成物は、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットをコードする遺伝子のためのプロモーターを含む遺伝学的に操作された細胞系を含み、ウイルスは、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、EBV、HHV-6、HHV-7
、およびHHV-8からなる群より選択されるヘルペスウイルス科のメンバーである。 しかしながら、本発明は特定のヘルペスウイルスに限定されないことが意図される。 一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系成分は、ICP1
0プロモーターを含有し、ヘルペスウイルス科のメンバーはHSV-2であり、もう一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系はICP6プロモーターを含み、ヘルペスウイルス科のメンバーはHSV-1である。 【００４５】 レポーター遺伝子発現の検出は、比色定量的、蛍光定量的、又は発光定量的なアッセイ法又はアッセイ系（これらに限定されることはない）を含む様々な方法を使用して達成されることが考慮される。 一つの好ましい態様において、レポーター遺伝子はβ-ガラクトシダーゼをコードする。 【００４６】 一つの態様において、組成物は、ウイルス感染に対する感受性を有する哺乳動物細胞系である遺伝学的に操作された細胞系を含む。 一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、新生ハムスター腎細胞（例えば、BHK細胞に由来する細胞系）を含む。 一つの態様において、組成物は、HSV-1およびHSV-2
（これらに限定されることはない）を含む、ヘルペスウイルス感染に対して許容性である許容性細胞系を含む。 特に好ましい態様において、許容性細胞系はMRC-
5である。 本発明の組成物は、レポーター遺伝子の発現に基づくウイルス感染の検出に限定されるものではなく、CPEのような効果も検出されうる。 【００４７】 本発明は、検体中の感染性ヘルペスウイルスの存在に関してアッセイするためのキットも提供する。 キットは、a）ヘルペスウイルス感染に対する感受性を有する遺伝学的に操作された哺乳動物細胞の細胞系（細胞系は、レポーター遺伝子と機能的に連結されたウイルスプロモーター配列を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを含有しており、レポーター遺伝子の発現は、検体中のウイルスの存在に依存し、量的に比例している）と、ウイルスに対して許容性の細胞系とから構成された混合細胞系の供給；およびb）レポーター遺伝子の発現を検出するための試薬の供給を含む。 遺伝学的に操作された細胞系の中に存在するプロモーター配列は、特定のウイルス又はウイルス科に限定されないことが意図される。 任意のウイルスプロモーターが、本発明のキットにおいて有用であると考えられる。
しかしながら、一つの好ましい態様において、ヘルペスウイルスプロモーター配列が、遺伝学的に操作された細胞系の中に存在する。 【００４８】 様々なプロモーター配列が、本発明のキットにおいて有用であると考えられる。 しかしながら、好ましい態様において、プロモーターは完全リボヌクレオチドレダクターゼをコードし、又は別の態様においては、リボヌクレオチドレダクターゼのサブユニットをコードする。 一つの特に好ましい態様において、プロモーター配列は、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットをコードする遺伝子のためのプロモーターを含有しており、ヘルペスウイルスは、HSV-1、HSV-2、
CMV、VZV、EBV、HHV-6、HHV-7、およびHHV-8からなる群より選択されたヘルペスウイルス科のメンバーである。 しかしながら、キットは、このヘルペスウイルスのリストに限定されないことが意図される。 実際、任意のヘルペスウイルスが本発明のキットを使用して検出されうることが考慮される。 キットの一つの特に好ましい態様において、プロモーター配列はICP10プロモーターを含有しており、
ヘルペスウイルス科のメンバーはHSV-2であり、別の好ましい態様において、プロモーター配列はICP6プロモーターを含有しており、ヘルペスウイルス科のメンバーはHSV-1である。 【００４９】 キットの一つの好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系の中に存在するプロモーター配列は、ヘルペスウイルス誘導可能プロモーターと機能的に連結されている大腸菌lacZ遺伝子を含む。 一つの特に好ましい態様において、遺伝学的に操作された哺乳動物細胞はBHKICP10LacZ細胞であり、別の態様において、細胞はBHKICP6LacZ細胞である。 【００５０】 一つの好ましい態様において、レポーター遺伝子は、β-ガラクトシダーゼをコードする。 しかしながら、本発明は、特定のレポーター遺伝子に限定されないことが意図される。 レポーター遺伝子はまた、比色定量的、蛍光定量的、又は発光定量的なアッセイ系のような方法（これらに限定されることはない）を含む様々な方法によって検出可能な任意の数の酵素をコードすると考えられる。 キットの一つの好ましい態様において、レポーター遺伝子発現の検出のために提供される試薬は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（5-brom
o-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）、o-ニトロフェニル-ガラクトピラノシド（o-nitrophenyl-galactopyranoside）、およびフルオセインジ-β-D
-ガラクトピラノシド（fluorescein di-β-D-galactopyranoside）の溶液（これらに限定されることはない）を含みうる。 しかしながら、キットは、これらのアッセイ系に限定されるものではなく、その他の系（例えば、放射線定量アッセイ系）も有用でありうる。 【００５１】 本発明のキットは、陽性対照および陰性対照のため好適な材料、ならびに使用説明書のような付加的な成分も含みうることが考慮される。 本発明のキットは、
レポーター遺伝子発現の検出のための混合細胞系および試薬に限定されないことが意図される。 キットは、レポーター遺伝子発現以外の、レポーター遺伝子発現とは無関係の、細胞に対するウイルスの効果の検出に有用であると考えられる。
例えば、キットはCPEの検出に有用であり得ることが考慮される。 【００５２】 本発明は、RD細胞およびヒト粘膜表皮細胞を含有している混合細胞型培養物を使用することによる、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法をさらに提供する。 特に、本発明は、a）i）エンテロウイルスを含有すると推測される試料、およびii）少なくとも2個の細胞型（細胞型はRD細胞およびヒト粘膜表皮細胞を含む）を含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料の少なくとも一部を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）エンテロウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法を提供する。
本発明は特定の粘膜表皮細胞に限定されないが、一つの好ましい態様において、
ヒト粘膜表皮細胞はH292である。 本発明はエンテロウイルス型に限定されないが、別の好ましい態様において、エンテロウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、およびポリオウイルスより選択される。 【００５３】 他の細胞型と組み合わされたCaco-2細胞を含有している混合細胞型培養物を使用することによる、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法も、本明細書において提供される。 特に、本発明は、a）i）エンテロウイルスを含有すると推測される試料、およびii）少なくとも2個の細胞型（細胞型のうちの一つはCaco-2細胞を含む）を含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料の少なくとも一部を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）エンテロウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法を提供する。 本発明は、Caco-2細胞と共に混合細胞培養物の中に用意される細胞型の型又は起源に限定されないことが意図される。 しかしながら、一つの態様において、Caco-2細胞以外の細胞型は、RD細胞、H292細胞、BGMK細胞、およびA549細胞より選択される。 本明細書において提供された方法は、エンテロウイルスの型に限定されないことが意図される。 しかしながら、一つの態様において、エンテロウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、アストロウイルス、およびアデノウイルスより選択される。 【００５４】 ミンク肺細胞を含有している混合細胞型培養物を使用したパラインフルエンザウイルスの検出および同定のための方法も、本発明によって提供される。 特に、
a）i）パラインフルエンザウイルスを含有すると推測される試料、およびii）少なくとも2個の細胞型（細胞型のうちの一つはミンク肺細胞を含む）を含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料の少なくとも一部を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）パラインフルエンザウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のパラインフルエンザウイルスの検出および同定のための方法が提供される。 本発明は、特定のミンク肺細胞型に限定されないが、一つの好ましい態様において、ミンク肺細胞はMv1Lu細胞である。 本発明は特定のパラインフルエンザウイルスにも限定されないが、方法の好ましい態様において、パラインフルエンザウイルスは1型、2型、および3型より選択される。 【００５５】 本発明は、a）i）サイトメガロウイルスを含有すると推測される試料、および
ii）MRC-5細胞と、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A5
49細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH292細胞より選択された少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）サイトメガロウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のサイトメガロウイルスの検出および同定のための方法をさらに提供する。 【００５６】 a）i）エンテロウイルスを含有すると推測される試料、およびii）CV-1細胞と、MRC-5細胞、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A549細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH292細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）
エンテロウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法も、本明細書において提供される。 【００５７】 本発明は、a）i）エンテロウイルスを含有すると推測される試料、およびii）
バッファローグリーンザル細胞と、MRC-5細胞、CV-1細胞、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A-549細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH292細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）エンテロウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のエンテロウイルスの検出および同定のための方法をさらに開示する。 【００５８】 a）i）単純ヘルペスウイルスを含有すると推測される試料、およびii）遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞と、MRC-5細胞、CV-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、McCoy細胞、A549細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH29
2細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）単純ヘルペスウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中の単純ヘルペスウイルスの検出および同定のための方法が、本開示によってさらに提供される。 【００５９】 a）i）アデノウイルスを含有すると推測される試料、およびii）A549細胞と、
MRC-5細胞、CV-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH292細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）アデノウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のアデノウイルスの検出および同定のためのさらにもう一つの方法が提供される。 【００６０】 a）i）呼吸器合胞体ウイルスを含有すると推測される試料、およびii）HEp-2
細胞と、MRC-5細胞、CV-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、McCoy細胞、
遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A549細胞、Mv1Lu細胞、およびH29
2細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）呼吸器合胞体ウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中の呼吸器合胞体ウイルスの検出および同定のための方法も、本発明において供給される。 【００６１】 a）i）インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスを含有すると推測される試料、およびii）Mv1Lu細胞と、MRC-5細胞、CV-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A549細胞、HEp-2細胞、およびH292細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）インフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスの存在に関して、接種された培養物を観察する段階を含む、試料中のインフルエンザウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスの検出および同定のための方法が、さらに提供される。 【００６２】 本発明は、a）i）呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、およびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスを含有すると推測される試料、およびii）H292細胞と、MRC-5細胞、CV-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、McCoy細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A549細胞、HEp-2細胞、およびMv1Lu細胞より選択された第一の細胞型を含む少なくとも一つの細胞型と、第二の細胞型とを含む混合細胞培養物を提供する段階；b）接種された培養物を作製するため、試料を混合細胞培養物に接種する段階；ならびにc）呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、およびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスの存在に関して、
接種された培養物を観察する段階を含む、試料中の呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより選択されたウイルスの検出および同定のための方法も提供する。 第二の細胞型は特定の細胞に限定されないが、一つの態様において、第二の細胞型は、MRC-5細胞、C
V-1細胞、バッファローグリーンザル腎細胞、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎細胞、A549細胞、HEp-2細胞、Mv1Lu細胞、およびH292細胞より選択される。 【００６３】 発明の説明 本発明は、一般に、診断微生物学の分野に関し、より具体的には、検体中に存在する1つまたは複数のウイルス又はその他の細胞内寄生体を検出し識別するための組成物および方法に関する。 本発明は、抗微生物剤に対する生物の感受性を評価するための組成物および方法も提供する。 【００６４】 本発明は、個々の各細胞系によって検出されうるよりも広範囲のウイルスおよび/又はその他の生物に対する相補的な感受性を示す、比較的等しい比率の単層として共存するよう増殖させられた細胞の混合物から構成された単一の細胞培養物ユニットにおける、臨床検体およびその他の検体の中に存在するいくつかの異なるウイルスおよびその他の細胞内生物の検出のための方法および組成物を提供する。 例えば、ウイルスアッセイ法は、ウイルスを含有すると推測される検体を細胞混合物に接種する段階、ウイルス感染周期が進行するために十分な時間を経過させる段階、続いて、検体中の感染性ビリオンの数を決定するため、ウイルス感染細胞を検出し、かつ/又はその数を定量する段階を含む。 この検出段階は、
抗原特異的抗体、核酸プローブ、およびレポーター遺伝子検出を使用した特異的ウイルス抗原検出を含む任意の数の利用可能な確認法を使用して達成されうる。
アッセイ法は、試料中に存在する感染性ビリオンの数の定量のための信頼性の高い方法および組成物も提供する。 さらに、本発明の方法および組成物は、検体中の単一ビリオンの存在が検出されうるよう十分な感度を有している。 【００６５】 本発明は、単一細胞アッセイ法において伝統的に使用されている様々な細胞型の新規な混合物を含む組成物も提供する。 好ましい態様において、細胞は、混合単層細胞培養物を作製するために混合される。 一つのそのような混合細胞培養物は、ヒト粘膜表皮細胞（例えば、NCI-H292；「H292」細胞とも呼ばれる）と共培養されたミンク肺（例えば、Mv1Lu）細胞を含む。 この細胞混合物は、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV、パラインフルエンザ1型、2型、および3型、アデノウイルス、ならびにCMVのようなウイルス（即ち、呼吸器ウイルス性疾患と最も一般的に関連しているウイルスの群）に対する感受性を有する。 他の混合培養物において、ポリオウイルス、エコーウイルス、およびコクサッキーBウイルス（例えば、コクサッキーAウイルスおよびコクサッキーBウイルス）、ならびに一部のEV株のようなエンテロウイルスの検出および同定のため、バッファローグリーンザル腎細胞（BGMK）が、NCI-H292細胞と共培養される。 本発明は、エンテロウイルスに加え、A型肝炎のようなピコルナウイルスに対する感受性を有する細胞型を包含することが考慮される。 【００６６】 本発明は、遺伝学的に操作された細胞と共培養された、単一細胞アッセイ法において伝統的に使用されている種々の細胞型の新規な混合物を含む組成物も提供する。 特に好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、ウイルス感染に対する感受性を有する、DNAによりトランスフェクトされた細胞系、ウイルス誘導可能プロモーターと酵素をコードする遺伝子とを含むキメラ遺伝子で安定的に形質転換された細胞系（酵素発現はウイルスの存在に依存している）である。 そのような遺伝学的に操作された細胞は、例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第5,418,132号に記載されている。 一つの好ましい態様において、細胞混合物は、誘導可能HSVプロモーター、HSV-1 ICP6プロモーターの後方（即ち、3'側）に大腸菌lacZ遺伝子を含有するよう操作されたゲノムを有する安定な新生ハムスター腎（BHK）細胞系（BHK/ICP6LacZ-5細胞はCRL-12072としてAT
CCより入手可能）と共培養されたヒト肺繊維芽細胞（例えば、MRC-5細胞）を含む。 この細胞混合物は、CMV、ならびにHSV 1型および2型による感染に対する感受性を有する。 【００６７】 さらにもう一つの態様において、本発明は、異なる型の遺伝学的に操作された細胞の新規な混合物を含む組成物を提供する。 特に好ましい態様において、遺伝学的に操作された細胞系は、ウイルス感染に対する感受性を有する、DNAによりトランスフェクトされた細胞、ウイルス誘導可能プロモーターと酵素をコードする遺伝子とを含むキメラ遺伝子で安定的に形質転換された細胞系（酵素発現はウイルスの存在に依存している）である。 第二の遺伝学的に操作された細胞系は、
ウイルス誘導可能プロモーターと第二の酵素（即ち、第一の細胞系と関連したものとは異なる酵素）をコードする遺伝子とを含むキメラ遺伝子で安定的に形質転換された、ウイルス感染に対する感受性を有する、DNAによりトランスフェクトされた細胞系（第二の酵素の発現は第二のウイルスの存在に依存している）である。 一つの好ましい態様において、操作されたBHK細胞（例えば、BHK/ICP6/LacZ
-5細胞）が、誘導可能CMVプロモーター（CMV UL45プロモーター）を含有するよう操作されたゲノムを有する安定なミンク肺細胞（Mv1Lu）と共培養された細胞混合物が調製される。 これらの細胞は、「MLID5」細胞と呼ばれ、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願第08/846,026号に開示されている。 この細胞混合物は、CMV、ならびにHSVウイルス1型および2型（HSV-1およびHSV-2）による感染に対する感受性を有しており、CMVは遺伝学的に操作されたBHK細胞に感染し、HSV-1およびHSV-2はミンク肺細胞に優先的に感染する。 もう一つの態様において、本発明は、誘導可能CMVプロモーターの後方（即ち、3'側）にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するよう操作された細胞ゲノムを有する遺伝学的に操作された細胞（例えば、ミンク肺細胞）の使用を考慮する。 これらの細胞も、米国特許出願第08/846,026号に記載されている。 しかしながら、本発明は特定の細胞型又は細胞系に限定されず、本発明は特定の細胞の組み合わせにも限定されないことが意図される。 本発明は、遺伝学的に操作された細胞に関しても限定されないことが意図される。 【００６８】 以下の表は、様々な細胞の、単一コンフルエント単層および共培養コンフルエント混合細胞単層を形成する能力を示すマトリックスを提供する。 【００６９】 【表１】 細胞培養物 ++は、コンフルエント単層を生じる単一細胞型を示す。 +は、ある程度の二形性混合単層を示す。 可は、分布の均一な極めて均質な様相を示す、細胞混合物を示す。 否は、機能しないと考えられた細胞混合物を示す。 *は、遺伝学的に操作されたELVIS BHK細胞を示す。 【００７０】 さらにもう一つの態様において、本発明は、感染性ウイルスの存在に関して試料をアッセイするためのキットを提供する。 これらのキット中には、特定のウイルス群（例えば、呼吸器感染/疾患に関連したウイルス）の検出および同定を容易にする混合細胞培養物が提供される。 キット中には、シェルバイアル、チューブ、又はマルチウェルプレートの中に凍結した又は分注された（即ち、使用の提供が整っている）、共培養された細胞が供給される。 これらの細胞は、試料の型によって示されるような関心対象のウイルス群による感染に対する感受性を有する。 好ましい態様において、キットは、ウイルス抗原の発現又はウイルスによって誘導されるレポーター遺伝子の発現を検出するために必要な試薬も含む。 【００７１】 本発明のいくつかの利点のうちの一つは、診断アッセイ法に適した単一混合細胞ユニットにおける、複製の可能性からの単一ウイルス型の検出および同定のための、迅速かつ高感度のアッセイ系を提供するという点である。 従って、本発明は、個々の容器において培養された多数の細胞系の必要性を消失させ、1日〜28
日ではなく、細胞培養物の接種後1日〜3日以内に信頼性の高い結果を提供し、初代細胞培養物を取り扱う必要性を消失させ、ウイルスの分類および予備同定のための効率的なスクリーニング法を提供し、かつレポーター遺伝子発現を誘導することができるウイルスに高度に特異的なアッセイ系を提供する。 従って、本発明は、明らかに、診断ウイルス学の分野で従来満たされていなかった必要性を満たす。 【００７２】 定義 本明細書および添付の特許請求の範囲の中の「試料」および「検体」という用語は、それらの最も広い意味において使用される。 一方で、それらは検体又は培養物を含むことを意味する。 他方で、それらは、生物学的試料および環境的試料の両方を含むことを意味する。 これらの用語は、尿、血液、糞便、脳脊髄液（CS
F）、精液、痰、および唾液のような体液、ならびに固形組織（これらに限定されることはない）を含む、ヒトおよびその他の動物から得られる全ての型の試料を包含する。 これらの用語は、微生物培養のための試料を得るために一般的に使用されているスワブおよびその他の試料採取装置も指す。 【００７３】 生物学的試料は、ヒトを含む動物の液体又は組織、ならびに乳製品、野菜、肉、および肉副産物のような食物の製品および成分、ならびに廃棄物でありうる。
環境的試料には、表面物質、土壌、水、および工業試料のような環境的材料、ならびに食物および乳製品を加工する器具、装置、設備、使い捨て製品、および使い捨てでない製品より得られた試料が含まれる。 これらの例は、本発明に適用可能な試料型を限定するものと解釈すべきではない。 【００７４】 生物学的試料であっても環境的試料であっても、微生物を含有すると推測される試料は、まず、微生物の「純粋培養物」を作出するため、濃縮手段に供されうる（又は、供されなくてもよい）。 本発明において、「濃縮手段」又は「濃縮処理」とは、（i）任意の培養培地および/又は技術により、関心対象の特定の微生物を他の微生物から分離するための従来の技術、ならびに（ii）特定の微生物を他の微生物から単離するための新規な技術であると考慮される。 本発明は、一つの濃縮段階又は濃縮手段の型のみに限定されないことが意図される。 例えば、試料を従来の濃縮手段に供した後、関心対象の種の株の純粋培養物が作製されるよう、得られた調製物をさらなる精製に供することは、本発明の範囲内である。 次いで、この純粋培養物は、本発明の培地および方法によって分析されうる。 【００７５】 本明細書において使用される「生物」および「微生物」という用語は、ウイルス、ならびにリケッチアおよびクラミジアを含む細菌（これらに限定されることはない）を含む、任意の種又は型の微生物をさすために使用される。 従って、その用語は、DNAウイルスおよびRNAウイルス、ならびにリケッチア目およびクラミジア目に含まれる生物（これらに限定されることはない）を包含する。 【００７６】 本明細書において使用される「培養物」という用語は、1つまたは複数の微生物を含有していると推測される任意の試料又は検体を指す。 「純粋培養物」とは、存在する生物が、特定の属および種の1個の株のみである培養物である。 これは、複数個の属および/又は種の微生物が存在する培養物である「混合培養物」
とは対照的である。 【００７７】 本明細書において使用される「細胞型」という用語は、その起源又は特徴に関わらず、任意の細胞を指す。 【００７８】 本明細書において使用される「細胞系」という用語は、初代細胞系、有限細胞系、連続細胞形、形質転換された細胞系を含む、インビボで培養された細胞を指す。 【００７９】 本明細書において使用される「初代細胞培養物」および「初代培養物」という用語は、動物又は昆虫の組織より直接得られた細胞培養物を指す。 これらの培養物は、成体組織に由来してもよいし、胎児組織に由来してもよい。 【００８０】 本明細書において使用される「有限細胞系」という用語は、老化前に、限られた回数の個体数倍加を行うことができる細胞培養物を指す。 【００８１】 本明細書において使用される「連続細胞系」という用語は、初代細胞系又は有限細胞系の中の細胞集団が、見かけ上増殖を停止するが、減少した細胞サイズ、
より高い増殖速度、より高いクローニング効率、増加した腫瘍原性、および可変性染色体補体（variable chromosomal complement）という一般的な特徴を有する細胞集団がさらに出現する「危機」を経た細胞培養物を指す。 これらの細胞は、インビトロでの自発的形質転換に起因する場合が多い。 これらの細胞は、無限の寿命を有する。 【００８２】 本明細書において使用される「形質転換された細胞系」という用語は、前記のような特徴を有する連続細胞系へと形質転換された細胞培養物を指す。 形質転換された細胞系は、腫瘍組織から直接得られてもよいし、ベクター系を使用した、
完全ウイルス（例えば、SV40又はEBV）又は形質転換ウイルスに由来するDNA断片による細胞のインビトロ形質転換によって得られてもよい。 【００８３】 本明細書において使用される「ハイブリドーマ」という用語は、2個の細胞型を融合させることにより作製された細胞を指す。 一般的に使用されているハイブリドーマには、免疫感作された動物に由来する抗体分泌B細胞の、インビトロでの無限増殖能を有する悪性骨髄腫細胞系との融合により作出されたものが含まれる。 これらの細胞は、クローニングされ、モノクローナル抗体を調製するために使用される。 【００８４】 本明細書において使用される「混合細胞培養物」という用語は、2個の細胞型の混合物を指す。 いくつかの好ましい態様において、細胞は遺伝学的に操作されていない細胞系であり、他の好ましい態様において、細胞は遺伝学的に操作された細胞系である。 いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞型が、再「許容性」（re"permissive"）である（即ち、ウイルスが、複製し、培養物中の細胞から細胞へと伝播することができる）。 本発明は、使用された細胞型が全て遺伝学的に操作されていない混合細胞培養物、1つまたは複数の細胞型が遺伝学的に操作されており、残りの細胞型が遺伝学的に操作されていない混合物、ならびに細胞型が全て遺伝学的に操作されている混合物を含む、試料中のウイルスの検出、同定、および/又は定量に適した細胞型の任意の組み合わせを包含する。 【００８５】 本明細書において使用される「細胞内寄生体の検出に適した」という用語は、
試料中の細胞内寄生体の存在を検出するために良好に使用されうる細胞培養物を指す。 好ましい態様において、細胞培養物は、細胞内寄生体の感染に対するそれらの感受性を維持し、かつ/又は細胞内寄生体の複製を支持することができる。
本発明は、特定の細胞型又は細胞内寄生体に限定されないことが意図される。 【００８６】 本明細書において使用される「感染に対する感受性を有する」という用語は、
ウイルス又はその他の細胞内生物によって感染される細胞の能力を指す。 それは、「許容性」感染を包含するが、それに限定されるものではなく、その用語は、
細胞が感染されるが、生物が必ずしも複製し、かつ/又は感染細胞からその他の細胞へと伝播することのない状況を包含する。 本明細書において使用される「ウイルス増殖」という用語は、許容性細胞型から、許容性又は感受性のいずれかを有するさらなる細胞への感染性ウイルスの伝播又は伝達を記載するものである。 【００８７】 本明細書において使用される「単層」、「単層培養物」、および「単層細胞培養物」という用語は、基板に付着しており、厚みが1個の細胞である層として増殖する細胞を指す。 単層は、フラスコ、チューブ、カバーガラス（例えば、シェルバイアル）、ローラーボトル等（これらに限定されることはない）を含む、任意のフォーマットで増殖させられうる。 細胞は、ビーズ（これに限定されることはない）を含む微小担体に接着して増殖させられてもよい。 【００８８】 本明細書において使用される「懸濁物」および「懸濁培養物」という用語は、
基板に接着せずに生存し増殖する細胞を指す。 懸濁培養物は、典型的には、造血細胞、形質転換された細胞系、および悪性腫瘍由来の細胞を使用して作製される。 【００８９】 本明細書において使用される「培養培地」および「細胞培養培地」という用語は、インビトロの細胞（即ち、細胞培養物）の増殖の支持に適した培地を指す。
その用語は、任意の特定の培地に限定されないことが意図される。 例えば、その定義は、増殖培地および維持培地を包含することが意図される。 実際、その用語は、関心対象の細胞培養物の増殖に適した任意の培養培地を包含することが意図される。 【００９０】 本明細書において使用される「絶対細胞内寄生体」（又は、「絶対細胞内生物」）という用語は、その生存および/又は複製のために細胞内環境を必要とする任意の生物を指す。 絶対細胞内寄生体には、ウイルス、ならびにある種の細菌（
例えば、リケッチア目 [例えば、コキシエラ（Coxiella）、リケッチア、およびエールリキア（ehrlichia）]およびクラミジア目[例えば、C.トラコマチス、C.
シタチ（psittaci）］の大部分のメンバー等）を含むその他の多くの生物が含まれる。 「細胞内寄生体」という用語は、上記の絶対細胞内寄生体（これに限定されることはない）を含む、宿主動物の細胞内に見出されうる任意の生物を指す。
例えば、細胞内寄生体には、ブルセラ（Brucella）、リステリア（Listeria）、
ミコバクテリウム（Mycobacterium）（例えば、M.ツベルクローシス（tuberculo
sis）およびM.レプレ（leprae））、およびプラモジウム（Plasmodium）、ならびにロカリメア（Rochalimea）のような生物が含まれる。 【００９１】 本明細書において使用される「抗微生物剤」という用語は、微生物の増殖を阻害するか、又は微生物を殺傷する任意の化合物に関して使用される。 その用語は、その最も広い意味で使用されるものとし、天然又は合成により作製された抗生物質（これらに限定されることはない）のような化合物を含む。 その用語には、
微生物の増殖を阻害するか、又は微生物を殺傷するために有用な化合物および要素も含まれることが意図される。 【００９２】 本明細書において使用される「色原性化合物」および「色原性基質」という用語は、吸光特徴又は放出特徴による検出系において有用な任意の化合物を指す。
その用語は、視覚的に又は光学機器により検出可能な可溶性および不溶性の任意の酵素切断産物を包含することが意図される。 「色原性」という呼称には、色の変化として検出可能な最終生成物を生成させる全ての酵素基質が含まれる。 これには、インディゴ、青、赤、黄、緑、橙、茶等のような通常の意味の「色」として使用されるような任意の色、ならびに蛍光により検出可能な色（例えば、フルオレセインの黄緑、ローダミンの赤等）を生成させる蛍光色性又は蛍光原性の化合物（これらに限定されることはない）が含まれる。 色素（例えば、pH）および発光原性化合物のようなその他の指標も、この定義に包含されることが意図される。 【００９３】 本明細書において使用される「pH指標」、「酸化還元（redox）指標」、および「酸化-還元指標」という用語は、その一般的に使用されている意味を有することが意図される。 従って、「pH指標」には、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクロロフェノールブルー、m-クレゾールパープル、チモールブルー、ブロモクレゾールパープル、キシレノールブルー、メチルレッド、メチルオレンジ、およびクレゾールレッド（これらに限定されることはない）を含む、
pH変化の検出のために一般的に使用されている全ての化合物が包含される。 「酸化還元指標」および「酸化-還元指標」という用語には、様々な型又は形態のテトラゾリウム、レゾアズリン、およびメチレンブルー（これらに限定されることはない）を含む、酸化/還元電位（即ち、「eH」）の検出のために一般的に使用されている全ての化合物が包含される。 【００９４】 本明細書において使用される「接種懸濁物」又は「接種物」という用語は、試験される生物の接種を受けることができる懸濁物に関して使用される。 「接種懸濁物」という用語は、特定の液体又は液状物質に限定されないことが意図される。 例えば、接種懸濁物は、水、生理食塩水、又は水性溶液から構成されうる。 接種懸濁物は、水、生理食塩水、又は任意の水性材料が添加される成分を含むことも考慮される。 一つの態様において、成分は、意図された微生物に関して有用な少なくとも一つの成分を含むことが考慮される。 本発明は、特定の成分に限定されないことが意図される。 【００９５】 本明細書において使用される「キット」という用語は、試薬およびその他の材料の組み合わせに関して使用される。 【００９６】 本明細書において使用される「初代単離」という用語は、試料から生物を直接培養する過程を指す。 本明細書において使用される「単離」という用語は、維持および/又は使用のための生物のストック培養物の「継代」又は「移植」を含む、初代単離であっても、又は任意の後続の培養であってもよい、生物の任意の培養を指す。 【００９７】 本明細書において使用される「推定的診断」という用語は、患者の疾患に関与している病原生物に関して、治療を行う医師に、何らかの指針を与える、予備的な診断を指す。 本明細書において使用される推定的診断とは、微生物の予備的な同定をさす「推定的同定」に基づく場合が多い。 【００９８】 本明細書において使用される「決定的診断」という用語は、患者の疾患の病原体が同定される最終的な診断を指す。 「決定的診断」という用語は、属および/
又は種のレベルでの生物の最終的な同定に関して使用される。 【００９９】 本明細書において使用される「組換えDNA分子」という用語は、分子生物学的技術によって接合させられたDNAのセグメントから構成されているDNA分子を指す。 【０１００】 一つのモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸が、その隣の3'酸素へと接着するよう、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドが作成されるため、
DNA分子は、「5'末端」および「3'末端」を有すると言われる。 従って、オリゴヌクレオチドの末端は、5'リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3'酸素と連結されていない場合、「5'末端」と呼ばれ、3'酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸と連結されていない場合、「3'末端」と呼ばれる。 本明細書において使用されるように、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在する場合であっても、5'末端および3'末端を有すると言われ得る。 直鎖状又は環状のDNA分子において、別個の要素は、「下流」又は3'側の因子の「上流」又は5'側に存在すると呼ばれる。 この用語法は、転写がDNA鎖に沿って5'側から 3'側へと進行するという事実を反映している。 連結された遺伝子の転写を指図するプロモーター因子およびエンハンサー因子は、一般に、コード領域の5'側又は上流に配置される（エンハンサー因子は、プロモーター因子およびコード領域の3'側に配置された場合であっても、効果を発揮しうる）。 転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルは、コード領域の3'側又は下流に配置される。 【０１０１】 「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド]という用語は、遺伝子のコード領域を含むDNA配列、又は換言すると遺伝子産物をコードするDNA配列を指す。コード領域は、cDNA又はゲノムDNAのいずれかの形態で存在しうる。エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナル等のような適当な調節因子は、転写の適切な開始、および/又は一次RNA転写物の正確なプロセシングを許容するために必要である場合、遺伝子のコード領域の極めて近傍に配置されうる。又は、本発明のベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性のエンハンサーおよび/又はプロモーター、スプライス部位、
介在配列、ポリアデニル化シグナル等、又は内因性調節因子および外因性調節因子の両方の組み合わせを含有していてもよい。 【０１０２】 本明細書において使用される「転写単位」という用語は、転写開始部位と転写終結部位との間のDNAセグメント、ならびに効率的な開始および終結のために必要な制御因子を指す。 例えば、エンハンサー/プロモーター、コード領域、終結配列、およびポリアデニル化配列を含むDNAセグメントが、転写単位を含む。 【０１０３】 本明細書において使用される「制御因子」という用語は、核酸配列の発現のいくつかの局面を調節する遺伝学的因子を指す。 例えば、プロモーターは、機能的に連結されたコード領域の転写の開始を容易にする制御因子である。 その他の制御因子は、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル等（下記定義）である。 【０１０４】 本明細書において使用される「レポーター遺伝子構築物」又は「レポーター遺伝子ベクター」という用語は、レポーター遺伝子の産物をコードする配列、および特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現にとって必要な適当な核酸配列を含有している組換えDNA分子を指す。 真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル、およびポリアデニル化シグナルを利用することが既知である。 【０１０５】 「レポーター遺伝子」という用語は、異種のプロモーターおよび/又はエンハンサー因子と機能的に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーターおよび/又はエンハンサー因子の活性化に必要な因子を含有している（又はそれを含有するようにされうる）細胞へ導入された場合に、容易に、かつ定量可能にアッセイされる遺伝子産物（典型的には、酵素）をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。 レポーター遺伝子の例には、β-ガラクトシダーゼをコードする細菌遺伝子（lacZ）、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、およびβ-グルクロニダーゼをコードする遺伝子（GUS）（これらに限定されることはない）が含まれる。 【０１０６】 真核生物における転写調節シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれる。 プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与している細胞タンパク質と特異的に相互作用するDNA配列の短いアレイからなる（M
aniatisら、Science 236:1237[1987]）。 プロモーター因子およびエンハンサー因子は、酵母、昆虫、および哺乳動物の細胞、ならびにウイルスの遺伝子（類似調節因子[即ち、プロモーターは原核生物にも見い出される]）を含む、様々な真核生物起源より単離されている。 特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現するために使用される細胞型に依存する。 広い宿主域を有する真核生物のプロモーターおよびエンハンサーも存在し、一方で限定された細胞型のサブセットにおいてのみ機能性であるものも存在する（概説については、Vossら、Trends Biochem.Sci.、11: 287[1986]、およびManiatisら[1
987]前記参照）。 例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種に由来する極めて多様な細胞型において極めて高い活性を有し、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のため広く使用されている（Dijkemaら、EMBO J.4：761[1
985]）。 広範囲の哺乳動物細胞型における活性を有するプロモーター/エンハンサー因子の他の二つの例は、ヒト伸長因子1α遺伝子に由来するもの（Uetsukiら、J.Biol.Chem.、264：5791[1989]；Kimら、Gene 91：217[1990]；ならびにMizu
shimaおよびNagata、Nuc.Acids.Res.、18：5322[1990]）、およびラウス肉腫ウイルス（Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777[1982]）、およびヒトサイトメガロウイルス（Boshartら、Cell 41：521[1985]）の末端反復配列である。 【０１０７】 「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するDNAセグメントをさす（例えば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含有している）。 エンハンサー/プロモーターは、「内因性」又は「外因性」もしくは「異種」でありうる。 内因性エンハンサー/プロモーターとは、ゲノムにおいて特定の遺伝子と天然に連結されているものである。 外因性（異種）エンハンサー/プロモーターとは、遺伝学的操作（即ち、分子生物学的技術）により遺伝子に並置されたものである。 【０１０８】 発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、組換え転写物の発現レベルを増加させる場合が多い。 スプライシングシグナルは、一次RNA転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターからなる（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cl
oning： A Laboratory Manual）」第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、New York [1989]、16.7-16.8頁）。 一般的に使用されているスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位は、SV40の16S DNAに由来するスプライス部位である。 【０１０９】 真核細胞における組換えDNA配列の効率的な発現は、得られた転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指図するシグナルを必要とする。 転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出され、数百ヌクレオチド長である。 本明細書において使用される「ポリA部位」又は「ポリA配列」という用語は、新生RNA転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指図するDNA配列を意味する。 ポリAテールを欠いた転写物は不安定であり迅速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。 発現ベクターにおいて利用されるポリAシグナルは、「異種」又は「内因性」でありうる。 内因性ポリAシグナルとは、ゲノムにおいて特定の遺伝子のコード領域の3'末端に天然に見出されるものである。 異種ポリAシグナルとは、ある遺伝子から単離され、もう一つの遺伝子の3'側に配置されたものである。 一般的に使用されている異種ポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。 SV40ポリAシグナルは、237bpのBamHI/BclI制限断片上に含まれており、終結およびポリアデニル化の両方を指図する（Sambro
ok.（前記）16.6〜16.7）。 この237bp断片は、671bp BamHI/PstI制限断片内に含まれている。 【０１１０】 「遺伝学的に操作された細胞系」という用語は、分子生物学的技術（即ち、組み換えDNA技術）によって細胞系へ導入された異種DNAを含有している細胞系を指す。 【０１１１】 「安定なトランスフェクション」又は「安定的にトランスフェクトされた」という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来DNAの導入および組み込みを指す。 「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムDNAへ安定的に組み込まれた外来DNAを有する細胞を指す。 【０１１２】 「安定なトランスフェクション」（又は「安定的にトランスフェクトされた」
）という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来DNAの導入および組み込みを指す。 「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムDNA
へ安定的に組み込まれた外来DNAを有する細胞を指す。 【０１１３】 本明細書において使用される「選択可能マーカー」という用語は、選択可能マーカーが発現されている細胞に、抗生物質又は薬物に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子の使用を指す。 選択可能マーカーは、「優性」でありうる。 優性選択可能マーカーは、任意の哺乳動物細胞系において検出されうる酵素活性をコードする。 優性選択可能マーカーの例には、哺乳動物細胞における薬物
G418に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに耐性を付与する細菌ハイグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ（hyg）遺伝子、ミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を付与する細菌キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも呼ばれる）が含まれる。 関連酵素活性を欠く細胞系と共に使用されなければならない、優性でない選択可能マーカーも存在する。 非優性選択可能マーカーの例には、tk
-細胞系と合わせて使用されるチミジンキナーゼ（tk）遺伝子、CAD欠損細胞と合わせて使用されるCAD遺伝子、およびhprt -細胞系と合わせて使用される哺乳動物ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hprt）遺伝子が含まれる。 哺乳動物細胞系における選択可能マーカーの使用の概説は、Sambrookら（前記）16.9〜16.15
頁に提供されている。 【０１１４】 「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、および「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。 これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。 従って、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。 【０１１５】 付着細胞系に関して本明細書において使用される「コンフルエント」又は「コンフルエンシー」という用語は、培養物全体の細胞が相互に接触し、細胞の連続的なシート又は「単層」のような様相を作出しているような状態を定義する。 【０１１６】 本明細書において使用される「細胞変性効果」又は「CPE」という用語は、ウイルスのような外的な病原体に起因する細胞構造の変化（即ち、病理学的効果）
を記載するものである。 一般的な細胞変性効果には、細胞破壊、合胞体（即ち、
融合した巨大細胞）の形成、細胞周囲の液胞の形成、および封入体の形成が含まれる。 CPEは、許容性細胞宿主の生存維持に必要な機能を果たす能力に負の影響を与える、許容性細胞に対するウイルスの作用に起因する。 インビトロ細胞培養系では、コンフルエント単層の一部としての細胞が、ウイルスを含有している検体との接触の後に非コンフルエントな領域を示した場合に、CPEが出現する。 観察される微視的な効果は、一般に、焦点性であり、焦点は単一のビリオンによって開始される。 しかしながら、試料中のウイルス負荷量によっては、十分な時間のインキュベーションの後、CPEが単層全体に観察されうる。 ウイルスによって引き起こされたCPEを示す細胞は、通常、丸形へと形態を変化させ、長い時間をかけて死滅し、単層中のそれらの固着点から放出されうる。 多くの細胞が焦点性破壊点に達した時点で、単層中に穴として現われるその区域は、ウイルスプラークと呼ばれる。 細胞変性効果は、当業者によって容易に判別可能かつ区別可能である。 【０１１７】 「ONPG」という略語は、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドを表す。
ONPGは、酵素β-ガラクトシダーゼ（β-gal）の基質である。 ONPGとβ-galとの反応は、405nmにおいて分光光度的に定量されうる黄色の生成物を生成させる。 【０１１８】 「X-gal」という略語は、酵素β-ガラクトシダーゼの基質である化学化合物5-
ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを表す。 X-galとβ-ガラクトシダーゼとの反応は、視覚的に区別可能な青色沈殿物の形成をもたらす。 【０１１９】 「ハイブリウィックス（hybriwix）」という用語は、DNAハイブリダイゼーションによって感染細胞単層中のある種のウイルスDNAの定量を可能にする、ダイアグノスティックハイブリッド（Diagnostic Hybrids,Inc.）（Athens、Ohio）
の製品を表わす。 「DNAハイブリダイゼーション」とは、塩基配列が、塩基対形成の規則に従い対合する2個の相補DNA分子のアニーリングである。 DNAハイブリダイゼーションは、既知のDNA又は「プローブ」へのハイブリダイゼーションにより、未知又は「標的」DNAを同定又は定量するために使用される。 プローブは、典型的には、ガンマ計数器により検出および定量が可能な放射性同位体
125 Iのようなレポーター分子で標識される。 【０１２０】 本明細書において使用される「プラーク減少アッセイ法」又は「PRA」という用語は、薬物に曝露された細胞単層におけるプラーク形成の減少を計数することにより、抗ウイルス薬の抗力を決定するために使用される標準的な方法である。
「プラーク」とは、限局された「CPE」の区域である。 通常は、単一の感染性ウイルスが細胞単層に感染し、次いでそれが複製され、単層の隣接細胞へと伝播した結果である。 プラークは「ウイルス感染焦点」と呼ばれる場合もある。 【０１２１】 本明細書において使用される「許容性」という用語は、ウイルスとその推定宿主細胞との一連の相互作用事象を記載するものである。 その過程は、宿主細胞表面へのウイルス吸着から開始し、感染性ビリオンの放出で完了する。 他の細胞へのウイルスの伝播を容易に許容する場合、その細胞は「許容性」である。 プラーク減少アッセイ法、ゲル電気泳動から得られた結果に基づくウイルスタンパク質の産生の比較および/又は定量、DNA又はRNAの含有量を分析するためのハイブリダイゼーション分析を使用した相対的比較等を含む多くの方法が、特定の細胞系の許容性の決定のため、利用可能である。 【０１２２】 本明細書において使用される「感受性」という用語は、許容性宿主細胞又は非許容性宿主細胞がウイルスに吸着し、ウイルスの侵入を受ける程度を記載する。
侵入を受けることができるが、ビリオンを放出することはできない細胞系は、許容性は有しておらず、感受性を有している。 【０１２３】 本明細書において使用される「追加播種（seed on）」という用語は、表面に付着した細胞を含有している容器へ懸濁細胞の水性溶液を移し、その後、懸濁細胞又は「種」が重力によって沈降し、比較的均質に付着細胞に接着し、混合物として最終細胞単層へ組み込まれるようになるのに十分な時間、その容器を保存する行為を記載するものである。 「混合細胞単層」は「追加播種」過程に起因する。 【０１２４】 本明細書において使用される「混合播種（seed in）」という用語は、各々異なる細胞特性を有している2個以上の懸濁組織培養細胞の水性溶液を混合し、そのような細胞混合物を容器に移し、懸濁細胞が重力によって沈降し、任意の単一細胞型の分布が、最初の混合物の中の細胞の相対比率の指標となるよう、比較的均質に接着するようになるのに十分な時間、その容器を保存することを記載するものである。 【０１２５】 本明細書において使用される「スタート（starts）」という用語は、ウイルスの一次感染を表すレポーター細胞を指す。 ウイルスがレポーター細胞（遺伝学的に操作された細胞）に感染し、レポーター遺伝子の発現を誘導する。 レポーター細胞は、非許容性であるが（即ち、レポーター細胞の許容性は必要でない）、それでもスタートを作製するものでありうる。 【０１２６】 実施例 以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様および局面を例証し、さらに例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。 【０１２７】 以下の実施例の開示において、以下の略語が適用される：eq（当量）；M（モル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；N（規定）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；l又はL（リットル）；ml（
ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；×g（重力加速度）；℃（摂氏温度）；FBS（胎児ウシ血清）；PBS（リン酸緩衝生理食塩水；HEPE
S（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]）；HBSS（ハンクス平衡塩溶液）；MEM（最小必須培地）；EMEM（イーグル最小必須培地）；B
BL（Becton Dickinson Microbiology Systems、Cockeysville、MD）；DIFCO（DI
FCO Laboratories、Detroit、MI）；USBiochemical(USBiochemical Corp.、
Cleveland、OH)；Chemicon(Chemicon,Inc.、Temecula、CA)；Dako(Dako Corpora
tion、Carpinteria、CA)；Fisher(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)；Sigma
(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO.)；ATCC(American Type Culture Collecti
on、Rockville、Maryland)；Bartel製(Bartels、Issaquah、WA)；およびBioWhit
taker(BioWhittaker、Walkersville、MD)。 【０１２８】 本発明の開発中に使用され、以下の実施例に記載された細胞は、BioWhittaker
より得られたBGMK細胞およびPRMK細胞、ならびにATCCおよびBioWhittakerの両方から得られたMRC-5細胞を除き、ATCCより得られた。 細胞のATCC番号を、以下の表に示す。 【０１２９】 【表２】 ATCC細胞系 【０１３０】 実施例1 細胞の共培養 本実施例においては、単一の二形性の細胞シートがコンフルエンシーで作製される混合細胞培養物を確立した。 【０１３１】 これらの実験では、全ての細胞系を、25mM HEPES、7％胎児ウシ血清（FBS）、
2mM L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシン（各々、培地1ml当たり100単位/100μg）を含むEMEM（イーグル最小必須培地）において、無菌ポリスチレンフラスコ内でコンフルエンシーにまで培養した。 【０１３２】 まず、マグネシウム又はカルシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）で起源細胞単層を濯ぐことにより、培養すべき細胞を採集した。 細胞系によっては、細胞単層に直接、トリプシン（カルシウム又はマグネシウムを含まないHBSS中
0.125％）又はトリプシン-EDTA（カルシウム又はマグネシウムを含まないHBSS中
1mM EDTA中0.25％）を添加し、室温でおよそ5分間インキュベートすることにより細胞を解離させた。 10倍容量の細胞培養培地を、トリプシン処理された各細胞懸濁物に添加し、ほぼ単一の細胞懸濁物（即ち、細胞塊を含まない）が作製されるよう、細胞を繰り返しピペッティングした。 96穴マイクロタイタープレート内での2日間〜3日間のインキュベーションでコンフルエントな細胞単層を生成させるのに適した細胞懸濁物の光学密度を作製するため、トリプシン処理された各細胞懸濁物を妥当な容量の培養培地で希釈した。 単一細胞単層（即ち、1ウェル当たり1個の細胞型）については、各ウェルに接種するために懸濁物0.2mlを使用した。 例えば、最終的な細胞調製物の500nmにおける最終光学密度は、CV-1細胞についての0.012OD単位/mlから、HEp-2細胞についての0.03OD単位/mlまでの範囲であった。 【０１３３】 等量の各希釈細胞懸濁物を用いて、2個の別個の細胞型を共定植することにより、細胞混合物単層を作製した（即ち、各細胞型0.1mlを、96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに接種するために使用した）。 30〜60分間重力によって細胞をウェル表面に接着させ、接種されたマイクロタイタープレートを、95％相対湿度で、5％CO
2の中で、36℃で、最長3日間インキュベートした。 【０１３４】 インキュベーション中、定期的に、単一単層および混合単層を全体生存率に関してチェックした。 混合細胞培養物単層は、ほぼ等しい各細胞型の密度で、二つの別個の細胞形態（即ち、二形性細胞シート）を有する単一細胞シート（即ち、
単一単層）として共存し発展する細胞系の能力に関してもチェックした。 コンフルエンシーになった時点で、光学顕微鏡を使用した可視化のための対比を提供するため、細胞を固定し、淡青色に染色するため、メチレンブルー染色溶液で細胞を処理した。 【０１３５】 混合単層のうちのいくつかは、ウェル表面に付着し、滑らかで均一に分布した単層を示す混合細胞単層として良好に増殖した。 これらの混合培養物を「形態カテゴリー1」と名付けた。 これらの培養物では、各細胞型が容易に区別可能であり、混合単層中で高率に生存し、単一細胞分布の様相を与えた。 HEp-2細胞とMcC
oy細胞とから構成された混合単層が、この形態を示した。 【０１３６】 混合単層のうちのいくつかは、ウェル表面に付着した混合単層として良好に増殖したが、コンフルエンシーになった時点で、二つの別個の形態を示した。 これらの混合培養物を、「形態カテゴリー2」と名付けた。 これらの培養物においては、各細胞系の隔離された別個のパッチが単層内に共存し、油の水との混合の様相を与えた。 メカニズムの理解は本発明を使用するためには必要でないが、この様相は2個の特定の細胞型間の接触阻止の結果である可能性が最も高い。 パッチの相対サイズは、主に、細胞定植時、細胞がどの程度均一に分布されたかの関数であることが見い出された。 定植時の細胞分布が均一であるほど、パッチ又は島は、単層がコンフルエンシーに達した際、より小さかった。 この様相を生じた単層の例は、NCI-H292細胞と共培養されたミンク肺細胞、バッファローグリーンザル腎（BGMK）細胞と共培養されたミンク肺細胞、およびNCI-H292細胞と共培養されたヒト肺癌A549細胞であった。 【０１３７】 しかしながら、同培養培地への定植時、比較的等しい数で混合された場合、いくつかの細胞型は、混合細胞単層を生じることができなかった。 これらの培養物のうちのいくつかにおいては、細胞型のうちの一つのみが生存可能であった（即ち、培養物は事実上、単一細胞型であった）。 混合単層の作製に適していないことが見出された混合細胞培養物の例には、BGMK細胞と共培養されたヒト胎児肺繊維芽細胞（MRC-5細胞）が含まれる。 この混合物においては、MRC-5細胞が、定植の直後に毒性となり死細胞の塊を形成する。 従って、コンフルエンシーの時点で、単層は、1個の機能性の生存可能な細胞型、BGMK細胞のみを含有している。 従って、細胞が、滑らかな、又は二形性の混合細胞単層を作製することができなかったため、この細胞混合物は、混合細胞単層の作製には適していないことが見出された。 【０１３８】 実施例2 混合細胞培養物における呼吸器ウイルスの検出 本実施例においては、混合細胞培養物を、臨床検体中に存在するインフルエンザA、RSV、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、およびインフルエンザBを含む様々な呼吸器ウイルスを検出するために使用した。 これらの実験において使用された混合細胞は、Mv1Lu（ミンク肺細胞）およびNCI-H292（ヒト粘膜表皮細胞）であった。 【０１３９】 細胞系 Mv1Lu細胞およびH292細胞のコンフルエントT-225フラスコを、HEPES、10％FBS
、2mM L-グルタミン、および50μg/mlゲンタマイシンを含むEMEM中に調製した。
まず、マグネシウムおよびカルシウムを含まない30mlのHBSSで濯ぐことにより、
細胞を採集を採集した。 次いで、実施例1に記載されたような7mlのトリプシン-E
DTA溶液への短時間（即ち、フラスコの底から細胞が浮遊するまで）の曝露により、細胞をフラスコから解離させた。 次いで、細胞懸濁物濃縮物を調製するため、30mlの培地を細胞へ添加した。 3mlの細胞を使用して、各細胞懸濁物の光学密度を500nmで決定した。 典型的には、OD読み取り値は、Mv1Lu細胞およびH292の細胞両方について0.2/mlであった。 Mv1Lu細胞およびH292細胞に加え、アカゲザル腎細胞（PRMK）、A549細胞、およびMDCK細胞を、本実施例において使用した。 これらの追加の細胞系は、当分野において既知のような単一細胞培養物で調製した。 【０１４０】 混合細胞培養物 各細胞型の許容される作業比率を提供するため、各細胞懸濁物の濃度が、0.2O
D単位/mlであると決定された時点で、5.2mlのMv1Lu細胞懸濁物および8.7mlのH29
2細胞懸濁物を、86.1mlの培地に添加した（即ち、希釈混合細胞の調製物であった）。 希釈混合細胞の定植後1日〜3日以内に、各細胞型が実質的に同等の表面積をカバーするコンフルエント単層が達成されるよう、この比率は工夫された。 分注の前に、希釈混合細胞の均質な懸濁物が調製されるよう留意した。 混合細胞を、ガラスシェルバイアル（即ち、無菌のガラスカバーガラスを含有しているガラスバイアル）1個当たり0.75mlで分注した。 定植後、細胞が重力によって沈降し、各細胞型のより最適な細胞分布を生じるように、バイアルを室温で60分間放置した。 次いで、混合細胞を、95％相対湿度で、5％CO
2で、36℃で、1日間〜3日間インキュベートした。 続いて、コンフルエンシー到達から最長10日間、実質的に同等の表面比率で各細胞型を維持するために、シェルバイアルを室温で保存した。 【０１４１】 試料および加工 診断ウイルス学研究室に提示された鼻咽頭検体は、インフルエンザ様徴候を示す患者より得られたものであった。 直接抗原試験用の細胞ペレット、および様々な細胞培養物の接種のための検体上清を作製するため、検体を遠心分離した。 細胞懸濁物を調製するため、細胞ペレットをリン酸緩衝液に再懸濁させ、細胞懸濁物の一部25μlを、ガラススライド上にスポットし、乾燥させた。 次いで、スライド上の各細胞スポットを、固定剤（例えば、アセトン）で固定し、インフルエンザAおよびRSV、ならびにその他の呼吸器ウイルスを含む様々な呼吸器ウイルスを認識することができる各抗体溶液（Bartel製）と共に30分間インキュベートした。 フルオレスセイン（FITC）標識ヤギ抗マウス抗体およびた対比染色剤（Bart
el製）を含有している二次抗体溶液を、スライド上の各細胞スポットをカバーするために添加し、35℃〜37℃で、さらに30分間インキュベートした。 FITC-ヤギ抗マウス抗体溶液中の対比染色剤は、細胞を染色し、蛍光下で赤色を呈するエバンスブルーを含有している。 鼻咽頭検体から調製されたスライドを、×100〜×4
00で、エピフルオレセンス（epifluorescence）を使用して、陽性の（即ち、ウイルス感染した）青リンゴ色に染色された蛍光細胞に関して観察した。 【０１４２】 さらに、検体上清の一部0.2mlを、ガラスカバーガラスを含有しているシェルバイアルの中で調製された様々な細胞培養物へと接種した。 細胞培養物は、前記と同様にして作製された、単一細胞単層としての初代アカゲザル腎細胞（PRMK；
ViroMed又はBioWhittaker）、Mv1Lu細胞（Diagnostic Hybrids）、HEp-2細胞（D
iagnostic Hybrids）、MDCK細胞、A549細胞、およびH292細胞、ならびにMv1Lu細胞とH292細胞との混合細胞単層を含んでいた。 【０１４３】 接種された各シェルバイアルを、700×gで60分間遠心分離し、次いで適切な培養培地（例えば、0.5〜2％FBS、2mM L-グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシン[各々、培地1ml当たり100単位/100μg］を含有しているEMEM）の中で、36℃で、1日間〜3日間インキュベートした。 インキュベーション後、容器を傾けて培養培地を捨て、アセトンおよびメタノール（50：50v/v）の溶液を用いて、細胞をガラスカバーガラスに固定した。 インフルエンザAおよびRSV、ならびにその他の呼吸器ウイルスを含む複数の呼吸器ウイルスに対するモノクローナル抗体のプールを含有している抗体溶解（Chemicon又はBartel製）を、各カバーガラスをカバーするために添加した。 次いで、カバーガラスを35℃〜37℃で30分間インキュベートした。 次いで、抗体溶液を除去し、カバーガラスをPBSで濯いだ。
フルオレセイン（FITC）標識ヤギ抗マウス抗体および対比染色剤（Bartel製）を含有している二次抗体溶液を、各カバーガラスをカバーするために添加し、35℃
〜37℃でさらに30分間インキュベートした。 FITC-ヤギ抗マウス抗体溶液中の対比染色剤は、細胞を染色し、蛍光下で赤色を呈するエバンスブルーを含有している。 鼻咽頭検体より調製されたシェルバイアルカバーガラスを、×100〜×400で、エピフルオレセンスを使用して、陽性の（即ち、ウイルス感染した）青リンゴ色に染色された蛍光細胞に関して観察した。 【０１４４】 結果 いくつかの検体が、インフルエンザAモノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞スポット上の陽性直接抗原反応を示した。 これらの検体は、単一細胞Mv1Luカバーガラス上およびMv1Lu/H292混合細胞カバーガラス上の蛍光染色も示したが、単一細胞H292カバーガラス上には全く又はごくわずかにしか蛍光が示されなかった。 H292細胞は、インフルエンザAのこの株に対する感受性を有していないか、又は感染が検出不可であるような有意に低い感受性を有している。 さらに、いくつかの場合（即ち、低いウイルス力価を有する検体）においては、培養系の方が、直接抗原検出法よりも高感度であった。 また、単一PRMK細胞培養物（即ち、インフルエンザAを検出するために使用されている「最高標準」）が、
インフルエンザAの存在に関して陽性であったが、多くの検体で、感染細胞数および陽性検体総数は、混合細胞単層によって陽性と同定されたものより少なかった。 【０１４５】 さらに、MDCK細胞およびPRMK細胞の両方が、直接抗原試験（IFA）によりインフルエンザAに関して陽性であった一つの低力価検体、およびやはりIFAによりインフルエンザAに関して陽性であったもう一つの検体を検出しなかったが、Mv1Lu
細胞は、直接抗原検出（IFA）に基づき陽性と決定された全ての試料において、
ウイルスを検出した。 【０１４６】 いくつかの検体は、RSVモノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞スポット上の陽性直接抗原反応を示した。 これらの検体は、単一細胞H292カバーガラス上およびMv1Lu/H292混合細胞カバーガラス上にも蛍光染色を示したが、単一細胞MV1Luカバーガラス上には全く、又はほとんど蛍光が示されなかった。 H29
2細胞はRSV感染に対する感受性を有しているが、Mv1Lu細胞は感受性を有していない（又は、感染が検出不可であるような有意に低い感受性を有している）。 混合細胞培養物に加え、HEp-2細胞（即ち、インフルエンザAを検出するために使用されている「最高標準」）も、RSVの存在に関して観察され、HEp-2細胞の性能は、一般に、Mv1LuとH292との混合細胞単層、又はH292単一細胞単層のそれより低感度であった。 これらの細胞を使用したインフルエンザAの検出は従来記載されていないため、ミンク肺細胞において試験されたインフルエンザAを用いたこれらの結果は、極めて驚くべきものであった。 【０１４７】 直接抗原試験（IFA）に基づき5つの臨床検体から同定されたアデノウイルスは、H292および細胞培養物において検出されたが、PRMK細胞は低力価検体のうちの
2個を検出しなかった（即ち、2個の偽陰性が存在した）。 従って、H292および混合培養物は、アデノウイルスの検出に関してPRMKより高感度であった。 A549細胞は、わずかに多い陽性細胞を提供しうるが、292細胞、混合細胞培養物、およびA
549細胞は、等しい数の陽性検体を検出した。 【０１４８】 パラインフルエンザウイルスも、H292および混合細胞培養物において検出されたが、PRMK細胞は1個の低力価検体を検出しなかった。 【０１４９】 これらの結果は、混合細胞培養物が、単一細胞（H292およびMv1Lu）培養物と等しい感度を有していたことを明らかに示している。 従って、混合細胞は、診断ウイルス学研究室において現在一般的に使用されている単一細胞培養物と同じレベルの呼吸器ウイルス検出感度を提供すると共に、材料、時間、スペース、および労力の節約を提供する。 【０１５０】 インフルエンザB検体 前述の試料に加え、ATCCより得られた複数のインフルエンザB株の様々な希釈物を、MDCK細胞、Mv1Lu細胞、およびPRMK細胞において試験した。 下記表は、これらの実験の結果を提供する。 この表中、「MD」とは「メリーランド（Maryland
）」株をさし、「HK」とは「香港（Hong Kong）」株をさし、「TW」とは「台湾（Taiwan）」株をさし、「MA」とは「マサチューセッツ（Massachusetts）」株を指す。 【０１５１】 【表３】 MDCK細胞、ML細胞、およびPRMK細胞による原型ウイルスからのインフルエンザB型ウイルス検出の比較 【０１５２】 これらの結果は、Mv1Lu、MDCK、およびPRMKが、複数のインフルエンザBウイルス株の検出に関してほぼ同等であることを示している。 従って、これらの細胞系は、このウイルスの同定のための混合細胞培養物および単一細胞培養物の優れた候補として同定された。 【０１５３】 実施例3 混合細胞培養物におけるCMVの検出 本実施例においては、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の存在を検出するために、Mv1Lu細胞とNCI-H292細胞との混合細胞培養物を使用した。 【０１５４】 HCMV（ATCC#VR977）のタウン（Towne）株を、MRC-5細胞において10
6 /mlを超える力価へと増幅し、10％FBSを含有しているEMEMの中で-85℃で凍結させた。 HCMV
の段階希釈物を調製し、ミンク肺（Mv1Lu）細胞、MRC-5細胞の単一単層、および
Mv1Lu細胞とH292細胞との混合細胞単層へと接種した。 各感染細胞培養系を、700
×gで60分間遠心分離し、次いで、適切な培地（例えば、10％FBSを含有している
EMEM）の中で、5％CO
2で、36℃で、24時間インキュベートした。 培養培地を除去し、80％アセトン水溶液を使用してガラスカバーガラスに細胞を固定した。 十分量のHCMV抗体溶液（Chemicon）を、各カバーガラスをカバーするために添加し、
35℃〜37℃で30分間インキュベートした。 抗体溶液を除去し、カバーガラスをPB
Sで濯いだ。 FITC標識ヤギ抗マウス抗血清からなる二次抗体溶液を各カバーガラスをカバーするために添加し、35℃〜37℃でさらに30分間インキュベートした。
次いで、検体を、×100〜×400で、エピフルオレセンスの下で、陽性の（即ち、
CMV感染した）核が染色された蛍光細胞に関して観察した。 【０１５５】 前記実施例と同様に、FITC標識ヤギ抗マウス抗体溶液中の対比染色剤は、細胞を染色し、蛍光により励起させられた場合に赤色を呈するエバンスブルーを含有している。 蛍光性の青リンゴ色の染色が、Mv1Lu単一細胞単層および混合細胞単層において観察されたが、H292細胞においては観察されず、Mv1Lu細胞はHCMV感染に対する感受性を有しているが、H292細胞は感受性を有していない（又は、H2
92細胞は有意に低い感受性を有している）。 MRC-5細胞（即ち、HCMVを検出するための「最高標準」）は、混合細胞単層とほぼ同一の性能を示し、これらの培養物における感染細胞の数は、混合単層における細胞数と類似していた。 【０１５６】 実施例4 混合細胞培養物におけるエンテロウイルスの検出 本実施例においては、混合細胞培養物を、エンテロウイルスであるコクサッキーBウイルスおよびエコーウイルスを検出するために使用した。 これらの実験では、BGMK細胞とNCI-H292細胞との混合細胞単層を使用した。 【０１５７】 BGMK細胞およびH292細胞のコンフルエントT-225フラスコを、25mM HEPES、10
％FBS、2mM L-グルタミン、および50μg/mlゲンタマイシンを含むEMEMの中で調製した。 まず、マグネシウムおよびカルシウムを含まない30mlのHBSSで濯ぐことにより細胞を採集し、次いで、7mlの（実施例1に記載された）トリプシン-EDTA
溶液による短時間の処理によってフラスコから解離させた。 次いで、さらに30ml
の培養培地（HEPES、10％FBS、2mM L-グルタミン、および50μg/mlゲンタマイシンを含むEMEM）を、細胞懸濁物濃縮物を作製するために懸濁物に添加した。 500n
mにおける光学密度を、細胞3mlを使用して、各懸濁物について決定した。 典型的には、OD読み取り値は、BGMK細胞懸濁物およびH292細胞懸濁物の両方について0.
2/mlであった。 【０１５８】 次に、希釈混合細胞懸濁物中の各細胞型の許容される作業比率を提供するため、3mlのBGMK細胞懸濁物および8mlのH292細胞懸濁物（いずれの懸濁物も0.2OD単位/mlであった）を、29mlの培養培地（25mM HEPES、10％FBS、2mM L-グルタミン、および50μg/mlゲンタマイシン）に添加した。 この比率は、希釈混合細胞の定植後1日〜3日以内に、実質的に同等の表面積をカバーする各細胞型からなるコンフルエント単層を達成するためのものであった。 希釈混合細胞の均質な懸濁物が調製されるよう留意した後、無菌のガラスカバーガラスを含有しているガラスシェルバイアル100個に各0.75mlを分注した。 細胞が重力によって沈降し、より最適な細胞分布を生じるように、室温で、定植後60分間、バイアルを放置した。 次いで、バイアルを、95％相対湿度、5％CO
2 、36℃における1日間〜3日間のインキュベーションのためインキュベーターに移した。 【０１５９】 コクサッキーBウイルス又はエコーウイルスを含有していることが示されたウイルス懸濁物ストックおよび臨床検体を、BGMK/H292細胞混合物、ならびにBGMK
細胞、H292細胞、MRC-5細胞、およびPRMK細胞の単一細胞単層へと感染させるために使用した。 臨床試料については、喉スワブ、鼻咽頭スワブ、痰、大便、および直腸スワブを、患者から収集し、ウイルス輸送培地（transport medium）に配置し、混入した可能性のある細菌および真菌を除去するため0.45μmフィルターで濾過した後、細胞培養物へと接種した。 患者から収集された脳脊髄液（CSF）
は、ウイルス輸送培地に配置し、細胞の接種に直接使用した。 シェルバイアルの接種については、バイアルの中に存在する培地を除去し、新鮮な培地を添加した。 次いで、検体0.2mlを各バイアルへ接種した。 接種されたバイアルを、室温で、700×gで、45〜60分間遠心分離した。 続いて、バイアルを、1日間〜3日間37℃
でインキュベートし、ウイルスの存在を免疫蛍光染色を使用して検出した。 【０１６０】 染色のため、培地を各バイアルから除去し、アセトンを用いてカバーガラスに細胞を固定した。 カバーガラスを各バイアルから除去し、37℃で30分間、25μl
の一次抗体（エンテロウイルスに対するマウスモノクローナル抗体[Dako]）で染色した。 PBSで洗浄した後、FITC結合抗マウスIg（Dako）25μlを、染色のための二次抗体として使用し、37℃で30分間インキュベートした。 もう1回洗浄した後、カバーガラスをスライドに取り付け、蛍光下で観察した。 カバーガラス上の1
つまたは複数の特異的蛍光染色細胞の存在を陽性と見なした。 前記実施例と同様に、FITC標識ヤギ抗マウス抗体溶液中の対比染色剤は、細胞を染色し、蛍光曝露の際に赤色を呈するエバンスブルーを含有している。 コクサッキーBウイルス検出のための蛍光性の青りんご色染色は、BGMK単一細胞単層中のBGMK細胞の多くに観察され、混合細胞単層においては主にBGMK細胞に観察されたが、さほど多くの
H292細胞には観察されず、BGMK細胞の方が、コクサッキーBウイルス感染に対する高い感受性を有している。 いくつかの型のコクサッキーBウイルス単離物について、H292細胞はさほど高い感受性を有していない（又は、H292細胞は有意に低い感受性を有している）。 「最高標準」細胞系（即ち、PRMK細胞）は、混合細胞単層と同数の感染細胞を示さなかった。 【０１６１】 エコーウイルスの検出のための蛍光性の青りんご色染色は、H292単一細胞単層中の多くのH292細胞に観察され、混合細胞単層においては主にH292細胞において観察されたが、さほど多くのBGMK細胞には観察されず、H292細胞の方がエコーウイルス感染に対する高い感受性を有しており、BGMK細胞はさほど高い感受性を有していない（又は、BGMK細胞は有意に低い感受性を有している）。 「最高標準」
系（即ち、MRC-5細胞）は、混合細胞単層ほど多くの感染細胞は有していないようであった。 エンテロウイルスの高力価試料によって感染されたBGMK/H292混合細胞単層の場合には、細胞特異的ウイルス媒介細胞変性効果（CPE）が出現した（即ち、コクサッキーBウイルスが高力価で存在する場合、BGMK細胞においてCPE
が観察され、エコーウイルスが高力価で存在する場合、H292細胞においてCPEが観察された）。 【０１６２】 実施例5 混合細胞培養物における単純ヘルペスウイルスおよびHCMVの検出 本実施例においては、遺伝学的に操作された新生ハムスター腎（BHK）細胞（
例えば、ATCC#CCL-12072）とMv1Lu細胞との混合細胞単層を使用して、単純ヘルペスウイルス（HSV）およびHCMVを検出するために、混合細胞培養物を使用する。 【０１６３】 混合細胞の適当な希釈液が作製されるよう、前記実施例と同様に、BHK細胞およびMv1Lu細胞を、フラスコ内で増殖させ、トリプシン処理し、混合する。 次いで、これらの混合細胞希釈液を、前記と同様に、カバーガラスを含有している無菌のガラスシェルバイアルに接種するために使用する。 次いで、前記と同様に、
細胞を遠心分離し、ウイルス又は臨床試料を接種し、インキュベートし、固定する。 【０１６４】 HCMVは、前記実施例3と同様の抗体により、Mv1Lu細胞において検出され、HSV
（HSV-1およびHSV-2）は、β-ガラクトシダーゼ染色キットにより（即ち、遺伝学的に操作されたBHK細胞に感染するウイルスによって誘導されるレポーター遺伝子を検出して）同定される。 【０１６５】 実施例6 混合細胞培養物における呼吸器ウイルスの検出 本実施例においては、混合細胞培養物を、呼吸器ウイルスのパネルを検出するために使用する。 これらの実験では、少なくとも3個のウイルスを検出することができる混合細胞培養物を作製するため、3個の細胞型を組み合わせる。 【０１６６】 まず、混合細胞の適当な希釈液が作製されるよう、前記実施例と同様に、A549
細胞、H292細胞、およびミンク肺（例えば、Mv1Lu）細胞を、フラスコ内で増殖させ、トリプシン処理し、混合する。 好ましい態様において、細胞は、培養物中の混合細胞がほぼ同じ割合（即ち、1：1：1）で存在するよう、希釈される。 次いで、これらの混合細胞希釈液を、前記と同様に、カバーガラスを含有している無菌のガラスシェルバイアルに接種するために使用する。 次いで、前記と同様に、細胞を遠心分離し、ウイルス又は臨床試料を接種し、インキュベートし、固定する。 【０１６７】 これらの細胞に感染することができるウイルスは、前記実施例2の方法を使用して検出されて同定される。 これらの混合細胞培養物においては、292細胞がパラインフルエンザウイルスおよびRSVの存在を検出するために使用され、A549細胞がアデノウイルスの存在を検出するために使用され、ミンク肺細胞がインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザAおよびB）の存在を検出するために使用される。 【０１６８】 実施例7 混合細胞培養物におけるHSVおよびクラミジアの検出 本実施例においては、性感染病と一般的に関連している2個の生物の検出を可能にする混合細胞培養物を提供する。 これらの実験では、HSVの検出に有用なミンク肺細胞（例えば、Mv1Lu）を、C.トラコマチスの検出に有用なMcCoy細胞と混合する。 【０１６９】 まず、細胞の適切な希釈液が作製されるよう、前記実施例と同様に、McCoy細胞およびミンク肺（例えば、Mv1Lu）細胞を、フラスコ内で増殖させ、トリプシン処理し、混合する。 好ましい態様において、細胞は、培養物中の混合細胞がほぼ同じ割合で存在するよう希釈される。 次いで、これらの混合細胞希釈液を、前記と同様に、カバーガラスを含有している無菌のガラスシェルバイアルに接種するために使用する。 次いで、前記と同様に、細胞を遠心分離し、試料（例えば、
臨床試料）を接種し、インキュベートし、固定する。 【０１７０】 これらの細胞に感染することができる生物（例えば、HSVはミンク肺細胞に感染し、C.トラコマチスはMcCoy細胞に感染する）は、前記実施例2の方法を使用して、検出されて同定される。 他の混合細胞培養系の場合と同様に、ウイルスおよび/又はC.トラコマチスの存在は、CPEの観察、動物接種等のようなその他の方法によっても検出されうる。 従って、本実施例又は前記実施例の混合細胞培養物アッセイ系は、微生物の検出、同定、および/又は定量の特定の方法に限定されないことが意図される。 【０１７１】 実施例8 ヒト胎児横紋筋肉腫（RD）細胞とH292細胞との混合細胞培養物およびBGMK細胞と
A549細胞との混合細胞培養物におけるエンテロウイルスの検出 本実施例においては、2個の異なる混合細胞培養物[RD細胞（ATCC#CCL 136）と
H292細胞とを含有している混合物A；BGMK細胞とA549細胞とを含有している混合物B]を、80個の異なるエンテロウイルス単離物を検出するために使用した。 前記実施例1と本質的に同様に、混合細胞培養物を調製した。 80個の単離物は、脳脊髄液、喉、および糞便からMRC5および/又はPMKの上に採集された、保存（凍結）
された臨床単離物であった。 結果を、表4に示す。 【０１７２】 【表４】 混合物Aおよび混合物Bにおける増殖による単離物の割合（％） 【０１７３】 表4における結果は、80個のエンテロウイルス全てが、混合物A又は混合物Bのいずれかのシェルバイアル上で増殖したことを示している。 全エンテロウイルスのおよそ80％が混合物Aにおいて増殖し、66％が混合物Bにおいて増殖した。 コクサッキーウイルスの過半数（64％）が混合物Aにおいて増殖し、75％が混合物Bにおいて増殖した。 エコーウイルスのうち、95％が混合物Aにおいて増殖し、51％
が混合物Bにおいて増殖した。 ポリオウイルスは、全て、混合物AおよびBの両方において増殖した。 【０１７４】 これらの結果は、混合物Aおよび混合物Bが、各々、試験された全エンテロウイルスの大多数（それぞれ81％および60％）を検出することに成功したことを例証している。 データは、混合物Aと混合物Bとの組み合わせが、試験されたエンテロウイルスの全臨床単離物を100％検出したことを例証している。 従って、混合物A
と混合物Bとの組み合わせは、脳脊髄液、喉、および糞便のような臨床起源に由来する全てのエンテロウイルスを検出することを可能にする。 【０１７５】 実施例9 ヒト大腸腺癌（Caco-2）細胞を含有している混合細胞培養物におけるエンテロウイルスの検出 本実施例においては、ヒト大腸腺癌（Caco-2）細胞（ATCC#HTB 37）を含有している混合細胞培養物を、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、アストロウイルス、およびアデノウイルスを含む腸内ウイルスを検出し同定するために使用する。 ロタウイルス、アストロウイルス、およびアデノウイルスは、幼児に発症するウイルス性胃腸炎の80％の原因である[Pin
toら（1994）J.Medical Virol.44：310-315］。 【０１７６】 混合細胞培養物 前記実施例8と同様に調製された、RD細胞、H292細胞、BGMK細胞、およびA549
細胞（表5）より選択された1個、2個、および3個の他の細胞型と組み合わされたヒト大腸腺癌（Caco-2）細胞（ATCC#HTB37）を含有する混合細胞培養物を、80個の異なるエンテロウイルス単離物を検出するために使用する。 混合細胞培養物を、ポリオウイルス1、コクサッキーウイルスA24、エンテロウイルス70、レオウイルス3、ヒトロタウイルス、アデノウイルス5、アデノウイルス40、およびアデノウイルス41、アストロウイルス1、およびHAV株HM175を検出するためにも使用する。 これらのウイルスは、ピント（Pinto）ら（1994）（前記）によって以前に記載されている。 以下の表5に記載された混合細胞培養物を、前記実施例1と本質的に同様に調製し、Caco-2細胞、RD細胞、H292細胞、BGMK細胞、又はA549細胞を含有している単一細胞型培養物と比較する。 【０１７７】 【表５】 Caco-2細胞を含有している混合培養物 【０１７８】 インキュベーション中、定期的に、単一単層および混合単層を、全体生存率、
およびほぼ等しい各細胞型の密度で、二つの別個の細胞形態を有する（即ち、二形性細胞シート）単一細胞シート（即ち、単一単層）として共存し、発展する細胞系の能力に関してチェックする。 成功の混合培養物は、混合細胞単層がウェル表面に付着し、各細胞型が容易に区別されうる滑らかで均一に分布した単層を示しているものである（即ち、「形態カテゴリー1」）。 又は、成功の混合培養物は、混合単層がウェル表面に付着しているが、コンフルエンシーの時点で二つの別個の形態を示さないものである（即ち、「形態カテゴリー2」）。 【０１７９】 試料および加工 腸内ウイルスは、ウイルスにより誘導された細胞変性効果（CPE）の同定により、および/又はCPEが感染培養物中に出現する前の少なくとも1個の初期ウイルス特異的核酸の発現の検出により検出される。 腸内ウイルスの存在は、以前に記載されたように[Pintoら（1994）（前記）]、Caco-2細胞を含有している混合細胞培養物の感染の前後に、ドットブロットハイブリダイゼーションによってアッセイされる。 簡単に説明すると、ウイルスRNAおよびDNAは、大便懸濁物から混合細胞培養物の感染後（pi）48時間目に抽出される。 ロタウイルスWaの遺伝子4
の2,300 bpに対応するプローブを、ヒトロタウイルスを検出するために使用し、
ヒトアストロウイルス1型の3'末端に由来する1kbに対応するプローブを、ヒトアストロウイルスを検出するために使用し、アデノウイルス40の1,800bp PstI断片
Hに対応するプローブ、およびアデノウイルス41の6,500bp PstI断片Bに対応するプローブを、それぞれアデノウイルス40およびアデノウイルス41を検出するために使用する[Pintoら（1994）（前記）]。 全てのcDNAプローブを、製造業者の指示に従い、ジゴキシゲニン-11-UTP（Boehringer Mannheim）で標識する。 標準的な手法に従い、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイ法を、異なるcD
NAを用いて実施する。 【０１８０】 結果 Caco-2細胞を含有している混合細胞培養物におけるドットブロットハイブリダイゼーションを使用したCPEおよび/又はウイルス核酸の検出は、これらの細胞が、混合細胞培養物に接種された腸内ウイルス（即ち、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、アストロウイルス、およびアデノウイルス）に対する感受性を有することを例証する。 【０１８１】 以上より、本発明が、診断微生物学において現在使用されている方法と比べて多くの利点を提供することは明らかである。 【０１８２】 以上の明細書中で言及された出版物および特許は全て、参照として本明細書に組み込まれる。 本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者には明らかであると考えられる。 本発明は特定の好ましい態様に関して記載されたが、添付の特許請求の範囲に記載されたような本発明は、そのような特定の態様に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。 実際、診断微生物学およびウイルス学、細胞培養、および/又は関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グッドラム パトリシア ゲイル レイ アメリカ合衆国 オハイオ州 アセンズ レイク レーン 12670 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ10 QQ15 QR77 QS24 QX01 |
