本发明涉及一种培养细胞的方法。本发明还涉及一种筛选细胞的方法。此外，本发明涉及一种通过细胞培养产生蛋白质的方法。

从一个细胞长成的细胞群被认为是由每一个都具有完全一致特征的细胞所组成的，并且通过单细胞克隆得到这样的同质细胞群已经成为学术上和商业上的一项重要技术。例如，要生产药物，同质产品的制备是先决条件，尤其是蛋白质的生产，有必要选择、分离并培养产生该蛋白质的单细胞，由此构建一个产生该蛋白质的同质细胞群。因此，单细胞克隆已经成为蛋白质，尤其是重组蛋白质生产的一种必不可少的技术。
需要单细胞克隆来制备单克隆抗体的常规方法使用了所谓的有限稀释法，其中将由抗原免疫的动物得到的脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞进行融合来制备杂交瘤，如此制备的异质细胞群中每一个细胞都与饲养细胞一起培养。在此使用了经过丝裂霉素或辐射处理剥夺了细胞生长能力的脾细胞作为饲养细胞。
遇到培养困难的情况，可在培养系统中进一步添加生长因子例如IL-6。但是这些方法具有所使用的饲养细胞不是同质细胞群、由于实验方法引起的变化很大、要求有丧失生长能力的预处理等缺点。此外，在一些细胞中，从单细胞生长是困难的，即使是添加饲养细胞或添加生长因子和胎牛血清。
发明公开本发明提供培养一个细胞的方法或克隆细胞的方法，同时提供通过细胞培养获得蛋白质的方法，该方法没有常规有限稀释方法中所发现的任何缺点。
经过深入的研究，本发明的发明人已经发现通过将产生蛋白质的一个转化细胞或一个杂交瘤细胞与亲代细胞的共培养可有效地构建一个同质细胞群。
实施本发明的实施方案此处所使用的“培养‘一个’转化细胞”是指从一个细胞开始培养，也是指在培养过程中，培养从一个细胞生长得到的一群细胞。
转化细胞，包括基因工程细胞和杂交瘤细胞，是经过操作组成型产生蛋白质并且不需要诱导而产生该蛋白质的细胞。
基因工程细胞是指那些已经引入编码该蛋白质的DNA从而具有组成型产生该目的蛋白质特性的转化细胞。基因工程细胞可通过将编码目的蛋白质的DNA与合适的表达载体连接，并将获得的表达载体用常规使用的方法引入细胞来制备。这样的基因工程细胞包括其染色体中已经插入了该DNA的转化细胞以及DNA已经留存在细胞染色体外的细胞。
适于制备基因工程细胞的细胞包括所有类型的宿主细胞，优选地，可以提及真核细胞。作为真核细胞，可以提及动物细胞，例如哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等。作为哺乳动物细胞，优选地可以提及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS、骨髓瘤细胞、BHK(幼小仓鼠肾脏)、海拉细胞(Hela)、非洲绿猴肾细胞(Vero)以及其它细胞。作为CHO细胞，可以优选使用缺少dhfr基因的dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77：4216-4220)、CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60：1275)或CHO DG44(Urlaub，Get al.，细胞(Cell)(1983)33(2)：405-412)。
杂交瘤细胞是指通过将组成型产生目的蛋白质的细胞，例如产生免疫球蛋白的细胞，和与此相容的无限增殖细胞，例如骨髓瘤细胞(P3K、YB2/0、U266)融合而制备的杂交细胞。此外，杂交瘤细胞包括采用使产生目的蛋白质的细胞无限增殖化的方法，例如使用EB病毒(EBV)所获得的无限增殖细胞。可以使用来自例如小鼠、大鼠和人等的动物细胞作为用于制备杂交瘤细胞并产生目的蛋白质的细胞。
亲代细胞是指产生蛋白质的细胞相同细胞株的转化以前的细胞。具体地，优选使用用来制备产生蛋白质细胞的那些细胞作为亲代细胞。基因工程细胞的亲代细胞是那些例如在转化细胞构建中被用于引入编码目的蛋白质DNA的、并且没有经过转化的细胞。杂交瘤细胞的亲代细胞是用于与产生免疫球蛋白的细胞融合的无限增殖细胞。
选择标记基因是指赋予仅仅使得产生目的蛋白质的细胞能够选择性存活这种特性的基因。根据本发明，产生蛋白质的转化细胞优选含有一个选择标记基因。优选地，亲本细胞不含有选择标记基因。
作为在基因工程细胞中使用的选择标记基因，可以提及氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌(E.coli)黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因等。因此，为了在维持产生蛋白质的细胞存活时杀死亲代细胞，仅仅而且需要在没有选择标记基因表达时细胞就不能存活的条件下进行细胞培养。这样的条件包括添加G418、氨甲蝶呤等。
作为在杂交瘤细胞中使用的选择标记基因，可以提及HPRT等。可以将选择标记基因引入将要融合的无限增殖细胞，或可以将已经含有选择标记基因的无限增殖细胞与产生目的蛋白质的细胞融合。可以在没有选择标记基因表达时，细胞就不能存活的条件下培养含有选择标记基因的细胞。这样的条件包括在无次黄嘌呤-胸腺嘧啶的培养基等中进行培养。
细胞产生的蛋白质可以是任何有用途的或有生物学活性的蛋白质。这样的蛋白质包括激素(垂体激素释放激素、催产素、血管升压素、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)、生长激素(GH)、促乳素、胃泌素、促胰液素、缩胆囊素、胰岛素、胰高血糖素、降钙素)、酶(例如葡萄糖氧化酶)、酶抑制剂(例如胰凝乳蛋白酶抑制剂)、淋巴因子或细胞因子(例如白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素-α(IFNα)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-ω、干扰素-τ)、造血因子(例如，促红细胞生长素(EPO)、促凝血酶原激酶(TPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞生长因子(SCF)、生长因子(例如，血管内皮细胞生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、白细胞移行抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、制癌蛋白M(OSM))、免疫球蛋白(例如，人抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或其片段、Fv、scFv(单链Fv)、scFv二聚体)等。当此细胞为杂交瘤细胞时，该蛋白质具体是免疫球蛋白。
可以使用常规的方法进行细胞的培养或克隆。首先，将产生目的蛋白质的细胞在适当的培养基中悬浮。所使用的培养基可以是常规使用的例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等。该培养基可以与血清添加物例如，胎牛血清(FCS)或与无血清培养基联合。培养基的pH优选在约6-8之间。
所使用的细胞优选处于对数生长期。当形成细胞簇后，可用适当规格的注射器将细胞冲洗分散。可将得到的细胞悬液适当稀释并以1细胞/孔的比例接种到细胞培养板上。
可采用相似的方法制备亲代细胞，将大约1,000-20,000个亲代细胞，优选约3,000-10,000个细胞，更优选约5,000-10,000个细胞加入到含有一个目的细胞的孔中。然后将培养板在合适的条件下培养。培养通常在约30-40℃下进行大约96-120小时，如果需要，可在适当浓度的二氧化碳下，进行培养基的更换、通气和振荡。
因为所培养的细胞优选含有选择标记基因，而亲代细胞不具有，所以在选择标记基因表达使得目的细胞存活的条件下，亲代细胞将被杀死。当选择标记基因是dhfr时，选择标记基因能够表达的条件可以是在培养基中加入氨甲蝶呤。该选择标记基因表达后，继续培养一段合适的时间，然后，例如在显微镜下检测培养物确认存活细胞集落的形成。确认集落形成以后，将培养物转移到较大的适当培养器中进行扩大培养。因为所得到的集落是由一个细胞而来的，集落的形成表明该细胞已经得到克隆。
继续培养所得到的集落，如果适当，进行传代培养和/或扩大培养，并且可以从培养上清液或细胞中回收产生的目的蛋白质来获得同质蛋白质。所得到的蛋白质可以通过在本领域技术人员公知的方法中适当地组合柱层析等来纯化，然后可以按照希望进行储存和使用。因为通过单细胞的扩大培养得到的蛋白质是同质的，所以随后的纯化也容易，可以大量获得更高纯度的蛋白质。因此，在降低制药成本上，它是极其有用的。作为在亲和层析中使用的柱子，可采用其中已经结合了该蛋白质的抗体的亲和柱层析。如果该蛋白质是一种抗体，则可以使用A蛋白柱或G蛋白柱。
具体地，作为使用A蛋白的柱子，可以想到Hyper D，SepharoseF.F.(Pharmacia)等。可以适当联合使用离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析等(蛋白质纯化和鉴定策略：实验室方法手册(Strategiesfor Protein Purificaton and Characterization：A Laboratory CourseManual)。Daniel R.Marshak等人编，冷泉港实验室出版社，1996)。除柱层析之外，还可以使用粗的纯化方法，例如超滤膜方法和硫酸铵方法。
通过本发明单细胞克隆所克隆和产生的蛋白质可以具体地用作药物组合物。可以将蛋白质通过肠胃外途径全身或局部给药，尽管给药方法依赖于它们的活性。例如，可以选择静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内给药，并且根据患者的年龄和症状，可以适当地选择给药方法。此外，根据给药途径，药物组合物中可以含有药物学上可接受的载体和/或添加剂。尤其是，可以添加药物学上可接受的表面活性剂、等渗剂、稳定剂、缓冲液、助溶剂、止痛剂、含硫的还原剂和抗氧化剂。
现在将参考以下实施例对本发明加以解释，但应当指出它们不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1.与亲代细胞的共培养将亲代细胞CHO DG44传代，并在添加1％HT补充物(GIBCO-BRL生产)的CHO-S-SPM II(DPM)培养基(GIBCO-BRL生产)中培养，使用处于对数生长期的CHO DG44细胞。采用国际专利出版物WO98/14580中所描述的方法制备已经整合了编码人源化抗-HM1.24抗体的基因的CHO DG44细胞。将如此获得的产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞(将人源化抗-HM1.24抗体重链的表达载体HEF-RVHs-AHM-gγl(FERM BP6127)和人源化抗-HM1.24抗体轻链的表达载体HEF-RVLa-AHM-gк(FERM BP5645)同时转化CHO细胞)用作转化细胞。
采用与国际专利出版物WO98/14580中类似的方法制备产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞。将产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞在临用前添加了640μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)、50nmol/L MTX和8mmol/LL-谷氨酸盐的CD-CHO培养基(GIBCO-BRL生产)中进行传代培养。当这些细胞轻微地形成细胞聚团后，用23G针头冲洗处理来分散细胞。
将产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞在用于传代培养的培养基中洗涤后，用该培养基将细胞浓度调整到1细胞/孔，得到250ml细胞悬液(20细胞/ml)。用相同的培养基将亲代细胞CHO DG44的细胞浓度调整到100细胞/孔、1,000细胞/孔和10,000细胞/孔以获得150ml细胞悬液(1×103细胞/ml、1×104细胞/ml、1×105细胞/ml)。
将0.05ml产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞悬液与每一种CHODG44细胞悬液0.1ml放入96孔板中。因此，每个孔中含有一个产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞。按照类似的方法，每一种悬液制备15块96孔板共计1440个样品。
在5％CO2孵育箱中，37℃培养14天后，在显微镜下检测细胞。从确证已形成集落的孔中收集细胞，并在24孔板(1ml)中，用相同的培养基进行扩大培养以保证细胞的稳定生长。表1显示了已确认有细胞集落形成的孔的数目。
表1.添加亲本细胞株试验的克隆结果(a)亲本株的细胞数                 形成的集落数100细胞/孔                     01,000细胞/孔                   610,000细胞/孔                  58合计                           64
(b)亲本株的细胞数                  形成的集落数1,000细胞/孔                    610,000细胞/孔                   30合计                            36表1中，(a)表示显微镜检测中所选择的集落数(即传代培养至24孔板中的集落数)(14天)，(b)表示从24孔板扩大到6孔板中的集落数。
在与100细胞/孔的CHO DG44细胞进行共培养的孔中，没有形成产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞的集落，而在与1,000细胞/孔或10,000细胞/孔的CHO DG44细胞进行共培养的孔中，分别确证了6个和30个集落。
因此，此结果提示通过与1,000细胞/孔或10,000细胞/孔的亲代细胞进行共培养，即使1个细胞/孔浓度的转化细胞也可以长成单克隆。采取与亲代细胞共培养的方法使得以前被认为是不可能的单个细胞克隆能够实现。在有640μg/ml G418和50nM MTX存在下，将在使用24孔板的扩大培养中呈现稳定生长的集落进行培养，由此获得同质的产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞。
实施例2.扩大培养将用于扩大培养的1×105个产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞，在添加10g/L Primatone的CHO-S-SFM II培养基(6升×3罐)中，在pH7.2、DO60％空气饱和和60rpm的条件下，培养11天。将三个罐中的培养物上清合并，用Sartobran PH Capsule(Sartorius)过滤，加样到rProtein A FF柱(Pharmacia)中，用1M NaCl/10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(pH7.5)和10mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(pH7.5)冲洗柱子，然后用2.5M NaCl pH2.7洗脱。
为了去除内毒素，将Kurimover(Kurita Kogyo)直接流加到所得到的蛋白A洗脱组分中，并在4-10℃搅拌6小时。通过0.2μm醋酸纤维素滤器(Corning)过滤，得到2.65ml人源化抗-HM1.24抗体溶液。通过反相HPLC分析确定所得到的人源化抗-HM1.24抗体几乎是同质的。
实施例3.
使用产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞和产生人源化抗-PHTrP抗体的CHO细胞将采用与亲代细胞CHO DG44细胞共培养的单细胞克隆与通过其它方法(条件培养基法、血清添加法和细胞裂解物法)的单细胞克隆进行了比较。
采用国际专利出版物WO98/13388中所描述的方法制备已经整合了编码人源化抗-PTHrP抗体的基因的CHO DG44细胞。将如此获得的产生人源化抗-PTHrP抗体的CHO细胞(将人源化抗-PTHrP抗体重链的表达载体hMBC1HcDNA/pUC19(FERM BP-5629)和人源化抗-PTHrP抗体轻链的表达载体hMBC1LqλcDNA/pUC19(FERM BP-5630)同时转化CHO细胞)用作转化细胞。此外，GIBCO CHO-S-SFMII-改进/CD-CHO培养基(半培养基)用作产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞的新鲜培养基，GIBCOCHO-S-SFMII培养基用作产生人源化抗-PTHrP抗体的CHO细胞的新鲜培养基。
(1)与亲代细胞共培养的方法将培养第1天的产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞或产生人源化抗-PTHrP抗体的CHO细胞在新鲜培养基中稀释，以便它们0.2ml中都含有1个细胞。加入5,000,000个亲代细胞DG44CHO细胞并悬浮。将细胞悬液接种到5个96孔板中，每孔0.2ml。
(2)条件培养基(CM)法培养第1天的转化细胞培养物离心后，将上清通过0.2μm滤器过滤。将500个培养第1天的转化细胞的悬液加入到滤液中并使得最终体积为100ml。将该细胞悬液接种到5个96孔板中，每孔为0.2ml。在使用培养第3天的培养液的方法中，以相似的方法使用培养第3天的转化细胞的离心上清液。
(3)血清添加法将培养第1天的转化细胞培养液在新鲜培养基中稀释，使得每200μ1中含有1个细胞。将10ml FBS(胎牛血清I.S.C at #3000 Lot#300050933)加入到90ml这种稀释液中，悬浮到5个96孔板中，每孔为0.2ml。
(4)细胞裂解物添加法将培养第1天的转化细胞培养液在新鲜培养基中稀释，使得每200μl中含有1个细胞。将细胞裂解物的沉淀悬浮到这种稀释液中，并将它接种到5个96孔板中，每孔为0.2ml。按照下列方法制备上述细胞裂解物。将培养第3天的5,000,000个亲代株细胞离心，悬浮在10ml无菌水中。-80℃冷冻后，37℃反复解冻2次，然后3500rpm离心60分钟。将沉淀在10ml无菌水中洗涤，3500rpm再一次离心60分钟制备细胞裂解物。
结果在平板接种后20天和21天观察每一种方法中产生人源化抗-HM1.24抗体的CHO细胞和产生人源化抗-PTHrP抗体的CHO细胞的集落出现，每个平板上集落出现的比率如表2中所示。结果，两种细胞通过与亲代株进行共培养都能进行单细胞克隆。当如对人源化抗-HM1.24抗体所观察的用其它方法不可能进行单细胞克隆时，通过与亲代株的细胞进行共培养的单细胞克隆被证明是行之有效的。只将1个、3个、10个、30个和100个转化细胞接种到每个孔中作为对照时，在接种30个或100个细胞时任一个转化细胞都形成集落，而接种10个或更少的转化细胞时，则没有观察到集落。
表2每一种克隆方法中集落出现的比率(A)人源化抗-PTHrP抗体(第20天)克隆方法                       出现的集落数(集落/平板)与亲代株共培养                         23.0条件培养基法(第1天)                    10.6条件培养基法(第3天)                    6.6血清添加法                             27.2细胞裂解物添加法                       4.6
(B)人源化抗-HM1.24抗体(第21天)克隆方法                        出现的集落数(集落/平板)与亲代株共培养                              36.4条件培养基法(第1天)                         0.0条件培养基法(第3天)                         0.0血清添加法                                  0.0细胞裂解物添加法                            0.2工业适用性本发明能够培养或克隆产生目的蛋白质的一个细胞。