[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2011年1月28日提交的美国临时申请号61/437,569的权益，其通过引用并入本文用于所有目的。

[0003] 关于在联邦资助的研究和开发下做出的发明权的声明

[0004] 本发明在美国能源部授予的合同号DE-AC02-05CH11231的政府支持下完成。美国政府具有本发明的某些权利。

[0005] 植物细胞壁是造纸工业的唯一纤维素来源，并且是木质纤维素生物燃料的有前途的糖来源。植物将太阳能转化成可运输的和可储存的能量的利用，将对环境具有积极影响，因为使用植物可以帮助急剧减少化石衍生的燃料的利用，可以减少向大气中的碳排放，并且甚至可以促进碳隔离。但是，即使木质纤维素生物燃料对环境有益，生产它们的成本仍然是没有成本效益的，主要是由于源自植物细胞壁的昂贵粗糖。低密度、对酶促水解的不顺从和中等纤维素含量是糖成本的主要促成因素，因为它们会影响运输成本并需要大量能量和化学试剂。因此，提高粗生物质的密度和可消化性将对木质纤维素生物燃料生产成本产生重要的有益影响。

[0006] 细胞壁不顺从主要由木质素的存在造成，所述木质素嵌入多糖聚合物中，并降低它们的可提取性和水解酶的可达性。植物细胞壁的木质素含量和糖化效率经常高度负相关(Vinzant等人,1997；Chen等人,2007；Jorgensen等人,2007)。不幸的是，大多数降低植物木质素含量的尝试导致了严重的生物质产量下降(Voelker等人,2010；Shadle等人,2007；Franke等人,2002)，并且因此，不容易获得具有显著木质素下降的作物。该细胞壁-生长关系不是木质素独有的；它经常被观察到，并与导管塌缩有关，并且大部分发生在半纤维素或纤维素生物合成所涉及的次生细胞壁基因有缺陷的情况下(Voelker等人,2010；Anterola和Lewis,2002；Brown等人,2005)。这些导管是给地上组织供给通过根系统吸收的水和营养物所必需的(Gomez等人,2008,Boyce等人,2004)。因此，使用沉默策略来减少植物中的木质素，所述沉默策略在酶促步骤抑制水平和生物质产量之间折中。

[0007] 在木质组织中产生新细胞壁(即所谓的次生细胞壁)，并且所述新细胞壁是当除去水时促成生物质密度的主要组分。优化细胞壁沉积会增加生物质密度并由此增加能量密度。该提高将有益于降低生物质的运输成本，所述运输成本是在生物精炼厂门处递送的生物质价格的重要组分(Searcy等人,2007；Aden等人,2002；Kumar等人,2005)。因此，开发出允许木质组织细胞壁或髓心变厚而不改变植物生长的策略，可以增加生物质和能量密度，并且将有利于木质纤维素生物能生产的成本效益。

[0008] 另外需要以特定方式工程改造路径中的不同生物合成途径，使得可以在目标组织中靶向生物合成产物的生产。

[0009] 本发明解决了这些需要。

[0010] 不同的生物学过程存在于从原核生物至真核生物的生物体中，它们由小数目的转录因子调节。在一个方面，本发明提供了一种正反馈回路来增加目标产物在生物体(例如，植物)中的表达。根据本发明的人工正反馈回路(AFPL)采用转录因子/启动子构建体，典型地，其中所述转录因子是调控靶向的生物合成途径的所有或大部分组分的表达的“主要”转录因子。在转录因子诱导或增加基因的表达的情况下，在该途径下游的基因的启动子与编码所述转录因子的核酸可操作地连接，从而导致增加的转录因子表达。AFPL可以用于植物中的任何生物合成方法中，例如，用于控制细胞壁沉积、蜡/角质积累或脂质积累等。

[0011] 在一个方面，本发明提供了一种工程改造植物以增加生物合成产物在期望的组织中的生产量的方法，所述方法包括:将表达盒引入植物中，其中所述表达盒包含与异源启动子可操作地连接的编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节生物合成产物的生产，其中所述异源启动子是诱导一定基因的基因表达的启动子，所述一定基因是所述转录因子在期望的组织中的下游靶标；和在表达所述转录因子的条件下，培养所述植物。所述方法可以应用于任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物。在某些实施方案中，所述植物是拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、罂粟、竹、油菜、向日葵、柳树或短柄草属。

[0012] 在某些实施方案中，所述启动子是组织特异性的次生壁启动子，并且所述转录因子会诱导次生壁生物合成产物的表达。例如，所述转录因子可以是NAC次生壁增厚促进因子1(NST1)、NST2、NST3、次生壁相关的NAC结构域蛋白2(SND2)、SND3、MYB结构域蛋白103(MYB103)、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58或MYB63。在某些实施方案中，所述组织特异性的次生壁启动子是IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7、IRX10、GAUT13、GAUT14或CESA4启动子。

[0013] 在工程改造植物以增加生物合成产物在期望的组织中的生产量的方法的某些实施方案中，所述转录因子会诱导蜡和/或角质的表达。在某些实施方案中，所述转录因子是：shine(SHN)转录因子，其选自SHN1(也被称作WIN1)、SHN2、SHN3、SHN4或SHN5；或MYB 96。在某些实施方案中，所述启动子是CER1、CER2、CER3、CER4、CER5、CER6、CER10、WSD1、Mah1、WBC11、KCS1、KCS2、FATB、LACS1、LACS2、CYP864A、CYP86A7、CYP86A5、KCS10或KCS5启动子。

[0014] 在另一个方面，本发明提供了一种包含表达盒的植物，所述表达盒包含与异源启动子可操作地连接的编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节生物合成产物的生产，其中所述异源启动子是诱导一定基因的基因表达的启动子，所述一定基因是所述转录因子在期望的组织中的下游靶标；和在表达所述转录因子的条件下，培养所述植物。所述植物可以是任意植物，包括单子叶植物和双子叶植物。在某些实施方案中，所述植物是拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、罂粟、竹、油菜、向日葵、柳树或短柄草属。

[0015] 在某些实施方案中，所述植物包含表达构建体，其中启动子是组织特异性的次生壁启动子，且由所述构建体编码的转录因子会诱导次生壁生物合成产物的表达。例如，所述转录因子可以是NAC次生壁增厚促进因子1(NST1)、NST2、NST3、次生壁相关的NAC结构域蛋白2(SND2)、SND3、MYB结构域蛋白103(MYB103)、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58或MYB63。在某些实施方案中，所述组织特异性的次生壁启动子是IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7、IRX10、GAUT13、GAUT14或CESA4启动子。

[0016] 在某些实施方案中，由所述表达建体编码的转录因子会诱导蜡和/或角质的表达。在某些实施方案中，所述转录因子是：shine(SHN)转录因子，其选自SHN1(也被称作WIN1)、SHN2、SHN3、SHN4或SHN5；或MYB 96。在某些实施方案中，所述启动子是CER1、CER2、CER3、CER4、CER5、CER6、CER10、WSD1、Mah1、WBC11、KCS1、KCS2、FATB、LACS1、LACS2、CYP864A、CYP86A7、CYP86A5、KCS10或KCS5启动子。

[0017] 在一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0018] 将表达盒引入植物中，其中所述植物被修饰成具有降低的木质素生物合成酶表达水平；且进一步，其中所述表达盒包含与异源的导管特异性的启动子可操作地连接的编码木质素生物合成酶的多核苷酸；和

[0019] 在表达木质素生物合成酶的条件下，培养所述植物。

[0020] 在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶是PAL、C4H、4CL、HCT、C3H或CCR1。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶是C4H。

[0021] 在某些实施方案中，所述启动子是VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1，例如，与VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1 启动子基本上相同的启动子；或天然的VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1启动子。

[0022] 在某些实施方案中，如下降低所述经修饰的植物中的木质素生物合成酶的活性水平：使所述植物与反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸会沉默编码木质素生物合成酶的基因的表达。在某些实施方案中，所述经修饰的植物(在其中表达与异源启动子可操作地连接的多核苷酸)具有在编码木质素合成酶的基因中的突变，所述突变会减少该酶的表达。

[0023] 在某些实施方案中，所述植物选自：拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、竹、油菜、向日葵、柳树和短柄草属。

[0024] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的植物、植物细胞、种子、花、叶、果实或生物质：其包含经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积的植物组织。

[0025] 在另一个方面，本发明提供了在糖化反应中获得增加的量的来自植物的可溶性糖的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：使经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积的植物进行糖化反应，由此与野生型植物相比，增加可从植物得到的可溶性糖的量。

[0026] 在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有增加的次生细胞壁沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0027] 将表达盒引入植物中，其中所述表达盒包含与异源启动子可操作地连接的编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节次生细胞壁在木质组织中的生产量，其中所述启动子与一定基因的天然启动子基本上相同，所述一定基因是所述转录因子的下游靶标；和[0028] 在表达所述转录因子的条件下，培养所述植物。在某些实施方案中，所述启动子和所述转录因子、或者所述启动子或所述转录因子来自与在其中建立人工正反馈回路的宿主细胞不同的植物种。在其它实施方案中，所述转录因子和所述启动子来自不同的植物种。

[0029] 在某些实施方案中，所述转录因子是NST1、NST2、NST3、MYB103、MYB85、MYB46、MYB83、MYB58或MYB63。在某些实施方案中，所述转录因子是NST1。

[0030] 在某些实施方案中，所述启动子是IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7或IRX10启动子。在某些实施方案中，所述启动子是天然IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7或IRX10启动子。

[0031] 在某些实施方案中，在其中表达与异源启动子可操作地连接的多核苷酸的植物是野生型植物。在某些实施方案中，在其中表达与异源启动子可操作地连接的多核苷酸的植物是具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积的经工程改造的植物。

[0032] 在某些实施方案中，所述植物选自：拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、竹、油菜、向日葵、柳树和短柄草属。

[0033] 在某些实施方案中，本发明提供了植物、植物细胞、种子、花、叶、果实或生物质，其包含经工程改造成具有增加的次生细胞壁沉积的植物组织。

[0034] 在另一个方面，本发明提供了增加从源自植物的生物质实现的生物能生产量的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：从经工程改造成具有增加的次生细胞壁沉积的植物收获生物质；和使所述生物质进行转化反应，由此与野生型植物相比增加生物能生产量。

[0035] 在另一个方面，本发明提供了增加茎/秆/木料强度的方法，所述方法可以减少倒伏和增加来自植物的木材密度。因而，本发明提供了一种在生长过程中增加植物的茎、秆或木料强度的方法，所述方法包括:培养经工程改造成具有增加的次生细胞壁沉积的植物，由此与野生型植物相比提高抗倒伏性。还可以培养具有增加的次生壁沉积的植物，以提供与野生型植物相比具有增加的机械应力抵抗力的植物、或得自这样的植物的生物质。

[0036] 在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0037] 将表达盒引入植物中，其中所述植物被修饰成具有降低的木聚糖生物合成酶活性水平；且进一步，其中所述表达盒包含与异源的导管特异性的启动子可操作地连接的编码木聚糖生物合成酶的多核苷酸；和

[0038] 在表达所述木聚糖生物合成酶的条件下，培养所述植物。在某些实施方案中，在其中引入表达盒的植物被修饰成具有降低的木聚糖生物合成酶表达水平。

[0039] 在某些实施方案中，所述木聚糖生物合成酶是不规则的木质部8(IRX8)、IRX14、IRX14-like、IRX9、IRX9-like、IRX7、IRX10、IRX10-like、IRX15、IRX15-like、F8H或PARVUS。

[0040] 在某些实施方案中，所述启动子是VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1，例如，与VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1启动子基本上相同的启动子；或天然的VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1启动子。

[0041] 在某些实施方案中，如下降低经修饰的植物中的木聚糖生物合成酶的活性水平：使所述植物与反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸会沉默编码木聚糖生物合成酶的基因的表达。在某些实施方案中，所述经修饰的植物(在其中表达与异源启动子可操作地连接的多核苷酸)具有在编码木聚糖合成酶的基因中的突变，所述突变会减少该酶的表达。在某些实施方案中，如下降低经修饰的植物中的木聚糖生物合成酶的活性：使所述植物与突变的木聚糖生物合成基因接触，所述基因编码具有显性阴性突变的蛋白并造成木聚糖生物合成的减少。

[0042] 在某些实施方案中，所述植物选自：拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、竹、油菜、向日葵、柳树和短柄草属。

[0043] 在某些实施方案中，本发明提供了植物、植物细胞、种子、花、叶、果实或生物质，其包含经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积的植物组织。

[0044] 在另一个方面，本发明提供了在糖化反应中获得增加的量的来自植物的可溶性糖的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：使经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积的植物进行糖化反应，由此与野生型植物相比，增加可从植物得到的可溶性糖的量。

[0045] 在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖O-乙酰化。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0046] 将表达盒引入植物中，其中所述植物被修饰成具有降低的负责木聚糖O-乙酰化的酶的表达水平；且进一步，其中所述表达盒包含与异源的导管特异性的启动子可操作地连接的编码木聚糖O-乙酰化酶的多核苷酸；和

[0047] 在表达木聚糖O-乙酰化酶的条件下，培养所述植物。

[0048] 在某些实施方案中，所述木聚糖O-乙酰化酶是RWA蛋白。

[0049] 在某些实施方案中，所述木聚糖O-乙酰化酶是毛状体双折射样(Trichome Birefringence Like)蛋白家族(PF03005家族也被称作未知功能结构域(Domain of Unknown Function)231)的成员。

[0050] 在某些实施方案中，所述启动子是VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1，例如，与VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1启动子基本上相同的启动子；或天然的VND1、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7、VNI2、REF4或RFR1启动子。

[0051] 在某些实施方案中，如下降低经修饰的植物中的木聚糖O-乙酰化酶的表达水平：使所述植物与反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸会沉默编码木聚糖O-乙酰化酶的基因的表达。在某些实施方案中，所述经修饰的植物(在其中表达与异源启动子可操作地连接的多核苷酸)具有在编码木聚糖O-乙酰化酶的基因中的突变，所述突变会减少该酶的表达。

[0052] 在某些实施方案中，所述植物选自：拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、竹、油菜、向日葵、柳树和短柄草属。

[0053] 在某些实施方案中，本发明提供了植物、植物细胞、种子、花、叶、果实或生物质，其包含经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积的植物组织。

[0054] 在另一个方面，本发明提供了在糖化反应中获得增加的量的来自植物的可溶性糖的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：使经工程改造成具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖O-乙酰化的植物进行糖化反应，由此与野生型植物相比，增加可从植物得到的可溶性糖的量。附图说明

[0055] 图1.苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的PAL的蛋白序列：拟南芥(Arabidopsis thaliana)(“AtPAL1”(SEQ ID NO:2))、小立碗藓(Physcomitrella patens)(藓)(“PpPAL3”(SEQ ID NO:97))、水稻(Oryza sativa)(稻)(“OsPAL”(SEQ ID NO:98))、玉米(Zea mays)(玉米)(“ZmPAL”(SEQ ID NO:99))、两色高梁(Sorghum bicolor)(高粱)(“SbPAL”(SEQ ID NO:100))、马尾松(Pinus massoniana)(松树)(“PlPAL”(SEQ ID NO:101))、紫苜蓿(苜缩属sativa)(苜蓿)(“MsPAL”(SEQ ID NO:102))、小麦(Triticum aestivum)(小麦)(“TaPAL”(SEQ ID NO:103))、大豆(Glycine max)(大豆)(“GmPAL2”(SEQ ID NO:104))、饲用甜菜(Beta vulgaris)(糖用甜菜)(“BvPAL”(SEQ ID NO:105))、红花烟草(Nicotiniana tabacum)(烟草)(“NtPAL1”(SEQ ID NO:106))、马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯)(“StPAL1”(SEQ ID NO:107))、绿竹(Bambusa oldhamii)(竹)(“BoPAL”(SEQ ID NO:108))、芫菁(Brassica rapa)(“BnPAL1”(SEQ ID NO:109))、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵)(“HaPAL”(SEQ ID NO:110))、蓖麻(Ricinus communis)(“RcPAL”(SEQ ID NO:111))、葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)(“VvPAL”(SEQ ID NO:112))、麻疯树(麻风树属curcas)(“JcPAL”(SEQ ID NO:113))、一品红(Euphorbia pulcherrima)(一品红)(“EpPAL”(SEQ ID NO:114))、红车轴草(Trifolium pratense)(三叶草)(“TpPAL”(SEQ ID NO:115))、日本百脉根(Lotus japonicus)(“LjPAL5”(SEQ ID NO:
116))和江南卷柏(Selaginella moellendorffii)(卷柏)(“SmPAL”(SEQ ID NO:117))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:96。

[0056] 图2.肉桂酸4-羟化酶(C4H)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的C4H的蛋白序列：拟南芥(“AtC4H”(SEQ ID NO:4))、火炬松(Pinus taeda)(松树)(“PtC4H”(SEQ ID NO:119))、水稻(稻)(“OsC4H”(SEQ ID NO:120))、玉米(玉米)(“ZmC4H”(SEQ ID NO:121))、两色高梁(高粱)(“SbC4H”(SEQ ID NO:122))、蒺藜状苜蓿(苜缩属truncatula)(“MtC4H”(SEQ ID NO:123))、小麦(小麦)(“TaC4H”(SEQ ID NO:124))、大豆(大豆)(“GmC4H”(SEQ ID NO:125))、红花烟草(烟草)(“NtC4H”(SEQ ID NO:126))、马铃薯(马铃薯)(“StC4H”(SEQ ID NO:127))、绿竹(竹)(“BoC4H”(SEQ ID NO:128))、甘蓝型油菜(Brassica napus)(“BnC4H1”(SEQ ID NO:129))、向日葵(向日葵)(“HaC4H”(SEQ ID NO:130))、蓖麻(“RcC4H”(SEQ ID NO:131))、葡萄(葡萄)(“VvC4H”(SEQ ID NO:132))、一品红(一品红)(“EpC4H”(SEQ ID NO:133))、红车轴草(三叶草)(“TpC4H”(SEQ ID NO:134))和江南卷柏(卷柏)(“SmC4H”(SEQ ID NO:135))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:118。

[0057] 图3.4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的4CL的蛋白序列：拟南芥(“At4CL2”(SEQ ID NO:6)和“At4CL1”(SEQ ID NO:137))、红花烟草(烟草)(“Nt4CL1”(SEQ ID NO:138)和“Nt4CL2”(SEQ ID NO:144))、赤桉(Eucalyptus camaldulensis)(“Ec4CL”(SEQ ID NO:139)、“Ec4CL1”(SEQ ID NO:142)和“Ec4CL2”(SEQ ID NO:143))、火炬松(松树)(“Pt4CL”(SEQ ID NO:145)和“Pt4CL1”(SEQ ID NO:140))、大豆(大豆)(“Gm4CL1”(SEQ ID NO:141))、水稻(稻)(“Os4CL3”(SEQ ID NO:146)和“Os4CL4”(SEQ ID NO:150))、两色高梁(高粱)(“Sb4CL”(SEQ ID NO:147))、玉米(玉米)(“Zm4CL”(SEQ ID NO:148))、柳枝稷(柳枝稷)(“Pv4CL”(SEQ ID NO:149))、黑麦草(Lolium perenne)(黑麦草)(“Lp4CL3”(SEQ ID NO:151))、江南卷柏(卷柏)(“Sm4CL1”(SEQ ID NO:152))和小立碗藓(藓)(“Pp4CL1”(SEQ ID NO:153))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:136。

[0058] 图4.羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸羟基肉桂酰基转移酶(HCT)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的HCT的蛋白序列：拟南芥(“AtHCT”(SEQ ID NO:8))、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)(“AlHCT”(SEQ ID NO:155))、火炬松(松树)(“PtHCT”(SEQ ID NO:156))、蓖麻(“RcHCT”(SEQ ID NO:157))、中果咖啡(Coffea canephora)(“CcHCT”(SEQ ID NOS:158和162))、葡萄(葡萄)(“VvHCT”(SEQ ID NO:159))、红花烟草(烟草)(“NtHCT”(SEQ ID NO:160))、红车轴草(三叶草)(“TpHCT”(SEQ ID NO:161))、水稻(稻)(“OsHCT”(SEQ ID NO:163)和“OsHCT3”(SEQ ID NO:164))、两色高梁(高粱)(“SbHCT”(SEQ ID NO:165))、玉米(玉米)(“ZmHCT”(SEQ ID NO:166)和“ZmHCT2”(SEQ ID NO:167))、燕麦(燕麦)(“AsHCT”(SEQ ID NO:168))和江南卷柏(卷柏)(“SmHCT1”(SEQ ID NO:169)和“SmHCT2”(SEQ ID NO:
170))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:154。

[0059] 图5.香豆酰基莽草酸3-羟化酶(C3H)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的C3H的蛋白序列：拟南芥(“AtC3H”(SEQ ID NO:10))、蓝桉(Eucalyptus globulus)(“EgC3H”(SEQ ID NO:172))、蓖麻(“RcC3H”(SEQ ID NO:173))、葡萄(葡萄)(“VvC3H”(SEQ ID NO:174))、大豆(大豆)(“GmC3H”(SEQ ID NO:175))、红车轴草(三叶草)(“TpC3H”(SEQ ID NO:
176))、蒺藜状苜蓿(“MtC3H”(SEQ ID NO:177))、中果咖啡(“CcC3H”(SEQ ID NO:178))、罗勒(罗勒)(“ObC3H”(SEQ ID NO:179))、火炬松(松树)(“PtC3H”(SEQ ID NOS:180和181))、红花烟草(烟草)(“NtC3H”(SEQ ID NO:182))、银杏树(Ginkgo biloba)(“GbC3H”(SEQ ID NO:183))、两色高梁(高粱)(“SbC3H”(SEQ ID NO:184))、玉米(玉米)(“ZmC3H”(SEQ ID NO:
185))、水稻(稻)(“OsC3H”(SEQ ID NOS:186和188))、小麦(小麦)(“TaC3H”(SEQ ID NO:
187))、江南卷柏(卷柏)(“SmC3H”(SEQ ID NO:189))和小立碗藓(藓)(“FpC3H”(SEQ ID NO:
190))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:171。

[0060] 图6.肉桂酰基辅酶A还原酶(CCR)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的CCR的蛋白序列：拟南芥(“AtCCR1”(SEQ ID NO:12))、番茄(Solanum lycopersicum)(番茄)(“SlCCR”(SEQ ID NO:192))、一品红(一品红)(“EpCCR”(SEQ ID NO:193))、马铃薯(马铃薯)(“StCCR”(SEQ ID NO:194))、冈尼桉(Eucalyptus gunnii)(“EgCCR”(SEQ ID NO:195))、葡萄(葡萄)(“VvCCR”(SEQ ID NO:196))、蓖麻(“RcCCR”(SEQ ID NO:197))、火炬松(松树)(“PtCCR”(SEQ ID NOS:198和199))、大豆(大豆)(“GmCCR”(SEQ ID NO:200))、挪威云杉(Picea abies)(云杉)(“PaCCR”(SEQ ID NO:201))、马尾松(松树)(“PmCCR”(SEQ ID NO:202))、水稻(稻)(“OsCCR”(SEQ ID NO:203))、黑麦草(黑麦草)(“LpCCR”(SEQ ID NO:
204))、柳枝稷(柳枝稷)(“PvCCR”(SEQ ID NOS:205和207))、两色高梁(高粱)(“SbCCR”(SEQ ID NO:206))、甘蔗(Saccharum officiunarum)(甘蔗)(“SoCCR”(SEQ ID NO:208))、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)(“HvCCR”(SEQ ID NO:209))、玉米(玉米)(“ZmCCR”(SEQ ID NO:
210))和江南卷柏(卷柏)(“SmCCR”(SEQ ID NO:211))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:191。

[0061] 图7.IRX8序列比对。拟南芥属IRX8(GAUT12)和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi15239707：得自拟南芥的IRX8(SEQ ID NO:212)；gi2241262287：得自毛果杨(Populus trichocarpa)的同系物(SEQ ID NO:213)；
gi224117396：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:214)；gi224141469：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:215)；gi224077712：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:216)；gi302803855：得自江南卷柏的同系物(SEQ ID NO:217)；gi30678270：得自拟南芥的GAUT13(SEQ ID NO:
218)；gi30685369：得自拟南芥的GAUT14(SEQ ID NO:219)；gi115489272：得自水稻的同系物(SEQ ID NO:220)；gi224131384：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:221)；gi22331857：得自拟南芥的GAUT15(SEQ ID NO:222)。

[0062] 图8.IRX14比对。拟南芥属IRX14和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi|30690793：得自拟南芥的IRX14(SEQ ID NO:223)；gi|15240245：得自拟南芥的IRX14-like(SEQ ID NO:224)；gi|224096716和gi|224081752：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NOS:225和226)；gi|302797519：得自江南卷柏的同系物(SEQ ID NO:227)；gi|115469624：得自水稻的同系物(SEQ ID NO:228)。

[0063] 图9.IRX9比对。拟南芥属IRX9和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi|15228084：得自拟南芥的IRX9(SEQ ID NO:229)；gi|
224140167和gi|224069352：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NOS:230和231)；gi|297600755和gi|115461821：得自水稻的同系物(SEQ ID NOS:232和233)；gi|224092304：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:234)；gi|302759368：得自江南卷柏的同系物(SEQ ID NO:235)；gi|
42571663：得自拟南芥的IRX9-like(SEQ ID NO:236)；gi|224063335：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:237)；gi|115439133，gi|115474279，gi|115465403，gi|115481434和gi|
115456794：得自水稻的同系物(SEQ ID NOS:238-242)。

[0064] 图10.IRX7比对。拟南芥属IRX7(FRA8)和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi|42570324：得自拟南芥的IRX7(SEQ ID NO:243)；gi|224106838：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:244)；gi|42568020：得自拟南芥的IRX7-like(F8H)(SEQ ID NO:245)；gi|115450193：得自水稻的同系物(SEQ ID NO:246)；gi|
302786830和gi|302826405：得自江南卷柏的同系物(SEQ ID NOS:247和248)。

[0065] 图11.IRX10比对。拟南芥属IRX10和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi|18424516：得自拟南芥的IRX10-like(GUT1)(SEQ ID NO:249)；gi|224119858：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:250)；gi|15223522：得自拟南芥的IRX10(GUT2)(SEQ ID NO:251)；gi|224053575和gi|224075447：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NOS:252和253)；gi|115441967：得自水稻的Os01g0926600(SEQ ID NO:254)；gi|
302783378：得自江南卷柏的GT47D1(SEQ ID NO:255)；gi|115458146：得自水稻的Os04g0398600(SEQ ID NO:256)；gi|115441965：得自水稻的Os01g0926400(SEQ ID NO:
257)；gi|115481310：得自水稻的Os10g0180000(SEQ ID NO:258)；gi|224106838：得自毛果杨的同系物(SEQ ID NO:259)。

[0066] 图12。Parvus序列比对。拟南芥属PARVUS(GATL1)和同源蛋白的氨基酸序列比对。用COBALT(Papadopoulos JS和Agarwala R(2007)COBALT：constraint-based alignment tool for multiple protein sequences，Bioinformatics 23:1073-79)进行所述比对。通过它们的GenBank蛋白ID来鉴别蛋白。gi|18394719：得自拟南芥的PARVUS(SEQ ID NO:
260)。其它蛋白是得自拟南芥(SEQ ID NOS:265、269-273和275-277)、毛果杨(SEQ ID NOS:
261-264、266和267)和水稻(SEQ ID NOS:268、274和278-280)的一些同系物，和得自江南卷柏的单一同系物(gi|302807664)(SEQ ID NO:281)。

[0067] 图13.NAC次生壁增厚促进因子(NST)比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的NST的蛋白序列：拟南芥(“AtNST1”(SEQ ID NO:14)、“AtNST2”(SEQ ID NO:283)和“SND1”(SEQ ID NO:284))、火炬松(松树)(“PtNAC023”(SEQ ID NO:285)、“PtNAC065”(SEQ ID NO:288)和“PtNAC”(SEQ ID NOS:296和297))、蒺藜状苜蓿(“MtNAC1”(SEQ ID NO:286))、大豆(大豆)(“GmNAM1”(SEQ ID NO:287))、葡萄(葡萄)(“VvNST”(SEQ ID NO:289))、蓖麻(“RcNST”(SEQ ID NO:290))、冈尼桉(“EgNST”(SEQ ID NO:291))、玉米(玉米)(“ZmNST”(SEQ ID NO:292))、两色高梁(高粱)(“SbNST”(SEQ ID NO:293、295和298))、水稻(稻)(“OsNAC7”(SEQ ID NOS:294和302)和“OsNST”(SEQ ID NO:301))、西加云杉(Picea sitchensis)(云杉)(“PsNST”(SEQ ID NO:299))、苹果(“AppleT”(SEQ ID NO:300))和江南卷柏(卷柏)(“SmNST1”)(SEQ ID NO:303)。大多数(共有)＝SEQ ID NO:282。

[0068] 图14.调节次生细胞壁生物合成的转录网络。呈现了调节导管元件和纤维中的次生细胞壁沉积的主要转录因子，以及在次生细胞壁生物合成过程中诱导的几个下游靶基因。呈现的转录因子能够诱导在纤维素、半纤维素和/或木质素生物合成中涉及的基因的表达。该图取自Zhong等人,2007。

[0069] 图15.经工程改造的植物系的细胞壁的木质素分析。A.使用乙酰基溴方法对得自野生型(W)和经工程改造的(“Eng Lig I”)(ref3-2+pVND6:C4H)植物的衰老茎的木质素定量。B.从左至右分别是同龄野生型(W)和2种经工程改造的Eng Lig I植物的、用间苯三酚染色的茎横截面的亮光图像。

[0070] 图16.Eng Lig I系的分析。A.在2个不同的生长阶段对比了Eng Lig I的植物生长表型。上图描绘了营养体阶段，下图描绘了成熟体阶段(抽苔阶段)。在A-D中，野生型植物显示在左侧，经工程改造的Eng Lig I植物显示在右侧。B.从干燥茎释放的糖，所述干燥茎用NaOH预处理并与纤维素酶混合液一起温育0、24或48小时。C.从干燥茎释放的糖，所述干燥茎用热水预处理并与纤维素酶混合液一起温育0、24或48小时。D.从干燥茎释放的糖，所述干燥茎用稀酸预处理并与纤维素酶混合液一起温育0、24或48小时。

[0071] 图17.Eng Lig II系的分析。A.在2个不同的生长阶段对比了Eng Lig II(ref3-2+pVND6:C4H+pIRX8:NST1)的植物生长表型。上图描绘了营养体阶段，下图描绘了成熟体阶段(抽苔阶段)。野生型植物显示在左侧，经工程改造的Eng Lig II植物显示在右侧。B.从左至右分别是同龄野生型(W)、ref3-2突变体和经工程改造的Eng Lig II植物的、用间苯三酚染色的茎横截面的亮光图像。C.使用乙酰基溴方法对得自野生型(W)、经工程改造的Eng Lig I和经工程改造的Eng Lig II植物的衰老茎的木质素定量。

[0072] 图18.穿过野生型(A,C)和经工程改造的(ref3-2+pVND6:C4H+pIRX8:NST1)(B,D)植物的横截面的透射电子显微照片。A-B.植物的木质部组织。C-D.植物的维管束间组织。“Ve,”“Xf,”和“If”分别代表导管、木质纤维和维管束间纤维。

[0073] 图19.Eng Lig I和Eng Lig II系的糖化效率。A.从干燥茎释放的糖，所述干燥茎用热水预处理并与纤维素酶混合液一起温育0-144小时。得自野生型(野生型；蓝色)植物、经工程改造的Eng Lig I(橙色)植物或Eng Lig II(红色)植物的茎。B.从干燥茎释放的糖，所述干燥茎用NaOH预处理并与纤维素酶混合液一起温育0-144小时。得自野生型(野生型；蓝色)植物、经工程改造的Eng Lig I(橙色)植物或Eng Lig II(红色)植物的茎。

[0074] 图20.启动子活性表征。A.从左至右分别是得自野生型(WT)、cadc/d突变体、用pVND6:CADc转化的cadc/d突变体和用pC4H:CADc转化的cadc/d突变体的5-10cm茎的基部的茎横截面的明视野图像。由于CAD活性缺乏而产生红色。B.从左至右分别是得自野生型(WT)、f5h突变体、用pVND6:F5H转化的f5h突变体和用pC4H:F5H转化的f5h突变体的5-10cm茎的基部的Maule染色的茎横截面的明视野图像。由于芥子醇的存在而产生红色，并且所述红色代表在Maule染色反应过程中发生反应的木质素中的芥子醇的量。通过天然F5H基因的表达，恢复了f5h突变体中的芥子醇的生产。

[0075] 图21.木质部塌缩。A.同龄成体ref3-2突变体(纯合子c4h突变体)和野生型植物(wt)(分别为右图和左图)。B.相同生长龄ref3-2突变体(纯合子c4h突变体)和野生型植物(分别为右图和左图)。C.上图和下图分别描绘了放大20和40倍的间苯三酚染色的茎横截面的明视野图像，所述茎得自在与A所示相同龄取样的野生型和ref3-2(分别为左图和右图)。黄色箭头指向ref3-2突变体中的一些塌缩导管。

[0076] 图22.NST1的表达分析。通过半定量RT-PCR分析了NST1表达。pIRX8:NST1：使用特异性的NST1引物来证实由pIRX8启动子驱动的NST1的表达。NST1：使用特异性的NST1引物来证实各自由pIRX8和pNST1启动子驱动的2个NST1基因的表达。pVND6:C4H:使用特异性的C4H引物来证实由pVND6驱动的C4H基因的表达。C4H:使用特异性的C4H引物来证实由pVND6或pC4H启动子驱动的C4H基因(野生型和ref3-2突变体等位基因)的表达。微管蛋白：使用特异性的微管蛋白引物来证实用于RT-PCR的RNA的质量和数量。泳道1-4显示了独立的EngLig II(ref3-2+pVND6:C4H+pIRX8:NST1)植物；泳道5显示了一种野生型植物；泳道6和7显示了独立的Eng Lig I(ref3-2+pVND6:C4H)植物；且泳道8显示了一种ref3-2突变体植物。

[0077] 图23.细胞壁厚度。A-D.在得自Col0(WT)(A)、ref3-2(c4h突变体)(B)、Eng Lig I(C)和Eng Lig II(D)植物中的维管束内区域的20个独立纤维细胞上测量的细胞壁厚度和细胞直径。通过将细胞壁厚度总和(μm)除以细胞直径(μm)来测量细胞壁比率。E.细胞壁厚度和细胞直径测量方法。绿色条(a)和黄色条(b)各自代表细胞壁厚度测量结果，且粉红色条代表细胞直径。通过将细胞壁厚度总和(μm)除以细胞直径(μm)来测量细胞壁比率：(a+b)/细胞直径。

[0078] 图24.化学水解后从细胞壁释放的糖。A-B.TFA水解后的半纤维素组成。A.释放的主要糖的定量(mg糖/mg干燥细胞壁)。B.每种糖在释放的总量中的百分比。C.在H2SO4水解后释放的总糖。

[0079] 图25.SHN蛋白序列的比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的SHN多肽的蛋白序列：拟南芥(“At”(SEQ ID NOS:37、305和306))、毛果杨(“Pt”(SEQ ID NOS:307-311))、蒺藜状苜蓿(“Mt”(SEQ ID NO:312-316))、水稻(“Os”(SEQ ID NO:317))、紫短柄草(Brachypodium distachyon)(“Bd”(SEQ ID NOS:318和319))、玉米(“Zm”(SEQ ID NO:320))、两色高梁(“Sb”(SEQ ID NOS:321和322))、大麦(“Hv”(SEQ ID NO:323))、西加云杉(“Ps”(SEQ ID NO:324))、江南卷柏(“Sm”(SEQ ID NO:325))和小立碗藓(“Pp(SEQ ID NO:
326))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:304。

[0080] 图26.Myb96蛋白序列的比对。使用ClustalW，比对了得自下述植物的Myb96多肽的蛋白序列：拟南芥(“At”(SEQ ID NOS:80和81))、小盐芥(Thellungiella halophila)(“Th”(SEQ ID NO:82))、蒺藜状苜蓿(“Mt”(SEQ ID NOS:85和86))、毛果杨(“Pt”(SEQ ID NO:84))、葡萄(“Vv”(SEQ ID NO:83))、大叶来檬(Citrus macrophylla)(“Cm”(SEQ ID NO:
87))、紫短柄草(“Bd”(SEQ ID NOS:88和89))、小麦(“Ta”(SEQ ID NO:90))、水稻(“Os”(SEQ ID NOS:91和92))和玉米(“Zm”(SEQ ID NO:93))。大多数(共有)＝SEQ ID NO:327。

[0081] 图27.细胞壁人工正反馈回路的表示。图27描绘了一种示例性的细胞壁致密化策略。

[0082] 图28.靶组织中的蜡生物合成途径的诱导。图28描绘了用于诱导靶组织中的蜡生物合成途径的示例性人工正反馈回路。

[0083] 图29.经工程改造的细胞壁植物系的植物生长表型。野生型、c4h突变体植物和经工程改造的植物系的生长对比，在所述经工程改造的植物系中，ref3-2突变被pREF4:C4H(A)或pRFR1:C4H(B)DNA构建体补充。

[0084] 图30.经工程改造的细胞壁植物系的木质素分布和含量。木质素分布显示在上图中。木质素定量显示在下图中。

[0085] 图31.木质素工程改造的植物系的糖化效率。图A和B显示了从干燥茎释放的糖，所述茎使用热水(图A)或碱(图B)预处理，随后与纤维素酶混合液一起温育。图C提供了糖化结果的总结。

[0086] 图32.细胞壁致密化反馈回路。图A解释了含有DNA构建体pCesA4:NST1的拟南芥属野生型植物中的细胞壁致密化。图B显示了使用pAtlRX8:AtNST1DNA构建体对短柄草属野生型植物细胞壁的致密化，其中所述启动子和转录因子都得自拟南芥属。

[0087] 图33.木聚糖工程改造化的例子。野生型、突变体和用由pVND6或pVND7驱动的突变的IRX7、IRX8或IRX9基因的野生型形式补充的突变体植物的生长对比。

[0088] 图34.转化体的后代的生长。通过用pVND7:IRX7表达构建体转化irx7突变体制备的4个单个转化体的后代的生长。

[0089] 图35.转化体的后代的生长。通过用pVND7:IRX9表达构建体转化irx9突变体制备的2个单个转化体的后代的生长。

[0090] 图36.从转化体制备的非纤维质单糖组成。从4个单个转化体制备的细胞壁的非纤维质单糖组成，所述转化体通过用pVND7:IRX7表达构建体转化irx7突变体来制备。

[0091] 图37.从转化体制备的非纤维质单糖组成。从4个单个转化体制备的细胞壁的非纤维质单糖组成，所述转化体通过用pVND6:IRX8表达构建体转化irx8突变体来制备。

[0092] 图38.从单个转化体制备的茎细胞壁的非纤维质单糖组成。从4个单个转化体的后代制备的茎细胞壁的非纤维质单糖组成，所述转化体通过用pVND7:IRX9表达构建体转化irx9突变体来制备。

[0093] 图39.细胞壁的糖化分析。从2个单个转化体的后代制备的细胞壁的糖化分析，所述转化体通过用pVND6:IRX9表达构建体转化irx9突变体来制备。

[0094] 图40.被转化以建立人工正反馈回路的植物中的蜡沉积。用不同构建体转化的拟南芥属植物的视觉分析表明了与对照植物相比增加的叶片亮度。

[0095] I.定义

[0096] 本文中使用的术语“木质素生物合成酶”表示，调节植物中的木质素单体(对-香豆酰基(4-羟基肉桂基)醇、松柏基(3-甲氧基4-羟基肉桂基)醇、和芥子基(3,5-二甲氧基4-羟基肉桂基)醇)的合成的蛋白。该术语包括本文所述的具体酶的多态变体、等位基因、突变体和种间同系物。编码木质素生物合成酶的核酸表示基因、前-mRNA、mRNA等，包括编码本文所述的具体序列的多态变体、等位基因、突变体和种间同系物的核酸。因而，在某些实施方案中，木质素生物合成核酸(1)具有这样的核酸序列：其与SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个的核酸序列具有大于约50％核苷酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性，优选地在至少约10个、15个、20个、25个、50个、100个、200个、500个或更多个核苷酸的区域内或在整个多核苷酸的长度内；或(2)编码这样的多肽：所述多肽的氨基酸序列与由SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个的核酸序列编码的多肽、或与SEQ ID NO:2、4、6、
8、10或12中的任一个的氨基酸序列、或与图1-6中的任一个所示的任意序列具有大于约
50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。在某些实施方案中，木质素生物合成酶或木质素生物合成多肽具有这样的氨基酸序列：其与SEQ ID NO:2、
4、6、8、10或12中的任一个的氨基酸序列、或与图1-6中的任一个所示的任意氨基酸序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。

[0097] 通过名称(例如，肉桂酸4-羟化酶)、基因符号(例如，C4H)或登录号(例如，NM_128601(对于核酸)或NP_180607(对于蛋白))，可以鉴别木质素生物合成酶。应当理解，所有这些标识符表示相同的生物标记，因而是等效的。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶是苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)(登录号NM_129260或NP_181241)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)(登录号NM_128601或NP_180607)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)(登录号NM_113019或NP_
188761)、羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸羟基肉桂酰基转移酶(HCT)(登录号NM_124270或NP_
199704)、香豆酰基莽草酸3-羟化酶(C3H)(登录号NM_119566或NP_850337)或肉桂酰基辅酶A还原酶1(CCR1)(登录号NM_101463或NP_173047)。

[0098] 本文中使用的术语“木聚糖生物合成酶”表示在木聚糖合成中涉及的酶。本文中使用的该术语还可以表示修饰木聚糖的酶，例如，乙酰化木聚糖的酶。该术语包括本文所述的具体多肽的多态变体、等位基因、突变体和种间同系物。编码木聚糖生物合成酶的核酸表示基因、前-mRNA、mRNA等，包括编码本文所述的具体氨基酸序列的多态变体、等位基因、突变体和种间同系物的核酸。因而，在某些实施方案中，木聚糖生物合成酶编码这样的多肽：所述多肽的氨基酸序列与图7-12中的任一个所示的任意序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、
200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。在图7-12中提供的登录号下可得到木聚糖生物合成酶的例子的核酸序列。在某些实施方案中，木聚糖生物合成酶具有这样的氨基酸序列：其与图7-12中的任一个所示的任意序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、
200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。在某些实施方案中，所述木聚糖生物合成酶是不规则的木质部8(IRX8)、IRX14、IRX14-like、IRX9、IRX9-like、IRX7、IRX10、IRX10-like、F8H、PARVUS或RWA1、RWA2、RWA3或RWA4。

[0099] 当在描述具有基本上集中在特定组织的木质素沉积和/或木聚糖沉积的植物的背景下使用时，术语“基本上集中”表示，与通常具有高木质素和/或木聚糖含量的其它细胞类型(诸如维管束间纤维或韧皮纤维)相比，在特定目标细胞类型中以明显更高的量产生的木质素沉积和/或木聚糖沉积。在某些实施方案中，当在特定目标细胞类型中的木质素沉积和/或木聚糖沉积的量是在通常具有高木质素和/或木聚糖含量的其它细胞类型中的木质素沉积和/或木聚糖沉积的量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多时，木质素沉积和/或木聚糖沉积是基本上集中在特定目标细胞类型。在某些实施方案中，当在特定目标细胞类型中的木质素沉积和/或木聚糖沉积的量是在维管束间纤维或韧皮纤维中的木质素沉积和/或木聚糖沉积的量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多时，木质素沉积和/或木聚糖沉积基本上集中在特定目标细胞类型。在某些实施方案中，当在除了特定目标细胞类型以外的细胞类型中不存在可检测的木质素沉积和/或木聚糖沉积时，木质素沉积和/或木聚糖沉积基本上集中在特定目标细胞类型。在某些实施方案中，木聚糖O-乙酰化类似地基本上集中在特定细胞类型，而木聚糖含量一般不一定以不同于天然(即，野生型)情形的方式基本上集中。使用本领域已知的任意方法，可以评估木质素沉积和/或木聚糖沉积，所述方法包括、但不限于使用乙酰基溴试剂的分光光度法、组织化学染色(例如，用间苯三酚)和免疫组织化学(例如，用LM10单克隆抗体)。使用免疫组织化学(例如，用LM23单克隆抗体)，用乙酰酯的生化测定，或通过确定水解酶的作用，可以评估木聚糖O-乙酰化。

[0100] 本文中使用的术语“调节生物合成途径的组分的产生的转录因子”或“主要转录因子”表示，调节生物合成途径中的一个或多个基因的表达的转录因子。

[0101] 本文中使用的术语“调节次生细胞壁的产生的转录因子”表示，通过调控转录而调节在木质素生物合成和/或多糖(纤维素和半纤维素)生物合成中涉及的一个或多个基因的表达的多肽和所述多肽的变体、突变体和同系物。在某些实施方案中，编码这样的转录因子的核酸：(1)具有这样的核酸序列，其与SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中的任一个的核酸序列具有大于约50％核苷酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的核苷酸序列同一性，优选地在至少约10个、15个、20个、25个、50个、100个、200个、500个或更多个核苷酸的区域内或在整个多核苷酸的长度内；(2)编码这样的多肽，所述多肽的氨基酸序列与由SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中的任一个的核酸序列编码的多肽、或与SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中的任一个的氨基酸序列、或与图13所示的任一个氨基酸序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。在某些实施方案中，调节次生细胞壁产生的转录因子多肽:(1)具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中的任一个的氨基酸序列、或与图13所示的任一个氨基酸序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。

[0102] 在某些实施方案中，所述转录因子是NAC次生壁增厚促进因子1(NST1)(ANAC043；登录号NM_130243或NP_182200)、NST2(ANAC066；登录号NM_116056或NP_191750)、NST3(SND1/ANAC012；登录号NM_103011或NP_174554)、次生壁相关的NAC结构域蛋白2(SND2)(ANAC073；登录号NM_118992或NP_194579)、SND3(ANAC010；登录号NM_102615或NP_
564309)、MYB结构域蛋白103(MYB103)(登录号NM_105065或NP_176575)、MBY85(登录号NM_
118394或NP_567664)、MYB46(登录号NM_121290或NP_196791)、MYB83(登录号NM_111685或NP_187463)、MYB58(登录号NM_101514或NP_173098)或MYB63(登录号NM_106569或NP_
178039)。

[0103] 当在调节目标生物合成途径的组分的转录因子的下游靶标的背景下使用时，术语“下游靶标”表示这样的基因或蛋白：其表达直接地或间接地由所述转录因子调节。在某些实施方案中，所述下游靶标是被所述转录因子直接地或间接地增量调节的基因或蛋白。在某些实施方案中，所述下游靶标是被所述转录因子直接地或间接地减量调节的基因或蛋白。

[0104] 在次生壁产生的背景下，下游靶标可以是，例如，IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX14-L、IRX7或IRX10。关于下游靶标的登录号和序列的例子，参见例如图7-12。在本领域中还描述了下游靶基因；参见，例如，Oikawa等人,2010,PLoS ONE 5(11):e15481。如本领域理解的和在下文中进一步解释的，一些下游靶标(例如，IRX9-Like和RWA2)本身不可在次生壁组织中表达，但是可以与次生壁特异性的启动子或导管特异性的启动子(所述启动子受调节次生壁产生的转录因子调节)连接，并且然后可以起将木聚糖或木聚糖乙酰化基本上集中在次生壁的作用。

[0105] 本文中使用的术语调节“蜡和/或角质”组分(例如，蜡酯、烷烃、脂肪醇和脂肪酯)产生的转录因子表示，通过调控转录而调节在蜡和/或角质生物合成中涉及的一个或多个基因的表达的多肽和所述多肽的变体、突变体和同系物。在某些实施方案中，编码这样的转录因子的核酸：编码具有特定氨基酸序列的多肽，所述特定氨基酸序列与由SEQ ID NO:80-93中的任一个的核酸序列编码的多肽、或与SEQ ID NO:80-93中的任一个的氨基酸序列具有大于约50％氨基酸序列同一性、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选地
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性，优选地在至少约25个、50个、100个、200个或更多个氨基酸的区域内或在整个多肽的长度内。

[0106] 当在调节蜡/角质产生的转录因子的背景下使用时，“下游靶标”表示在蜡/角质产生中涉及的非编码RNA、基因或蛋白，其表达直接地或间接地由所述转录因子调节。在某些实施方案中，所述下游靶标是直接地或间接地由所述转录因子增量调节的非编码RNA、基因或蛋白。在某些实施方案中，所述下游靶标是直接地或间接地由所述转录因子减量调节的非编码RNA、基因或蛋白。这样的基因的例子包括下述的(所述基因的同义词在括号中列出)：CER1，醛脱羰酶；CER2(VC2)，BAHD-型酰基–转移酶；CER3(WAX2)，甾醇去饱和酶；CER4(FAR3)，脂肪酰基辅酶A还原酶；CER5(WBC12)，ABC转运蛋白；CER6(CUT1)，极长链脂肪酸缩合酶；CER10(ECR)，烯酰辅酶A还原酶；WSD1，蜡酯合酶；MAH1，中链烷烃水解酶；WBC11(ABCG11，DSO，COF1)，ABC转运蛋白；KCS1，极长链脂肪酸缩合酶；KCS2(DAISY)，极长链脂肪酸缩合酶；FATB，酰基载体；LACS1，长链酰基辅酶A合酶；LACS2，长链酰基辅酶A合酶；CYP86A4，细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶；CYP86A7，细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶；LCR(CYP86A5)，细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶；KCS10(FDH)，极长链脂肪酸缩合酶；和CER60(KCS5)，极长链脂肪酸缩合酶。在示例性的蜡/角质基因列表中提供了登录号的例子。

[0107] 术语“降低的活性水平”、“减少的活性”和“降低的活性”可互换地表示，与在野生型(即，天然存在的)植物中的活性量相比，在经工程改造的植物中的蛋白(例如，目标细胞壁生物合成酶或目标木聚糖生物合成酶基因或蛋白)的活性量的下降。在某些实施方案中，减少的活性源自降低的表达水平。降低的活性水平或降低的表达水平可以是蛋白(例如，细胞壁生物合成酶基因或蛋白或木聚糖生物合成酶基因或蛋白)的活性或表达的量的下降了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更大。在某些实施方案中，所述降低的活性水平或降低的表达水平是酶(例如，目标细胞壁生物合成酶基因或蛋白或目标木聚糖生物合成酶基因或蛋白)在经工程改造的植物的所有组织中的活性或表达的量的下降。在某些实施方案中，所述蛋白或基因(例如，目标细胞壁生物合成酶基因或蛋白或目标木聚糖生物合成酶基因或蛋白)的活性或表达的量的下降集中在经工程改造的植物的一个或多个组织。在某些实施方案中，所述生物合成酶的量没有下降，但是氨基酸序列经过修饰，使得酶活性直接地或间接地下降(例如，通过抑制性蛋白的表达)。通过测量由目标基因编码的RNA的水平的下降和/或蛋白表达水平或目标蛋白活性的下降，可以评估基因或蛋白的表达量的下降。

[0108] 术语“多核苷酸”和“核酸”互换使用，并表示从5'末端至3'末端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，可使用可能具有替代主链的核酸类似物，其包括例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)；带正电主链、非离子主链和非核糖主链。因此，核酸或多核苷酸还可能包含经修饰的核苷酸，其允许被聚合酶正确阅读。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括作为单独单链或在双链体中的核酸的有义链和反义链。本领域技术人员会理解，对单链的描述还限定了互补链的序列；因此本文中所描述的序列也提供它的互补序列。除非另外说明，具体的核酸序列也隐含地涵盖了其变体(例如简并密码子取代物)和互补序列，明确说明的序列。核酸可以是DNA，包括基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸可能包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，其包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等[0109] 在2个核酸或多肽的背景下使用的术语“基本上相同的”表示，与参照序列具有至少50％序列同一性的序列。同一性百分比可以是从50％至100％的任意整数。一些实施方案至少包括：使用本文描述的程序，优选BLAST(使用如下所述的标准参数)，与参照序列相比，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％。例如，编码木质素生物合成酶的多核苷酸可以具有这样的序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性。

[0110] 如果两个序列中的核苷酸序列或氨基酸残基序列在如下所述进行最大对应性比对时是相同的，则这两个核酸序列或多肽序列被称为“相同的”。在2个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“相同的”或“同一性”百分比表示，当在对比窗中对比和比对最大对应性时，使用下述序列对比算法之一或通过手工比对和目检测得，2个或多个序列或子序列是相同的，或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。当关于蛋白或肽的序列同一性百分比使用时，将认识到：不相同的残基位置常常相差保守的氨基酸置换，其中氨基酸残基被其它具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基替代，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换时，可上调序列同一性百分比，以针对置换的保守性质进行校正。进行这样的调节的方法是本领域技术人员众所周知的。典型地，这包括：将保守置换计分为部分错配而非完全错配，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同的氨基酸被给予1分且非保守置换被给予0分时，保守置换被给予0至1之间的得分。根据例如Meyers和Miller,Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988)的算法，计算保守置换的得分，例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中实现。

[0111] 对于序列对比，通常一个序列作为参照序列，测试序列与其进行对比。当使用序列对比算法时，将测试序列和参照序列输入到计算机中，指定子序列坐标，如有必要，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。序列对比算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。

[0112] 本文中使用的“对比窗”包括对选自20至600、经常约50至约200、更经常约100至约150的连续位置数目中的任一个数目的区段的提及，在所述区段中，可以在将序列与具有相同连续位置数目的参照序列最佳比对后，将这两条序列进行对比。为了对比而比对序列的方法是本领域众所周知。用于对比的最佳序列比对可以通过如下方法进行，例如，Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,
J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'
l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package中，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或通过手工比对和目检。

[0113] 适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。用于执行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)是公众可获得的。这个算法包括，首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字来鉴定高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，高分序列对匹配或满足某些正评估的阈值分T。T被称为邻近字分数阈值(Altschul等人,出处同上)。这些最初的邻近字采样充当了开始搜索以发现含有它们的更长的HSP的种子。然后沿着每个序列的两个方向延伸所述字采样，直到累积的比对计分提高。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配的残基对的奖励分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的计分。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积的分数。在下述情况时停止在每个方向上字采样的延伸：累积的比对分数从其达到的最大值下降了数值X；由于一个或多个负分数残基比对的积累，累积的计分达到零或低于零；或到达任何一个序列的结尾。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用的是字长度(W)28，期望值(E)10，M＝1，N＝-2，并对比两个链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的是，字长度(W)3，期望值(E)10，和BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。

[0114] BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量法是最小总和概率(P(N))，其提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间可能偶然出现匹配的概率指示。例如，如果在与参照核酸对比测试核酸时最小总和概率小于约0.01、更优选地小于约10-5和最优选地小于约10-20，那么认为核酸与参照序列相似。

[0115] 与参照序列基本上相同的核酸或蛋白序列包括“经保守修饰的变体”。对于特定的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子确定的每一个位点，密码子可以变化成任何所述的相应的密码子而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，它们是一类保守修饰的变异。本文中编码多肽的每种核酸序列也描述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每种密码子(除了AUG，该密码子通常是甲硫氨酸的唯一密码子)都可被修饰，而能生成功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都包含在各所述序列中。

[0116] 关于氨基酸序列，技术人员将认识到当改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸置换时，在核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变被编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各种置换是“保守修饰的变异”。提供功能相似氨基酸的保守置换表是本领域公知的。

[0117] 以下六组每组都包含相互之间为保守置换的氨基酸：

[0118] 1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

[0119] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

[0120] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

[0121] 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

[0122] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

[0123] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

[0124] (参见，例如，Creighton,Proteins(1984))。

[0125] 核苷酸序列基本上相同的另一种表示是，在严谨条件下，2种分子彼此杂交或与第三种核酸杂交。严谨条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。通常，选择的严谨条件比特定序列在确定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是这样的温度(在确定的离子强度和pH下)：在该温度，50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。通常，严谨条件是这样的条件：其中盐浓度为约0.02摩尔，在pH 7，且温度为至少约60℃。例如，用于杂交(诸如在印迹技术中的RNA-DNA杂交)的严谨条件是包括在0.2X SSC中在55℃洗涤至少1次20分钟的条件或等效条件。

[0126] 本文中使用的术语“启动子”表示，能够驱动细胞中的DNA序列的转录的多核苷酸序列。因而，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括，在调节或调控基因转录的时机和/或速率中涉及的顺式-和反式-作用转录控制元件和调节序列。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括在转录调节中涉及的增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5'和3'非翻译区或内含子序列。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子相互作用以影响(开启/关闭、调节、调控等)基因转录。启动子位于转录基因的5'侧，且如本文中使用的，包括在翻译起始密码子的5'侧的序列(即，包括mRNA的5'非翻译区，通常包含100-200bp)。最常见地，核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更经常在1kbp内，且经常在翻译起始位点的500bp内。按照惯例，启动子序列经常被提供为在它控制的基因的编码链上的序列。在该应用的背景下，通常用启动子天然地调节其表达的基因的名称来表示所述启动子。通过基因的名称来表示在本发明的表达构建体中使用的启动子。通过名称对启动子的提及包括野生型天然启动子以及所述启动子的保留诱导表达的能力的变体。通过名称对启动子的提及不限于特定植物物种，而是也包括得自其它植物种内的对应基因的启动子。

[0127] “组成型启动子”在本发明范围内表示能够在几乎所有细胞类型中启动转录的启动子，而“细胞类型特异性的启动子”或“组织特异性的启动子”仅在一种或几种特定细胞类型中或在形成组织的细胞群中启动转录。在某些实施方案中，如果启动子在特定细胞类型或组织中启动的转录水平是所述启动子在非导管组织中启动的转录水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更高，那么该启动子是组织特异性的。在某些实施方案中，所述启动子是导管特异性的。本文中使用的“导管特异性的”启动子表示这样的启动子：与植物的其它非导管细胞相比，其在导管中启动明显更高的转录水平。本文中使用的术语“导管”表示木质导管，即植物中的维管组织的传导组件，其在水、营养物和信号传递分子在植物中的运输中起作用。在某些实施方案中，如果启动子在导管组织中启动的转录水平是所述启动子在非导管组织中启动的转录水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更高，那么该启动子是导管特异性的。导管特异性的启动子的非限制性例子包括，编码维管相关的NAC-结构域蛋白1(VND1)、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7的任意基因的天然启动子。参见，例如，Kubo等人,Genes Dev.19:1855-1860(2005)，它通过引用并入本文。导管特异性的启动子的另一个例子包括REF4和RFR1的天然启动子(参见，例如，Bonawitz等人,“The REF4and RFR1subunits of the eukaryotic transcriptional coregulatory complexMediator are required for phenylpropanoid homeostasis in Arabidopsis.”doi:10.1074/jbc.M111.312298(2012))。

[0128] 在人工正反馈回路的背景下，在目标生物合成途径的基因的下游的“诱导型”启动子表示这样的启动子：其中所述基因的表达被增强，即，其表达可以直接地或间接地被在人工正反馈回路中采用的转录因子活化(开启和/或增加)。因而，当提及在人工反馈回路构建体中采用的启动子时，应当理解，所述启动子被转录因子“诱导”，不论是否明确地阐明所述启动子是诱导型启动子。

[0129] 在下述情况下，多核苷酸相对于生物体或第二种多核苷酸序列而言是“异源”：所述多核苷酸源自外来物种，或者，如果源自相同物种，其从它的原始形式经过修饰。例如，当将编码多肽序列的多核苷酸说成与异源启动子可操作地连接时，是指，编码所述多肽的多核苷酸编码序列源自一个物种，而所述启动子序列源自另一个不同的物种；或者，如果二者源自相同的物种，所述编码序列天然地不与所述启动子结合(例如，是遗传工程改造的编码序列，例如，从相同物种的不同基因改成，或得自不同生态型或变种的等位基因)。

[0130] 术语“可操作地连接”表示，2个2个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能关联。通常，它表示转录调节序列与被转录的序列的功能关联。例如，在下述情况下，启动子或增强子序列与DNA或RNA序列可操作地连接：其在适当的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调控所述DNA或RNA序列的转录。通常，与被转录的序列可操作地连接的启动子转录调节序列与所述被转录的序列是物理上连续的，即，它们顺式地起作用。但是，有些转录调节序列(诸如增强子)不需要与它们增强其转录的编码序列在物理上连续或位于紧邻处。

[0131] 术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”表示这样的核酸构建体：当被引入宿主细胞中时，其分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。该定义明确地包括未翻译或不可翻译的反义或有义构建体。在表达转基因和抑制内源基因(例如，通过反义、RNAi或有义抑制)的情况下，技术人员会认识到，插入的多核苷酸序列不需要是相同的，但是可以仅仅与它的来源基因的序列基本上相同。如本文中解释的，对特定核酸序列的提及明确地涵盖这些基本上相同的变体。表达盒的一个例子是，包含与异源启动子可操作地连接的转录因子的多核苷酸构建体，所述异源启动子是得自由所述转录因子调节的基因的启动子。

[0132] 本文中使用的术语“植物”可以表示完整植物或植物的部分，例如，种子，且包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体和单倍体。本文中使用的术语“植物部分”表示枝条营养器官和/或结构(例如，叶、茎和块茎)、枝、根、花和花器(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵细胞和中央细胞)、种子(包括合子、胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟的子房)、幼苗和植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、以及单个植物细胞、植物细胞群(例如，培养的植物细胞)、原生质体、植物提取物和种子。在本发明的方法中可以使用的植物的种类通常宽泛至顺从转化技术的高等和低等植物种类，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、苔藓植物和多细胞的藻类。

[0133] 本文中使用的术语“生物质”表示这样的植物材料：其被加工以提供产品，例如，生物燃料诸如乙醇、或家畜饲料、或用于纸和纸浆工业产品的纤维素。这样的植物材料可以包括完整植物或植物的部分，例如，茎、叶、枝、芽、根、块茎等。

[0134] 术语“增加的次生细胞壁沉积”表示，与野生型(即，天然存在的)植物相比，在本发明的经工程改造的植物中产生增加的量的次生细胞壁，例如，增加的密度或厚度和/或增加的细胞直径和细胞壁厚度之比。“次生细胞壁”主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，且沉积在植物的一些(但并非所有)组织(诸如木质组织)中。在下述情况下，将次生细胞壁沉积说成与野生型植物相比在经工程改造的植物中增加：与在野生型植物中的次生细胞壁的一种或多种组分的量相比，在经工程改造的植物中的次生细胞壁的一种或多种组分(例如，纤维素、半纤维素或木质素)的量，或细胞直径和细胞壁厚度之比，增加了至少10％、至少20、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。使用本领域已知的任意方法，可以评估存在的次生细胞壁的组分的量，所述方法包括、但不限于显微术(例如，电子显微术、RAMAN-显微术)、组织化学染色(例如，间苯三酚)和酶或化学反应(例如，多糖水解或TFA水解)。

[0135] 术语“糖化反应”表示，将生物质(经常是纤维质或木质纤维素生物质)转化成单体糖(诸如葡萄糖和木糖)的过程。

[0136] 术语“可溶性糖”表示，从生物质的糖化产生的单体糖、二聚体糖或三聚体糖。

[0137] 当表示从本发明的经工程改造的植物得到的糖或可溶性糖的量时，术语“增加的量”表示，与得自野生型(即，天然存在的)植物的对应生物质相比，从单位量的起始原料的生物质糖化得到的糖的量或产量的增加。在本发明范围内，“得自野生型植物的对应生物质”表示这样的植物材料：其得自与具有降低的木质素生物合成酶表达水平和/或木聚糖生物合成酶的植物的生物质相同的植物部分。如本领域理解的,增加的量或增加的产量是基于相同量的对应植物材料的对比。

[0138] 本文中使用的术语“转化反应”表示，将生物质转化成生物能形式的反应。转化反应的例子包括、但不限于：燃烧(烧)、气化、热解和多糖水解(酶法或化学法)。

[0139] 当表示从本发明的经工程改造的植物得到的生物能生产量时，术语“增加的生产量”表示，与从得自野生型(即，天然存在的)植物的对应生物质产生的生物能的量相比，当对得自经工程改造的植物的生物质进行转化反应(例如，燃烧、气化、热解或多糖水解)时产生的生物能的量增加。

[0140] II.简介

[0141] 在一个方面，本发明涉及下述发现：可以在植物中建立人工正反馈回路(APFL)，以调节期望的生物合成途径中的基因表达，例如，以调控一个或多个期望的组织中的基因表达。因此，本发明提供了植物中的APFL，其中所述APFL包含编码转录因子的基因，所述转录因子控制目标生物合成途径的表达，所述基因与所述生物合成途径中的诱导型下游基因的启动子可操作地连接，其中所述下游基因的表达由所述转录因子控制。可以由这样的系统调节的生物合成途径的例子包括：次生细胞壁沉积、蜡/角质生物合成、脂质生物合成、生物碱生物合成和萜类化合物生物合成。因而，根据本发明的APFL的一个例子涉及，增加特定组织中的细胞壁沉积，其中将编码本文所述的控制次生细胞壁生物合成的转录因子的核酸与在次生壁生物合成中涉及的下游诱导型基因的启动子可操作地连接，其中所述下游基因的表达由所述转录因子诱导。本发明的APFL的第二个例子包含：编码本文所述的控制蜡和/或角质的表达生物合成的转录因子的核酸，所述核酸与在蜡和/或角质生物合成中涉及的下游诱导型基因的启动子可操作地连接，其中所述下游基因的表达由所述转录因子诱导。本发明的APFL的另一个例子包含：编码本文所述的调节脂质生物合成和例如在种子和其它组织中的积累的转录因子的核酸，所述核酸与在脂质生物合成中涉及的下游诱导型基因的启动子可操作地连接，其中所述下游基因的表达由所述转录因子诱导。

[0142] 在不同的实施方案中，本发明提供了包含本发明的AFPL的核酸、表达构建体和植物以及使用这样的组合物的方法。

[0143] 在一个方面，本发明部分地基于下述发现：将木质素沉积集中在植物导管中，同时降低植物别处的木质素和/或木聚糖含量，会克服通常与具有降低的木质素或木聚糖含量的植物有关的问题，特别是导管塌缩和植物发育迟缓。尽管就诸如给导管(其在植物中供给水和营养物)提供结构支持等目的而言细胞壁组分(诸如木质素和木聚糖)对植物是有益的，但是这些细胞壁组分(例如，木质素和木聚糖)也是细胞壁不顺从酶促降解和多糖可提取性的主要原因。因此，木质素和木聚糖在导管中的特异性集中代表了这样的方法：通过该方法，可以使得植物的细胞壁更易于酶促降解和多糖可提取性，从而改善从植物的糖化和例如生物燃料生产；并且，也给纸和纸浆工业提供改进的底物。因此，在一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素和/或木聚糖沉积和/或木聚糖O-乙酰化。如下完成导管特异性的木质素和/或木聚糖沉积和/或木聚糖O-乙酰化：减少木质素和/或木聚糖生物合成酶和/或木聚糖O-乙酰化酶，并在导管特异性的启动子控制下表达基本上相同的酶(例如，在所述植物中减少的酶的直系同源物或旁系同源物，或具有相同生化功能的酶)，所述启动子不是木质素和/或木聚糖生物合成酶和/或木聚糖O-乙酰化酶的天然启动子。本发明的植物或包含本发明的植物的生物质适合用在糖化反应中，以得到与从野生型植物可以得到的量相比增加的量的可溶性糖，或者用在造纸工业中。

[0144] 本发明也部分地基于下述发现：特异性地增加在木质组织中的细胞壁沉积会产生这样的植物，所述植物具有被细胞壁聚合物填充的细胞。增加的细胞壁沉积是有益的，因为它会增加植物的生物质密度，后者又可以增加可以从所述植物得到的生物能生产量。因此，在另一个方面，本发明提供了使用AFPL工程改造植物的方法，所述植物具有增加的细胞壁沉积。在作为转录因子下游靶标的诱导型基因的启动子的控制下，在植物中表达调节次生细胞壁产生的转录因子。所述转录因子的表达会增加由所述下游启动子驱动的表达，因为所述启动子与编码所述转录因子的基因可操作地连接，这又会增加所述转录因子的表达，从而产生正反馈回路，该回路会增强次生细胞壁途径的下游基因的表达，并由此增加次生细胞壁沉积。所述转录因子和启动子可以得自与宿主植物不同的植物种，或者所述转录因子或启动子可以得自不同的植物种。类似地，所述转录因子和启动子不需要得自相同的植物种。本发明的植物或包含本发明的植物的生物质适合用在生物质转化反应中，以与野生型植物的生物能生产量相比增加生物能生产量。

[0145] 本发明的方法可以进一步彼此联合使用。因而，在某些实施方案中，本发明提供了制备植物的方法，所述植物具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积，且具有增加的次生细胞壁沉积。在某些实施方案中，本发明提供了制备植物的方法，所述植物具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积，且具有增加的次生细胞壁沉积。在某些实施方案中，本发明提供了制备植物的方法，所述植物具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖O-乙酰化沉积，且具有增加的次生细胞壁沉积。在某些实施方案中，本发明提供了制备植物的方法，所述植物具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积，且具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积。在某些实施方案中，本发明提供了制备植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积，且具有增加的基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖O-乙酰化沉积。

[0146] 在另一个方面，本发明提供了一种增加期望的组织中的蜡/角质产生的方法。在作为转录因子下游靶标的诱导型基因的启动子的控制下，在植物中表达调节蜡/角质层产生的转录因子。所述转录因子的表达会增加由所述下游启动子驱动的表达，因为所述启动子与编码所述转录因子的基因可操作地连接，这又会增加所述转录因子的表达，从而产生增加蜡/角质产生的正反馈回路。所述转录因子和启动子、或者所述转录因子或启动子可以得自与在其中建立人工正反馈回路的宿主植物细胞不同的物种。在某些实施方案中，所述转录因子和启动子得自不同的物种。根据本发明的该方面制备的植物具有增加的干旱耐受性和降低的水消耗。

[0147] III.具有经空间修饰的基因表达的植物

[0148] A.木质素或木聚糖生物合成酶的表达的修饰

[0149] 在一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木质素沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0150] 将表达盒引入植物中，其中所述植物被修饰成具有降低的木质素生物合成酶表达水平；且其中所述表达盒包含与异源的导管特异性的启动子可操作地连接的编码木质素生物合成酶的多核苷酸；和

[0151] 在表达木质素生物合成酶的条件下，培养所述植物。

[0152] 在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有基本上集中在植物木质部组织导管的木聚糖沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0153] 将表达盒引入植物中，其中所述植物被修饰成具有降低的木聚糖生物合成酶表达水平；且其中所述表达盒包含与异源的导管特异性的启动子可操作地连接的编码木聚糖生物合成酶的多核苷酸；和

[0154] 在表达所述木聚糖生物合成酶的条件下，培养所述植物。

[0155] 当被引入修饰成具有降低的木质素或木聚糖生物合成酶表达水平的植物中时，在本文中描述的表达盒会产生具有精细调节的木质素或木聚糖沉积的植物，其中木质素仍然在导管组织中表达，从而防止导管塌缩，但是其中木质素或木聚糖在其它组织中不高度表达，从而减少细胞壁不顺从。

[0156] 本领域技术人员会理解，被表达盒引入植物中的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶不一定与在引入所述表达盒之前在植物中修饰的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶相同。在某些实施方案中，被表达盒引入植物中的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶与在引入所述表达盒之前在植物中修饰的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。在某些实施方案中，被表达盒引入植物中的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶是在引入所述表达盒之前在植物中修饰的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶的同系物(例如，图1-12中的任一个比对所示的同系物，或具有相同生化功能的酶，例如，旁系同源物)。

[0157] 1.木质素生物合成酶

[0158] 在某些实施方案中，所述表达盒包含编码木质素生物合成酶的多核苷酸。基于调节木质醇单体产生并因此调节木质素生物合成，可以选择用于本发明中的木质素生物合成酶。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶是苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)、羟基肉桂酰辅酶A:莽草酸羟基肉桂酰基转移酶(HCT)、香豆酰基莽草酸3-羟化酶(C3H)或肉桂酰基辅酶A还原酶1(CCR1)。

[0159] 已经在拟南芥属中表征了木质素生物合成酶PAL、C4H、4CL、HCT、C3H和CCR1，并且已经证实它们会介导从苯丙氨酸合成木质素单体(木质醇单体)。参见，例如，Bonawitz和Chapple,Annu.Rev.Genet.44:337-63(2010)。因而，在某些实施方案中，所述编码木质素生物合成酶的多核苷酸与SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个多核苷酸序列基本上相同。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中的任一个多肽序列基本上相同。另外，在木质素生物合成中涉及的许多酶在物种之间是保守的。因而，在某些实施方案中，所述编码木质素生物合成酶的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个多核苷酸序列的同系物。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中的任一个多肽序列或图1-6中的任一图所示的任一个多肽序列的同系物。

[0160] 在某些实施方案中，所述编码木质素生物合成酶的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述编码木质素生物合成酶的多核苷酸包含编码特定多肽序列的多核苷酸序列，所述多肽序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中的任一个或图1-6中的任一图所示的任一个多肽序列基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。在某些实施方案中，所述木质素生物合成酶包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中的任一个或图1-6中的任一图所示的任一个多肽序列基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少
97％、至少98％或至少99％同一)的氨基酸序列。

[0161] 在本文的序列表中描述了PAL、C4H、4CL、HCT、C3H和CCR1的基因和蛋白序列和/或登录号。在图1-6中显示了木质素生物合成酶的氨基酸序列比对，其中显示了得自多个植物种的这些蛋白中的每一种的氨基酸序列。另外，在本领域中已知并描述了这些蛋白的基因和蛋白序列以及获得所述基因或蛋白的方法。参见，例如，Schilmiller等人,2009,Plant J.,doi:10.1111/j.1365-313X.2009.03996.x。本领域技术人员会认识到，可以修饰本领域中已知的和/或在本文中描述的这些基因或蛋白序列以制备基本上相同的木质素生物合成酶，例如，通过在一个或多个氨基酸残基处产生保守置换。技术人员还会认识到，已知的序列(例如，本文中提供的比对) 会提供关于可以改变哪个氨基酸来制备基本上相同的木质素生物合成酶的指导。例如，使用图1-6所示的任意比对，技术人员会认识到哪个氨基酸残基不是高度保守的，并因而可能进行改变，而不对木质素生物合成酶的功能产生显著影响。

[0162] 2.木聚糖生物合成酶

[0163] 本发明的方法也可以采用木聚糖生物合成酶。在木聚糖生物合成中涉及的几种酶是已知的。已经证实在木聚糖生物合成中涉及属于GT43家族(被称作IRX9、IRX9-like、IRX14和IRK14-like)的糖基转移酶(GT)。在这里使用的GT家族的命名法是根据CAZy数据库(www.cazy.org)(Cantarel等人,2009)。还已经证实在木聚糖生物合成中涉及GT47家族的其它GT：IRX10、IRX10-like、IRX7和F8H。另外，已经证实在木聚糖生物合成中涉及GT8中的GT：IRX8(GAUT12)和PARVUS(GATL1)。已知在木聚糖生物合成中涉及所有提及的酶，因为其中基因已经被突变的植物是木聚糖缺陷型(Brown,2009；Wu等人,2010)(Lee等人,2009)(Pena等人,2007；Persson等人,2007；Liepman等人,2010；Scheller和Ulvskov,2010)。在木聚糖生物合成中还涉及术语DUF579家族(也被称作IRX15)的蛋白，尽管它们似乎不是GT(Brown等人,2011)。已经鉴别出负责向木聚糖主链添加葡糖醛酸残基的GT，并且将其称作PGSIP或GUX，但是，这些基因的灭活不会导致木聚糖缺乏(Mortimer等人,2010；Oikawa等人,2010)。已经在文献中将参与向木聚糖主链添加阿拉伯糖残基的GT鉴别为GT61酶家族的成员(Anders等人.2012)。已经鉴别出在多糖(包括木聚糖)的O-乙酰化中涉及的蛋白，并将其命名为RWA蛋白(Manabe等人,2011)，并且已经证实在木糖葡聚糖和甘露聚糖的O-乙酰化中涉及的蛋白是DUF231家族的成员(Gille等人.2011)。最可能的是，木聚糖O-乙酰化需要大DUF231家族的其它成员。

[0164] 在图7-12中显示了各种IRX蛋白和Parvus蛋白的蛋白序列和登录号。图7-12提供了指定的蛋白的氨基酸序列比对。另外，在本领域中已知并描述了这些蛋白的基因和蛋白序列以及获得所述基因或蛋白的方法。本领域技术人员会认识到，可以修饰本领域中已知的和/或在本文中描述的这些基因或蛋白序列以制备基本上相同的木质素生物合成酶，例如，通过在一个或多个氨基酸残基处产生保守置换。技术人员还会认识到，已知的序列(例如，本文中提供的比对)会提供关于可以改变哪个氨基酸来制备基本上相同的木质素生物合成酶的指导。例如，使用图7-12所示的任意比对，技术人员会认识到哪个氨基酸残基不是高度保守的，并因而可能进行改变，而不对木质素生物合成酶的功能产生显著影响。

[0165] 除了木聚糖合成基因(例如，在上文中列出的那些)，还可以使用类似的策略通过RWA基因表达来调节多糖O-乙酰化表达谱。RWA蛋白通常在乙酰化(包括在木聚糖O-乙酰化中)中起作用。因而，将RWA的特异性表达与RWA敲除/减量调节相组合，还可以使用本文中描述的技术生产具有非常低的乙酸盐含量、但是仍然具有优良生长性能的植物。在拟南芥属中存在4个RWA基因，且3个(RWA1、RWA3和RWA4)主要在具有次生壁的组织中表达(Manabe等人,2011；)。这些RWA基因中的2个或更多个的减量调节或灭活会导致降低的木聚糖O-乙酰化和受损的维管组织功能(Scheller等人,2010；WO/2010/096488)。因而，可以在植物中减量调节RWA，例如，使用在WO2010/096488中描述的方法和组成，然后将RWA基因重新引入植物中，其中所述RWA基因处于本文所述的启动子/转录因子控制下。作为靶向RWA蛋白的替代方案，可以靶向在木聚糖O-乙酰化中涉及的一种或多种DUF231蛋白。

[0166] 尽管主要使用拟南芥研究了如上文所述使用的基因和蛋白，在其它植物种中可容易地鉴别出直系同源物。例如，对于许多基因，已经通过互补实验证实，沉默或从其它植物直系同源产生的RNAi具有与拟南芥蛋白相同的功能(Zhou等人,2006；Zhou等人,2007；Lee等人,2009)。

[0167] 在本文中描述了IRX8、IRX14、IRX14-like、IRX9、IRX9-like、IRX7、IRX10、IRX10-like、IRX15、IRX15-like、F8H和PARVUS的基因和蛋白序列和/或登录号。在图7-12中还显示了木聚糖生物合成酶的氨基酸序列比对，其显示了得自多个植物种的这些蛋白中的每一种的氨基酸序列。另外，如上面所讨论的，在本领域中已知并描述了这些蛋白的基因和蛋白序列以及获得所述基因或蛋白的方法。本领域技术人员会认识到，可以修饰本领域中已知的和/或在本文中描述的这些基因或蛋白序列以制备基本上相同的木质素生物合成酶，例如，通过在一个或多个氨基酸残基处产生保守置换。技术人员还会认识到，已知的序列(例如，本文中提供的比对)会提供关于可以改变哪个氨基酸来制备基本上相同的木聚糖生物合成酶的指导。例如，使用图7-12所示的任意比对，技术人员会认识到哪个氨基酸残基不是高度保守的，并因而可能进行改变，而不对木聚糖生物合成酶的功能产生显著影响。

[0168] 3.导管特异性的启动子

[0169] 在某些实施方案中，所述编码木质素生物合成酶或木聚糖生物合成酶的多核苷酸与导管特异性的启动子可操作地连接。所述导管特异性的启动子相对于编码木质素生物合成酶或木聚糖生物合成酶的多核苷酸而言是异源的(即，不是与木质素生物合成酶或木聚糖生物合成酶有关的天然启动子)。在下述情况下，启动子适合用作导管特异性的启动子：所述启动子在植物的导管细胞中强烈表达，但是与其表达被修饰的木质素生物合成酶或木聚糖生物合成酶的天然启动子的表达水平相比，在植物的纤维细胞中以更低的水平表达。

[0170] 在某些实施方案中，所述启动子与编码维管相关的NAC-结构域1(VND1)、VND2、VND3、VND4、VND5、VND6、VND7或VND-相互作用2(VNI2)的基因的天然启动子基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。在某些实施方案中，所述启动子与编码REF4或RFR1的基因的天然启动子基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。

[0171] 在某些实施方案中，所述导管特异性的启动子包含SEQ ID NO:36、94或95。在某些实施方案中，所述导管特异性的启动子包含SEQ ID NO:36、94或95的子序列或其变体。在某些实施方案中，所述导管特异性的启动子包含SEQ ID NO:36、94或95的子序列，所述子序列包含所述序列的约50个至约1000个或更多个连续核苷酸。在某些实施方案中，所述导管特异性的启动子包含SEQ ID NO:36、94或95的子序列，所述子序列包含所述序列的50-1000个、50-900个、50-800个、50-700个、50-600个、50-500个、50-400个、50-300个、50-200个、50-100个、75-1000个、75-900个、75-800个、75-700个、75-600个、75-500个、75-400个、75-
300个、75-200个、100-1000个、100-900个、100-800个、100-700个、100-600个、100-500个、
100-400个、100-300个或100-200个连续核苷酸。

[0172] 在本领域中还描述了导管特异性的启动子。参见，例如，Yamaguchi等人,2010,Plant Cell；Kubo等人,2009,Genes Dev.；和Yamaguchi等人,2008,Plant J.；它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

[0173] 本领域技术人员会明白，启动子区域可以耐受显著的变异而不减少活性。因而，在某些实施方案中，所述导管特异性的启动子与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:95基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少
80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。

[0174] 4.植物的遗传背景

[0175] 在某些实施方案中，在其中引入包含木质素或木聚糖生物合成酶的表达盒的植物具有这样的遗传背景：其被修饰成具有降低的木质素或木聚糖生物合成酶活性水平。在某些实施方案中，所述植物被修饰成具有在整个植物中降低的木质素或木聚糖生物合成酶活性水平。在某些实施方案中，所述植物被修饰成具有仅在植物的细胞或组织子集中降低的木质素或木聚糖生物合成酶活性水平。根据本领域已知的任意方法，诸如反义、siRNA、微RNA、dsRNA、有义抑制、诱变或使用显性阴性抑制策略，可以修饰植物的遗传背景。在某些实施方案中，降低了蛋白的表达水平。在某些实施方案中，然后使用具有降低的木质素和/或木聚糖生物合成酶活性水平或表达的经修饰的植物来表达表达盒，所述表达盒表达相同的木质素和/或木聚糖生物合成酶，但是在导管特异性的启动子(而不是它的天然启动子) 控制下。在某些实施方案中，被表达盒引入植物中的木质素和/或木聚糖生物合成酶与在植物中减少的木质素和/或木聚糖生物合成酶基本上相同的，但是并非完全相同，以便避免被表达盒引入的木质素和/或木聚糖生物合成酶的沉默(例如，可以在被表达盒引入的木质素和/或木聚糖生物合成酶中产生沉默性的核苷酸变化，使得氨基酸序列与在植物中减少的木质素和/或木聚糖生物合成酶相同，但是核苷酸序列不同)。

[0176] a)基因沉默技术

[0177] 在某些实施方案中，通过反义寡核苷酸来抑制木质素或木聚糖生物合成酶的表达。在反义技术中，克隆得自目标基因的核酸区段，并与启动子可操作地连接，使得RNA的反义链会被转录。然后将该表达盒转化进植物中，并产生RNA的反义链。在植物细胞中，已经提出，反义RNA会通过阻止编码目标酶的mRNA的积累来抑制基因表达，参见，例如，Sheehy等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:8805-8809(1988)；Pnueli等人,The Plant Cell 6:175-186(1994)；和Hiatt等人,美国专利号4,801,340。

[0178] 被转化进植物中的反义核酸序列与要抑制的一个或多个内源基因的至少一部分基本上相同。但是，所述序列不一定完全相同才能抑制表达。因而，仅编码木质素或木聚糖生物合成酶-编码序列的一部分的反义或有义核酸分子可以是用于生产这样的植物：其中木质素或木聚糖生物合成酶的表达受到抑制。对于反义抑制，被引入的序列也不需要相对于初级转录产物或完全加工过的mRNA而言是全长的。通常，可以使用较高的同源性来补偿较短序列的应用。此外，被引入的序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，并且非编码区段的同源性可以是同样有效的。在某些实施方案中，可以使用这样的序列：其中至少例如20个、25个、30个、50个、100个、200个或更多个连续核苷酸(至多mRNA全长)与内源木质素或木聚糖生物合成酶mRNA或其补体基本上相同。

[0179] 还可以使用催化RNA分子或核酶来抑制编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因的表达。可能设计这样的核酶：其与基本上任意靶RNA特异性地配对，并在特定位置处切割磷酸二酯主链，由此在功能上灭活靶RNA。在实现该切割时，所述核酶本身没有改变，因而能够重复利用和切割其它分子，使它成为真正酶。核酶序列在反义RNA内的包含会给它们赋予RNA切割活性，由此增加构建体的活性。

[0180] 已经鉴别出许多类核酶。一类核酶源自许多能够在植物中自我切割和复制的小环状RNA。所述RNA要么单独复制(类病毒RNA)，要么与辅助病毒一起复制(卫星RNA)。例子包括：得自鳄梨日斑病类病毒的RNA，和得自烟草环斑病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒毛烟草斑驳病毒、茄属植物斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。在Haseloff等人.Nature,334:585-591(1988)中描述了靶RNA特异性的核酶的设计和应用。

[0181] 可以用于抑制编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因的表达的另一种方法是通过有义抑制(也被称作共抑制)。已经证实，表达盒(其中相对于启动子以有义取向构造核酸)的引入是用于阻断靶基因的转录的有效方式。关于该方法用于调控内源基因表达的例子，参见Napoli等人,The Plant Cell 2:279-289(1990)；Flavell,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:3490-3496(1994)；Kooter and Mol,Current Opin.Biol.4:166-171(1993)；和美国专利号5,034,323、5,231,020和5,283,184。

[0182] 通常，在希望抑制表达的情况下，发生被引入的序列的一些转录。可能发生这样的效应：其中被引入的序列不含有编码序列本身，而是仅含有与在内源序列的初级转录物中存在的序列同源的内含子或非翻译序列。被引入的序列通常与意图抑制的内源序列基本上相同。该最小同一性通常是大于约65％，但是较高的同一性可以造成内源序列表达的更有效抑制。在某些实施方案中，使用具有实质上更大同一性的序列，例如，使用至少约80％、至少约95％或100％同一性。与在下面进一步讨论的反义调节一样，可以设计和试验该效应，以应用于表现出同源性或实质同源性的类似基因家族内的任意其它蛋白。

[0183] 对于有义抑制，与初级转录产物或完全加工过的mRNA相比，在表达盒中的被引入的序列(需要小于绝对同一性)也不需要是全长的。此外，被引入的序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，且非编码区段的同一性是同样有效的。在某些实施方案中，使用具有在上面关于反义调节指出的大小范围(即，30-40个、或至少约20个、50个、100个、200个、500个或更多个核苷酸)的序列。

[0184] 借助于RNA干扰(RNAi)(实际上，共抑制可以视作一类RNAi)，也可以抑制内源基因表达，所述RNA干扰使用具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA。RNAi是这样的现象：其中当将具有与靶基因序列相同或类似的序列的双链RNA引入细胞中时，插入的外源基因和靶内源基因二者的表达被抑制。所述双链RNA可以从2个单独的互补RNA形成，或者可以是具有内部互补序列(其形成双链RNA)的单个RNA。尽管RNAi的机制的整个细节仍然是未知的，认为引入的双链RNA首先被切割成小片段，它们然后以某种方式充当靶基因的索引，由此降解靶基因。已知RNAi在植物中也是有效的(参见，例如，Chuang,C.F.和Meyerowitz,E.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA  97:4985(2000)；Waterhouse等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13959-13964(1998)；Tabara等人.Science 282:430-431(1998)；Matthew,Comp Funct Genom 5:240–244(2004)；Lu,等人,Nucleic Acids Res.32(21):e171(2004))。

[0185] 因而，在某些实施方案中，使用RNAi技术来完成编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因的抑制。例如，为了使用RNAi来抑制编码蛋白的DNA的表达，向目标植物中引入双链RNA，其具有编码所述蛋白的DNA的序列或其基本上类似的序列(包括经工程改造成不翻译所述蛋白的那些)或其片段。本文中使用的RNAi和dsRNA都表示，通过双链RNA分子的引入而诱导的基因特异性的沉默(参见例如，美国专利号6,506,559和6,573,099)，并且包括对具有双链区域的分子(例如，短发夹RNA分子)的提及。然后可以针对与靶蛋白有关的表型筛选得到的植物，例如，针对与野生型植物相比得自植物的糖的可提取性增加进行筛选，和/或通过监测编码所述蛋白的转录物的稳态RNA水平。尽管用于RNAi的基因不需要与靶基因完全相同，它们与靶基因序列可以是至少70％、80％、90％、95％或更多相同。参见，例如，美国专利公开号2004/0029283。还可以使用构建体来抑制靶基因表达，所述构建体编码具有茎-环结构的RNA分子，所述茎-环结构与靶基因无关且位于对目标基因特异性的序列的远端。参见，例如，美国专利公开号2003/0221211。

[0186] RNAi多核苷酸可以包括全长靶RNA，或者可以与靶RNA的片段对应。在某些情况下，所述片段将具有少于100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1,000个与靶序列对应的核苷酸。另外，在某些实施方案中，这些片段的长度是至少，例如，50个、100个、150个、200个或更多个核苷酸。在某些情况下，用于RNAi的片段与在所述生物的其它蛋白中不存在的靶蛋白区域至少基本上类似，或者可以选择成与其它生物转录物具有尽可能少的相似性，例如，通过在分析公众可得到的序列数据库时与序列对比来选择。

[0187] 以瞬时和稳定转染的方式连续表达siRNA的表达载体已经被工程改造成表达小发夹RNA，所述小发夹RNA在体内被加工成能够实现基因特异性沉默的siRNA分子(Brummelkamp等人,Science 296:550-553(2002),和Paddison,等人,Genes&Dev.16:948-
958(2002))。Hammond等人.Nature Rev Gen 2:110-119(2001),Fire等人.Nature 391:
806-811(1998)和Timmons和Fire Nature 395:854(1998)进一步详细讨论了双链RNA的转录后基因沉默。

[0188] 抑制内源植物基因表达的另一种方式是，通过抑制靶标(例如，编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因)的微RNA的重组表达。人工微RNA是单链RNA(例如，18-25聚体，通常21聚体)，其通常不存在于植物中，并且从内源miRNA前体加工得到。根据植物miRNA靶标选择的决定簇来设计它们的序列，使得人工微RNA会特异性地沉默它的目标靶基因，并且一般地描述在Schwab等人,The Plant Cell 18:1121-1133(2006)中，以及基于因特网的设计其中描述的这类微RNA的方法。也参见,美国专利公开号2008/0313773。

[0189] 降低一个或多个目标基因的基因表达产物水平的方法的另一个例子采用核糖开关技术(参见，例如，美国专利申请公开号US20100286082,和US20110245326)。

[0190] 在本领域中已经描述了抑制植物的一种或多种木质素和/或木聚糖生物合成酶的基因表达的方法，包括具有受抑制的RWA表达的植物。参见，例如，Coleman等人,Plant Physiol.148:1229-37(2008)(杨树中的C3'H RNAi)；Kitin等人,Plant Physiol.154:887-98(2010)(杨树中的4CL反义)；Coleman等人,Proc.Acad.Natl.Sci.USA 105:4501-06(2008)(杨树中的C3'H RNAi)；和Voelker等人,Plant Physiol.154:874-86(2010)(杨树中的4CL反义),和WO2010/096488(RWA抑制)，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

[0191] 本领域技术人员会明白，靶向了在木质部和纤维中高度表达的异形体。例如，使用拟南芥属用于例证目的，IRX7、IRX8、IRX9、PARVUS、IRX15在木质部和纤维中高度表达，并因此被靶向。对于IRX10和IRX14，这两种异形体(拟南芥属具有2种异形体)通常被靶向，因为它们二者在木质部和纤维中表达。类似地，为了制备其Rwa表达受到抑制的植物，靶向在木质部和纤维中表达的异形体。例如，再次使用拟南芥属来例证，RWA1、RWA3和RWA4之一(通常2个或更多个)被靶向(RWA2不在木质部和纤维中表达)。

[0192] 本领域进一步理解，在本发明方法的使用导管特异性的启动子(例如VND6)将活性引回木聚糖缺陷型或木质素缺陷型植物的步骤中，不一定表达与为了抑制而靶向的异形体相同的异形体。例如，可以采用具有极少木聚糖的irx9突变体植物，但是不一定在该植物中表达组织特异性的IRX9异形体，相反，还可以容易地采用在那些组织中通常不表达的IRX9同系物。许多植物(包括拟南芥属)具有第二个IRX9-like基因，其主要在除了木质部和纤维以外的组织中表达。类似的关联对于IRX7/F8H、IRX14/IRX14-like和IRX15/IRX15-like也是真实的。同样地，可以工程改造RWA1/RWA3/RWA4突变体以在导管特异性的启动子(例如，VND6启动子)控制下表达Rwa2。

[0193] b)具有突变体背景的植物

[0194] 在某些实施方案中，通过制备具有在编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因中的突变的植物，降低木质素或木聚糖生物合成酶的表达水平。用于消除或减少编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因的表达的一种方法是，通过使用根瘤土壤杆菌的T-DNA的插入诱变。在制备插入突变体以后，可以筛选突变体以鉴别在目标基因中含有插入的那些。可以杂交含有在目标基因处的单突变事件的突变体，以制备所述突变的纯合植物(Koncz等人(1992)Methods in Arabidopsis Research.World Scientific)。

[0195] 可替换地，可以使用随机诱变方案，以制备将产生截短的或有缺陷的(无功能的或活性较差的)酶或不稳定的RNA的新等位基因，或者以破坏或“敲除”编码木质素或木聚糖生物合成酶的基因的表达(其中使用化学或插入诱变或辐照)。诱变和突变体鉴别的一种方法被称作TILLING(用于靶向基因组中的诱导的局部损伤)。在该方法中，在目标植物的种子中诱导突变，例如，使用EMS处理。培养得到的植物并自我授粉，并评估后代。例如，可以如下评估植物：使用PCR来鉴别突变的植物是否具有在目标基因中的突变，或通过评价所述植物是否在表达目标基因的植物部分中具有降低的木质素含量。TILLING可以鉴别出这样的突变：其可能改变特定基因的表达或由这些基因编码的蛋白的活性(参见Colbert等人(2001)Plant Physiol 126:480-484；McCallum等人(2000)Nature Biotechnology 18:455-457)。

[0196] 在本领域中已经描述了制备特定植物的方法，所述植物具有一种或多种木质素和/或木聚糖生物合成酶的突变体背景。参见，例如，Schilmiller等人,Plant J.60:771-82(2009)(C4H的拟南芥属突变体)；和Weng等人,Plant Cell 22:1033-45(2010)(F5H的卷柏属突变体)，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。制备具有RWA突变体背景的植物的方法已经描述在例如WO2010/096488中。

[0197] 在某些要将包含木质素生物合成酶和木聚糖生物合成酶的表达盒引入植物中的实施方案中，所述植物具有这样的遗传背景：其被修饰成具有降低的木质素生物合成酶和木聚糖生物合成酶表达水平。这样的植物可以使用本文的应用部分中描述的已知方法来制备，所述应用部分描述了修饰植物以抑制或减少目标产物的表达。

[0198] B.使用调节次生细胞壁产生的转录因子来修饰表达

[0199] 在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有增加的次生细胞壁沉积。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0200] 将表达盒引入植物中，其中所述表达盒包含编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节次生细胞壁在木质组织中的生产量，所述多核苷酸与诱导型异源启动子可操作地连接，其中所述启动子与一定基因的天然启动子基本上相同，所述一定基因在生物合成途径中是所述转录因子的下游靶标；和

[0201] 在表达所述转录因子的条件下，培养所述植物。所述下游靶标可以是所述转录因子的直接或间接靶标。

[0202] 当被引入植物中时，在本文中描述的表达盒会产生正反馈回路，其允许维持在次生细胞壁生物合成中涉及的基因的表达或过表达，因为所述转录因子会直接地或间接地诱导所述下游靶基因的启动子驱动的表达，所述启动子又与编码所述转录因子的多核苷酸可操作地连接，从而导致增加的转录因子表达。该正反馈回路会导致次生细胞壁组分(诸如纤维素、半纤维素和木质素)的持续产生或过度产生。

[0203] 1.调节次生细胞壁产生的转录因子

[0204] 在某些实施方案中，所述表达盒包含编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节次生细胞壁产生。基于它诱导在木质素生物合成和/或多糖(纤维素和半纤维素)生物合成中涉及的一个或多个基因，可以选择用于本发明中的转录因子。可替换地或额外地，基于在植物中的过表达或功能缺失表型(例如，过表达表现出增加的细胞壁增厚或次生细胞壁沉积表型的转录因子的植物，或具有表现出减少的细胞壁增厚或次生细胞壁沉积表型的转录因子的显性抑制或功能缺失突变的植物)，可以选择使用的转录因子。在某些实施方案中，所述转录因子是NAC次生壁增厚促进因子1(NST1)、NST2、NST3、次生壁相关的NAC结构域蛋白2(SND2)、SND3、MYB结构域蛋白103(MYB103)、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58或MYB63。

[0205] 已经在拟南芥属中表征了转录因子NST1、NST2、NST3、SND2、SND3、MYB103、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58和MYB63，并且已经证实它们会调节该物种中的次生细胞壁产生。参见，例如，Mitsuda等人,Plant Cell 17:2993-3006(2005)；Mitsuda等人,Plant Cell 19:270-80(2007)；Ohashi-Ito等人,Plant Cell 22:3461-73(2010)；Zhong等人,Plant Cell 20:
2763-82(2008)；Zhong等人,Plant Cell 19:2776-92(2007)；Ko等人, Plant J.60:649-65(2009)；和McCarthy等人,Plant Cell Physiol.50:1950-64(2009)。因而，在某些实施方案中，编码调节次生细胞壁产生的转录因子的多核苷酸与SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、
25、27、29、31或33中的任一个多核苷酸序列基本上相同。另外，已经在多种其它植物中鉴别出这些转录因子，所述植物包括水稻、高粱、杨树、葡萄、藓类植物、玉米和柳枝稷。此外，次生细胞壁生物合成的一般机制不仅在单子叶植物和双子叶植物之间是保守的，而且在这些组内也是保守的。因而，在某些实施方案中，编码调节次生细胞壁产生的转录因子的多核苷酸包含下述序列的同系物：SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中的任一个多核苷酸序列，SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中的任一个氨基酸序列，或图13中的任意氨基酸序列。

[0206] 在某些实施方案中，编码调节次生细胞壁在木质组织中的生产量的转录因子的多核苷酸包含，与SEQ ID NO:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33中的任一个基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的多核苷酸序列。在某些实施方案中，编码调节次生细胞壁在木质组织中的生产量的转录因子的多核苷酸包含这样的多核苷酸序列：其编码与SEQ ID NO:
14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中的任一个基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的多肽序列。在某些实施方案中，所述调节木质中的次生细胞壁产生的转录因子包含这样的氨基酸序列：其与SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34中的任一个或与图13中的任一个氨基酸序列基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少
70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。

[0207] 在本文的序列表中描述了NST1、NST2、NST3、SND2、SND3、MYB103、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58和MYB63的基因和蛋白序列和/或登录号。另外，在图1-6中显示了所述转录因子的氨基酸序列比对，其中显示了得自多个植物种的这些蛋白中的每一种的氨基酸序列。在本领域中也已知并描述了这些蛋白的基因和蛋白序列以及获得所述基因或蛋白的方法。
参见，例如，Goiocoechea等人,2005,Plant J.43:553-67；McCarthy等人,2009,Plant Cell Physiol.50:1950-64；Shen等人,2009,Bioenerg.Res.2:217-32；和Zhong等人,2010,Trends in Plant Sciences,http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2010.08.007。本领域技术人员会认识到，可以修饰本领域中已知的和/或在本文中描述的这些基因或蛋白序列以制备基本上相同的转录因子，例如，通过在一个或多个氨基酸残基处产生保守置换。技术人员还会认识到，已知的序列(例如，本文中提供的比对)会提供关于可以改变哪个氨基酸来制备基本上相同的转录因子的指导。例如，使用图1-6所示的任意比对，技术人员会认识到哪个氨基酸残基不是高度保守的，并因而可能进行改变，而不对所述转录因子的功能产生显著影响。

[0208] 2.作为调节次生细胞壁产生的转录因子的下游靶标的启动子

[0209] 在某些实施方案中，所述编码调节次生细胞壁产生的转录因子的多核苷酸与作为所述转录因子的下游靶标的启动子可操作地连接。所述启动子相对于编码调节次生细胞壁产生的转录因子的多核苷酸而言是异源的(即，不是与调节次生细胞壁产生的转录因子有关的天然启动子)。在下述情况下，启动子适合与调节次生细胞壁产生的转录因子一起使用：如果所述启动子的表达直接地或间接地被要表达的转录因子诱导，和如果所述启动子在目标位置(例如，植物的茎)表达，但是在植物的叶子中不强烈表达。

[0210] 在某些实施方案中，所述启动子与作为所述转录因子的下游靶标的基因的天然启动子基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。在某些实施方案中，所述启动子与IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7或IRX10的天然启动子基本上相同。在某些实施方案中，所述转录因子选自NST1、NST2、NST3、SND2、SND3、MYB103、MBY85、MYB46、MYB83、MYB58和MYB63，且所述启动子与选自IRX1、IRX3、IRX5、IRX8、IRX9、IRX14、IRX7、IRX10、GAUT13或GAUT14的天然启动子基本上相同。参见图14。还可以使用替代启动子。例如，可以如下鉴别替代启动子：
通过共表达分析，例如，使用Atted II数据库和已知的启动子作为诱饵；或通过鉴别候选基因的启动子中的目标功能基序。还可以使用受所述转录因子调节的其它基因的启动子。

[0211] 在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:35的子序列或其变体。在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:35的子序列，所述子序列包含SEQ ID NO:35的约50个至约1000个或更多个连续核苷酸。在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:35的子序列，所述子序列包含SEQ ID NO:35的50-1000个、50-900个、50-800个、50-700个、50-600个、50-500个、50-400个、50-300个、50-200个、50-100；75-1000个、75-900个、75-800个、
75-700个、75-600个、75-500个、75-400个、75-300个、75-200；100-1000个、100-900个、100-
800个、100-700个、100-600个、100-500个、100-400个、100-300个或100-200个连续核苷酸。

[0212] 在本领域中还描述了作为本文所述的转录因子的下游靶标的启动子。参见，例如，Oikawa等人,2010,PLoS ONE；Taylor等人,2000,Plant Cell；Betancur等人,2010,J.Integrative Plant Biol.；Persson等人,2007,Plant Physiol.；Wu等人,2010,Plant Physiol.；Zhong等人,2005,Plant Cell；和Wu等人,2009,Plant J.；它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

[0213] 本领域技术人员会明白，启动子区域可以耐受显著的变异而不减少活性。因而，在某些实施方案中，所述启动子与SEQ ID NO:35基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。

[0214] C.使用调节蜡/角质产生的转录因子来修饰表达

[0215] 为了减少植物固定每吨CO2的水消耗和提高植物干旱胁迫耐受性，提高的植物水利用效率是一个重要的首选因素。通过减少细胞的氧化性应激，将会改善或维持在水限制条件下的生物质产量，这也会造成光合作用效率的下降。开发出可以减少植物的水损耗且不减少生物质产量的策略，会减少水需求，提高干旱胁迫耐受性，并且与已经开发的干旱胁迫耐受性技术相容。植物损耗的水的一部分是通过在叶表皮表面上的角质层(也称为上角质层)的水蒸发而发生。已经鉴别出了控制蜡/角质生物合成的转录因子。尽管这些转录因子中的一些在植物中的过表达会提高对干旱胁迫的抗性和降低水损耗，用于增加这些转录因子的表达的表达策也会造成蜡或/和角质在敏感组织中的沉积，从而对植物生长和发育产生不希望的作用(Aharoni等人,The Plant Cell 16:2463-2480,2004；Zhang等人,Plant J.42:689-797,2005)。除了水利用效率以外，修饰上角质层的蜡组成和含量具有几个其它潜在优点，因为上角质层是许多病原体、昆虫和化学试剂的第一屏障。因此，本发明提供了一种人工正反馈回路系统，其用于增加植物表皮上的蜡和/或角质沉积，以便提高植物水利用效率和干旱胁迫耐受性。

[0216] 因而，在另一个方面，本发明提供了工程改造植物的方法，所述植物具有改变的(例如，增加的)蜡和/或角质产生。在某些实施方案中，所述方法包括：

[0217] 将表达盒引入植物中，其中所述表达盒包含编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节蜡/角质组分的产生，所述多核苷酸与异源诱导型启动子连接，其中所述启动子与一定基因的天然启动子基本上相同，所述一定基因是所述转录因子的下游靶标；和[0218] 在表达所述转录因子的条件下，培养所述植物。所述下游靶标可以是所述转录因子的直接或间接靶标。

[0219] 当被引入植物中时，在本文中描述的表达盒会产生正反馈回路，其允许维持在蜡和/或角质生物合成中涉及的基因的表达或过表达，因为所述转录因子会直接地或间接地诱导所述下游靶基因的启动子驱动的表达，所述启动子又与编码所述转录因子的多核苷酸可操作地连接，从而导致增加的转录因子表达。该正反馈回路会导致蜡和/或角质的持续产生或过度产生。

[0220] 1.调节蜡/角质产生的转录因子

[0221] 在某些实施方案中，所述表达盒包含编码转录因子的多核苷酸，所述转录因子调节用于生产蜡(和/或角质)的蜡和/或角质组分的产生。基于它诱导在蜡生物合成途径中涉及的一个或多个基因(通常多个基因)，可以选择用于本发明中的转录因子。可替换地或额外地，可以基于在植物中的过表达或功能缺失表型来选择使用的转录因子(例如，过表达表现出增加的蜡生产量表型的转录因子的植物，或具有表现出减少的蜡生产量表型的转录因子的显性抑制或功能缺失突变的植物)。在某些实施方案中，所述转录因子是shine(SHN)转录因子，诸如SHN1(也被称作WIN1)、SHN2、SHN3、SHN4、SHN5或MYB 96。

[0222] 已经在拟南芥属中表征了转录因子SHN1、SHN2、SHN3、SHN4、SHN5和MYB96，并且已经证实它们会在拟南芥属和其它植物种中调节蜡和/或角质生物合成。参见，例如，Shi等人,PLoS Genet.7,e1001388(2011)；Seo等人,Plant Cell 23:1138-1152(2011)；Kannangara等人,Plant Cell 19:1278-1294(2007)；Zhang等人,Plant J.42:689-707(2005),Aharoni等人,Plant Cell 16:2463-2480(2004)；Broun等人,Proc.Natl.Acad Sci USA 101:4706-4711(2004)；和Suh等人,Plant Physiol.139:1649-1665(2005)。另外，已经在多种其它植物中鉴别出了SHN转录因子序列，所述植物包括杨树、苜缩属、水稻、草例如短柄草属、玉米、高粱、大麦、云杉、卷柏和苔藓植物。类似地，已经在多种其它植物中鉴别出了Myb96转录因子序列，所述植物包括盐芥属、苜缩属、杨树、葡萄藤、柑橘、短柄草属、小麦、大麦、水稻和高粱。此外，蜡/角质生物合成的一般机制不仅在单子叶植物和双子叶植物之间是保守的，而且在这些组内也是保守的。

[0223] 在某些实施方案中，编码调节蜡/角质产生的转录因子的多核苷酸会编码SHN转录因子。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:37-59中的任一个的SHN转录因子或其变体。因而，在某些实施方案中，编码调节蜡/角质合成生产量的转录因子的多核苷酸会编码与SEQ ID NO:37-59中的任一个基本上相同的蛋白。

[0224] 在某些实施方案中，编码调节蜡角质合成生产量的转录因子的多核苷酸包含这样的多核苷酸序列：其编码与SEQ ID NO:37-59中的任一个具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

[0225] 在某些实施方案中，编码调节蜡/角质产生的转录因子的多核苷酸会编码Myb96转录因子。在某些实施方案中，所述多核苷酸会编码SEQ ID NO:80-93中的任一个的Myb96转录因子或其变体。因而，在某些实施方案中，编码调节蜡/角质合成生产量的转录因子的多核苷酸会编码与SEQ ID NO:80-93中的任一个基本上相同的蛋白。

[0226] 在某些实施方案中，编码调节蜡角质合成生产量的转录因子的多核苷酸包含这样的多核苷酸序列：其编码与SEQ ID NO:80-93中的任一个具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

[0227] 在本文中提供了SHN1、SHN2、SHN3、SHN4、SHN5或MYB 96的示例性的蛋白序列和/或登录号。另外，在图25和26中显示了所述转录因子的氨基酸序列比对，其中显示了得自多个植物种的这些蛋白中的每一种的氨基酸序列,。在本领域中已知并描述了这些蛋白的基因和蛋白序列以及获得所述基因或蛋白的方法(参见，例如，在上文中引用的参考文献)。本领域技术人员会认识到，可以修饰本领域中已知的和/或在本文中描述的这些基因或蛋白序列以制备变体转录因子，例如，通过在一个或多个氨基酸残基处产生保守置换。技术人员还会认识到，已知的序列(例如，本文中提供的比对)会提供关于可以改变哪个氨基酸来制备基本上相同的转录因子的指导。例如，使用在图25和26中提供的比对，技术人员会认识到哪个氨基酸残基不是高度保守的，并因而可能进行改变，而不对所述转录因子的功能产生显著影响。类似地，技术人员可以鉴别在所有或几乎所有的转录因子中保守的高度保守的结构域，并在鉴别用于本发明中的变体中使用该信息。

[0228] 2.作为调节蜡和/或角质产生的转录因子的下游靶标的启动子

[0229] 在某些实施方案中，所述编码调节蜡和/或角质产生的转录因子的多核苷酸与作为所述转录因子的下游靶标的启动子可操作地连接。所述启动子相对于编码调节蜡和/或角质产生的转录因子的多核苷酸而言是异源的(即，不是与所述转录因子有关的天然启动子)。在下述情况下，启动子适合与所述转录因子一起使用：如果所述启动子的表达直接地或间接地被要表达的转录因子诱导，和如果所述启动子在植物中的目标位置(例如，植物的叶)表达。

[0230] 在某些实施方案中，所述启动子与作为所述转录因子的下游靶标的基因的天然启动子基本上相同(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)。在某些实施方案中，所述启动子是CER1、CER2、CER3、CER4、CER5、CER6、CER10、WSD1、Mah1、WBC11、KCS1、KCS2、FATB、LACS1、LACS2、CYP864A、CYP86A7、CYP86A5、KCS10或KCS5启动子，或它们的与天然启动子基本上相同的变体。在某些实施方案中，所述转录因子选自SHN1、SHN2、SHN3、SHN4、SHN5或MYB 96，且所述启动子与选自CER1、CER2、CER3、CER4、CER5、CER6、CER10、WSD1、Mah1、WBC11、KCS1、KCS2、FATB、LACS1、LACS2、CYP864A、CYP86A7、CYP86A5、KCS10或KCS5的天然启动子基本上相同。还可以使用替代启动子。例如，可以如下鉴别替代启动子：通过共表达分析，例如，使用Atted II数据库和已知的启动子作为诱饵；或通过鉴别候选基因的启动子中的目标功能基序。还可以使用受所述转录因子调节的其它基因的启动子。

[0231] 在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:60-79中的任一个的子序列(例如，得自WBC11或CER1的序列)或其变体。在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:60-79中的任一个的子序列，所述子序列包含约50个至约1000个或更多个连续核苷酸。在某些实施方案中，所述启动子包含SEQ ID NO:60-79中的任一个的子序列，所述子序列包含所述序列的50-1000个、50-900个、50-800个、50-700个、50-600个、50-500个、50-400个、50-
300个、50-200个、50-100；75-1000个、75-900个、75-800个、75-700个、75-600个、75-500个、
75-400个、75-300个、75-200个、100-1000个、100-900个、100-800个、100-700个、100-600个、100-500个、100-400个、100-300个或100-200个连续核苷酸。

[0232] 在本领域中还描述了作为本文所述的转录因子的下游靶标的启动子。参见，例如，植物中的蜡生物合成的综述和其中引用的参考文献(Schreiber,Trends Plant Sci.,2010；Kunst和Samuels,Curr.Opinion Plant Biol.12:721-727,2009；Samuels等人,Annu.Rev.Plant Biol.59:683-707,2008；Nawrath,I9:281-287,2006；Kunst和Samuels,Progress in Lipid Res.42:51-80,2003；Lemieux,Trends in Plant Sci.1:312,1996)。
描述在拟南芥属中分析的蜡突变体的参考文献包括：Bourdenx等人,Plant Physiol 156,
29–45(2011)；Panikashvili等人.Mol Plant 3,563–575(2010)；Weng,等人,Planta 231,
1089–1100(2010)；Lee等人.Plant J 60,462–475(2009)；Li等人,Plant Physiol 148,97–
107(2008)；Greer等人,Plant Physiol 145,653–667(2007)；Rowland等人,FEBS Lett 
581,3538–3544(2007)；Rowland等人,Plant Physiol 142,866–877(2006)；Costaglioli等人,Biochim Biophys Acta 1734,247–258(2005)；Sturaro等人,Plant Physiol 138,478–
489(2005)；Schnurr等人,Plant Cell 16,629–642(2004)；Pighin等人,Science 306,702–
704(2004)；Bonaventure等人,Plant Cell 15,1020–1033(2003)；Chen等人,Plant Cell 
15,1170–1185(2003)；Fiebig等人,Plant Cell 12,2001–2008(2000)；和Millar等人,Plant Cell 11,825–838(1999)。蜡生物合成途径在植物物种之间也是保守的(参见，例如，Wang等人,Plant Mol Biol 78,275–288(2011)；Mao等人,Planta 235,39–52(2012)；Yu等人,Planta 228,675–685(2008)；Tacke等人,Plant J 8,907–917(1995)；Islam等人,Plant Mol Biol 70,443–456(2009)；Post-Beittenmiller Plant Physiol Bioch 36,157–166(1998)；和Park等人,Plant Mol Biol 74,91–103(2010))。

[0233] D.人工正反馈回路

[0234] 在另一个方面，本发明提供了用于调节植物中的基因表达的人工正反馈回路。APFL会过度诱导或增加特定转录因子和它的下游途径的终生表达。在上面关于纤维茎中的次生壁沉积和关于蜡沉积描述了这样的系统的例子。在图27和28中显示了作为该策略的基础原理的细胞壁致密化和蜡沉积的示例性例子。适合用于APFL中的转录因子通常在控制目标途径的多种组分的表达中起作用。使用细胞类型特异性的启动子(其中由转录因子驱动表达)作为APFL构建体中的启动子。如下建立APFL：将表达构建体引入植物细胞中，其中所述构建体包含编码目标转录因子的多核苷酸，所述多核苷酸与期望的启动子可操作地连接。在表达天然转录因子后，与由APFL构建体编码的引入的转录因子的表达一起诱导下游基因的表达。

[0235] 可以采用APFL的生物合成途径的其它例子包括脂质生物合成途径。例如，已知的是，在种子和其它组织中的脂质生物合成和积累发生在特定细胞类型中，并由诸如WRL1(WRINKLED；At3g54320)、LEC1(At1g21970)或LEC2(At1g28300)等转录因子调节。因此，可以使用这些转录因子来建立AFPL以增加脂质在期望的组织(诸如种子)中的积累。还可以为其它生物合成途径鉴别出用于APFL中的其它转录因子和适当启动子。在例如下述文献中讨论了脂质生物合成途径：Ohlrogge和Browse,Plant Cell 7:957,1995；Hildebrand,等人,Plant Lipids:Biology,Utilisation and Manipulation,67-102(2005)；和Dyer&Mullen,Seed Sci.Res.15:255-267(2005)。

[0236] 可以进行工程改造以建立APFL的其它生物合成途径包括萜类化合物途径。例如，可以建立APFL以增加萜类吲哚生物碱生物合成。可以用于这样的APFL的转录因子包括CrMYC2、ORCA2或ORCA3。可以将编码所述转录因子的核酸与诱导型启动子(诸如pSTR)可操作地连接，所述诱导型启动子控制异胡豆苷合酶从长春花(catharanthus roseus)的表达。萜类吲哚生物碱途径是已知的(参见，例如，Peebles,等人,Metab Eng 11:76–86(2009)；
Liu,等人,J Integr Plant Biol 49:961–974(2007)；Menke,等人,.EMBO J 18:4455–4463(1999)，所述参考文献各自通过引用并入)。

[0237] APFL的另一个例子是用于增加青蒿素(倍半萜)生物合成的APFL。可以用于这样的APFL的示例性转录因子是AaWRK1(得自黄花蒿)。可以将编码所述转录因子的核酸与诱导型启动子(诸如pADS)可操作地连接，所述诱导型启动子控制紫穗槐-4,11-二烯合酶从黄花蒿的表达。该生物合成途径是已知的(参见，例如，Ma,等人,Plant Cell Physiol 50:2146–2161(2009)，其通过引用并入)。

[0238] APFL的另一个例子是用于增加小檗碱(一种生物碱)生物合成的APFL。可以用于这样的APFL的示例性转录因子是CjWRK1(得自日本黄连)。可以将编码所述转录因子的核酸与诱导型启动子(诸如pCYP719A1)可操作地连接，所述诱导型启动子控制四氢小檗碱合酶从日本黄连的表达。该生物合成途径是已知的(参见，例如，Kato,等人,Plant Cell Physiol 488–18(2007)，其通过引用并入)。

[0239] E.在其中引入人工反馈回路的植物的遗传背景

[0240] 在某些实施方案中，在其中表达如本文所述的编码转录因子的多核苷酸的植物是野生型(即，天然存在的)植物，所述多核苷酸与下游基因的启动子连接，其中表达由所述转录因子驱动。在某些实施方案中，在其中表达如本文所述的编码转录因子的多核苷酸的植物是突变体植物。本文中使用的“突变体植物”包括：具有任意一个或多个目标基因的任何功能缺失或功能获得突变的植物，以及在其中使用已知方法(例如，通过反义、siRNA、微RNA、dsRNA或有义抑制)抑制或减少任意一个或多个目标基因的内源表达的植物或。例如，在某些实施方案中，使用已知的技术诸如核糖开关技术(参见，例如，美国专利申请公开号US20100286082,和US20110245326)，可以减少一个或多个目标基因的基因表达产物水平。

[0241] 在某些实施方案中，在其中表达如本文所述的编码转录因子的多核苷酸的植物是这样的植物：其具有如上所述的木质素生物合成酶和/或木聚糖生物合成酶的经空间修饰的基因表达。在某些实施方案中，所述植物已经被修饰成至少在除了木质部组织以外的组织中具有降低的木质素生物合成酶表达水平和/或木聚糖生物合成酶，且另外包含表达盒，所述表达盒包含编码木质素生物合成酶(例如，PAL、C4H、4CL、HCT、C3'H或CCR1)和/或木聚糖生物合成酶(例如，IRX8、IRX14、IRX9、IRX7、IRX10、F8H、PARVUS、RWA1、RWA2、RWA3或RWA4)的多核苷酸，所述多核苷酸与异源的导管特异性的启动子(例如，pVND1、pVND2、pVND3、pVND4、pVND5、pVND6、pVND7、pVNI2、pREF4或pRFR1)可操作地连接。

[0242] F.重组表达载体的制备

[0243] 得到启动子序列和目标基因的编码序列(例如，木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、或调节次生细胞壁产生的转录因子)后，可以使用所述序列来制备用于在转基因植物中表达目标基因的表达盒。通常，植物转化载体包括一个或多个克隆的植物编码序列(基因组或cDNA)，所述编码序列编码目标蛋白(诸如转录因子)，并在5'和3'调节序列的转录控制下。载体也通常包含显性选择标记。在典型实施方案中，这样的植物转化载体也含有目标启动子(例如，本文所述的导管特异性的启动子或其表达受调节次生细胞壁产生的转录因子调节的启动子)、转录起始起始位点、RNA加工信号(诸如内含子剪接位点)、转录终止位点、和/或多腺苷酸化信号。

[0244] 所述植物表达载体可以包括RNA加工信号，其可以位于编码序列的内部、上游或下游。另外，所述表达载体可以包括植物基因的3'-非翻译区的调节序列，例如，增加mRNA的mRNA稳定性的3'终止子区域，诸如马铃薯的PI-II终止子区域或章鱼碱或胭脂碱合酶3'终止子区域。

[0245] 植物表达载体常规地也包括显性选择标记基因以允许容易地选择转化体。这样的基因包括编码抗生素抗性基因(例如，对潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或大观霉素的抗性)的那些基因、除草剂抗性基因(例如，草胺膦乙酰基转移酶)和编码阳性选择酶(例如甘露糖异构酶)的基因。

[0246] 一旦已经构建出本文所述的包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸编码木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、或调节次生细胞壁产生的转录因子，并且与启动子可操作地连接，就可以使用标准技术来将所述多核苷酸引入植物中，以便修饰基因表达。参见，例如，在下述文献中描述的方案：Ammirato等人(1984)Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species.Macmillan Publ.Co.Shimamoto等人(1989)Nature 338:274-276；Fromm等人(1990)Bio/Technology 8:833-839；和Vasil等人(1990)Bio/Technology 8:429-434。

[0247] 植物的转化和再生是本领域已知的，并且最适当的转化技术的选择将由从业人员确定。合适的方法可以包括、但不限于：植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒的转化；植物细胞的显微注射；植物细胞的微粒轰击；真空渗入；和根瘤土壤杆菌介导的转化。转化是指，以特定方式将核苷酸序列引入植物中，以造成所述序列的稳定或瞬时表达。在不同植物中的这些方法的例子包括：美国专利号5,571,706、5,677,175、5,510,471、5,750,386、5,597,945、5,589,615、5,750,871、5,268,526、5,
780,708、5,538,880、5,773,269、5,736,369和5,610,042。

[0248] 转化后，使用掺入转化载体中的显性选择标记，可以选择植物。通常，这样的标记会给转化的植物赋予抗生素或除草剂抗性或在特定底物上生长的能力，并且可以通过将所述植物暴露于适当浓度的抗生素、除草剂或底物来完成转化体的选择。

[0249] 根据本领域已知的任意方法，可以得到编码木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶或调节次生细胞壁产生的转录因子的多核苷酸，以及包含导管特异性启动子或作为调节次生细胞壁产生的转录因子的下游靶标的启动子的启动子序列的多核苷酸。这样的方法可以包括扩增反应诸如PCR和其它基于杂交的反应，或者可以直接合成。

[0250] G.在其中可以修饰基因表达的植物

[0251] 可以在不同种类的植物中表达如本文所述的包含多核苷酸的表达盒，所述多核苷酸包含编码木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、或调节次生细胞壁产生的转录因子，且与启动子可操作地连接。所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在本发明的某些实施方案中，所述植物是绿色田野植物。在某些实施方案中，所述植物是裸子植物或针叶树。

[0252] 在某些实施方案中，所述植物是适合用于制备生物质的植物。合适的植物的例子包括、但不限于：拟南芥属、杨树、桉树、水稻、玉米、柳枝稷、高粱、粟、芒属、甘蔗、松树、苜蓿、小麦、大豆、大麦、草坪草、烟草、大麻、竹、油菜、向日葵、柳树、麻风树属和短柄草属。

[0253] 在某些实施方案中，在其中引入表达盒的植物是与所述启动子相同的植物物种，和/或与编码木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、或转录因子的多核苷酸相同的植物物种(例如，在拟南芥属植物中表达得自拟南芥属的导管特异性的启动子、木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、和/或转录因子)。在某些实施方案中，在其中引入表达盒的植物是与所述启动子不同的植物物种，和/或与编码木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、或转录因子的多核苷酸不同的植物物种(例如，在杨树植物中表达得自拟南芥属的导管特异性的启动子、木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶、和/或转录因子)。参见，例如，McCarthy等人,Plant Cell Physiol.51:1084-90(2010)；和Zhong等人,Plant Physiol.152:1044-55(2010)。

[0254] H.筛选具有修饰的基因表达的植物

[0255] 在选择转化的植物以后，可以评价所述植物或植物部分以确定一个或多个目标基因的表达谱是否已经被修饰，例如，通过评价RNA或蛋白的水平，通过评价植物或植物部分中的木质素含量、木聚糖含量和/或次生细胞壁沉积量，或通过确定可以从所述植物提取的可溶性糖的量。这些分析可以使用本领域已知的任意数目的方法来实现。

[0256] 在某些实施方案中，通过评价RNA或蛋白的水平来筛选植物。测量RNA表达的方法是本领域已知的，且包括，例如，PCR、RNA印迹分析、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和微阵列。测量蛋白水平的方法也是本领域已知的，且包括，例如，质谱法或基于抗体的技术诸如ELISA、蛋白质印迹法、流式细胞计量术、免疫荧光和免疫组织化学。

[0257] 在某些实施方案中，通过评价木质素含量、木聚糖含量和/或次生细胞壁沉积的量来筛选植物。例如，通过分光光度法、显微术、克拉松木素测定、乙酰基溴试剂或通过组织化学染色(例如，用间苯三酚)，可以评估木质素含量。例如，通过免疫组织化学(例如，用LM10单克隆抗体)，可以评估木聚糖含量。例如，通过组织化学染色(例如，间苯三酚或Maule试剂)或酶促或化学反应(例如，多糖水解或TFA水解)，可以评估次生细胞壁沉积量。

[0258] IV.使用具有经空间修饰的基因表达的植物的方法

[0259] 得自具有木质素生物合成酶、木聚糖生物合成酶和/或调节次生细胞壁产生的转录因子中的一种或多种的经空间修饰的基因表达的植物的植物、植物部分或植物生物质材料可以用于多种方法。在某些实施方案中，所述植物、植物部分或植物生物质材料被用于转化反应中以制备与野生型植物相比增加的量的生物能。例如，所述植物、植物部分或植物生物质材料可以用于燃烧反应、气化、热解或多糖水解(酶法或化学法)。在某些实施方案中，所述植物、植物部分或植物生物质材料被用于糖化反应，例如，酶促糖化，以制备与野生型植物相比增加的量的可溶性糖。在某些实施方案中，所述植物、植物部分或植物生物质材料被用于与野生型植物相比增加生物质产量或简化木材工业(诸如造纸、制浆和建筑)的下游加工。在某些实施方案中，所述植物、植物部分或植物生物质材料被用于提高用于建筑目的的木材的质量。

[0260] 在某些实施方案中，使用细胞壁(组成或含量)的修饰来增加秆/茎强度以减少谷类(小麦、大麦、玉米….)的倒伏和种子损失。

[0261] 转化(例如生物质气化)的方法是本领域已知的。简而言之，在气化中，将植物或植物生物质材料(例如，叶和茎)粉碎成小颗粒，并与受控量的空气或氧和蒸汽一起输入气化器中。该反应的热和压力会断裂生物质的化学键，从而形成合成气，所述合成气随后被净化以除去杂质诸如硫、汞、微粒和痕量物质。然后可以将合成气转化成产品，诸如乙醇或其它生物燃料。

[0262] 酶促糖化方法也是本领域已知的。简而言之，任选地用热水或稀酸预处理植物或植物生物质材料(例如，叶和茎)，随后使用纤维素和β-葡萄糖苷酶在缓冲液中的混合物进行酶促糖化，并将植物或植物生物质材料与所述酶混合物一起温育。温育后，可以如下容易地确定糖化反应的收率：使用标准的糖检测方法，例如本领域技术人员众所周知的二硝基水杨酸方法，测量释放的还原糖的量。根据本发明工程改造的植物会提供与野生型植物相比更高的糖收率。

[0263] 实施例

[0264] 提供下述实施例来例证、而不是限制要求保护的发明。

[0265] 实施例1:重新工程改造植物中的次生细胞壁沉积

[0266] 该研究合并了2个方案，用于克服细胞壁不顺从和给纤维细胞填充细胞壁聚合物且不改变植物发育。第一个方案允许减少除了导管以外的地方的木质素，而第二个方案会特异性地增加在木质组织中的细胞壁沉积。该组合方案策略使用合成生物学来精细调整木质素生物合成和建立新反馈回路从而重新工程改造次生细胞壁沉积的控制。

[0267] 材料和方法

[0268] 质粒的构建

[0269] 从拟南芥cDNA扩增C4H(ref3)基因(AT2G30490)、F5H(At4g36220)和CADc基因(AT3G19450)的蛋白编码区，并用适当引物(参见表1)扩增在VND6基因(At5g62380)的翻译起始位点的5'上游的2756bp区域，作为基因组DNA的pVND6。

[0270] 表1.用于质粒构建和基因分型的引物(SEQ ID NOS:328-339)

[0271]pVND6-F3-KpnI 5'-cccgggtaccTCCTTTACGATGTTGTTATGGGTTA-3'
pVND6-R3-SpeI 5'-cccgactagtGTGTGCGAGACTTTGGATTTGATCTTTTTAATTTTA-3'
FY100908-C4h-GW-F 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGACCTCCTCTTGCTGGA-3' FY100908-C4h-GW-R 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcACAGTTCCTTGGTTTCATAACG-3' DL-F5G3-At3g19450-GW 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGGAAGTGTAGAAGCAGGAGAA-3' DL-R5G3-At3g19450-GW 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGTTTGTAGTTGTTGCAGCCTCCTC-3' FY081508-F5h-1-GW-F 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGAGTCTT CTATATCACA A-3' FY081508-F5h-1-GW-R 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcAAGAGCACAGATGAGGCGCGT-3' ref3-2F1 5'-TTC CGT ATC ATG TTC GAT AG-3'
ref3-2R1 5'-AAT GTC AAT TTC CCA AAA TC-3'
pcr-pVND6F1 5'-CAAATTGCCACATTGCAGAA-3'
pcr-REF3-R1 5'-CGACGAGATTACGGTGGTTGA-3'

[0272] 将入口片段(Invitrogen)引入pCAMBIA1390中，并使用KpnI-SpeI/AvrII位点克隆VND6启动子，然后通过入口系统将C4H和CADc基因引入表达载体中，以获得最终的表达载体pCAMBIA1390-pVND6:C4H、pCAMBIA1390-pVND6:F5H和pCAMBIA1390-pVND6:CADc。

[0273] 植物生长和转化

[0274] 使拟南芥属植物在土壤中在22℃生长，每天8小时光照(短光照条件)持续4-5周，和每天16小时光照(短光照条件)持续4-5周。

[0275] 通过电穿孔将表达载体pCAMBIA1390-pVND6:C4H、pCAMBIA1390-pVND6:F5H或pCAMBIA1390-pVND6:CADc引入根瘤土壤杆菌菌株GV3101中，并用于使用花浸法分别转染拟南芥属f5h、cadc/d纯合子ref3-2(c4h突变体)杂合子、f5h纯合子和cadc/d纯合子突变体植物(Clough和Bent,1998)。

[0276] 拟南芥属植物的基因型分析

[0277] 播种ref3-2杂合子突变体的种子，通过CTAB方法提取植物的基因组DNA，并用引物ref3-2F1和ref3-2R1(参见表1)通过PCR分析基因型。用HinfI消化PCR产物。预期的PCR产物是188bp和106bp片段(对于野生型植物)和294bp片段(对于ref3-2纯合子)。

[0278] 用引物pcr-pVND6F1和pcr-REF3-R1通过PCR鉴别pVND6:C4H的转化体。转化体的PCR产物是238bp。使用DyNAzyme DNA聚合酶(Finnzymes,USA)进行上述的PCR反应。

[0279] RNA分离和cDNA合成

[0280] 使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)，从在短光照条件下保持4周的拟南芥属植物的叶子分离出总RNA。使用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，合成cDNA。

[0281] 显微术分析

[0282] 为了研究茎细胞的木质素含量和解剖学，从突变体、野生型和转基因系的茎的基部制备横切面(当植物高度是30-35cm(对于健康植物)、15-20cm(对于突变体植物)时)。将成熟植物的茎基部包埋进7％琼脂糖中，然后使用振动切片机(Leica VT1000S)切片至100μm的厚度。将切片在水中固定，并在明视野下检查。还在紫外照明下观察木质化的细胞壁。木质素是紫外吸收剂，所以木质化的细胞壁在紫外照明下会发射蓝色自发荧光。将2％(w/v)的间苯三酚溶解在乙醇和浓HCl的2:1混合物中的溶液直接施加于茎切片，以检测所有木质素(Adler,1977)。还用卡尔科弗卢尔(对诸如纤维素等β-葡聚糖特异性的染料)将茎切片染色，以确定细胞的一般解剖学(Mori,1996)。将新鲜切片浸入0.5％卡尔科弗卢尔中保持5分钟，随后用水洗涤2次各5分钟，以除去任何多余的未结合的卡尔科弗卢尔。立即使用荧光显微镜(Leica DM4000B)观察切片。使用Leica DC500照相机记录图像。

[0283] 醇不溶性的残余物(AIR)的制备

[0284] 收集植物茎，干燥，并研磨成粉末，然后根据Goubet等人(2009)制备醇不溶性的残余物(AIR)。将研磨的茎粉末与1mL 95％乙醇一起混合，并在100℃温育30min。离心后，除去上清液，并用1mL 70％乙醇洗涤沉淀物2～3次，并彻底干燥。

[0285] 木质素测量

[0286] 通过乙酰基溴方法(Fukushima,2004)，分析了5mg AIR样品进行木质素测定。在具有螺旋盖的2mL埃彭道夫管中将AIR样品与200uL丙酮溴化物溶液(25％v/v的乙酰基溴在冰醋酸中的溶液)混合，在50℃在600rpm摇动2小时，然后用乙酸稀释至1mL的总体积。离心后，将100uL上清液转移至新试管，并分别与500uL乙酸、300uL 0.3M氢氧化钠和100uL盐酸羟胺混合，然后用乙酸稀释至2mL的总体积。将360uL该溶液转移至紫外特异性的96-孔平板(Greiner,Monroe,NC)，并在280nm读出吸光度。基于公开的消光系数(Fukushima,2004；Foster,2010)，计算乙酰基溴可溶性的木质素的百分比(％ABSL)。

[0287] 糖化和DNS测定

[0288] 用170uL水、稀碱(1％NaOH，在30℃30min，在100℃30min)或稀酸(1.2％H2SO4，在30℃30min，在120℃1小时)预处理5mg AIR样品。加入HCl或NaOH来中和最后的预处理样品，然后给所述样品加入8uL 5mg/mL四环素、25uL 1M柠檬酸盐缓冲液pH 6.2、2uL稀释的酶混合液(Novozyme酶NS50013(纤维素酶)和NS50010(β-葡萄糖苷酶)，分别在0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中1:10和1:100稀释)，并用水稀释至500ul的终体积。将样品在50℃在850rpm摇动24小时。糖化后，通过DNS测定来分析糖量。使用0、0.125、0.25、0.5、0.75、1和2mg/mL的在柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的葡萄糖作为标准品。将DNS试剂加入样品和标准品中，在95℃温育
10min，然后在540nm读出吸光度进行测定。

[0289] 半纤维素组成分析

[0290] 在120℃在1ml 2M TFA中将大约5mg AIR水解1h。通过在真空下干燥，除去TFA。随后如以前所述(Obro,2004；Christensen,2010)，使用PA20柱(Dionex,Sunnyvale,CA)通过水解的材料的HPAEC-PAD来确定单糖组成。单糖标准品包括L-Fuc、L-Rha、L-Ara、D-Gal、D-Glc、D-Xyl、D-GalA和D-GlcA，并得自Sigma。为了验证应答因子，在分析每批样品之前进行标准校准。

[0291] 结果

[0292] 导管特异性的启动子pVND6的表征

[0293] 由于导管组织在向光合器官运输水和营养物中的重要性，良好的植物发育需要导管的完整性。VND-型转录因子已经被表征为导管形成的主要调节剂，这提示它们具有限于导管的表达谱(Kubo等人,2005)。为了将这些转录因子的时空表达与木质素生物合成相关联，使用启动子pVND6来补充CAD突变体(参见Sibout等人,2005)(图20中A)。木质部的红色消失和导管完整性的恢复是使用该启动子的验收准则。

[0294] 为了对比启动子pVND6和启动子pC4H的强度，使用两种启动子来补充f5h突变体(Meyer等人,1998)。通过使用Maule染色作为读出来测量掺入木质素中的芥子醇单元的量，对比所述启动子的活性(图20中B)。在Maule染色后，与使用pC4H的系相比，在VND6启动子下表达F5H基因的系的茎横截面表现出远远更低的红色。这些结果指示，在pVND6:F5H系中芥子醇在木质素中的积累是由于与pC4H:F5H系相比更低的且更受限的F5H活性，该发现与上述的cadc/d互补相一致(图20中A)。

[0295] 木质素生物合成的限制

[0296] 木质素生物合成途径得到了充分表征，并且木质素生物合成途径的几个基因中的任一个的功能缺失都会导致有害的生长效应和不育。因此，控制这些基因之一的表达应当会提供控制木质醇单体产生的机会。我们选择了C4H基因(木质素生物合成途径中的一个早期基因)作为靶基因来控制产生木质醇单体的途径的通量。为了控制C4H的表达，我们使用了ref3-2突变体(Schilmiller等人,2009)，并且用含有pVND6:C4H基因构建体的二元载体转化了杂合子系(由于不育)。选择转化体，并关于ref3-2等位基因的纯合体型进行基因分型。令人感兴趣的是，携带pVND6:C4H片段的ref3-2纯合子，其被称作“EngSCW1g”(经工程改造的次生细胞壁第1代)，与同时培养的Col0野生型植物相比没有表现出生长差异。这些转化的植物能够产生大花结和高茎，并且是能育的(图16中A)。但是，由于花青苷仅积累在导管中，得自转化的植物的叶子是紫色，与此相比，野生型叶子在高光下变成完全紫色。该结果证实了pVND6启动子与pC4H相比的受限活性。

[0297] 通过乙酰基溴方法进行的EngSCW1g植物的木质素含量分析表明，在衰老茎中的木质素含量接近在相同条件下同时培养的Col0茎植物的木质素含量的大约2/3。为了证实茎中的木质素分布，使用间苯三酚和Maule染色方法，分析了约15-20cm老茎的横截面。与在它的天然C4H启动子控制下表达C4H基因的野生型植物相比，经工程改造的系的横截面表现出维管束间纤维的木质素染色的减少。与纯合子ref3-2突变体相比，EngCW1g植物的木质部组织表现出强烈的间苯三酚染色且没有表现出导管塌缩，这类似于野生型植物(图15中B和图21)。

[0298] 细胞壁沉积的增加

[0299] 控制导管和纤维中的次生细胞壁沉积的转录网络已经得到了充分研究。次生细胞壁沉积由2个独立的网络控制，尽管这2个网络会导致下游次生壁生物合成基因的相同集合的活化来调节纤维素、半纤维素和木质素的合成。几个研究组已经证实，在拟南芥属中用组成活性的35S启动子过表达次生细胞壁转录因子会产生异位次生细胞壁和到处木质化，包括在伸长细胞和光合组织中，其结果是抑制植物生长(Zhong等人,2008；Mitsuda等人,2005；Goicoechea等人,2005)。令人感兴趣的是，尽管具有受限的发育，所述植物在纤维细胞中表现出增强的次生细胞壁厚度(Zhong等人,2008)，这提示，增加次生细胞壁转录因子的表达可以成为增加细胞壁沉积(并因此增加生物质密度)的一个途径。

[0300] 因此，我们用IRX8启动子在EngCW1g植物中过表达了NST1cDNA。因为IRX8是在NST1转录因子的下游(即，由其控制)的基因(Mitsuda等人,2005；Zhong等人,2010)，该pIRX8:NST1构建体会建立正反馈回路，用于仅在次生细胞壁组织中过表达NST1cDNA。选择EngCW1g植物用于转化，因为VND6启动子不是NST1的下游靶标，并且因此在EngCW1g中在pVND6控制下的木质素生物合成将与NST1调节断开。制备的植物，其被称作“EngSCW2g”(经工程改造的次生细胞壁第2代)，与同时培养的Col0和EngSCW1g植物相比没有表现出生长差异。
EngSCW2g植物能够产生大花结和高茎，并且是能育的(图17中A)。象EngSCW1g植物一样，由于花青苷仅积累在导管中，得自EngSCW2g系的叶子是紫色，与此相比，野生型叶子在高光下变成完全紫色。通过半定量PCR验证了NST1基因(天然的和cDNA)的表达的证实，并揭示，天然NST1在野生型、EngSCW1g和EngSCW2g系中以相同水平表达。但是，仅在EngSCW2g系中检测到新NST1拷贝的表达，从而导致NST1基因(天然的和cDNA)在茎中更高的总体表达水平(图
22)。

[0301] 为了证实NST1过表达对茎中细胞壁沉积的影响，使用间苯三酚染色法分析了老茎的茎横截面中的木质素分布。EngSCW2g系的横截面仍然表现出与野生型相比维管束间纤维的木质素染色的减少，而木质部组织表现出强烈的间苯三酚染色且没有表现出导管塌缩，这类似于野生型和EngSCW1g系(图15中B和17中B)。通过透射电子显微术(TEM)，对得自xxx cm老茎的基部的横截面分析了细胞壁增厚。在得自维管束间纤维的纤维细胞和木质部中观察到EngSCW2g系与野生型相比强烈的细胞壁增厚，但是在导管中没有观察到(图18和23)，这与NST转录因子的过表达相一致(Zhong等人,2008)。在野生型茎横截面中，观察到常见的4个独特层(S1、S2和S3和胞间层)，与此相比，在EngSCW2g系中，观察到具有不同强度的额外层，所述层几乎填满整个细胞空间。

[0302] 为了生物能精细调节次生细胞壁沉积

[0303] 用金标记的CBM对得自EngSCW2g植物的细胞壁横截面的分析揭示，所述额外细胞壁层含有纤维素，这提示，已经增加了纤维素的量。为了证实纤维素的增加，使用H2SO4对得自EngSCW2g的衰老茎进行了完全多糖水解(Suilter等人2008,Technical report NREL/TP-510-4218)。从茎细胞壁释放的葡萄糖和其它糖的量在野生型、EngSCW1g和EngSCW2g系之间是类似的。木糖和葡糖醛酸的量也增加，这提示，这些植物中的半纤维素沉积也增加。通过三氟乙酸(TFA)水解对得自EngSCW1g和EngSCW2g系的成熟茎进行的半纤维素组成分析没有表现出与同时培养的野生型植物相比的重大差异(图24)。

[0304] 为了分析EngSCW2g系的糖化效率，对得自EngSCW2g系的5mg球磨茎进行2种不同的温和预处理：热水和稀碱，随后进行糖化动力学。在每种预处理后，在有纤维素酶混合液存在下，葡萄糖远远更快地从茎释放，并且当在120小时糖化之前分别进行碱和热水预处理时，EngSCW2g植物是对照植物的2-3倍(图19中A-B)。

[0305] 还用EngSCW1g系观察到糖化改善；对于那些植物，在热水或稀碱预处理以后在有相同量的纤维素酶存在下水解的糖分别是热水或稀碱预处理后对照植物的2.3和1.5倍。NST1转录因子在EngSCW2g系中的过表达增加了细胞壁沉积，但是没有降低糖化效率，这可以解释为，因为该系与亲本EngSCW1g系相比增加的多糖含量，该系释放出更高的葡萄糖量。

[0306] 被修饰成表达C4H的其它ref3-2突变体植物的分析

[0307] 还使用启动子pREF4或pRFR1，将Ref3-2突变体植物工程改造成表达C4H。将该突变体植物修饰成含有pREF4:C4H或prFR1:C4H以表达C4H。分析了经工程改造的细胞壁植物系的植物生长和表型。图29显示了植物的照片。在用任一种构建体转化的突变体植物中恢复了生长。在图30中显示了植物的木质素分布。结果表明，在经工程改造的植物中，木质素在导管中产生，但是在纤维中减少，这导致与野生型植物相比总木质素减少了>35％，且没有影响植物生长。图31提供的数据表明了经工程改造的系的糖化效率。这些结果表明，木质素在纤维中的减少极大地提高了糖化效率。因此，这些结果证实，可以使用启动子pREF4和pRFR1来工程改造象“EngSCW1g”植物(用pVND6:C4H构建体补充的ref3-2)一样含有低木质素的植物，并用作次生细胞壁正反馈回路的遗传背景。

[0308] 实施例2.在拟南芥属(双子叶植物)和短柄草属(单子叶植物)中经工程改造的正反馈回路

[0309] 图27解释了细胞壁沉积正反馈回路。细胞壁致密化是基于，建立人工正反馈回路来增强纤维特异性的转录因子的表达。通过表达在木聚糖或纤维素生物合成的下游诱导型启动子控制下的纤维特异性的转录因子(例如，NST1)的新拷贝来建立它。该方案与木聚糖和木质素工程改造策略相容。

[0310] 图31A显示了被遗传修饰成含有pCesA4:NST1表达构建体的野生型拟南芥属(双子叶植物)和野生型拟南芥属的茎横截面的紫外图像。含有次生细胞壁纤维素启动子(pCesA4)和次生细胞壁转录因子(NST1)的正反馈回路的建立会增强纤维细胞中的次生细胞壁沉积。

[0311] 图31B显示了被遗传修饰成含有pAtIRX8:AtNST1表达构建体的野生型短柄草属(单子叶植物)和野生型短柄草属的茎横截面的紫外图像。含有次生细胞壁纤维素启动子(pAtIRX8)和次生细胞壁转录因子(AtNST1)的正反馈回路的建立会增强短柄草属中的次生细胞壁沉积。

[0312] 本实施例证实，该途径在单子叶植物和双子叶植物中都是保守的，并且可以建立正反馈回路来增强次生细胞壁沉积。

[0313] 实施例3.工程改造木聚糖生物合成酶

[0314] 从拟南芥属生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)得到拟南芥属突变体irx7-1(At2g28110,salk_120296)、irx8-1(At5g54690,salk_008642)、irx9-1(At2g37090,salk_058238)、irx9-2(salk_057033C)、parvus(At1g19300,CS16279)。将野生型IRX7、IRX8、IRX9和PARVUS基因克隆进Gateway入口克隆中，并如上面关于木质素生物合成基因所述与pVND6或pVND7启动子一起重组进Gateway目标载体中。

[0315] 通过电穿孔将表达载体pCAMBIA1390-pVND6:IRX7、pCAMBIA1390-pVND7:IRX7、pCAMBIA1390-pVND6:IRX8、pCAMBIA1390-pVND7:IRX8、pCAMBIA1390-pVND6:IRX9、pCAMBIA1390-pVND7:IRX9、pCAMBIA1390-pVND6:PARVUS、pCAMBIA1390-pVND7:PARVUS引入根瘤土壤杆菌菌株GV3101中。使用花浸法(Clough和Bent,1998)，使用表达IRX7、IRX8、IRX9和PARVUS的构建体转化拟南芥属杂合子突变体植物(分别是irx7-1、irx8-1、irx9-1和parvus)。还使用表达IRX9的构建体转化irx9-2的纯合突变体。

[0316] 将转化的irx7、irx8、parvus、irx9-1和irx9-2植物的种子播种在补充了潮霉素的生长培养基上。回收湿霉素抗性的植物，并转移至土壤。所述植物表现出健康的生长表型，这不同于未转化的纯合的突变体，后者的生长明显受到影响。

[0317] 选择转化的irx7、irx8、irx9-2、parvus和irx9-1突变体。通过PCR表征回收的转化的突变体以确保它们关于原始突变的纯合表型，并确保pVND6或pVND7驱动的转基因的存在。将所述植物的生长与野生型和纯合突变体的生长进行对比，并通过花序茎的糖组成分析来确定它们的木聚糖含量。通过乙酰基溴方法来确定木质素。通过免疫荧光显微术使用LM10抗体确定木聚糖沉积的集中，并通过显微术和在紫外照明和间苯三酚染色下自发荧光的确定来确定木质素的沉积。如上所述确定糖化。

[0318] 图33提供的数据证实，在IRX7、IRX8或IRX9基因中的突变体表现出强烈的生长减少。构建体(其中突变基因的野生型形式由pVND6或pVND7启动子驱动)对所述突变体的转化恢复了生长。用pVND6:IRX9和pVND7:IRX7得到了类似的结果。

[0319] 图34提供的数据表明了通过用pVND7:IRX7构建体转化irx7突变体制备的4个单个转化体的后代的生长。通过测量花结直径来定量生长。2个植物系与野生型(Col0)相同地生长，而1个植物系比野生型植物稍微更好地生长，并且对于1种植物，生长仅部分地恢复。

[0320] 图35提供的数据表明了通过用pVND7:IRX9构建体转化irx9突变体制备的2个单个转化体的后代的生长。通过测量花结直径来定量生长。转化的植物系与野生型(Col0)相同地生长。用pVND6:IRX9转化的植物得到了类似的结果。

[0321] 图36提供的数据表明了通过用pVND7:IRX7构建体转化irx7突变体制备的4个单个转化体所制备的细胞壁的非纤维质单糖组成分析。所有转化体仍然表现出原始irx7突变体的低木聚糖含量，但是恢复了生长。

[0322] 图37提供的数据表明了通过用pVND6:IRX8构建体转化irx8突变体制备的4个单个转化体的后代所制备的细胞壁的非纤维质单糖组成分析。所有转化体仍然表现出原始irx8突变体的低木聚糖含量，但是恢复了生长。

[0323] 图38提供的数据表明了通过用pVND7:IRX9构建体转化irx9突变体制备的4个单个转化体和含有pVND6:IRX9构建体的单个转化体的后代所制备的茎细胞壁的非纤维质单糖组成分析。所有转化体仍然表现出原始irx9突变体的低木聚糖含量，但是恢复了生长。

[0324] 图39提供的数据表明了通过用pVND6:IRX9构建体转化irx9突变体制备的2个单个转化体和通过用pVND7:IRX9构建体转化irx9突变体制备的3个单个转化体的后代所制备的细胞壁的糖化分析。所有转化体表现出与原始irx9突变体类似的糖化改善，但是恢复了生长。

[0325] 实施例4.蜡-APFL在表皮细胞中的产生和在物种之间的保守

[0326] 蜡类是高能的(highly energetic)，且含有大量具有潜在燃料应用的长链烷烃和脂肪酸。因此，使用蜡-APFL来制备能够在茎的非必需组织(诸如髓心和纤维)中产生和积累大量蜡类的植物，会提供产生具有高能量密度并且还有效地利用水的生物能作物的新机会。

[0327] 图28解释了蜡沉积的人工正反馈回路。

[0328] 本实施例采用拟南芥属作为模型植物来开发蜡-APFL，以增加表皮细胞中的蜡生物合成和积累。设计了8个DNA构建体来在表皮细胞(其产生一些蜡)中产生蜡AFPL。使用pAtCER1或pAtWBC11作为启动子来制备这些构建体，以从拟南芥属表达AtSHN1(NP_172988)和分别从水稻、短柄草属和卷柏属表达选择的同系物OsSHN1(NP_001046226),BdSHN1(XP_003563662)或SmSHN1(XP_002969836)。使用土壤杆菌转化，将所有构建体单个地转移进野生型拟南芥属中。对于每种蜡-APFL，回收几个转基因植物。

[0329] 象在许多植物种中一样，在拟南芥属中，蜡生物合成主要发生在得自叶和茎的表皮细胞中。几项研究还已经报道，使用组成型或化学诱导型启动子过表达SHN基因的植物会产生叶或/和茎表面的光泽表型，这归因于蜡沉积或/和组成的修饰(McNevin等人1993；Broun等人2004；Kannangara等人2007；Shi等人.2011)。用不同构建体转化的拟南芥属植物的视觉分析表现出增加的叶光亮(图40)。

[0330] 对纯合系进行了其它分析，包括叶和茎表皮蜡的组成分析。植物发育、叶表皮光亮的其它评估、叶绿素浸取测定、蜡积累和组成分析、基因表达分析、以及对干旱胁迫和水损耗的生物影响，是用于表征植物中的蜡-APFL的主要标准。叶绿素浸取测定是鉴别角质层的乙醇渗透性的修饰的一般测定，并通过监测在有乙醇存在下对完整叶的叶绿素提取来进行(Aharoni等人,Plant Cell 2004出处同上；Seo等人,Plant Cell 2011,出处同上)。在通过将完整叶或茎短时间浸入氯仿(其含有一些正-三十烷作为标准品)中进行提取以后，分析了上角质层的蜡积累和组成。通过TLC平板，使用在90:7.5:1溶剂系统中的己烷:乙醚:乙酸，预分析了所述提取物的一般组成，并用99:1的N,O双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺):三甲基氯硅烷衍生化，用于GC/MS分析(Aharoni等人.Plant Cell,2004,出处同上；Kannangara等人,Plant Cell,2007,出处同上)。为了评价增强的蜡沉积对植物水利用效率的影响，通过监测重量减轻对分离的叶进行了水损耗测定。最后，通过5-6周龄植物在7-15天脱水期和随后的1周供水恢复期以后的植物存活计数，研究了蜡沉积修饰对植物干旱胁迫耐受性的影响。

[0331] 讨论

[0332] 修饰木质素含量始终是作物或树的一项挑战，因为减少得越严重，生物质产量受到的影响越多。该减少也经常与导管组织的完整性丧失有关，所述导管组织负责水和营养物从根向地上器官的运输和分布。木质素是植物细胞壁多糖的有效酶促水解的主要抑制因子之一。因此，我们的策略聚焦于减少除了导管以外(为了维持导管完整性)的大部分组织中的木质素，并聚焦于木质素生物合成与关键次生细胞壁转录因子开关的断开，以便操纵所述转录因子的表达而不影响木质素沉积。

[0333] 我们的重新工程改造次生细胞壁生物合成的策略证实，我们可以在木质组织中减少木质素含量和增加细胞壁增厚，且不改变植物生长。将控制木质素生物合成中的必需步骤的基因的启动子替换为另一个具有更受限的时空表达谱的启动子，会提供比单独的沉默方案更好的木质素沉积控制。该精细调节会避免每个组织中的木质素沉积的减少，并允许使它保持在诸如导管等必需组织中，与此相比，沉默方案会影响每个组织，并因此限制了这样的策略的功效。pVND6启动子用于控制C4H的活性的用途，允许木质素生物合成与控制纤维细胞中的次生细胞壁沉积的一般转录因子网络部分地断开，并首次允许在没有过度木质化情况下增加多糖沉积。为了仅在具有自我诱导的木质组织中增加次生细胞壁沉积，我们使用pIRX8启动子制备了人工正反馈回路，以表达主要转录因子NST1的第二拷贝。该启动子在产生次生细胞壁的组织中具有特异性活性，并且在纤维细胞中已经处于NST1转录因子控制下。因此，这样的嵌合基因允许通过自我诱导来过表达NST1，还增加在多糖生物合成中涉及的下游靶基因的表达。另外，使用NST1的下游启动子来表达它自身的新拷贝，可能已经增加了NST1转录因子的时间依赖性表达，因此增加纤维细胞中的次生细胞壁沉积的时间，从而增加细胞壁厚度。

[0334] 据我们所知，在植物中仅建立了一个人工负反馈回路来调节发育过程，并且它对应于衰老的延迟(Gan和Amasino,Science 1995)。该策略对应于使用早期衰老诱导型启动子(pSAG12)在衰老过程开始时表达编码异戊烯基转移酶的IPT基因，以便产生在该阶段特异性的细胞分裂素。已知该激素会抑制衰老过程和更长久地保持植物光合活性(Gan和Amasino,Science 1995)。由于衰老过程的调节机制和基因网络在物种之间的保守，和尤其是激素细胞分裂素对衰老过程的延迟，将该合成构建体转移进不同的作物(草和双子叶植物)中，并且可以由于植物的寿命的增加而提高生物质产量(McCabe等人,2001；Lin等人,Acta Botanica Sinica 2002,44:1333-1338；Robson等人,2004；Li等人,2004；Swartzberg等人,2006；Calderini等人,2007；Li等人,Plant Physiology 2010；和Chen等人,Molecular Breeding 2001)。

[0335] 次生细胞壁生物合成与保守调节网络属于相同类别，因为该生物学过程在维管植物内相当保守(Zhong等人,2010)。例如，在次生细胞壁生物合成中涉及的转录网络和基因相当保守。该网络的保守允许我们利用植物拟南芥属模型，从而实现该方案的快速试验和稳健性。因为增加的多糖含量具有从生物能至造纸工业的多种应用(包括饲料作物)，该策略的可转移性需要是通用的。本文所述的方案应当是相容的，且可快速地从模型物种转移至生物能作物(双子叶植物和单子叶植物)。以前已经证实，在物种之间过表达次生细胞壁转录因子会产生类似的表型和功能，这提示，启动子调节元件也是相当保守的。参见，例如，Shen等人,2009Bioenerg.Res 2:217-232；Zhong等人,2010Plant Physiol 152:1044-1055；Goicoechea等人2005Plant J 43:553-567；Franke等人,2000,Plant J.22:223-234。
因此，应当不需要靶作物的基因组序列，并且可以使用得自其它物种(诸如拟南芥属或作物相关的物种)的盒启动子(例如，pIRX5)和转录因子(例如，NST1)来转化靶植物。

[0336] 不同于酵母、大肠杆菌、立碗藓属和少数其它物种，仍然必须开发通过体内重组在植物中实现的启动子替换；因此，为了操纵组织特异性的木质素沉积，需要突变体。由于突变的有害效应，在作物中难以得到在木质素生物合成途径的必需基因中的天然功能缺失突变体。另外，尚未在植物中开发出组织/细胞特异性的基因表达抑制。因此，经常使用一般的沉默策略来修饰基因表达，以便降低作物中的酶活性，这至少需要在靶向的生物合成途径中涉及的基因的EST序列。与木质素生物合成途径有关的一个担心是，在基因抑制水平、植物健康和所需表型之间的折中经常是相矛盾的。例如，通过抑制木质醇单体生物合成中涉及的基因来改善糖化，极其常见地会影响导管完整性，从而影响水和营养物运输，并因此影响植物生长。为了将所述技术转移至作物，可以使用遗传密码的简并性(密码子选择的灵活性)来制备沉默的抗性的木质素基因，其与沉默构建体一起将用得自拟南芥属或靶作物的相关物种的导管特异性启动子表达，以减少或消除对应的天然基因的表达。例如，在杨树中用导管特异性的启动子(诸如VND6)表达不同的4CL编码序列，会恢复4CL反义系的生长和生物质产量(Kitin等人,2010；Voelker等人,2010)，并保持良好的糖化效率。可替换地，可以开发绕过缺陷性酶促步骤的策略。例如，可以在表达C3H RNAi的杨树中用导管特异性的启动子表达得自卷柏属的SmF5H基因，以恢复导管的完整性和正常的植物生长(Coleman等人,2008a,2008b)。最近在拟南芥属中证实，该SmF5H基因能够恢复HCT和C3H缺陷型突变体的生长(Li等人,2010Plant Cell 22:1620-1632)和分别缺乏产生莽草酸对香豆酰酯和将莽草酸对香豆酰酯偏位羟基化(它们是木质素生物合成中的必需步骤)的能力的木质素突变体的生长(Weng等人2010)。与该SmF5H策略类似地，通过使用将酪氨酸转化成对羟基香豆酸的酪氨酸氨裂合酶(TAL)基因，可以绕过两个将苯丙氨酸转化成对香豆酸的酶促步骤。

[0337] 总之，我们已经证实，2个方案(1个用于增加细胞生物质密度，1个用于将木质素生物合成限制在含有导管的必需组织中)是相容的，并允许制备具有大量非反抗性细胞壁的健康植物，从而允许在没有严重预处理的情况下有效地酶促转化成可发酵的糖。这些方案开启了作物优化的新领域，并且将有利于木质纤维素生物燃料、造纸和饲料工业。

[0338] 参考文献

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[0357] 应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的，并且提示本领域技术人员可以以此为依据进行各种变型或改变，且它们包括在本申请的精神和范围和待批权利要求范围内。在本文中引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请特此通过引用整体并入用于所有目的。

[0358] 在蜡/角质生物合成中涉及的示例性基因：包括登录号和同义的基因命名。

[0359] AtCER1:At1g02205:醛脱羰酶

[0360] AtCER2:VC2:At4g24510:BAHD-型酰基-转移酶

[0361] AtCER3:WAX2:At5g57800:甾醇去饱和酶

[0362] AtCER4:FAR3:At4g33790:脂肪酰基辅酶A还原酶

[0363] AtCER5:WBC12:ABCG12:At1g51500:ABC转运蛋白

[0364] AtCER6:CUT1:KCS6:At1g68530:极长链脂肪酸缩合酶

[0365] AtCER10:ECR:At3g55360:烯酰辅酶A还原酶

[0366] AtWSD1:At5g37300:蜡酯合酶

[0367] AtMAH1:CYP96A15:At1g57750:中链烷烃水解酶

[0368] AtWBC11:ABCG11:DSO:COF1:At1g17840:ABC转运蛋白

[0369] AtKCS1:At1g01120:极长链脂肪酸缩合酶

[0370] AtKCS2:DAISY:At1g04220:极长链脂肪酸缩合酶

[0371] AtFATB:At1g08510:酰基载体

[0372] AtLACS1:At2g47240:长链酰基辅酶A合酶

[0373] AtLACS2:At1g49430:长链酰基辅酶A合酶

[0374] AtCYP86A4:At1g01600:细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶

[0375] AtCYP86A7:At1g63710:细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶

[0376] AtLCR:CYP86A5:At2g45970:细胞色素P450依赖性的脂肪酸羟化酶

[0377] AtKCS10:FDH:At2g26250:极长链脂肪酸缩合酶

[0378] AtCER60:KCS5:At1g25450:极长链脂肪酸缩合酶

[0379] 示例性的序列

[0380] SEQ ID NO:1

[0381] 拟南芥PAL1核酸(At2g37040)NM_129260

[0382]atggagattaacggggcacacaagagcaacggaggaggagtggacgctatgttatgcggcggagacatcaagacaaagaacatggtgatcaacgcggaggatcctctcaactggggagctgcagcggagcaaatgaaaggtagccatttggatgaagtgaagagaatggttgctgagtttaggaagccagttgtgaatcttggtggtgagactctgaccattggacaagtggctgcgatctcaactattggtaacagtgtgaaggtggagctatcggagacagctagagccggtgtgaatgctagtagtgattgggttatggagagtatgaacaaaggcactgatagttatggtgttactactggttttggtgctacttctcatcggagaaccaaaaacggtgtcgcacttcagaaggaacttattagattccttaacgccggaatattcggaagcacgaaagaaacaagccacacattgccacactccgccacaagagccgccatgcttgtacgaatcaacactctcctccaaggattttccggtatccgatttgagattctcgaagcaattaccagtttcctcaacaacaacatcactccatctctccccctccgtggtacaatcaccgcctccggagatctcgttcctctctcctacatcgccggacttctcaccggtcgtcccaattccaaagctactggtcccaacggtgaagctttaacagcagaggaagctttcaaattagcaggaatcagctccggattctttgatctccagcctaaggaaggtctcgcgctagtcaatggcacggcggttggatctggaatggcgtcaatggtgttattcgaaacgaatgttctctctgttttggctgagattttgtcggcggttttcgcagaggtgatgagtggtaagcctgagttcaccgatcatctcactcacagacttaaacatcatcccggtcaaatcgaagcggcggcgataatggagcatatcctcgacggaagctcgtacatgaaattagctcagaagcttcacgagatggatccgttacagaaacctaaacaagatcgttacgctcttcgtacttctcctcaatggttaggtcctcaaatcgaagtgatccgttacgcaacgaaatcgatcgagcgtgagattaactccgtcaacgataatccgttgatcgatgtttcgaggaacaaggcgattcacggtggtaacttccaaggaacaccaatcggagtttcaatggataacacgagattggcgatagcagcgattggtaaactcatgtttgctcaattctcagagcttgtgaatgatttctacaacaatggtttaccctcgaatctaaccgcttcgaggaatccaagtttggattatggattcaagggagctgagattgcaatggcttcttattgttcagagcttcaatacttagctaatcctgtgactagccatgttcaatcagcagagcaacataaccaagatgtcaactctttgggactaatctcgtctcgcaaaacttctgaagctgttgatattctcaagcttatgtcaacaacgttcctcgttgcgatttgtcaagctgtggatttgagacatttggaggagaatttgagacagactgtgaagaacactgtctctcaagtggcgaagaaagttcttactactggagtcaatggtgagcttcatccttctcgcttctgcgaaaaggatttactcaaagttgtagaccgtgaacaagtctacacatacgcggatgatccttgtagcgcaacgtacccgttgattcagaagctgagacaagttattgttgaccatgctttgatcaatggtgagagtgagaagaatgcagtgacttcaatcttccataagattggagctttcgaggaggagcttaaggcagtgctaccgaaagaagtggaagcagcaagagcagcctacgataacggaacatcggctatcccgaacaggatcaaggaatgtaggtcgtatccattgtatagattcgtgagggaagagcttggaacagagcttttgaccggagagaaagtgacgtcgcctggagaagagttcgacaaggttttcacggcgatttgtgaaggtaaaatcattgatccgatgatggaatgtctcaacgagtggaacggagctcccattccaatatgttaa

[0383] SEQ ID NO:2

[0384] 拟南芥PAL1蛋白(At2g37040)NP_181241

[0385] MEINGAHKSNGGGVDAMLCGGDIKTKNMVINAEDPLNWGAAAEQMKGSHLDEVKRMVAEFRKPVVNLGGETLTIGQVAAISTIGNSVKVELSETARAGVNASSDWVMESMNKGTDSYGVTTGFGATSHRRTKNGVALQKELIRFLNAGIFGSTKETSHTLPHSATRAAMLVRINTLLQGFSGIRFEILEAITSFLNNNITPSLPLRGTITASGDLVPLSYIAGLLTGRPNSKATGPNGEALTAEEAFKLAGISSGFFDLQPKEGLALVNGTAVGSGMASMVLFETNVLSVLAEILSAVFAEVMSGKPEFTDHLTHRLKHHPGQIEAAAIMEHILDGSSYMKLAQKLHEMDPLQKPKQDRYALRTSPQWLGPQIEVIRYATKSIEREINSVNDNPLIDVSRNKAIHGGNFQGTPIGVSMDNTRLAIAAIGKLMFAQFSELVNDFYNNGLPSNLTASRNPSLDYGFKGAEIAMASYCSELQYLANPVTSHVQSAEQHNQDVNSLGLISSRKTSEAVDILKLMSTTFLVAICQAVDLRHLEENLRQTVKNTVSQVAKKVLTTGVNGELHPSRFCEKDLLKVVDREQVYTYADDPCSATYPLIQKLRQVIVDHALINGESEKNAVTSIFHKIGAFEEELKAVLPKEVEAARAAYDNGTSAIPNRIKECRSYPLYRFVREELGTELLTGEKVTSPGEEFDKVFTAICEGKIIDPMMECLNEWNGAPIPIC

[0386] SEQ ID NO:3

[0387] 拟南芥C4H核酸(At2g30490)NM_128601

[0388]atggacctcctcttgctggagaagtctttaatcgccgtcttcgtggcggtgattctcgccacggtgatttcaaagctccgcggcaagaaattgaagctacctccaggtcctataccaattccgatcttcggaaactggcttcaagtcggagatgatctcaaccaccgtaatctcgtcgattacgctaagaaattcggcgatctcttcctcctccgtatgggtcagcgaaacctagtcgtcgtctcctcaccggatctaacaaaggaagtgctcctcactcaaggcgttgagtttggatccagaacgagaaacgtcgtgttcgacattttcaccgggaaaggtcaagatatggtgttcactgtttacggcgagcattggaggaagatgagaagaatcatgacggttcctttcttcaccaacaaagttgttcaacagaatcgtgaaggttgggagtttgaagcagctagtgttgttgaagatgttaagaagaatccagattctgctacgaaaggaatcgtgttgaggaaacgtttgcaattgatgatgtataacaatatgttccgtatcatgttcgatagaagatttgagagtgaggatgatcctcttttccttaggcttaaggctttgaatggtgagagaagtcgattagctcagagctttgagtataactatggagatttcattcctatccttagaccattcctcagaggctatttgaagatttgtcaagatgtgaaagatcgaagaatcgctcttttcaagaagtactttgttgatgagaggaagcaaattgcgagttctaagcctacaggtagtgaaggattgaaatgtgccattgatcacatccttgaagctgagcagaagggagaaatcaacgaggacaatgttctttacatcgtcgagaacatcaatgtcgccgcgattgagacaacattgtggtctatcgagtggggaattgcagagctagtgaaccatcctgaaatccagagtaagctaaggaacgaactcgacacagttcttggaccgggtgtgcaagtcaccgagcctgatcttcacaaacttccataccttcaagctgtggttaaggagactcttcgtctgagaatggcgattcctctcctcgtgcctcacatgaacctccatgatgcgaagctcgctggctacgatatcccagcagaaagcaaaatccttgttaatgcttggtggctagcaaacaaccccaacagctggaagaagcctgaagagtttagaccagagaggttctttgaagaagaatcgcacgtggaagctaacggtaatgacttcaggtatgtgccatttggtgttggacgtcgaagctgtcccgggattatattggcattgcctattttggggatcaccattggtaggatggtccagaacttcgagcttcttcctcctccaggacagtctaaagtggatactagtgagaaaggtggacaattcagcttgcacatccttaaccactccataatcgttatgaaaccaaggaactgttaa

[0389] SEQ ID NO:4

[0390] 拟南芥C4H蛋白(At2g30490)NP_180607

[0391] MDLLLLEKSLIAVFVAVILATVISKLRGKKLKLPPGPIPIPIFGNWLQVGDDLNHRNLVDYAKKFGDLFLLRMGQRNLVVVSSPDLTKEVLLTQGVEFGSRTRNVVFDIFTGKGQDMVFTVYGEHWRKMRRIMTVPFFTNKVVQQNREGWEFEAASVVEDVKKNPDSATKGIVLRKRLQLMMYNNMFRIMFDRRFESEDDPLFLRLKALNGERSRLAQSFEYNYGDFIPILRPFLRGYLKICQDVKDRRIALFKKYFVDERKQIASSKPTGSEGLKCAIDHILEAEQKGEINEDNVLYIVENINVAAIETTLWSIEWGIAELVNHPEIQSKLRNELDTVLGPGVQVTEPDLHKLPYLQAVVKETLRLRMAIPLLVPHMNLHDAKLAGYDIPAESKILVNAWWLANNPNSWKKPEEFRPERFFEEESHVEANGNDFRYVPFGVGRRSCPGIILALPILGITIGRMVQNFELLPPPGQSKVDTSEKGGQFSLHILNHSIIVMKPRNC

[0392] SEQ ID NO:5

[0393] 拟南芥4CL2核酸(At3g21240)NM_113019

[0394]atgacgacacaagatgtgatagtcaatgatcagaatgatcagaaacagtgtagtaatgacgtcattttccgatcgagattgcctgatatatacatccctaaccacctcccactccacgactacatcttcgaaaatatctcagagttcgccgctaagccatgcttgatcaacggtcccaccggcgaagtatacacctacgccgatgtccacgtaacatctcggaaactcgccgccggtcttcataacctcggcgtgaagcaacacgacgttgtaatgatcctcctcccgaactctcctgaagtagtcctcactttccttgccgcctccttcatcggcgcaatcaccacctccgcgaacccgttcttcactccggcggagatttctaaacaagccaaagcctccgcggcgaaactcatcgtcactcaatcccgttacgtcgataaaatcaagaacctccaaaacgacggcgttttgatcgtcaccaccgactccgacgccatccccgaaaactgcctccgtttctccgagttaactcagtccgaagaaccacgagtggactcaataccggagaagatttcgccagaagacgtcgtggcgcttcctttctcatccggcacgacgggtctccccaaaggagtgatgctaacacacaaaggtctagtcacgagcgtggcgcagcaagtcgacggcgagaatccgaatctttacttcaacagagacgacgtgatcctctgtgtcttgcctatgttccatatatacgctctcaactccatcatgctctgtagtctcagagttggtgccacgatcttgataatgcctaagttcgaaatcactctcttgttagagcagatacaaaggtgtaaagtcacggtggctatggtcgtgccaccgatcgttttagctatcgcgaagtcgccggagacggagaagtatgatctgagctcggttaggatggttaagtctggagcagctcctcttggtaaggagcttgaagatgctattagtgctaagtttcctaacgccaagcttggtcagggctatgggatgacagaagcaggtccggtgctagcaatgtcgttagggtttgctaaagagccgtttccagtgaagtcaggagcatgtggtacggtggtgaggaacgccgagatgaagatacttgatccagacacaggagattctttgcctaggaacaaacccggcgaaatatgcatccgtggcaaccaaatcatgaaaggctatctcaatgaccccttggccacggcatcgacgatcgataaagatggttggcttcacactggagacgtcggatttatcgatgatgacgacgagcttttcattgtggatagattgaaagaactcatcaagtacaaaggatttcaagtggctccagctgagctagagtctctcctcataggtcatccagaaatcaatgatgttgctgtcgtcgccatgaaggaagaagatgctggtgaggttcctgttgcgtttgtggtgagatcgaaagattcaaatatatccgaagatgaaatcaagcaattcgtgtcaaaacaggttgtgttttataagagaatcaacaaagtgttcttcactgactctattcctaaagctccatcagggaagatattgaggaaggatctaagagcaagactagcaaatggattaatgaactag

[0395] SEQ ID NO:6

[0396] 拟南芥4CL2蛋白(At3g21240)NP_188761

[0397] MTTQDVIVNDQNDQKQCSNDVIFRSRLPDIYIPNHLPLHDYIFENISEFAAKPCLINGPTGEVYTYADVHVTSRKLAAGLHNLGVKQHDVVMILLPNSPEVVLTFLAASFIGAITTSANPFFTPAEISKQAKASAAKLIVTQSRYVDKIKNLQNDGVLIVTTDSDAIPENCLRFSELTQSEEPRVDSIPEKISPEDVVALPFSSGTTGLPKGVMLTHKGLVTSVAQQVDGENPNLYFNRDDVILCVLPMFHIYALNSIMLCSLRVGATILIMPKFEITLLLEQIQRCKVTVAMVVPPIVLAIAKSPETEKYDLSSVRMVKSGAAPLGKELEDAISAKFPNAKLGQGYGMTEAGPVLAMSLGFAKEPFPVKSGACGTVVRNAEMKILDPDTGDSLPRNKPGEICIRGNQIMKGYLNDPLATASTIDKDGWLHTGDVGFIDDDDELFIVDRLKELIKYKGFQVAPAELESLLIGHPEINDVAVVAMKEEDAGEVPVAFVVRSKDSNISEDEIKQFVSKQVVFYKRINKVFFTDSIPKAPSGKILRKDLRARLANGLMN

[0398] SEQ ID NO:7

[0399] 拟南芥HCT核酸(At5g48930)NM_124270

[0400]atgaaaattaacatcagagattccaccatggtccggcctgccaccgagacaccaatcactaatctttggaactccaacgtcgaccttgtcatccccagattccatacccctagtgtctacttctacagacccaccggcgcttccaatttctttgaccctcaggtcatgaaggaagctctttccaaagcccttgtccctttttaccctatggctggtcgcttgaagagagacgatgatggtcgtattgagatcgattgtaacggtgctggtgttctcttcgttgtggctgatactccttctgttatcgatgattttggtgattttgctcctacccttaatctccgtcagcttattcccgaagttgatcactccgctggcattcactctttcccgcttctcgttttgcaggtgactttctttaaatgtgggggagcttcacttggggttgggatgcaacatcacgcggcagatggtttctctggtcttcattttatcaacacatggtctgatatggctcgtggtcttgacctaaccattccacctttcattgatcgaacactcctccgagctagggacccgccacagcctgcttttcatcatgttgaatatcagcctgcaccaagtatgaagatacctcttgatccgtctaaatcaggacctgagaataccactgtctctatattcaaattaacacgagaccagcttgttgctcttaaggcgaaatccaaggaggatgggaacactgtcagctacagctcatacgagatgttggcagggcatgtgtggagatcagtgggaaaggcgcgagggcttccaaacgaccaagagacgaaactgtacattgcaactgatggaaggtctagactacgtccgcagctgcctcctggttactttgggaatgtgatattcactgcaacaccattggctgttgcaggggatttgttatctaagccaacatggtatgctgcaggacagattcatgatttcttggttcgtatggatgataactatctgaggtcagctcttgactacctggagatgcagcctgatctgtcagcccttgtccgcggtgcacatacctacaagtgcccaaatttgggaatcacaagctgggttagattacctatttatgatgcagactttggttggggtcgtcctatctttatgggacctggtggaattccatacgagggtttgtcttttgtgctaccaagtcctactaatgatggcagcttatccgttgccattgccctccaatctgaacacatgaaactgtttgagaagtttttgtttgagatatga

[0401] SEQ ID NO:8

[0402] 拟南芥HCT蛋白(At5g48930)NP_199704

[0403] MKINIRDSTMVRPATETPITNLWNSNVDLVIPRFHTPSVYFYRPTGASNFFDPQVMKEALSKALVPFYPMAGRLKRDDDGRIEIDCNGAGVLFVVADTPSVIDDFGDFAPTLNLRQLIPEVDHSAGIHSFPLLVLQVTFFKCGGASLGVGMQHHAADGFSGLHFINTWSDMARGLDLTIPPFIDRTLLRARDPPQPAFHHVEYQPAPSMKIPLDPSKSGPENTTVSIFKLTRDQLVALKAKSKEDGNTVSYSSYEMLAGHVWRSVGKARGLPNDQETKLYIATDGRSRLRPQLPPGYFGNVIFTATPLAVAGDLLSKPTWYAAGQIHDFLVRMDDNYLRSALDYLEMQPDLSALVRGAHTYKCPNLGITSWVRLPIYDADFGWGRPIFMGPGGIPYEGLSFVLPSPTNDGSLSVAIALQSEHMKLFEKFLFEI

[0404] SEQ ID NO:9

[0405] 拟南芥C3H核酸(At4g34050)NM_119566

[0406]atggcgacgacaacaacagaagcaacgaagacatcatcgaccaatggagaagatcagaagcagtctcagaatcttcgacatcaagaagttggtcacaagagtctcttacagagcgatgatctctaccagtatatactggagacaagtgtgtatcctagagaaccagaatcaatgaaggaactcagggaagtgacagcaaaacatccatggaacataatgaccacatcagctgatgaaggacagttcttaaacatgcttatcaagctcgttaacgccaagaacacaatggagatcggagtttacactggctactctcttctcgccaccgctcttgctctccctgaagacggcaaaattctggctatggatgtcaacagagagaattacgaattgggtttaccgatcattgagaaagccggcgttgctcacaagatcgacttcagggaaggccctgctcttcccgttcttgatgaaatcgttgctgacgagaagaaccatggaacatatgactttatattcgttgatgctgacaaagacaactacatcaactaccacaagcgtttgatcgatcttgtgaaaattggaggagtgattggctacgacaacactctgtggaatggttctgtcgtggctcctcctgatgcaccaatgaggaagtacgttcgttactacagagactttgttcttgagcttaacaaggctcttgctgctgaccctcggatcgagatctgtatgctccctgttggtgatggaatcactatctgccgtcggatcagttga

[0407] SEQ ID NO:10

[0408] 拟南芥C3H蛋白(At4g34050)NP_850337

[0409]MSWFLIAVATIAAVVSYKLIQRLRYKFPPGPSPKPIVGNLYDIKPVRFRCYYEWAQSYGPIISVWIGSILNVVVSSAELAKEVLKEHDQKLADRHRNRSTEAFSRNGQDLIWADYGPHYVKVRKVCTLELFTPKRLESLRPIREDEVTAMVESVFRDCNLPENRAKGLQLRKYLGAVAFNNITRLAFGKRFMNAEGVVDEQGLEFKAIVSNGLKLGASLSIAEHIPWLRWMFPADEKAFAEHGARRDRLTRAIMEEHTLARQKSSGAKQHFVDALLTLKDQYDLSEDTIIGLLWDMITAGMDTTAITAEWAMAEMIKNPRVQQKVQEEFDRVVGLDRILTEADFSRLPYLQCVVKESFRLHPPTPLMLP小时

[0410]NADVKIGGYDIPKGSNVHVNVWAVARDPAVWKNPFEFRPERFLEEDVDMKGHDFRLLPFGAGRRVCPGAQLGINLVTSMMSHLLHHFVWTPPQGTKPEEIDMSENPGLVTYMRTPVQAVATPRLPSDLYKRVPYDMSEQ ID NO:11[0411] 拟南芥CCR1核酸(At1g15950)NM_101463

[0412]atgccagtcgacgtagcctcaccggccggaaaaaccgtctgcgtcaccggagctggtggatacatcgcttcttggattgttaagatacttctcgagagaggttacacagtcaaaggaaccgtacggaatccagatgatccgaagaacacacatttgagagaactagaaggaggaaaggagagactgattctgtgcaaagcagatcttcaggactacgaggctcttaaggcggcgattgatggttgcgacggcgtctttcacacggcttctcctgtcaccgacgatccggaacaaatggtggagccggccgtgaatggagccaagtttgtaattaatgctgcggctgaggccaaggtcaagcgcgtggtcatcacctcctccattggtgccgtctacatggacccgaaccgtgaccctgaggctgtcgttgacgaaagttgttggagtgatcttgacttctgcaaaaacaccaagaattggtattgttacggcaagatggtggcggaacaagcggcgtgggagacagcaaaggagaaaggtgttgacttggtggtgttgaatccggtgctggttcttggaccgccgttacagccgacgatcaacgccagtctttaccacgtcctcaaatatctaaccggctcggctaagacttatgctaatttgactcaagcttatgtggatgttcgcgatgtcgcgctggctcatgttctggtctatgaggcaccctcggcctccggacgttatctcctagccgagagtgctcgccaccgcggggaagttgttgagattctggctaagctattcccggagtatcctcttccgaccaagtgcaaggacgagaagaaccctagagccaagccatacaaattcactaaccagaagattaaggacttaggcttagagttcacttccaccaagcaaagcctctacgacacagtcaagagcttacaagagaaaggccatcttgctcctcctcctcctcctccttcagcatcgcaagaatccgtggaaaatggcattaagatcgggtcttga

[0413] SEQ ID NO:12

[0414] 拟南芥CCR1蛋白(At1g15950)NP_173047

[0415] MPVDVASPAGKTVCVTGAGGYIASWIVKILLERGYTVKGTVRNPDDPKNTHLRELEGGKERLILCKADLQDYEALKAAIDGCDGVFHTASPVTDDPEQMVEPAVNGAKFVINAAAEAKVKRVVITSSIGAVYMDPNRDPEAVVDESCWSDLDFCKNTKNWYCYGKMVAEQAAWETAKEKGVDLVVLNPVLVLGPPLQPTINASLYHVLKYLTGSAKTYANLTQAYVDVRDVALAHVLVYEAPSASGRYLLAESARHRGEVVEILAKLFPEYPLPTKCKDEKNPRAKPYKFTNQKIKDLGLEFTSTKQSLYDTVKSLQEKGHLAPPPPPPSASQESVENGIKIGS

[0416] SEQ ID NO:13

[0417] 拟南芥NST1(At2g46770)核酸NM_130243

[0418]atgatgtcaaaatctatgagcatatcagtgaacggacaatctcaagtgcctcctgggtttaggtttcatccgaccgaggaagagctgttgcagtattatctccggaagaaagttaatagcatcgagatcgatcttgatgtcattcgcgacgttgatctcaacaagctcgagccttgggacattcaagagatgtgtaaaataggaacaacgccacaaaacgactggtatttctttagccacaaggacaaaaaatatccgacgggaacgagaactaacagagccactgcggctggattttggaaagcaactggccgcgacaagatcatatatagcaatggccgtagaattgggatgagaaagactcttgttttctacaaaggccgagctcctcacggccaaaaatctgattggatcatgcatgaatatagactcgatgacaacattatttcccccgaggatgtcaccgttcatgaggtcgtgagtattataggggaagcatcacaagacgaaggatgggtggtgtgtcgtattttcaagaagaagaatcttcacaaaaccctaaacagtcccgtcggaggagcttccctgagcggcggcggagatacgccgaagacgacatcatctcagatcttcaacgaggatactctcgaccaatttcttgaacttatggggagatcttgtaaagaagagctaaatcttgaccctttcatgaaactcccaaacctcgaaagccctaacagtcaggcaatcaacaactgccacgtaagctctcccgacactaatcataatatccacgtcagcaacgtggtcgacactagctttgttactagctgggcggctttagaccgcctcgtggcctcgcagcttaacggacccacatcatattcaattacagccgtcaatgagagccacgtgggccatgatcatctcgctttgccttccgtccgatctccgtaccccagcctaaaccggtccgcttcgtaccacgccggtttaacacaggaatatacaccggagatggagctatggaatacgacgacgtcgtctctatcgtcatcgcctggcccattttgtcacgtgtcgaatggtagtggataa

[0419] SEQ ID NO:14

[0420] 拟南芥NST1(At2g46770)蛋白NP_182200

[0421] MMSKSMSISVNGQSQVPPGFRFHPTEEELLQYYLRKKVNSIEIDLDVIRDVDLNKLEPWDIQEMCKIGTTPQNDWYFFSHKDKKYPTGTRTNRATAAGFWKATGRDKIIYSNGRRIGMRKTLVFYKGRAPHGQKSDWIMHEYRLDDNIISPEDVTVHEVVSIIGEASQDEGWVVCRIFKKKNLHKTLNSPVGGASLSGGGDTPKTTSSQIFNEDTLDQFLELMGRSCKEELNLDPFMKLPNLESPNSQAINNCHVSSPDTNHNIHVSNVVDTSFVTSWAALDRLVASQLNGPTSYSITAVNESHVGHDHLALPSVRSPYPSLNRSASYHAGLTQEYTPEMELWNTTTSSLSSSPGPFCHVSNGSG

[0422] SEQ ID NO:15

[0423] 拟南芥NST2(At3g61910)核酸NM_116056

[0424]atgaacatatcagtaaacggacagtcacaagtacctcctggctttaggtttcacccaaccgaggaagagctcttgaagtattacctccgcaagaaaatctctaacatcaagatcgatctcgatgttattcctgacattgatctcaacaagctcgagccttgggatattcaagagatgtgtaagattggaacgacgccgcaaaacgattggtacttttatagccataaggacaagaagtatcccaccgggactagaaccaacagagccaccacggtcggattttggaaagcgacgggacgtgacaagaccatatataccaatggtgatagaatcgggatgcgaaagacgcttgtcttctacaaaggtcgagcccctcatggtcagaaatccgattggatcatgcacgaatatagactcgacgagagtgtattaatctcctcgtgtggcgatcatgacgtcaacgtagaaacgtgtgatgtcataggaagtgacgaaggatgggtggtgtgtcgtgttttcaagaaaaataacctttgcaaaaacatgattagtagtagcccggcgagttcggtgaaaacgccgtcgttcaatgaggagactatcgagcaacttctcgaagttatggggcaatcttgtaaaggagagatagttttagaccctttcttaaaactccctaacctcgaatgccataacaacaccaccatcacgagttatcagtggttaatcgacgaccaagtcaacaactgccacgtcagcaaagttatggatcccagcttcatcactagctgggccgctttggatcggctcgttgcctcacagttaaatgggcccaactcgtattcaataccagccgttaatgagacttcacaatcaccgtatcatggactgaaccggtccggttgtaataccggtttaacaccagattactatataccggagattgatttatggaacgaggcagatttcgcgagaacgacatgccacttgttgaacggtagtggataa

[0425] SEQ ID NO:16

[0426] 拟南芥NST2(At3g61910)蛋白NP_191750

[0427] MNISVNGQSQVPPGFRFHPTEEELLKYYLRKKISNIKIDLDVIPDIDLNKLEPWDIQEMCKIGTTPQNDWYFYSHKDKKYPTGTRTNRATTVGFWKATGRDKTIYTNGDRIGMRKTLVFYKGRAPHGQKSDWIMHEYRLDESVLISSCGDHDVNVETCDVIGSDEGWVVCRVFKKNNLCKNMISSSPASSVKTPSFNEETIEQLLEVMGQSCKGEIVLDPFLKLPNLECHNNTTITSYQWLIDDQVNNCHVSKVMDPSFITSWAALDRLVASQLNGPNSYSIPAVNETSQSPYHGLNRSGCNTGLTPDYYIPEIDLWNEADFARTTCHLLNGSG

[0428] SEQ ID NO:17

[0429] 拟南芥NST3/SND1(At1g32770)核酸NM_103011

[0430]atggctgataataaggtcaatctttcgattaatggacaatcaaaagtgcctccaggtttcagattccatcccaccgaagaagaacttctccattactatctccgtaagaaagttaactctcaaaagatcgatcttgatgtcattcgtgaagttgatctaaacaagcttgagccttgggatattcaagaggaatgtagaatcggttcaacgccacaaaacgactggtacttcttcagccacaaggacaagaagtatccaaccgggaccaggacgaaccgggcaacagtcgctggattctggaaagctaccggacgtgacaaaatcatctgcagttgtgtccggagaattggactgaggaagacactcgtgttctacaaaggaagagctcctcacggtcagaaatccgactggatcatgcatgagtatcgcctcgacgatactccaatgtctaatggctatgctgatgttgttacagaagatccaatgagctataacgaagaaggttgggtggtatgtcgagtgttcaggaagaagaactatcaaaagattgacgattgtcctaaaatcactctatcttctttacctgatgacacggaggaagagaaggggcccacctt t c a c a a c a c t c a a a a c g t t a c c g g t t 
tagaccatgttcttctctacatggaccgtaccggttctaacatttgcatgcccgagagccaaacaacgactcaacatcaagatgatgtcttattcatgcaactcccaagtcttgagacacctaaatccgagagcccggtcgaccaaagtttcctgactccaagcaaactcgatttctctcccgttcaagagaagataaccgaaagaccggtttgcagcaactgggctagtcttgaccggctcgtagcttggcaattgaacaatggtcatcataatccgtgtcatcgtaagagttttgatgaagaagaagaaaatggtgatactatgatgcagcgatgggatcttcattggaataatgatgataatgttgatctttggagtagtttcactgagtcttcttcgtctttagacccacttcttcatttatctgtatga

[0431] SEQ ID NO:18

[0432] 拟南芥NST3/SND1(At1g32770)蛋白NP_174554

[0433] MADNKVNLSINGQSKVPPGFRFHPTEEELLHYYLRKKVNSQKIDLDVIREVDLNKLEPWDIQEECRIGSTPQNDWYFFSHKDKKYPTGTRTNRATVAGFWKATGRDKIICSCVRRIGLRKTLVFYKGRAPHGQKSDWIMHEYRLDDTPMSNGYADVVTEDPMSYNEEGWVVCRVFRKKNYQKIDDCPKITLSSLPDDTEEEKGPTFHNTQNVTGLDHVLLYMDRTGSNICMPESQTTTQHQDDVLFMQLPSLETPKSESPVDQSFLTPSKLDFSPVQEKITERPVCSNWASLDRLVAWQLNNGHHNPCHRKSFDEEEENGDTMMQRWDLHWNNDDNVDLWSSFTESSSSLDPLLHLSV

[0434] SEQ ID NO:19

[0435] 拟南芥SND2(At4g28500)核酸NM_118992

[0436]atgacttggtgcaatgaccgtagcgatgttcagaccgttgaaagaatcattccctccccgggggcggctgagtcccccgtagcctcacttccggtctcttgtcacaaaacttgcccttcttgtggccataacttcaagtttcacgaacaggctgggatccatgacttgccgggacttcctgctggagtaaaatttgatccgacggatcaagaggtcttggagcatcttgaaggcaaggtaagagatgacgcaaaaaagcttcatcctctcattgatgagtttatccgtaccatcgatggtgaaaacggcatttgttatacccatcctgaaaaattgccaggagtgaacaaggacgggacggtgcgtcatttcttccaccgaccgtcgaaggcatacacgacgggaacaagaaagcgacgtaaagtccacactgattctgacgtcggtggagagacacggtggcacaagacaggaaaaacacggccagttcttgctggaggaagagtgagaggctacaagaaaatcctagtgctctacacaaactacggcaaacaaaaaaaacccgagaagactaattgggtaatgcatcaatatcatcttggcactagcgaggaagagaaagaaggtgagctcgtcgtctccaaagtcttttaccagactcaaccacgtcaatgcggtggctccgttgctgctgcagccaccgctaaggaccgaccttacctccacggcctcggtggaggtggtggccgccaccttcattaccatcttcatcataacaacggtaacggtaagagcaacggcagtgggggaaccgccggagccggtgagtattatcacaatattccggctattatctcgttcaatcagaccgggatacagaaccacttggttcatgactctcaaccttttatcccttaa[0437] SEQ ID NO:20

[0438] 拟南芥SND2(At4g28500)蛋白NP_194579

[0439] MTWCNDRSDVQTVERIIPSPGAAESPVASLPVSCHKTCPSCGHNFKFHEQAGIHDLPGLPAGVKFDPTDQEVLEHLEGKVRDDAKKLHPLIDEFIRTIDGENGICYTHPEKLPGVNKDGTVRHFFHRPSKAYTTGTRKRRKVHTDSDVGGETRWHKTGKTRPVLAGGRVRGYKKILVLYTNYGKQKKPEKTNWVMHQYHLGTSEEEKEGELVVSKVFYQTQPRQCGGSVAAAATAKDRPYLHGLGGGGGRHLHYHLHHNNGNGKSNGSGGTAGAGEYYHNIPAIISFNQTGIQNHLVHDSQPFIP

[0440] SEQ ID NO:21

[0441] 拟南芥SND3(At1g28470)核酸NM_102615

[0442]atgagttggtgtgatggttcagatgataactacgatcttaatcttgaaagagtatcgaacactgatcatccatcggttcaactcaaagaccaatctcaatcatgtgtaacgagccgtccagattccaagattagcgctgaaactcccatcacgacttgtccttcttgcggacacaagctccatcatcaccaagacgaccaggttggtagcatcaaagatttaccaagcttaccggcaggagtcaaattcgatccgtcggataaagagatccttatgcatttggaggcgaaggtatcatccgataagcgaaaacttcatccgttgattgatgaatttatacctacgcttgaaggagagaatggaatttgttatacgcatcctgagaaacttcctggagtaagcaaggacgggcaagtacggcacttcttccaccggccatcaaaggcttatacgaccggaacacgaaaacgaagaaaagtgagcacagatgaggaaggccatgaaacaaggtggcacaaaacaggcaagactcgacctgttttgtctcaatcaggagaaaccggtttcaagaagatcctagtgctctacaccaactatggtcgccagaagaagcctgagaagacgaattgggtgatgcatcagtatcatttaggtagcagcgaggacgaaaaagacggtgaaccagtcctctctaaagtcttctaccaaacacagcctaggcaatgcggttcgatggaacctaaaccgaaaaatctcgtaaacctaaaccggtttagttatgaaaatattcaggccggtttcgggtatgagcatggtggtaaaagtgaagagacgacgcaggtgattcgagagttggtagttcgtgaaggcgatgggtcatgttcgtttcttagttttacttgtgatgcaagtaagggtaaagaaagcttcatgaagaatcaatag

[0443] SEQ ID NO:22

[0444] 拟南芥SND3(At1g28470)蛋白NP_564309

[0445] MSWCDGSDDNYDLNLERVSNTDHPSVQLKDQSQSCVTSRPDSKISAETPITTCPSCGHKLHHHQDDQVGSIKDLPSLPAGVKFDPSDKEILMHLEAKVSSDKRKLHPLIDEFIPTLEGENGICYTHPEKLPGVSKDGQVRHFFHRPSKAYTTGTRKRRKVSTDEEGHETRWHKTGKTRPVLSQSGETGFKKILVLYTNYGRQKKPEKTNWVMHQYHLGSSEDEKDGEPVLSKVFYQTQPRQCGSMEPKPKNLVNLNRFSYENIQAGFGYEHGGKSEETTQVIRELVVREGDGSCSFLSFTCDASKGKESFMKNQ

[0446] SEQ ID NO:23

[0447] 拟南芥MYB103(At1g63910)核酸NM_105065

[0448]atgggtcatcactcatgctgcaaccagcaaaaggtgaagagagggctttggtcaccggaagaagatgagaagcttattagatatatcacaactcatggctatggatgttggagtgaagtccctgaaaaagcagggcttcaaagatgtggaaaaagttgtagattgcgatggataaactatcttcgacctgatatcaggagaggaaggttctctccagaagaagagaaattgatcataagccttcatggagttgtgggaaacaggtgggctcatatagctagtcatttaccgggaagaacagataacgagattaaaaac tattggaattcatggattaagaaaaagatacgaaaaccgcaccatcattacagtcgtcatcaaccgtcagtaactactgtgacattgaatgcggacactacatcgattgccactaccatcgaggcctctaccaccacaacatcgactatcgataacttacattttgacggtttcactgattctcctaaccaattaaatttcaccaatgatcaagaaactaatataaagattcaagaaacttttttctcccataaacctcctctcttcatggtagacacaacacttcctatcctagaaggaatgttctctgaaaacatcatcacaaacaataacaagaacaatgatcatgatgacacgcaaagaggaggaagagaaaatgtttgtgaacaagcatttctaacaactaacacggaagaatgggatatgaatcttcgtcagcaagagccgtttcaagttcctacactggcgtcacatgtgttcaacaactcttccaattcaaatattgacacggttataagttataatctaccggcgctaatagagggaaatgtcgataacatcgtccataatgaaaacagcaatgtccaagatggagaaatggcgtccacattcgaatgtttaaagaggcaagaactaagctatgatcaatgggacgattcacaacaatgctctaactttttcttttgggacaaccttaatataaacgtggaaggttcatctcttgttggaaaccaagacccatcaatgaatttgggatcatctgccttatcttcttctttcccttcttcgttttaa

[0449] SEQ ID NO:24

[0450] 拟南芥MYB103(At1g63910)蛋白NP_176575

[0451] MGHHSCCNQQKVKRGLWSPEEDEKLIRYITTHGYGCWSEVPEKAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDIRRGRFSPEEEKLIISLHGVVGNRWAHIASHLPGRTDNEIKNYWNSWIKKKIRKPHHHYSRHQPSVTTVTLNADTTSIATTIEASTTTTSTIDNLHFDGFTDSPNQLNFTNDQETNIKIQETFFSHKPPLFMVDTTLPILEGMFSENIITNNNKNNDHDDTQRGGRENVCEQAFLTTNTEEWDMNLRQQEPFQVPTLASHVFNNSSNSNIDTVISYNLPALIEGNVDNIVHNENSNVQDGEMASTFECLKRQELSYDQWDDSQQCSNFFFWDNLNINVEGSSLVGNQDPSMNLGSSALSSSFPSSF

[0452] SEQ ID NO:25

[0453] 拟南芥MYB85(At4g22680)核酸NM_118394

[0454]atggggagacagccatgctgtgacaagctaggggtgaagaaagggccgtggacggtggaggaagataagaagcttataaacttcatactaaccaatggccattgttgctggcgtgctttgccgaagctggccggtctccgtcgctgtggaaagagctgccgcctccggtggactaactatctccggcctgacttaaaacgaggccttctctcgcatgatgaagaacaacttgtcatagatcttcatgctaatctcggcaataagtggtctaagatagcttcaagattacctggaagaacagataacgaaataaaaaaccattggaatactcatatcaagaagaaacttcttaagatgggaatcgatcctatgacccatcaacccctaaatcaagaaccttctaatatcgataattccaaaaccattccgtccaatccagacgatgtctcagtggaaccaaagacaactaacacgaaatacgtggagataagtgtcacgacaacagaagaagaaagtagtagcacggttactgatcaaaacagttcgatggataatgaaaatcatctaattgacaacatttatgatgatgatgaattgtttagttacttatggtccgacgaaactactaaagatgaggcctcttggagtgatagtaactttggtgttggtggaacattatatgaccacaatatctccggcgccgatgcagattttccgatatggtcaccggaaagaatcaatgacgagaagatgtttttggattattgtcaagactttggtgttcatgattttgggttttga

[0455] SEQ ID NO:26

[0456] 拟南芥MYB85(At4g22680)蛋白NP_567664

[0457] MGRQPCCDKLGVKKGPWTVEEDKKLINFILTNGHCCWRALPKLAGLRRCGKSCRLRWTNYLRPDLKRGLLSHDEEQLVIDLHANLGNKWSKIASRLPGRTDNEIKNHWNTHIKKKLLKMGIDPMTHQPLNQEPSNIDNSKTIPSNPDDVSVEPKTTNTKYVEISVTTTEEESSSTVTDQNSSMDNENHLIDNIYDDDELFSYLWSDETTKDEASWSDSNFGVGGTLYDHNISGADADFPIWSPERINDEKMFLDYCQDFGVHDFGF

[0458] SEQ ID NO:27

[0459] 拟南芥MYB46(At5g12870)核酸NM_121290

[0460]atgaggaagccagaggtagccattgcagctagtactcaccaagtaaagaagatgaagaagggactttggtctcctgaggaagactcaaagctgatgcaatacatgttaagcaatggacaaggatgttggagtgatgttgcgaaaaacgcaggacttcaaagatgtggcaaaagctgccgtcttcgttggatcaactatcttcgtcctgacctcaagcgtggcgctttctctcctcaagaagaggatctcatcattcgctttcattccatcctcggcaacaggtggtctcagattgcagcacgattgcctggtcggaccgataacgagatcaagaatttctggaactcaacaataaagaaaaggctaaagaagatgtccgatacctccaacttaatcaacaactcatcctcatcacccaacacagcaagcgattcctcttctaattccgcatcttctttggatattaaagacattataggaagcttcatgtccttacaagaacaaggcttcgtcaacccttccttgacccacatacaaaccaacaatccatttccaacgggaaacatgatcagccacccgtgcaatgacgattttaccccttatgtagatggtatctatggagtaaacgcaggggtacaaggggaactctacttcccacctttggaatgtgaagaaggtgattggtacaatgcaaatataaacaaccacttagacgagttgaacactaatggatccggaaacgcacctgagggtatgagaccagtggaagaattttgggaccttgaccagttgatgaacactgaggttccttcgttttacttcaacttcaaacaaagcatatga[0461] SEQ ID NO:28

[0462] 拟南芥MYB46(At5g12870)蛋白NP_196791

[0463] MRKPEVAIAASTHQVKKMKKGLWSPEEDSKLMQYMLSNGQGCWSDVAKNAGLQRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGAFSPQEEDLIIRFHSILGNRWSQIAARLPGRTDNEIKNFWNSTIKKRLKKMSDTSNLINNSSSSPNTASDSSSNSASSLDIKDIIGSFMSLQEQGFVNPSLTHIQTNNPFPTGNMISHPCNDDFTPYVDGIYGVNAGVQGELYFPPLECEEGDWYNANINNHLDELNTNGSGNAPEGMRPVEEFWDLDQLMNTEVPSFYFNFKQSI

[0464] SEQ ID NO:29

[0465] 拟南芥MYB83(At3g08500)核酸NM_111685

[0466]atgatgatgaggaaaccggacattactacgatcagagacaaaggcaagccaaatcatgcatgtggtggtaataacaacaaaccgaagctaagaaaaggactttggtcgcctgatgaagatgagaagctgataagatacatgttgactaatggacaaggatgttggagtgacatcgctagaaatgctggtcttttacgttgtggtaaaagttg 
tcgccttcgctggatcaattacttgaggcctgatcttaaacgtggatccttctctcctcaggaggaggatctcatcttccatttgcattccattcttggtaacaggtggtctcaaatagctactcggcttccaggtagaacagacaacgagatcaaaaacttttggaactcgacattgaagaagcggcttaagaacaacagcaacaacaatacttcatcaggatcatcacctaacaatagtaatagtaattccttggacccaagagatcaacatgtggatatgggaggcaactcaacttcattgatggatgactatcatcatgatgaaaacatgatgacagtggggaacaccatgcgcatggactcttcctccccattcaatgttggaccaatggttaatagtgtgggcttaaaccaactttatgatcccttgatgatatcagtgccggataacggatatcaccaaatgggaaacacagtgaatgtgttcagcgttaatggtttaggagattatggaaacacaattcttgatccaattagcaagagagtatcagtagaaggtgatgattggttcattcccccctcggagaataccaacgtcattgcttgtagtacaagcaacaacctaaacttacaggcccttgatccttgcttcaatagcaaaaatctttgtcattcagaaagcttcaaggtagggaatgtgttggggatagagaatggttcttgggaaatagaaaaccctaaaatcggagattgggatttggatggtctcatcgataacaactcttcttttcccttccttgatttccaagtcgattga

[0467] SEQ ID NO:30

[0468] 拟南芥MYB83(At3g08500)蛋白NP_187463

[0469] MMMRKPDITTIRDKGKPNHACGGNNNKPKLRKGLWSPDEDEKLIRYMLTNGQGCWSDIARNAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGSFSPQEEDLIFHLHSILGNRWSQIATRLPGRTDNEIKNFWNSTLKKRLKNNSNNNTSSGSSPNNSNSNSLDPRDQHVDMGGNSTSLMDDYHHDENMMTVGNTMRMDSSSPFNVGPMVNSVGLNQLYDPLMISVPDNGYHQMGNTVNVFSVNGLGDYGNTILDPISKRVSVEGDDWFIPPSENTNVIACSTSNNLNLQALDPCFNSKNLCHSESFKVGNVLGIENGSWEIENPKIGDWDLDGLIDNNSSFPFLDFQVD

[0470] SEQ ID NO:31

[0471] 拟南芥MYB58(At1g16490)核酸NM_101514

[0472]atgggcaaaggaagagcaccatgttgtgacaaaaccaaagtgaagagaggaccatggagccatgatgaagacttgaaactcatctctttcattcacaagaatggtcatgagaattggagatctctcccaaagcaagctggattgttgaggtgtggcaagagttgtcgtctgcgatggattaattacctcagacctgatgtgaaacgtggcaatttcagtgcagaggaagaagacaccatcatcaaacttcaccagagctttggtaacaagtggtcgaagattgcttctaagctgcctggaagaacagacaatgagatcaagaatgtgtggcatacacatctcaagaaaagattgagctcggaaactaaccttaatgccgatgaagcgggttcaaaaggttctttgaatgaagaagagaactctcaagagtcatctccaaatgcttcaatgtcttttgctggttccaacatttcaagcaaagacgatgatgcacagataagtcaaatgtttgagcacattctaacttatagcgagtttacggggatgttacaagaggtagacaaaccagagctgctggagatgccttttgatttagatcctgacatttggagtttcatagatggttcagactcattccaacaaccagagaacagagctcttcaagagtctgaagaagatgaagttgataaatggtttaagcacctggaaagcgaactcgggttagaagaaaacgataaccaacaacaacaacaacagcataaacagggaacagaagatgaacattcatcatcactcttggagagttacgagctcctcatacattaa

[0473] SEQ ID NO:32

[0474] 拟南芥MYB58(At1g16490)蛋白NP_173098

[0475]MGKGRAPCCDKTKVKRGPWSHDEDLKLISFIHKNGHENWRSLPKQAGLLRCGKSCRLRWINYLRPDVKRGNFSAEEEDTIIKLHQSFGNKWSKIASKLPGRTDNEIKNVWHTHLKKRLSSETNLNADEAGSKGSLNEEENSQESSPNASMSFAGSNISSKDDDAQISQMFEHILTYSEFTGMLQEVDKPELLEMPFDLDPDIWSFIDGSDSFQQPENRALQE种子EVDKWFKHLESELGLEENDNQQQQQQHKQGTEDEHSSSLLESYELLIH

[0476] SEQ ID NO:33

[0477] 拟南芥MYB63(At1g79180)核酸NM_106569

[0478]atggggaagggaagagcaccttgttgtgacaagaccaaagtgaagagaggtccatggagcccagaagaagacattaaactcatctctttcattcaaaagtttggtcatgagaactggagatctctccccaaacaatctgggctattgaggtgtgggaagagttgtcgtctaaggtggattaactatcttaggccagatctgaagcgtggcaacttcacttcagaggaggaagaaacaatcattaagcttcaccacaactatgggaacaagtggtcgaaaatcgcttctcaacttccaggtagaacagataacgagatcaagaatgtgtggcacactcatctaaagaaaagactggctcagagctcaggaactgcagatgaaccggcctcgccttgttcgagtgattctgtttctcgtgggaaagatgataagtcatctcacgtagaagattctttgaacagagagactaatcataggaatgagttgtctacatctatgtcttctgggggttccaaccaacaagatgatccaaagatagacgaactcaggtttgagtatatagaagaagcttatagcgagtttaacgacattattattcaagaggtagacaaacccgatctgctggagataccatttgattcagatcctgacatttggagtttcttagatacttcaaactcatttcaacaatccactgcaaatgagaacagctcaggctcaagagcaacaacagaagaagagtctgatgaggatgaggttaagaaatggttcaagcacctagaaagcgaactcgggttagaagaagacgataatcaacaacaatacaaagaagaagaatcatcatcatcatcactcttgaagaactacgagctcatgatacattga

[0479] SEQ ID NO:34

[0480] 拟南芥MYB63(At1g79180)蛋白NP_178039

[0481] MGKGRAPCCDKTKVKRGPWSPEEDIKLISFIQKFGHENWRSLPKQSGLLRCGKSCRLRWINYLRPDLKRGNFTSEEEETIIKLHHNYGNKWSKIASQLPGRTDNEIKNVWHTHLKKRLAQSSGTADEPASPCSSDSVSRGKDDKSSHVEDSLNRETNHRNELSTSMSSGGSNQQDDPKIDELRFEYIEEAYSEFNDIIIQEVDKPDLLEIPFDSDPDIWSFLDTSNSFQQSTANENSSGSRATTEEESDEDEVKKWFKHLESELGLEEDDNQQQYKEEESSSSSLLKNYELMIH[0482] SEQ ID NO:35

[0483] 启动子pIRX8

[0484]ACGAGCTGACTTGTACCGATGAGCTGGCTCTTCTGGGCGAGCTGGCTGATCTTGACGAGCAGACTTCTCCCGACGAGCTGACTTGTGTCGATGAGCTGGCTCTTCTGGGCGAGTTGGCTGATCTTGACGAGC 
AGACTTCTCCCGACGAGCTGACTTGTGTCGATGAGCTGGCTCTTCTGGGCGAACTGGCTGATCTTGACGAGCAGACTTCTCCCGACGAGCTGACTTGTGCTATCCTTTCTCCAGGTCTCGAAAAAGTCCCCTTTCCCGAGACTTTCTATTCCTTATTTATACCCGTCCGTATAGTAGGGTACGCAAGGTGAATTCTCGAGAGTGCCCCTTTTCTACGCAGCCGAACTCACATCCTGACCAGGCCGGGCTTCGGCCTGGTGGGCCGGCTCGAGTTCTAAAGTGATGGTCGGGGCTGGGTCGTTATTCCTTGAAATGGGCCGGTTGATCACTGAGGCCCAATTGATGTATCAACATGTGGTTTTTATAAAAAGAGTCGTGAGAAGAGTTTTCTCTAAAAATCCCTTGTGTTTGGTAATCAAACTTCATTCAACCAACGAATTCCAAAAAAACAACTAAATTGTTCGGGTATATAAAATGATTGGTAATGATATATCCCATAGAGGCCGTAGACATAGGCCCAAAAAGTTTCCATAACTAGCAGAAATTGAAACTTGCAAGTTGCAAATATTATTACACTGGAAAGGCAACAAGTCTTGAAGTACAAACTACAAAGACTTCTTGTTTGGATGGGGACGACTGACGAGTTTGAATAACTTAAGAGAAAAGGGTCGCAATCGAAATTAGACAAGAAATTAGTCCTCAAAAAGTAAATTCTGAAGTTGAAGCTCCAATGTCTTTGTTCAAAGACTTTATTTAGATGTAAAGTTATGTCTTGTAACCACCAAACAGCTCCTTTTCATCTACACTCCCAATTTTTTTAACATCTATGTTTTGCATTGCCTTTGACTTGTCTTTCTCTCTCCAACTTCTCTCCTTCAACATAAAGCCAAATCCTAAATCCAAATCCCTTAAACCGAACCGAATTAAACCGAAGCTGTTGAACTATCGCAAAATTTCAGATCTTACTAATCATAAACATGTGACGTTTAATTCATTTTAAGAGTTTCATGATTTGCACTGAATGGTATTCCGAGTCCACCGGAAAAAAACTTTTCCTACAAGTAGAAAAAGGATAACCCCATAAATCCAAATAACCTAACCGATCAAACATATACCAATATAAACCAAAACAAGATTCAGATTCATCGGTTTAGTAATCGAAGTAATGTACTAATGTGTAATATTGATTCCACCACCAGCTTAGAGATTCGAACCAAAAACCGAATAGCGCATAACCGAGAAAACCCAAAGCTTCCTAACAAATACATAAAACCGTGGTGTTTCTAATTCTAACCAACACACGTTTCCTTTTTATTCACAAGAAACATCAGAGTTATGATCTGCCATTAATAACCTAAACACAAAGCAAGGTTAGGTAAATGATATGGACCCCTAATGAATAATCATACAATACATAACAACGTAAGATCCAGTTTCCCTCTTCG

[0485] SEQ ID NO:36

[0486] 启动子pVND6

[0487]CGCCAAAAAGATGTTATGATGTGATGCATTCTTTAATATAGATTAAACTATTGGTGATTTGTTTTTCTATAGTTAATCACTAGCAAGAACATTTTTCTTTTATGTTTACAGTTTTTAGATTATAAAAAAATGGTGTAATAAGAACATGTCAAATCAAATGTATTTAATTTGTTAATATAGATTTGTGTATAAACAATTGGTAGTTTTGATAATTCAATTTTTCAGCAATCATCATAATAATACTTTACAAGAAAAGCTAAATCATCTGAAAATTTTATATGAATACGTACGGTTTAATTCCCAATCTACAACTTTTTTAGTTGGATTTATTATAACCGTTTTTCTAAAACAAAACACATTAAAATTTATAAGTGAAGATCCAATGGGTTCAAACCTTTTAATTCTCAATAAATATACATAGATTCTCGAAGATATCCTATCAACTTGTAAAAGTTGTTTAATCAATCTTTTGTTTGATGAAATCTTGTTCAACTGTTGATTTGGTTAAGTTTTATAGCTGAAATGTGTATAAGTGTTTCTGAACCTTTTTAATTACTGCTAAATCAATTTATGTCTTACAAACTTGCCGATGTATCATGTATGTTCATTAGGGGTGTCAAAATGAGCCAGCTCGCTCAGCTCAGCTCATGATGAACTTAAATCTTTTATGAGCCAGCTCAGCTCAACTCATTTATTATATGAGCTTCAAAATACAAACTCGGACTCAGATCATCTAGATCACGAGCTAAATGAGGTAGTTCGCGAGCTAATGCAAATAAATGAAAAAATTTAAATTTTCTAAAATTTTTATGTAAATTATATATTTTTAAAAATATATTTCTATTTTTATAGATTATATAAATATTTATGTTTTGATTGTTGACTTTTTGTGTTTATTACTAATATTTATTTTCAGAAATTATTATGTAACTTATATATTTTCTAAAATATATTTCTATTATTTATAGAAAAATATATATATACTTTGATTGTTAGTTTTTTGTATATATTACTTCAAAAAAGCCAAACTCATGAGCTAGCTCATGTTCATTAAAGCTCGCTCATATAACTCGTGAGCTAAATAAAGTTCGATCACTAAACTCATTTATTAAATGATCCTAAAAAATAGAATTCGCGCTCATGAATAACTGAGTCGAGTTGAGCCAGCTCATGAGCTATCAGCTCATTTTGACACCATTAATGTTCATATAATAATCGTAATCCATCATGACCAATTAGGCAATTAAGACATACTATAACAAAACATTTTTTTTTTTTTCGTCAAACATTGTTTTGTTAAAGGTTTCAAAAAGAACATGCGTATCAATTTCACCAAACGAATCTAATAAATAGCACGACCATCGGATATTATATTGCTATTTGACGATCAACGTACGTTCGATTAAAAAAAGTACGGGGATTGTTTAGTTTAATCCAAGTGTAGTGTTATTTAGACTTCGAGTAACATCAACGCGGGAGAAGAAACGCATGGGATGAATGTGTAAAGTGGTTAACTTTCAACAATGTTTCTTAATTGCTAAGATGTTTAAAACGAGTTTACATGAATTCTTGTGTTACTTATCGAATTATCTTTTATGAGATAATTAGTACACTACCTTATTAGGGCTCCATTTCTTTTTCTATCTAGGCCTAGGTCGATCAGTACTGTGTATGTTACACATATGATATTAAAAAAAAAATTGATTCTATAATAATCTTCATAACTAAAGGCAAGTATAGTTTATTTGAAAACGTCTCATTCAATAGTTGGTAGAGATAGTTCTAAAAGATCACATTACTTCTCTATCACACAGAGTGTAGAAAAGTGAAAACTTATGCAACACTTCAGGTAGAAAGAGAAAAGACAGTGATAGCTTAGTTATAATTAAAGACCCCCAAAATCCAAATAGAATCTTCTCTTAAATAAACTATTGAAAAAATATTCACAAAAAAATAAAAAGCACATTTCCTTTTGCTTGCATCACGAGAGCTTTTGTCTCTCTTTACATTTATGTGCCTATATATAAGCCTAGAGAATCCACCATCATCGGAGTACTCGTTGTCTTTCATGATCTCAACATAAACAAGACAAAACGCTTTTGTCTCTTGTCTATCTAAATTAAATCTACGAGGAAACGAAGAGAAGCAACAAAATTCGATATTTTAGAAGTCTTGCATAAATAAGAAGAAGGTTTCAAGTAAGTTTCTTTCAGTACATAGAGAAACCATGTATATGATTTATGATTGTCAAGATGTTACACAGTCGTATATATAATTATAAGTATTTCATAAAAGTAATTTATGAAACCATGCACATAACTAACTTTTGTTTTTGATTTTGTAAATTGAGTAGTTTTTGTTTTTATTATCATTTTTATGTGTTTATAG T T G G T T C A G C C G A G A T A T T A T G A G T A A C C A 
AACGTAACCTTTTTCATAATGAAACGGATCAAATATACTTTAATCTTTTTCCTACATATGCTTAGTTACTTGAAAACTTGATTTCACATTACTTCTATGCATATCTTTTCTATGTACCGCGCGATGATAAAGTATGTGTTACAAATTGCCACATTGCAGAAAATATAAAATTAAAAAGATCAAATGGAAAGTCTCGCACAC

[0488] 示例性的SHN1蛋白序列和登录号

[0489] 图例：At：拟南芥，Pt：毛果杨，Mt：蒺藜状苜蓿，Os：水稻，Bd：紫短柄草，Zm：玉米，Sb：两色高梁，Hv：大麦，Ps：西加云杉，Sm：江南卷柏，Pp：小立碗藓

[0490] SEQ ID NO:37 AtSHN1_At1g15360_NP_172988

[0491] MVQTKKFRGVRQRHWGSWVAEIRHPLLKRRIWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPLNNNNTGETSEGKTDISASSTMSSSTSSSSLSSILSAKLRKCCKSPSPSLTCLRLDTASSHIGVWQKRAGSKSDSSWVMTVELGPASSSQETTSKASQDAILAPTTEVEIGGSREEVLDEEEKVALQMIEELLNTN

[0492] SEQ ID NO:38 AtSHN2_At5g11190_NP_196680

[0493] MVHSRKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEAAARAYDQAALLMNGQNAKTNFPVVKSEEGSDHVKDVNSPLMSPKSLSELLNAKLRKSCKDLTPSLTCLRLDTDSSHIGVWQKRAGSKTSPTWVMRLELGNVVNESAVDLGLTTMNKQNVEKEEEEEEAIISDEDQLAMEMIEELLNWS

[0494] SEQ ID NO:39 AtSHN3_At5g25390_NP_197921

[0495] MVHSKKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFDTAETAARAYDQAAVLMNGQSAKTNFPVIKSNGSNSLEINSALRSPKSLSELLNAKLRKNCKDQTPYLTCLRLDNDSSHIGVWQKRAGSKTSPNWVKLVELGDKVNARPGGDIETNKMKVRNEDVQEDDQMAMQMIEELLNWTCPGSGSIAQV

[0496] SEQ ID NO:40 PtSHN1_XP_002324652

[0497] MVQSKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDQAAILMSGRNAKTNFPIPQTSNEEDPKSSDEASLPTPPNGLSEILHAKLRKCSKAPSPSMTCLRLDTENSLIGVWQKRAGERSDSNWVMRVQLGQRESQVSESTLPLPQSSGGVSEPELRAEMGEDERIALQMIEELLNRNCPSPSFGVQDHGDGSLFL

[0498] SEQ ID NO:41 PtSHN2_XP_002308080

[0499] MVPSKKFRGVRQRRWGSWVSEIRHPLVKRRVWLGTFETAEEAARAYDQAAILMSGRNAKTNFPMPQTSNEDDPKSSDHQPSLTTPPNGLSQILHAKLRKCSKAPSPSMTCLRLDAENSIGVWQQRAGQRSDSNWVMTVQLGKRDESQVSESALPLPDQSPGGISGPEWREEMDKEERVALQMVEELLNRNCPSPPFGVQDHDDDSFFL

[0500] SEQ ID NO:42 PtSHN3_XP_002327422

[0501] MVQSKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFDTAEEAARAYDEAAILMSGRNAKTNFPVVANQTRNGQNSPSSSSALSAKLRKYCRSPYPSLTCLRLDAENCHIGVWQKRAGPRSVSNWIMTVELGKKDGRQAPEQKILISDTSDMAGQEGGSDDGPDDEERVALQMIEELLNR

[0502] SEQ ID NO:43 PtSHN4_XP_002324859

[0503] MVQSKKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEAAARAYDQAAILMNGQNAKTNFPTSHLDQDTNLGKDNNSPLPAKALAELLNSKLRKCCGKDPSPSLTCLRLDNDNSHIGVWQKKAGSRSSSNWVMKVELGNYNKKTESSPTVEIEPENGTEEEDRIAMQMIEELLNRN

[0504] SEQ ID NO:44 PtSHN5_XP_002309625

[0505] MVQSKKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEAAARAYDQAAILMNGQNAKTNFPASHLDQDTKLGKDNNSPLPAKALAELLYSKLRKCCGKDPSPSLTCLRLDNDNSHIGVWQKKAGSCSSSNWVMRVELGNSNRKSTQVMEELRPSLSSESSSRVEIEPEINGTDEEDKIAMQMIDELLNCN

[0506] SEQ ID NO:45 MtSHN1_XP_003609337

[0507] MVQSKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDQAAILMSGRNAKTNFPITQTSEGDPKSITSNENKPSTSKDLEEILHAKLRKCSKVPSPSMTCLRLDTENSHIGVWQKRAGKCSESNWVMTVQLGKKMSVTQDSGSSSSSVAPSSAVATEEEIVRGEIDEEDRIALQMIEELLNDKNCPSPSINNIKQGDDIDNSFFL

[0508] SEQ ID NO:46 MtSHN2_XP_003597892

[0509] MVHSKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAAKAYDEAAILMSGRNAKTNFPINVENQTNSISSSSTSSKAFSAVLSAKLRKCCKFPSPSLTCLRLDAENSHIGVWQKGAGPRSESNWIMMVELERKKSASVPEKAKPEELSKNGLDDEQKIALQMIEELLNRN

[0510] SEQ ID NO:47 MtSHN3_XP_003604418

[0511] MVKSKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAILMTNSNNKTFATSSSTSTKPNTSLSAILSAKLRKCCKSPSPSLTCLRLDTENSHFGVWQKRAGPRSDSSWIMMVELERKKKEQEEESEVLPNSDSETLASVVDNEDSEKAVKPENEDEEGNDKNKGLDEEQRIALQMIEELLNRN

[0512] SEQ ID NO:48 MtSHN4_XP_003603408

[0513] MVQQTKKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEAAARAYDQAAILMNGQSAKTNFPVTKNQGEEVASDTPYNGGGGDDSFLSPKALSELLSTKLRKYCKDPSPSLTCLRLDNDNSHIGVWQKRAGPHSDSNWVMRVELGGKKKTIESEEIGSKQHTIDGGNNSNADNENRVVVEEEERVALQMIEELLNWNYPCGSTSSN

[0514] SEQ ID NO:49 MtSHN5_XP_003588762

[0515] MVQRNKFRGVRQRQWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEAAARAYDQAAILMNGKNAKTNFPIPKDQTEDANSLTPNCDDNNNSFHTSNALSHLLKQKLTKCCQKQSQSLTCLRLDADNSHIGVWQKGAGSHSDSNWILRVELGKKHEDSHESNYVSSSEKSAPNNSTIVGDCAEKNGIEHEEDIVTMQMIEELLN

[0516] SEQ ID NO:50 OsSHN1_NP_001046226

[0517] MVQPKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPVQRNSTGDLATAADQDARSNGGSRNSSAGNLSQILSAKLRKCCKAPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSNWVMTVELNKEVEPTEPAAQPTSTATASQVTMDDEEKIALQMIEELLSRSSPASPSHGEGEGSFVI

[0518] SEQ ID NO:51 BdSHN1_XP_003563662

[0519] MVQSKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAILMSGRNAKTNFPVPRSATGEIIVAPAAARDSRGGGLGSSSGAGSLSQILSAKLRKCCKTPSPSLTCLRLDTEKSHIGVWQKRAGTRADSSWVMTVELNKEPAAAATTTTLSDSVAPTTPSTSSTSASTAGSPPVGMDDEERIALQMIEELLGGSSPNSPSHGLLQGEEGSFVI

[0520] SEQ ID NO:52 BdSHN2_XP_003571428

[0521] MVQPKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPVQRSSTGDPAPAAGRDVRGGNGGGSSSSSMSNLSQILSAKLRKCCKAPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSNWVMTVELNKGVGLPSDVEAQSTISTATTSSSVSTMDDEEKLTLQMIEELLSRSGPVSPSHGEDEGDFVV

[0522] SEQ ID NO:53 ZmSHN1_NP_001148685

[0523] MVQPKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPIQRSSTGEPTPAAGRDARSNFSSGSSTTNLSQILSAKLRKCCKAPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSNWVMTVELNKDAASTDAASQSTSATTAPPATPMDEEERIALQMIEELLSSSSPASPSNGDDQGRFII

[0524] SEQ ID NO:54 SbSHN1_XP_002451740

[0525] MVQPKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPVQRSSTGEPTPAAGRDAHSNAGSGSSTANLSQILSAKLRKCCKAPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSNWVMTVELNKGAASTDAASQSTSATTAPPATPMDDEERIALQMIEELLSSSSPASPSHGDDQGRFII

[0526] SEQ ID NO:55 SbSHN2_XP_002438651

[0527] MVQSKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAVLMSGRNAKTNFPVPRTATGELAPVPAARDARGGGGSSSAAAAPGGGTSNLSQILSAKLRKCCKTPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSSWVMTVQLNKDVPPPASSSGEEPVPSDGGAAATTPTSTSTSSTVTTTGSPPPAMMMDDEERIALQMIEELLGSSHSHGMFQGAAGSIVI

[0528] SEQ ID NO:56 HvSHN1_BAG12386

[0529] MVQSKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAILMSGRNAKTNFPVPRSANGEIIVAPAAAARDIRGGVGSSSSGAAGASSLSQILSAKLRKCCKTPSPSLTCLRLDTEKSHIGVWQKRAGARADSSWVMTVELNKEPAAAAPPTPSDSTVS

[0530] SEQ ID NOP:57 PsSHN1_ABK22668

[0531] MARPQRYRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKTRIWLGTFETAEDAARAYDEAARMMCGPRARTNFPFNPNAPQSPSSKVLSSTLTAKLHRCYMASMQGPRSGSSKKDSMARADKNNNIHSGNQSLTCLRLDNERSNNIGIWQKKSGSKQSESNWLMKLELDHDQHGNSTLKRETDDDIAQMIEELLDCGSLEICSPIASADSNINSAESMLN

[0532] SEQ ID NO:58 SmSHN1_Sm92334_XP002969836

[0533]MGRPQRYRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKTRVWLGTFETAEDAARAYDEAARLMGGPRARTNFPYDPNAPPHPSSSTLLSTLSAKLNRCFSSSSSSSSCSTDPHKKDPRVSQSLTCLRLDPEQSNLGIWQKKSGRQPESNWVMKVHFGSQGGGGVSSDIVLPTDNPAPPQPIEHKKMKSEEDLATEMIEELLNFPDSSSPSSSTSSSEAKNPNFSSSDLLHHIL V[0534] SEQ ID NO:59 PpSHN1_XP_001762992

[0535] MGRPQRYRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKTRVWLGTFETAEDAAHAYDEAARLMCGVRARTNFPYDPNASKRPNSQMLSATLSAKLHRWYLHSQQRDGQEGKSKDARMTQSLTCLCLDAEQSNLGIWQKKTGRQAEANWVRKVQFGDNNSPQTDSPQPENSSESCMSEEDKFAAEMIEELLGYSPGQFSNFGSPAMSDSSCSSSCSAVTTAFE

[0536] 可以用于驱动蜡/角质APFL中的转录因子表达的蜡角质基因的示例性启动子序列：

[0537] SEQ ID NO:60 pAtCER1_At1g02205

[0538] TGGGATCCTCTCCATCGTTTCCATCATGGGATACATTACTTACATTGACTTCATGAACAACATGGGACATTGCAACTTCGAGCTTTTCCCTAAGCGTCTCTTCCACCTCTTCCCTCCCCTCAAGTTCCTCTGTTACACCCCCTCGTACGTCGTTTGTAAAAACACTACTATTTATTTGGATTTGAATATATGCATGCATTTATAACATGGCATCAAATATGTTGAAGGTTTCACTCGCTCCACCACACGCAGTTCCGGACCAACTACTCTCTGTTCATGCCAATATACGACTTCATCTACGGGACGACTGATAATTTGACCGACTCACTATACGAGAGGTCGTTGGAGATAGAGGAAGAATCACCCGACGTCATCCACCTCACTCACCTCACCACACACAACTCCATCTACCAAATGCGCCTTGGTTTCCCGTCCCTCTCCTCTTGCCCCTTGTGGTCTCGACCCCCATGGTACCTCACATGCTTCATGTGGCCCTTCACTCTCCTCTGCTCATTTGCCCTCACTTCAGCTATCCCTTTGCGCACCTTTGTCTTTGAGCGAAACCGTCTCCGTGACCTCACCGTTCACTCTCACCTCCTTCCCAAGTTTTCCTTTCACGTAAGCATTTTACACGCATGCATATGCACTTTCCCTCTCTCTCGCTCTCTTGACACAAACGGGTTTACTTATTATGTTGTACTTCACACCACTATTTTCCAAACTTTCACACACAAAAAAAACATTGATTCTCACTTAACTTGTACGTACTACGTAGGAAGGACATAACCTTTTATACAAAAAGAAAATTAAAACAACCTAAAAATGAACAATGAACATTTTCTTGTGGGTATACCTTTTGTAAGTTGCATCTAAAGTTTATTAATAATTTTGCCTCATAAACATGCGGCGGTAGTATAAATCACAGCGCCACCATGAGTCCATCAACACTATCATAGAGGAAGCTATCCTTGAAGCAGATGAAAAGGGTGTGAAAGTAATGAGTCTTGGCCTGATGAACAATGTAAGTTTATTTACTTCAAATCCCCCTAAATATATATGAATCACTATTGGATAAGTACTGTAACTAATTACACACGCTGGCAAAAGAAAAAAGTAACTAATCAACACACAATTAATTAATGAGAGGGAGGAACTAAACGGGTCTGGAGAAATGTACGTGCAAAAGTATCCGAAGTTGAAGATAAGACTAGTGGACGGGAGCAGCATGGCAGCTACGGTGGTTATCAACAATATTCCAAAGGAAGCCACGGAAATTGTCTTTAGAGGAAATCTCACAAAGGTGGCTTCGGCTGTTGTCTTTGCTCTGTGCCAAAAGGGCGTCAAGGTTTGTGAATATATGAGGGAATTGGAATATATATACTCAGCTTCTCATATCAAACAAAAAATAATGTAGTAATGTGTATATATAGGTGGTCGTGTTACGCGAGGAGGAACACAGCAAACTCATCAAATCTGGGGTTGACAAGAATCTGGTACTGTCTACAAGCAATAGTTATTACTCCCCAAAGGTGTGGTTGGTGGGGGATGGAATAGAGAACGAAGAGCAGATGAAAGCAAAAGAAGGAACCCTCTTTGTTCCCTTTTCTCACTTTCCGCCCAACAAACTCCGCAAGGACTGTTTCTACCAGTCCACTCCAGCTATGCGTGTTCCCAAGTCTGCCCAAAACATCGACTCCTGTGAGGTACATCTTTGAATTCTTATAGATATATCTGTAACTTTTATATTATATAAGCTGATAGATGTGTTCATCTATAATGAATGAATGGTTGTTATATATATATAGAACTGGCTGGGGAGGAGGGTGATGAGTGCATGGAAAATAGGAGGTATAGTGCATGCACTTGAGGGTTGGGAGGAGCATGACTGCGGCAACACTTGCAACGTCCTCCGTCTCCACGCCATATGGGAAGCTGCTCTTCGCCATGATTTCCAACCTCTCCCACCATCTCCTCTATGAGCTTTTTTCATATTCATACATCTATGTCCCCTTTCTTGATTATATCTACTTCCCTTCCATCATTGTTTGCTGTTTACTATGTTTTTCTATCGACAATATATAAGTACCCTTGTTACCCTTGGTGCCACGTGCTTCATATATGTTAGAAAGGGCAAAAAAATTCGTCGTATGATATGCTTAGTTAAATTTTATAAAACTCAATAAAAATCTTCAGAAACAGTGCTATGATCATTACATCTTAACTAAGTGATATATATCTGCGTGCCTATTTAACAAAATAAACAAAAAAACAAAACAAAATATATTTGGGTGCATCATCAAATCAAAGTAGTTGCAAAAACTGGACGAGGTTTTTACTTAAATGGTCCTTACCCCGCATGGTCCACTTGCTACCTAATTAAGGATTGGTAGGGTGCGTATACGTATATAAATTGTGGCGGTGGGAGATGGAGTTACTAAAAACGAAACGTACAAGTATTATTCATAGCTCTCGTATAAGGGGTTAGTCCTTAGATCTAGATATTTTCACTTTTCTTTCATTTATGTCGGAGCAACAGACACTAGCTGGCGCTTCAACGTGCATGATCTTGATTGGCTAGTAAATTCCAAGCATCAATACCTAACACATGCCCAACTTGGTTCATTAGTATTCTTTCATTGGTAAAATACCCTTACCTTTCAATAATATCCAGAAATAAATATATGAAGCCATCCATCAACCGGTGCATTTCCTCAAGGCATGGATATGATATCAGAACATCGATGAAGGTGGGAGGGGGTAATTAGCTGAGTGTCATAAATGAGGATCCATGTGGAGATCATCGAATGGTAGTAGTACATGTTTGGTCTTAGCTGGCCCCACCACAAGGAATTGGACTGGTGGGAAGATAGGGGTGGTTACGTCATTCCACATATCTACCAATTAAGGAGTTTAATATAAACCTTGCTATATAATGTACCTTGGCTCACAAGAGTTGAAGAGACACAGTGACGACACAAACATATTACATTCGACGGTATA

[0539] SEQ ID NO:61 pAtCER2_VC2_At4g24510

[0540]ATCGTACTAAAAATCTGGGAAGTACACTGATCCGATGGAAATGAAGGAGAAGATTGTACATTTTATCGTGATGATTCGTCATAAACTGAGACTGGAGAGAGCGAAGCTGAACAGCTTTAGCAGCTGAAGCTGCTTCCTCTTCTGGCTTAGAAGCAT TCC TT GG ACG AC CG TGC AT TC TTC TC CG ACG AC TG TGA GA GA T 
GCGACAGTGTGATTCAACTTTTCCGGTTAAATCTGATCAGAAATTACGAAAACAGTTAAAACAAACACTAGATCGAGGAAAGAAAAAACGTGATCCAAATCTAGAAACAACAGAGATGACGAAATGGAGAATAAGAAGCAGATCACCTGAAAGGAGCACGTTGCGGCGTCGATCGAGAGAGAGAGACTTTTGTTTTCGGGCAATTGAGCGACTGAGAGAAGGTTCTATCGGAAAATTTAATGGGCCGGTTTAATGATTTCAATCGCTTAAACCAGTAAACCGGGTTTAATTGAAAAATACGGTCGAACACTAACCCGGTTTTGGAAGTCTTCGTTTATGTAGTGAAAGGCTTCGTCATCATCGTTGTTTCACAGTTGAAGGTTTTCACGAGAAAGTGAAGATTTTTGGAGAAACCATACTTTTGTGAAGGTTCGTTTCACCTTCAATTTCGTTTTTCCAATTTGGGTATCCGATAATTGTAAGAATTTGGGGTTTTAAGGTCAGATTGATTATGTATCTAATGCTTTTACATTGTAGTAGCTCGTGTTTTGGATTTTGAAGGATTGATTTCTAAATTTCCTTTTGATCTTGTAGTTGAATCACAATGGAAGATTCAGAGAAAAGAAAACAGATGTTAAAAGCAATGCGAATGGAAGCTGCAGCGCAGAATGATGATGATGCTACTACAGGTACTGAAACATCTATGAGCACAGGTCACCTCTCCAATCCATTGGCAGAGACATCCAATCACCAGCAGGATTCATTTGAAACGCAAAGGTTTGATTATTATACCGATCCCATGGCTGCTTATTCTAGTTTCAAGAAAAACAAGACCCCTAAGCAACAATACATCTCATCTCCTAGTCATCAAGGAAGCTCTCCTGTACCACCTCAGTTTCCACCATCAGTTCCTCCAGGTGCTTGTTTCTGCCTTGATAGTCAATGACTCTGTCTTAATTTTTGTTTTGTCTATATTCTTGTGAGGCCAAAGAAAGTAGTCCACTGATAAAGAAGATTGCCTAATATCATGAGAGTTTAACTTACAGTATGTTAGTTGGTCCTTGGTGAGTATAGGTATAGGATTGAACAGAATCAGGAATTCACTTTGGTATTTGGTTGTTGGGCTTTCGTAGAGTTAGGTGATGATTCTCTTCTACAAATCTATATGAAATTTTTGTTCTTTGTTTGGGTTTAGTCATGTGTTCTTGATTATAATCTACAAATCAAGATCAATGGAGGAAGAAATTTGTCTCTCAGTCTCAGGCTTCAAACTTATTAGCTTTAGCTACTTTAATTTGATATATCTCTTTAAGTTTCACTTTCTAGGAATTGACAGTATGAAAATCACATCAATTATGGAATTCAGTTAGGTTTGTGTCCTGTGCCTTGCAATGAACAGTAATCCAGTTCTGATCCTTGCATTATAACTTTGAACAGGATCATTATGTAGTGAGTATCAGGCACAGACCAATCATGGTGGCTTTCATGCAGCTCATTATGAACCAAGAGGGATGGCACATCTTTCACCCTCACACAGAGGTCCACCCGCCGGTTGGAATAACAACTTTAGGCCTCCACCAGTTAACCATTCAGGTCCACCTCAATGGGTACCTCGCCCTTTTCCATTCTCTCAAGAAATGCCGAACATGGGGAATAATAGATTTGGTGGTCGAGGCAGCTACAACAATACTCCTCCACAGTTTTCCAATTATGGACGACAAAATGCAAACTGGGGTGGAAACACGTATCCTAACTCAGGAAGAGGCAGAAGTCGAGGACGCGGTATGAACACAAGCTTTGGGAGAGATGGAGGAAGAAGACCCATGGAACCAGGGGCAGAACGATTTTACTCCAACTCTATGGCTGAAGATCCATGGAAGCATCTTAAGCCAGTCTTATGGAAGAATTGCTCAGATGCTTCGAGCAGCAGCTCAACAGGTCAAGCCTGGCTTCCCAAGTCTATAGCACCAAAAAAATCTGTGACCTCAGAAGCTACCCACAAAACTAGCAGTAATCAGCAGAGCCTTGCTGAGTACCTTGCTGCTTCTCTAGATGGTGCTACATGCGATGAGTCAAGCAATTAATCAGGACAACTGGCCTAGTGAAAATACACCAAGTCCAAGCATCTGAGGTACCTGGAAAGATCACCGTTGACTCTTTCGAACTAGGTATTGTTCAGTGACTTGTGTTTATTTTCTTAACAAGACACAACAGCGAATGATGAACATCTCTGAGGGCGCAATTAGGAGTAGATTGGTTGGCAATAGGGATGTTCTCTACCAAAAATTTTACTGTTTTTTCGCAAGATTTAGTTATCGTACAATTATGTAAAATCATTATCAGGAAATTTGTTGCATGATTGTGTTTGAGGTGGAAATGAACCGCATCCGTATTAAGATCATTTTTGCTGGTGGAAACAATGTTACCAGGAAACTGAACTTGGTTTTTTATAGATTAATGTGACTTGTTAGGTACCGTAATATAATACTAGTTGGCTACGACACGTACATGTGCGTTTATTGCTTGAAGCCAATAAGGACAAGGTGGACGTAATAAAGTGTGCTTGTTGTTGGATGGATCTGAATATGATGACTCAACTGTCCAACTCTAATGTTGTTGCTAAAGACCCAAATCCCACCCACATTTAATGTTGCCGTCACGGAAACAGTTTTCCCAACTGTCCTAAATCAGTGATACCCATGCCTATTCTGAACTCAACTCTCTTTCGAAACTCAATCCTTATATAACACATCCCATTTAAGCCTATAAGCTACACATATCAGCTCTCTCACAAAAATAAA

[0541] SEQ ID NO:62 pAtCER3_WAX2_At5g57800

[0542]ATTTTAAGAAATTAAATCTTTTTTTTTGGTATCTGTGTGTTACTTTTTATAAATGTATTTTGAAAAGTATTATTTCAATTTATAGATAAATATAATTATGACTCTCAAGTGGATTTTTTTTTCACGGTCAATTGGAGTTTGGCTGTGAATCTTGTGAATAATATCAACTAATTAAGAGTCGGCCGATACTCCGTATCTTTGATCACTTTCACCCATATCTTGAAATTTACCAAATGTTTTCTTTCATTGGGGTTTCTATACCTTTTTTTTTTGGTTCTTTCTGTAATTTGGGTTTTAAAGAAAAAACCTATAATTACAAAAAAGGTTAAAAGTTAAAACTAAGCACGTTCAAATATGTTCTTTCGAGATCCCACCTTCCTGTCTATCTTATAAGAAGTCGAACACGTGTGCTCGTTGTGTGAATTAGAGTGGTTATTTCAACATATATAATTAAACTATGTATGTATCATAAATACACTGAATATGTTGGAGTTGGGTCTTGTGGTAGGCTAACTTGTTCGCTTCACTTTGGTTTAGTTTAGCCTTGTAATCGGTGGTTTCATATACTGAAATTTTTAATTTTCTAATATAATCCAGATGACAAAAAAAAATCATAAATACACTGCAATGGCCATTTTTAAAAAAACTTTAAACGAAATATATATACATCACCAAGTATCAAGTAAGTAATTTGGTTGTTTTGATTTTTCAAAAAAACATTTAGGTGATTCTTTTAACAACCAATCATATATGTAGCAAAGATTAATTATGTCAATCTTTTAACGTCACTTATATAGTTTAGCTGTAGTATTATTGTAAGCCAATTGTACGGACTTCGTAACCGTTTCGACAAAGATACAAACTAATCAATGTTTAAGATGGCATAATATTCCGACTTCCCCTGCCACTCGGTAGTACTGCTGCGCCATCCTACAAGAAGCACTCGTAAATGAGTGGTTAGACGGCCAAAAATTAGCAGGATTCAATCCTTGATTAAGAGAT G G T T C A G A T A A G C C C T C T A G G C C T C T A C T C 
GTCACAATTCATATATTAATTGATCACACTGCATGAAATGATAAGATCAAGTCAATTACCTCAAAATTAATTGAAAGATAAAATGATAAAGCAACAAGTAATGATCATATATGGATGTAACAACCTTCTTCATCCATACGAATATGATAATTCTTTTGTCGATCATTTGCCACATCTATTTAACTAAGTATTTTGTACATTAAGATCATTTTGCGAGTATTCCCGCGTTCCCAACAAAAACGAATTGAAAAACTACATAGGGTGAATTTTGCTCTCGTGGCATTAAAGAGAGAGGCTGACATTATAGATTATGATATATTTATTATTTTTCTTAGTAGATTTCTTGACCAGCCTTTAGATATGCTTGCTCTGTCATGGCATAAAGCCTTAAACCCTAAAGCCCTTTACATTTGTACAGTACCAACAATTGTACCCAATGTTAAATGAATGCGGATTAATTTGTGATATGAGACCATCAAAATAAAATACTTATAAGATAGTAGATATATAGAACCGTAACAAAAAGATGAGAAGAAAAAGACAAATTGAATAGAAACTGGACCAAAAGATAAAAGAGTATATGAAGAAGCAAGCCACCAAGAAGTGTAACCATCGTTGCTTCAACTGTAAACCGCACATTAAATGTGTGTGAGAGAAAGAGAGATAGACTCCAGCTGTGAGAGCTACGTCCATTGCATCAATTGGGTTATATGTCGTTAACAATTTTTTAAAAATACATAAATAAATCAATAAAATATTTAGAAAAAATCAATATTATAATGATATTTTGAAGAAGTTAGGTCCATAATGGAAATATAGAGACTTAGTGTCTATTTATCAAGAAATAGTGTCTATTTATCAAGAAATAATGTCTATTTGGTCCACAATTATCATATTTTTTGTGGCCACTCAAACTACGAAAATAATGAATATTGTTAATTTTTGTCTTATTTAAGTCTATAACTAACTTACTAATTCGGTTGAAATTGCTAATATGCATTTTCCTTGGTCCACTATTACAGTGCTACTGCTGTCTTATTCTTGAACACAAAATAAAAAAGATTTCAAACACAAAATATGCATTTTTTTGTTCCACCATTACAAACCTTTATTTGGAGAAGTATACAGTTGGATATTAAATATTTTAATTAAAAAATTGAAAATATTGAAGTTCTTTTTCTCCAGTATTTTGGCTGGAGCAAAACTAAATAAATTCCAAATTAAAAGCTCGAACGGAAAACATTTACTATGCACCAAAATAAATGTTGATATGAAATTTGCATCAGCATATACAGTATGTATGTAGTACAATTGAACAGAGTCAAAATTAATTGTCACTGAAACAGTCAGATTTTATTTCTGTTAAAAAATATTTTCAGACAAAAAATGATTTTTTAACGTTTTTTTATATAATTTTATTAAACCTCAAAACATTCCTCAGCAGATTGTTTTATAATGTTATTATTATTTTTTCTTAAATAATTTTATTTGAATTTCGTTATAGAGAGATAAATAAAAGATTTTTGGGGTCTAGTTGGCTCTCATAGTTTGAATGCTTATATAAGGAAACAGAGCTCGAGGCTCTCAATAATGCCACATAAAACACAACACCAAAGCCTTTATAACTCTTTCTGGGGTTTTTAATTCTCTCAACGAACAAAAAAAAAAACTCAACTAATATTCTCCATCCTCTTTCTTCAGATTTAAGAGAAACCTTATCGTTATATTCTCTCTTCTCTTTTCTTTTTGACTCCCACAAGAAGAAAGCAAATTTCTTTTTCTCAGGATTGCTTGAAAACTGTAGAAATCTTTAAGGTTTTTTTACACCAATAAGAGTCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGATCTATTCATAAAAAAGACAGGTAATCTCAACTCCGAGGAGATAACTGATATAACAATTTGAGAGAATAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGACCAAGCTAAAGA

[0543] SEQ ID NOP63 pAtCER4_FAR3_At4g33790

[0544]TTCTTCAAGGAACAAAGATCTATCTTTTGGTTGCGTTTACATAGTGTTTACGTTCCATGTTATAATTATTAGCTCATATTAGAAACCCAGACGTAAACACAAACAAATAATCATGTCACTATACAGAATTTACCTAGTATAGAAGTCCATGATTTTTGTTCTTTTTACCTTTTAATAGAAAAGTTTTGTTCTTTAGTTTTTTGGGATTTAACATTCGTTTTAATATATCTTGTAGATGTTGCAGAAAAGTGTTGGTGGTAATAAGATAGAGCAAACCTTTCCAGAAAGTACATTGGATTACTCACAAGGCTTCTCGGCTACTCAGTTTCAGGTTTCTCTCTCTTCACTATCTCTCTGTTAGGTTCTGTTGAGTACACGTGACTTGTCTCAAGAATCTCACTATATATGTCTTTGGGTGTTGAAACAAGCAGGACAAAACAGCATTCCAAGAGCAGTGTGGTTATTTGCATATGGAAACCAGATTCTAAATAACCAGTTCAGTAATTTTTTATTATTATTTCTGTAGATGTTCAACTACTTTGTTTATTCTTACTTTATAAAGAATATATCAAATCTGACTAAAATTAACTTTGAAATTCGCTGGTGAAGATCAAACTGATGAAGAGCAGCAGCTATTTTGGACATTTGTGAAGCTTTTATGGATTCAACTTGAATCATTTCAAGCAGTGATTAAAGTGAAACTTTAACGTCCCAAATATGAAAAATAGGAAGGAGTTTTAAGCAAAAGACTGATATAGAACGAAAAAAAAAAAGGGTTCTCAAATCTCAACTGGACTGATTCTTTTCTCTCTTTTGCTTTGTAATTTCGTCACAAACAAGTTTTCCTTGTAGCCGCCTTTATGTAACTCGTGGTTTACAAATTACAACACTTCACTTCCATTGCAATTTTCTTTCATAGTATAACAAATTTCAATGCCTGAATAAGCTTTTTTTTTGTGTGGGGAAAAAAACTTCCAAGAAATATCTAGCAAAACAAATGATCTTAATGGTTCTTTTCAGAGCTGCTAAATTCTCAAAAGAATAATTCGAAGTAGATGACAAAGAGGGCATATTCAAAACTTATAAAGAAACTAATAAAACGTATTACTTTAAATAGAGCACGAAAACCTATATATAACCAAAATGCTAACCCTAAAAGTAACACTTGAAGAATGCGTAACACTAACGCAATAAAAGGGGAAAATAGAAACTTATCAAAATCTGGTTATCGGCTTGTTTTTATAGTCACTCTTCATATGCATCAGTGTTTGAGATTCTGCAGATTGTTGTAGCAGATCATGTTTAAAGTCCGTTATTTGTAGCTCTTTTGAGTTACTAGCGATTTTGGAGGTGTTAACCGGCCCAAGCATGAATAGGCCTGATGGTATTCTGGTCCATCTGAGCTTGGCCGAAGTTAATTGCAAAATTAAAATTAAGTTTATATTATTATGCTTTTGTCTATCTCTTGACTTTAATTAATCTTTTAAGGTTAATTGGTTATTGGTAGTTGAGGGTGTTTCAGTTAACCTTAAATAAAAAACTTAATTGACTTAAATTATAGTAAAAACCAAACCAAACCAAATAGAGATCCAAATTTAAATGTACATAATCTACCACTTTCATAATGTAAAAATCCAAGTGTTATCAGCTGCCGCATTTGTTCTGTCTTCTATATGTCGAATACGAGTACATAAACTACAACTTTGATAATCTAATTTTAGGATTTTAATATGCTAGGCTGTTTTGCGTTTGTCATGAGTAGGGTCGAATCATGCCTTAGCCAGTCGTACTAGTATAGATGGTTGTAAGTTGGATTTGATGACAACTGCTTTGGATTTGATGACAAGTA A C T A C T T A A A A G C A A T G G T T A G G C A G A C A T T A A 
ATAGGTGGTGATCTAATGTCTAACATCTAAAACGTTTTAATTGGAATTTAAACGAGTTTAGATGGTCTAATTAAGCGTTTATTATGTACATAATAGAACGTATAAAATATCATGATTCACAGAAGTAAATTTAAAATGTTTTAATTTTAGAAGTAAATTTAAAATTCAAACTACATCAAAAATTCAATAGAAATCAACTTAAAGATAACCATAAAATCAATTCAATTGACATCAAATAATAGAAGCCATCTACTTTTTATGTTATAAAACTTATAATGAATTTTATGTCATTATAAATCGAAAAACTACACTGAAATGAACAAAAAGTCAAATGACAACAGATTAATGATTATGTAAACTGTATAATGTCGATTAAAACCACATAATGCCATCAATTATTTAGCACCTATCAAATAATTGTCACGGTTGTATATATGGCGCGCCTAGACCGCCACTTAAAGCGCTATTTCAAGTATTGTTACAAACGAAGAAGGTAGGCGGTCTAATTTTTAAGTCTAAAATTAGATATCTTTGGACGCCTCATATTACTTATTGTTTTACTCTGTCGGATCCTATCTCACCCAACCATACATTTGTGGCAACAGAAATTGCCTCCAAATGCAAAAAAAAAAATCATTCTTTCTACTGTTAATACTTCGAAATATACAATTTTTAAAGTTAATATGTGTTTAAATACCATTTTGATCTAAATTTTGTGTTTTGTGTTTCTTTCTATATATATATGTACGTTTTCCATTATATCAGAATCGAATCATATCTAACCATATATGAATTAGTCTCGGTAGTTGTAATTTGGAATATTTATTTCGCTTTTCAACGTTGGTAGGTTCAAAAATACTTAAGTTAAGCCACGTTTAATTTAAATACGTTCATATTTAGAATATGTAGAGTTGAAATTTATAACTTAAGTATATGTTATGGAATTTGTTGACAGCTATTTTAAAGTAGTTGGGACAAAACAAAAATGTAGGTAGGTGCTCACATTAATTTCACCTTGTAAAGCCTAAAACTATAAATCTTAGTAACACATATGTGATATGTCAGTTGTACTCTGTTGCATTATTTCTCTCACTCAAACGTATATACAAACATAAATT

[0545] SEQ ID NO:64 pAtCER5_WBC12_ABCG12_At1g51500

[0546]TATTGTGAAGCTAATTTTTTTGCTTAGTTATGTTGATATCATTTTGCCTTTTGGTTTGTTATAGTGAAGCTTGATTTGTTGGATTGTTGTCATGATGTAATTTAGAGATGAATGCAATACTGTTTTGTCGTAGATGTTGACTTTACTCTTTGACATGCTTTGTGTTAATCAATGTAATACTGAATATCTGAAATTGAGAGCCAAAAATGATAAATTTATCTTTGCAATGTTACATTGCTTTTAAGAGGGAGATGTAATATTCTGTAAAGTGCAATGCTGTTCCCTAAGGACACTTCGTTTAAGTTACTTCAAAGTGTCAGAAATGACGGGTCGAATAAGATAAGCTGTCTTCTAGATGCGAGTTTAGGAATCAAATATTATTTTTCTTTAGTTTGCTTGAGTTCTCATGGAAGTGGAAGTAACACTTTGCTTTTGTTTTTTTTGATAAGGGATATGCTTTGATAGAATATGAGAAGAAGGAAGAAGCACAGAGCGCTATTTCAGCAATGAATGGTGCTGAGCTTCTAACACAGAATGTTAGCGTTGACTGGGCCTTCAGCAGCGGTCCCAGTGGTGGTGAATCTTACAGGAGAAAGAACTCGAGGTTTGTATCCTAATCTCTTTTCTGTTCCGCTACGACTTGTCTGATCTTGTGCCGATATGAAGTCAAGAGTGTCAAAAAGTATCAATTAAGATATAGACTTAGAAGTTTTAACAGTTGACAAGGTAGTATATTGTACTAAGCACCTACCAAACTTTACTGTCTTTATGCTAATGAATCGAAATCACTTGTGACTTGTCAAGTAGTTATACCTTTCTTTAAATCATCATCCATTGATCATTGGGGTTTTACAGGTATGGGAGGTCGCAACGTTCAAGAAGTCCGAGAAGACGTTACTGATTGTATGATTTGGTGGAGAGTTCTCCCCATATCTCTCTGTATTAGGGATTCCCTCTCTTATCTGTAAGGTACTGATGCAAGACGCTGAGTGTTGAACAAATTTTTTTCTGGGGTTTTTGTAGGGTTTGGCTGCTTTTGCATTGGTTTATCTCTTTATGCATTTGCATGGGATTGTTGCGTTTAAACACCATGAGATCTGTTTTAATGCTTTGTATTGGTAAAAGAAGAGAAACATTGGATGAGGAAGAATGTTTTAATTTTCATTCTCTTATTGATTCATATTTAGGTCAGACAGAATTTGAAAATCAAAGACCTTCCATTACACTAGAAAACCAAATATGATTATATAGAAAAAATCAAAGAATTTTCAACCAATGGCATTATTTCACACTGGTTTATTATTCTAGGCGTAACTATTGGTAACCTAAATATGTTAACAGAAATCATCAAATGACTATTAAATATTTTGGCTGAAATTTTCCAATCAATGGCAATATTCACATCGTTTGTTTTTATAGGCGTAACTATTCGTATCCTAAATATGTTAAAAGAAATCATCAAAGGTTTGATGATTTGAGATAGAGCATGTACTTTCTTGCTACTCACAGGTTGCATGATTTCATTTGTACGAATCAATCATCTATACTTTGTGCATTGAGCCAGTCCCACATTATGTTTATGTATCCATCTATTTTAAGGGCTCTCATATACTAACTTACAGCTGAAAAGTATAAATATGAAACAGTTGGAACAGTTATATAAGTTCTGCTTTTGTTGTCACCAACAAAAAAAATGATATGCTTTTACATGATTCCAACAAAAAAAAAACAGTTTTGTATTCTTGTTAATGATGGTGCCAAAGGCTTATAAGACCATACCTTAGATTCTGTTGAATTTAGAATCTGGGTTTCTATCTCTTTTCTGGAAATCTTGTTTCTTTTTGTTTTCTTTTTATACCAAAACTTTGTGAAATCTTAGGTACTTTTGTTTAGTATCAGTTTACTCGTTTAAAAAGAACCAATAAACCTACTAGATATAAATAGTAAGAAGTCTATAACTTAGGGTTGTGTTAAATACTAAACAATGCTTAAAAATGTGGTTAGACATAGCGCTATACTAAAGCTAAAAAGCTAAAGATAACCATAAAATCATGAAGATAATAAATGGACGGATAGACCAAAAAGAAATAATGAAGCATAATACAAAAAAAAAACTATATCGGTTCCAACTACCACACATTTAATTCCTTTCCCTTTTCATTTAACACCTGTGAAGACTCGTTGCGAGGGTTCTCTACCTCTTTATGTCATTCAAACTTATCAATTATCAAGTCTCTTGATTTTACATGTTCAACCAAACACGATTTTTCAAACTTAATTTTATATATCTTCTTCATTAATTATCGAATATCACTTCTCTTGCTTATAGTTACAAAAACTAATACAATGATAATTATATAATTCTATGTGTGAACAAAACGATAAATTTGTCAAAGTATCACTATCAATCCCTTGGAATTAGTAGACAACCAAATATGGATCCTTTAATTGATTTGTGATGTTTCTATTCATTTCGAACTAAATGAAAACATCTCATCGTAAATAATCACACTGTTAAATTTCATTTCACAAAAATATCATTTGATTTCTGTGTGGACGAAATTTCTTGTTAGTTGGCAAGAACCGACATAAAAAATATATTTCATACGTATAATAGTATGTCAATAAGTAGGTGGTTGCTTACTAGTTACTACTACACATGGACGATTGTATAAATATTAGACCT 
CATTCACACAACTCTCACTCTCTTACATTTAATGTGCAAGAAAATAAAAAAAACTATATACTATAGACGTGTATCTATATATGGTTATGATATTAAAGCCATCCATTAAATGTAATTAGTTGTTTGTTGATTGTTGCTCTCAAGTCTCACCTAAAGAAAACCTTAGGCCTACAAAAATTAATCACTATCTTTATAATTCCATCTCCAACCAATATAATAAAAATAACCTAGACGAAGAACAAACAAAACTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTAATAAGTAAGGTTTTGATCTTTTTCAAGATCAAACAAAAACA

[0547] SEQ ID NO:65 pAtCER6_CUT1_KCS6_At1g68530

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[0559] SEQ ID NO:71 pAtKCS2_DAISY_At1g04220

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[0563] SEQ ID NO；73 pAtLACS1_At2g47240

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[0565] SEQ ID NO:74 pAtLACS2_At1g49430

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[0567] SEQ ID NO:75 pAtCYP86A4_At1g01600

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[0569] SEQ ID NO:76 pAtCYP86A7_At1g63710

[0570]CTTCCTTTTATAGCTCCACCTTCATCTCCAGCTTCATTTTTCCAATCAGAGCCACCTTCTGCTACACAATCACCTGTTGGAATCCTCTCTTTTAGTCCTTTGCCTTGTAACAACCGTCCTTCCATCTTCGCCATTGGACCTTACGCTCATGAAACTCAATTGGTATCTCCTCCGGTTTTCTCAACTTACACTACTGAACCATCTTCAGCTCCAATCACACCTCCTCTTGATGACTCATCTATCTACTTAACCACCACAACACCTTCTTCACCTGAAGTGCCTTTTGCTCAGCTCTTTAACTCGAACCATCAAACCGGTAGCTATGGTTATAAGTTCCCAATGTCTTCTAGTTATGAGTTTCAGTTTTACCAACTTCCTCCTGGTAGTCCACTTGGTCAGCTTATTTCCCCGAGCCCTGGTTCTGGTCCAACTTCTCCTTTTCCCGATGGAGAAACCTCGCTGTTCCCTCACTTTCAAGTCTCTGATCCTCCAAAACTGTTGAGTCCAAAGACTGCTGGTGTTACAACTCCTTGTAAAGAGCAGAAGATTGTAAGACCGCATAAACCGGTTTCATTCGATCTTGATGCTGATCATGTCATTAGATGCGTGGATCAGAAGCTAAGAACAACGTTCCCTGAAGCATCATCAGATCAAGAATCAATGAATCATTCGTCTCTCGGGTCCAATAAGGAATTCAATTTCGGCACGGATGAGAAACATTTGACCGTTGATGAACATAGATCAGCTTCGCCGAAGAACAGCAATGATTGGTCTTTTTTCCCTGTGATGCAGTCAGGTACACTAAGCTAACCTTCATCAGAAGAATAGAAATCTGAAATTTAGATATCGATTCGGACAAATATCTTGTTCAAGATTCAAGAACAATTATAGAATTTTTAGATGATTCTGTTCAGGATCTTAAGGATATTTTCTTGTCTCTCTTTTTGGTTTTGTAATAAATATTTGGCATCGTTAGTTGTTGTATATGGCTACTCTTTATGTAGTTTTTTGTTTTTGTGAATACACATTTGATCGCATTTGTAAATAAAATTTAATCAGTTTCTTCGGAGAAATTCCATTAAATTTATAGGTATTGTTTACTATTTGATCTTCTGTTCTGTGTATTGTTGTGACTAGAGTTTTGTTATTGTTAGAGCC AATAAAAGGTGAGATCTATAGCATAAAGGTAGTGAATGTTTCTCCTTATTTGTTATCTTAGATTCAACCATGATATGCAATGTAAAGGAGAAAAAGAAAAAAGAGAGTAAACATTTGAGTATACAATTAACAAGCAACTCAAGACTGTTAACAAGTTTTATTCACCAAATCGATATACCGGTCAGGTTTTATAAGAAACATCACATCACAACCACTAAGTCCACTACAATTTGAAGCTTTGAGCCCTGTAAACAAGGATTATACATGACAAGTTAGAATGGGCCAGCTTAAATTACTAAGTCCACTCTCAGCATTCCGCAAGCCCACTTGGAATCCAGCTTCAAGTTCTCATAGGCGCTTTTGGTTCAATTAATCCCACCTAAAACCAGTATGCAATTGGAGAGTTAATAAATCTTGTAGGTTTAACTCTTGTTAGGAGGATAAATTAGATGATTTAAATTTCCTTATGTCTTTTTAAAAAAAAAAAATACAATTGAGTCTTGTCAATATGTATCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAGCAACGTTAACTACTAGTCAGCAAAAAACACATAGGTTAAAATATGTCGAGTCTCATAATGTGAAAACAAAAGAAAATACAAAGATTGAAAAAGAAACAACGACCCCCACTTTTAAACCCAATTAATGCCGTATTTTAAGTTGAAGTGCCGCTTTCCTCAAATCTCACTATTGTTTCTCTTATTCTCTATCATTCATATTTCATAGCCAACAAAGATTATGGTTTAGAGCATTTACTGATTTTATGTCAATTATAAACATGTCTTTTTTATCAAACGTTGTGAATAATCGATTACTTATTATATGGTGCTATTTATAAACTTACTGCATTTCTTTTTCTTCAAATATTCCGTTATAAAGGTGTTGAGAATTTTGTTTATAAAATTTTAGAATTACTGATTACTGTACATACATGTGTTTGTGGTATTTTGTTAATTATTGTCAATTATCAAAACACGAAATGTTGTCTTATTAACCCTTTTTCTGAATTATTGTGTTCTTGTGGAGGATATATTATATAGGTCGACATAATTTATTCGGATCACGCGTGGAAATTATATTTTGCCAAAACGAAAGTAGGAATTATATGATTCATGTATCATGTTATTGCTATTTTTATTTGATACTGTATTTTTTATAAATAAAGTTTTTTGGCTCACCAACTTAAGTGGCACTAATGGCATTGGCCCCTTTAAGCTGTAAGTTACCATTAATTTATGTTGCCAAAATATATAGCTGTCATTATGTTGCCTTAGTATGAATATATTTTTCTATCACACAATATCAATAGATATATGGTTATGACCATATCAACTTGTCCCATCAACATCTCAATCAAAACATTTGACATTATATAATTAACCAATTGATTTTAGGATAGGACTCTACAAACTTTTATTTAAACAATTTTCGCCTGAATAAAATCATGTGTTTAATTAGGAAGGTGATTATGCACAAACTCATAAGTGAGGAAATAAAAGGTTGAGATATAGTAGGTGAATTAATATATACAATATTAGGTTATTATAAACACAATGACAACCACAAAACTCTACACAAACAAACACATGACATGCAAATGCAACTATACGTCCCCAATTTTTTGGTTGGGAAGAATAATCAACAACAAACTTAGTTGCCTTATTAATTGCTTATACTTTTCTTTTCTCTTTTTAGATTTCATTTTCACATTTTTTAATCTATAAAACATTAATATGATTATCTTCCATTTCACACACACACTCACACTTCAATTCTCTTCTTATAGATTCTGCTCTCACCTCCAGACTAAAATATAAAAA[0571] SEQ ID NO:77 pAtLCR_CYP86A5_At2g45970

[0572]CCATTTCACAAAGATGGTAAAAACCGTAAAATGCTGATGAAATCGCAAAATCATTTTTTTTACTACCAAAGAGAACCATTGTTACACCGATACAAGCTTTAGCTTTAGCATGTGTCGCAGTAGTCGAGACAAAATATAAATCCGTCGTTCTTTAGTTTCGGTGGTAAACGAGAGAATAAATGACTAATGATATAGATAATTAAGTAAACATGTGATTATGCGTATTGAATTATTAGCCTCTAGAGTGGTTGAGTGTTGTCTGAATTACTATTAATTACCATGTGAATAAGCGACGTGGTAACTAACTATCATAATGATTCATTCATTATTTTAGCTACTTTTCAATATGATTTTTTTTATATCTCCTTTTGATTCTATATATGGTGGTCTTAAATGCCAAATGAGACAAGTAACAAGTAAAGTGACCAAAACAATTTCACTTAAATGACCAGTTTTACGTGGGACAACCCACGGAATCTAAAGATTTCTATGTTGTTTATTACTTAACGTGATAGGTTAAGTTTGTTTGTTAAGTCGTAAGAATCGTAACCATGGACTCATTACCATTAATGTGCCAAATTCCGAATAGATTTTGTAGTCATATAAAGTCATTGCGTTTATTCAATAAACAAGTCATAGCTATCGAGAATTCCTTCATTTTATTTTATTTTTTTGGTAAATAGTGCATGGGATGGATATACTTGATGCACCTAATCTAACTATTTTATTGTCTATTATTTATGTAACTTCCCGTACGTAACTGTCAATTTCAAGTATAAATATTAATTAATTTGTAAAGATATTATTATTTAAAATGATCTACAAAGTGTATTGTATATGTTTTTATTTTGCCGTTGATGGGAAGGTAACCTAATTAGATAACTTTATATTCTCTATCGATTTGTGTCCTTTGTCTTAAGTTTTAACCTAATATTGCATATTTAACCACATAAATACACTAACATGTGTAAACATTCACATTCTGCAAGGATTTTTTTGTTTTTAAAAGAACTTGAAACAAAATAAAAGAAAAGGATCAACTGAAAACCAACTGTCAATCAAGTTCATTTAAAACTCACCTTGTTTCATACAGCTGTAATGAAAAATAATAGTAATGGATTTCGAAGTATTTTAAAGTTCCAACCGGGTATTCTGCAATGCTTGGTTTGAAATTTGAAAAAGTTGACTATGGTTGGTCAATGCATTCATGCTTTGATGACAAAAATCAAAATTATATATATAAAAAATAGTTTTCTTCCTTCACAATTATCCACTATAGGGTTTATATATACTATATACTCTTTAATTAATTCTCCGATAGTTGTTCCTTTTGAAAAGGGTTGAATTTTCTGATAGTTTCGTTAACTTAATCGTTTTTCTTCTATGCATTAATTTTTCGAAAATTGAACTCCAATGCAGTACATGACTACATCGTATTTTAATATTTTCCCACAGCTTCTAATAATATTACAACGGGGGGTTTAAATTCAAAATTTAAAAGATTTTAATCGTCGACATGTGAAAATGTAGTATTAGGAGTGTGTTTATATATCCCATGTACACATCACGAGTTCTCGTATGAGTATGTGTTGGTTCTTACATTAATCAATTTATCACGATCACGCATTAAGAAGGCGACACATTATTATATTGTAGACATTGAATACTTGTAACGTCCTTTTTAAAAATATATTGACAAATATGTCACCAAACCCAAAAGCAACCTACATATGTTGTGTAGTTGAGCAAAACTATCATTGGTGAGTTTGTTCACCTATACCCTAACAATCTCAAATCTAAAACCCTAATTACTCATCCCTATACTCTATTGTATCACAAAAATAGGATTCTATAATTTTATACACGCACATATACTTTGTCAAAGCGTATCATAAAAAAATGAAATAAAAATCAACGAAATAACGTGATATGGCTAGTAATATAGTACGTAGTCTTACGACAATAGTTTAACTTATACGTGAAAAAGTGGGATAACATGAGTTTTCATATTTTTGTCATCAAATGATATGAAATAGAATAACCGAACATAGATCATTTTTTCACTAATTG 
AGAAGAAGAGAATTAGAGACTATCGACTCGTACGAGTGGTGAAACCCCTGTCATTTTGCCGTTATACAATCTACTGACCATGTCCATGACTAATAATACATCTATCAACAACCATCATGTCCCTTGAACCGACACCGAATTACAAAACCCTAACTTAATATCTTCAAAACATGCAATTAATAGACACGAGAATAAGATAAAATGAGGAGGCAACATCCCATGCTTACTTTGTGACTTCTTTTACACGATTTTCTAATACATTTTAAAAATACTACTTGACATCTCTCCATTTTTGGGGGGTTTTGAATTAAATTGTATATATAAATGGTTCATGCTTGGACATTGAAAACCTGTGGGTCATTTAGTCATAGATCTCTCTCTATCTTCCTTCCTCCTCCTCTTACTAGGCTCCTCAACTAAACGTCTTCAATGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCATTCTTTTACGACCTCATAGACTTGAAAATTTACCATTCTATTTTTCAAAACCTTTATATTGATGAGATTAATATATAAAGTCTCCAACCACCTAGCTACCAGCCTAGAGCAGGAACATTAATGGTGGTGCACACCATCTCATGCTTCACATACCCTAAAGTTCTTCACTCCAAGTTTATGAGGAGATCTAGAGAGATAATCATATAGAGAAAGAGAGATCTCCAGAGAAAATCCATTGAAGGGAAAAAAACAGTCTGTCTTTCATAATTGCTCTTTCTATAAATCTTCTCTCTTGTGTTCTTACCTTTCTTCTAAAACCATTCTCTCTCTCTTTAACACTTCATCACTCTTTACGGAAAATTTCTTATTTTCACCACCTGAGCCATCTCTATTTTCGTCAAAACTTCTCAACTTTTGTGCCAAAACGTCATTTCTTCTGAGGGAATAAACACAAAAGAACAATTTTCCCGGAAAATC

[0573] SEQ ID NO:78 pAtKCS10_FDH_At2g26250

[0574]GTCGTGTTTCGTTTGTGGATTTTGTTTTCTCATGATTTTTAAAATCCCATGTTTACACGATCATAACGTTTCGTCAATTTTAAAACGATAACTCTATAAGTAATAGCGTGTACCTTCATCGTATTTCTTTCGACGTCGTAATTATGATCACCATTCACCATTTTCCTTCTTTTTTCTTTTTAGGGTATATAACGCAACTATATAAAGCACACGTACTTAAAGAAACCCATTTGGGCATGTGTTGTCCTTGCTGTGGATCACATGCATAAGTCTGCTTTTTCTTTTTAATATGAATTGTTTTTGACTTCATATATAGGACCAATTCAAACATTTATATTTAAAGAATATTTTACTCAGTATTATTACTTTCTTTTGTAATGATTTACAATTTTGTGCCACTCGTATGTATAGCGTTTTAAAGAGGTTACTTACCAGTAGTTTTTGTCCAAATTTTATATGTGAAATAACCCTTCTCGGAAGGCTACCACATTTCCATTAAATTATTGGAAAACTTTTACAAAATGTGACAATTCGATCGGAAGGCTACTATCTCATAGGTATTGAGGCAGGATAGTCACTAAGTTAATGATTCTGCATCGGTCACAAACGTGGTGATCGACGTGAAAAGATTGAGCCCTCGCAAAAGTGAGATGGTGCTTTGTCAAACTTTTGCGATAAGTGATCATGATAATTACAAATTAAACTTCATTTTTGCCGTTTATGTGTCACTTAAAATTATGTTTTATTTTAGTTTTCTTAAATGAAAAAAGAGAGTTTATATATATATATATATATATATGAATCAAAATGTTAGTTAGTGGATCTTTTGATTCTGAAAAATTGTTGGATATTTGTTTCCTCGCTTAAATTGGTATTTATAGTAGAGTTTGAATCGAGGATTTGAATAGGTTCAAGAATTATTTTACCCTTTGGAAGCGTCATCTCGCTTTGAGTTCTACTACGATGTTATGGTTAGACTCCCACGGTGGGAGTTCCCATTTACTCTTAAATGCAACTGAACGGGCTTTACTATTTGATGCAATGATACAAAGAACCTTCAGATTTAAACAATGAGACGATCGCAACACAAGAGAATAATGTTACTGATCCTTCTACAACAAACACTGCACCAAGGCCTAGTTTGCTTGATTGAATGAAGTATACAAAGCATAGACACTTATCACATTTAAAGTATTTGTAATATGGCAATTTCGTATGTGTTAACACATTTCTCAAATTTTAAAAATCGTTTATATGGATCTTATAAAATATGGTAGTAATAATTTAGGTGGGGGATTGGGTCATTATTTATTTCTCTTCTATTTTGCTACTGCATTAACTAATATTAGGCTAAAAGTTCCTTAAATAATAAAGCTTTTTTATGCGTAATGTAGCCGCCCTCATTTATATAGGTCTCACCACCAATCGATTAATTGTAAGTAACAGAAATTGTTGATTATAGTTAAATGAGTCGTTGATAATTTGTTTAAATTTGTAAACTCTTCAGGCAAAATTTATATTATGTGAACAAAATTGCCATATATTTCATATCATGAATGAATTTGGTCTAAACATACTCCATACTGTCAAGGTTTAAAAAACATTATATTCATACAATCATACCATGAATGAATTTGTGTAAAGCTGTAAACTCTTCTTGCATCCTAGCTATTTTCCTCTTCTTCTTTTTTCTTTTTCTGACTAGTCATATAGATTTTTTTTTTGATTTTTATTTGATCGTTGGAGAATCTTCAAAAGATGACTCCACTCATCTTTTCAAAAACTACCTAGACCATATACAGGGCTCTCCGTCTACAACAATTAGCGTCCGGAAAACGTAAAGAAGTCTACAACAATTAGCGTCCTCGTGGATCAGTATCGTGACATTTGTGTCATGGAACCTATCCTTGGCAGTCGAAGTTAGGCTCACTCCCAACGGTCTAACTTCTAAGTGCTCACTAAAATATGAAAAACTAATGTTCTCGAACAAACACCACCTATAATGACTCAACCCTCCATAAAATTCGAAAACTGATCTTAAACAAAAATATATATAAGTGACGTAAAACATAAATTTATGTATATCTATTAAATAATAAATTAGTGAAGTAAAACATAAACTTAATCGCATAAAAGTTTAACTTTATTTTGCTTCTCAATAGATTTTGACTACATAATAGACGTGGATTTTAGTCAAACACAAGCGATATTGCAAAATTTCCGATATATATATATACACGTCTTTTTCACTAATAGAAAAGTAAACATATCAGCTCATCTTTTCTCTATTGGCAGTTCTCATCATCTTAATTGAAAATTTATGTTTCCACTTTTTTTAGCTTAGATACAAACTCAACTTTGTAAAAGATTTTCTTGTTGCATATTAAATTTTACATCACAACAAAAAGAAAAAAAGAAATAAACAAAGGAGATCAAATAGGTTGTACATAAATTAAGCAATCATACAACATCAAATCAACAGCTAAAAAGTTCAGTACAATCTTTACTTCCGAATTTACTTCATTGTCTTGACATCATGTTCTAAACAAAAACCAAACCAAAGTTCTCCACAAACCTGTCGGTTTTTAACCAAACCAAAGTTACTAGCTTAATTCAAAAAAAAAAAAAAACAGAACTGATTCAGAAACCCCAAATTGACAAATTGTCAAATTGTCAAAAAGTGGTCATCTTTATCCTTTGACATCTGGTTAGTATAAAAAATTGTAATAAATGCAAACATAAGATCCAAAACTACACCTTATTAGAACGGAGGAATTAAGAGTGACATAACTCACTCCAACTACGACCAGTACAAGTAGTTGGCGACATTAACTACCTCTCACCAACCACCAAACCCAATCCCCACAATATTACCATTACTCTCATATAACTACACATATTCATATTTACATTTTTTGCCAACACAACTCCTTATAAGATATACACTTCATCAACCTATA GATCTCACTCACATAATCAACCTACAAAACAAAAACAAGA[0575] SEQ ID NO:79 pAtCER60_KCS5_At1g25450

[0576] GGAAAACAAAAAAAAGCTTCAATAAACATAAGCCAGTTTATTTTATCAAAAATGTTATGACAAATAATGTAAACATGAGATATGTTTTGACCAGATTGTTGTTGTCCAGACGAACAGAAACTCGAGATGCGATGTGGAAGACTCCATCAACACCGTTGACTGCTTCGTCAAAGCTTCCCTCTATCGTTAGATCAGCTTCGAAGATCTTCAACCTTTCTTTTGCTCCTTTTAAGTCCCACAAGAAACCCACCTTTTCTTCATCTTCTTAATAACAAGGAAAGAAAATTACAGAATCATTTAAGAAACCAAAAAAAAAAACTTGTGGAAGCAAACCTAAGAATCTTTGGAGGATTCTAGGTAAAGTACCTGAGTCTCTAACAGTTGTTCTTACGTAATGACCAAATTCTAGAAGTGACTTGATAACATGAGAGGCTATAAAGCTGGTTCCTCCGGTAACCAAGTACTCTGCCATTTTATTAGGCTCCTCTGATTTTGTGTAACATTGACAAACTAGATCATGCGATTAGATGGTCTAATTTTATTTTATTTTGTGTTAGAAGGATGTTCAATCCTGGTTGATTTAGTTTATGTTTGACTTTTTTTTATGTAGTCTTTGAATAATAGTAGTTACATCTAACTTTCATAAAGACTTGGATTAGTATAACCTAATTATAAGCTTTGGGCTTGAAGCAAATATAATGAACTGAATGTGGGCTTTTAAAGTATCCAAAGAGGTTTATGAAATGTGATATATTTTTTTTGGTCTTCAATCTCTTGAAAATTGGTTAGCAATCCATTGGCAGTTGAAGGCTCTCTCAGAGACCTTGACTAGAAGGCCTCAAAGGCAAAGGAAGGTGGAAGGAAAAATCAAAATTCCCGGAGCTGAAAGTTGACACAAAGGAATCAACCTAGTTCTTTCTTGTCTTAGCTTTTTTGAAGGGAAATGAAAATTGACACAAAAGAAGGTGGAAGGAAAAATATGATGCTTGTCCTTTATTGGACATATCATTTTGCAGAATATATATTCTTCCTAGCATTTTGCATGCATTGTGTCTAGGTTGTCATGTTGTGGCTGGTTTACTAAGTTCCTAGTACAATGAACAAAGCGCCAGAGCTGAAAGTTGAAATAACAATCGTCAACATCCCAACCGCCTTAACATTAAAACCAACCAAAAAAACAAAAACACATCCCAACCGAAAGCAGCAATCCAGGAAGATTAGTTTATGTAAATGACAAACATAAATATGAAACCGTCACATAGTTGAGAGTCGCCGTGAATATTTACTTTTTAAATAAAAAGATATGGTTAGCCGCTGGTTGGTCTGACACCCCATGTATCATTATACTCATTATCCGTATGAAGGACCATTTTTTCATATAAGGATATACACGTTTGTAACGTATGCAGAGCCAACACCAAGTATATAACTTGTACTGTCGTCTCTGATTCTGTTAAAGCGGTTAACTAGATTATTGACTATGATAATTCAATGTAACACCAATTTATGCCCCGGACAAAAAAAAAATGGTGAAACCAAAATATTTGATTTGCATCCCAGTTACTATTTCCCTGCAATGATATGGGGGCGGCGGTTTGGAGATATCGCCAATGCCACAATTTGTCGTAAAAACAGTTAAACATTTTACTCACTAGTCACTCCCCACAAAAAAAACGATACTTAGTTCCACTCTCTACTACTACAAAACTTGTATACATTAAAAAACGATTTTTATTGAGTAGACATTAATGATCGGCTTATAAGTCTAAACAAGTAATGTGACAGAATTCACGTGAACAAATGCTCGAGTGGGATGTTTTTATTGCTTCTCAAGTTGGTGATCTTTAATATCGCCAAGATTAGGTTGTGCATTAAATTTGGATTACTTTTTATAAATTAAATCAAGATATGGATATGATAAACTTTCTCTCTTTTCTTTTAGTTAACATACTTTATAGACTTTATACTACATTAGATTAATTGCAGATTTAAACAATGTTTAAAATTACAAAAACGTTAAATGTCATATTTTCCATATAAATTTTGTTTTACGTAAAAGCAATTTACATGAATTTTGATAAAATCATGAAAAAACAGAAGCGGTGTCCAAGATTGGGGATGAATGAGAAAACACCGCACTGATAGTAACTGAAAAGAATGTAACCAGTCTCACGATGGGGATGGCGGAGAGAAAGAGAGAGACAAGACAGTAGAGAAAAGAAGGTACGACGGAGAGATGAAGGTTGGACAGAGAGAACAAAACGAGAACGGCAATGGCCGGGAAAAAAGGAGAGTAGGGAGGAAAAAAAAAAGAATTTTGTTTTTTTAGCTTTTGTAGGGTTTTTTGTTAGTCGTAAAATATAAATTATAATATCAAAGAAAATAATGAGTTAATTTTAAAGAAGGTTAGATGATATTTTTCACAAGTTTTTGTTGATATAGTAAACCCACAATTTTATTTTGTCATTCAAAGTAAATTTTCAACAAAATATAGCTGTTGCTGGTCACATTTTAACGGGAAAAAATAATTCTTGTACCTGGATGTATAACCTCTGAACCTTGTATTACAAATTTACAAAACACATTGATCTCAATCAGACCGAACATGTATATCGAGTCAACTGACAAATCTCTTTTCCTACTCTTGTTACATATTCTTTCTAGGAAAAAAAAATGCTTTCAGGCTCAATGAAATGAATTAAAACAGCAAAAGGTTGGTAAAAGTCTTTTTCCCCATAATCATTTGCTCCATAATTGACGTTTGTCTGGCAACAACTGGAAACACAGATATAGAAAAAAAGATTGGACAGTAAATCATAAAAAAAAAAAAGCAAAATTAAATAGAAAGACGAAGCGAGAGAAAGAGCGTTGAGTGGCGTGAGAGTTTGAGTCCGAAAATTAACTCCTCTCCCATCTGCCAACTTTCCTCTGTTTCTCCTTTATATCCCAAACCTATTCTTCCTCCACACCTCATCATAGGCATAGCAAAACTCTTCCAAA

[0577] 示例性的Myb 96蛋白序列和登录号：

[0578] 图例：At：拟南芥；Th：小盐芥；Mt：蒺藜状苜蓿；Pt：毛果杨；Vv：葡萄；Cm：大叶来檬；Bd：紫短柄草；Ta：小麦；Os：水稻；Zm：玉米

[0579] SEQ ID NO:80 Myb96_At5g62470_NP_201053

[0580]MGRPPCCEKIGVKKGPWTPEEDIILVSYIQEHGPGNWRSVPTHTGLRRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTEHEEKTIVHLQALLGNRWAAIASYLPERTDNDIKNYWNTHLKKKLKKINESGEEDNDGVSSSNTSSQKNHQSTNKGQWERRLQTDINMAKQALCEALSLDKPSSTLSSSSSLPTPVITQQNIRNFSSALLDRCYDPSSSSSSTTTTTTSNTTNPYPSGVYASSAENIARLLQDFMKDTPKALTLSSSSPVSETGPLTAAVSEEGGEGFEQ 
SFFSFNSMDETQNLTQETSFFHDQVIKPEITMDQDHGLISQGSLSLFEKWLFDEQSHEMVGMALAGQEGMF[0581] SEQ ID NO:81 AtMyb94_At3g47600_NP190344

[0582] MGRPPCCDKIGVKKGPWTPEEDIILVSYIQEHGPGNWRSVPTHTGLRRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTEHEEKMILHLQALLGNRWAAIASYLPERTDNDIKNYWNTHLKKKLKKMNDSCDSTINNGLDNKDFSISNKNTTSHQSSNSSKGQWERRLQTDINMAKQALCDALSIDKPQNPTNFSIPDLGYGPSSSSSSTTTTTTTTRNTNPYPSGVYASSAENIARLLQNFMKDTPKTSVPLPVAATEMAITTAASSPSTTEGDGEGIDHSLFSFNSIDEAEEKPKLIDHDINGLITQGSLSLFEKWLFDEQSHDMIINNMSLEGQEVLF

[0583] SEQ ID NO:82 ThMyb96_BAJ34253

[0584] MGRPPCCEKTGVKKGPWTPEEDIILVSYIQEHGPGNWRSVPTNTGLKRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTEHEEKMIVHLQALLGNRWAAIASYLPERTDNDIKNYWNTHLKKKLKKINEFGEEDNDGFSSSNTSSQKQHQSSNKGQWERRLQTDINMAKQALCEALSLDKPSSSTLSPSSSPLSPVIVPQNIPSFSSALLDRCYDLSSSSSSTTTTTTTTITSNTTTNPYPSGVYASSAENIARLLQDFMKDTPKALTLTSSSPVSETGPLSAAACEEGGEGFEQSFFSFNSMEETQNLTQETRFFHDQESKPVISMDQDHGLISQGSLSLLEKWLFDENMVGMALEGQEAMF

[0585] SEQ ID NO:83 VvMyb30_XP_002284926

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[0587] SEQ ID NO:84 PtMyb081_XP_002323853

[0588] MGRPPCCDKIGVKKGPWTPEEDIILVSYIQEHGPGNWRAVPTSTGLLRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTDHEEKMIIHLQALLGNRWAAIASYLPQRTDNDIKNFWNTHLKKKLRKLQAGQEGQSRDGLSSTGSQQISRGQWERRLQTDINMARQALCEALSPGKPSSLLTGLKPSCGYEKPATEPIYASSTENISRLLKGWMISGPKQSLKNSTTQNSFIDTAGADSLSSEGTPDKADKNGTGLSQAFESLFGFDSFDSSNSDFSQSMSPDTGLFQDESKPNSSAQVPLSLIERWLFDEGAMQGKDYINEVTIDEDNLF

[0589] SEQ ID NO:85 MtMyb_MTR4g108430_XP_003609059

[0590] MGRPPCCEKLGIKKGPWTPEEDIILVSYIQQHGPGNWRSVPTNTGLMRCSKSCRLRWTNYLRPGIKRGNFTDHEEKMIVHLQALLGNRWAAIASYLPQRTDNDIKNYWNTHLKRKMNKDQSSTDEGVDQESRSQLPNKGQWERRLQTDIHMAKQALSEALSLQHNPTTLGTLPDQMKPSSSFSHSHEHPPNLNIPSPYASSYENISRLMETWMKSPNSSAETNSSSIFSNMQGSSCSEGAQSTTQDHHGLNSSKSDYASRFRSSHEGNNSFNLNTKEGLFFHQEERINIKANMETHVPLTLLEKWLFEDGGASHECHEELINMSLEGTTSDFF

[0591] SEQ ID NO:86 MtMyb_MTR_3g039990_XP_003599668

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[0593] SEQ ID NO:87 CmMyb60_ABK59039

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AAATGATTTGTTTTGTGAATAGTTGATTCCAGCTAATGTGGTGAAAGACAATCATCTTACGTTTGGTGATTGTATCAACTACATTGATGAAGAAGGGAACTTAGTAGGACAAAGAGGGAATAAGCAGATGATAGGATTTGCTTCAAAGGATGCATGGCGACATAATTTGCAGAAGGATTAGACATAATAACATGAAGATACTGTCAAGTATGAGCTCCTTCATGAACTTAAGTACGTTCATAATTCCACTTGATCCACAACTTTGGGCTATTGGTATAAAAAGCTAACTTTATCTAGATTACATGCTACATCTCAATTCAAGATGTCCATTTATTAAAGCAAAGGCATGACTTTATCTTCGACTAGAAACTGGTGATGGACCATCCTCAACCTCCACTAGCATCATCTCCACCTACTCCTAACCACTAACCCAATTATCCTTTTCACCTTTTCCTCTCAACACTATCCTATTTTTAGGTGATTTAGGGAAAAGAGAAATACTACACTTTGATGTAATTTTTTTTTTAATTGAATTGAGCTTTGAATACTATGGTTAATATGGATGAAAGAAAACACACGTTCCTACTAATTTCTTTTTCTAAATGATGACGTTTTCTCAAGTTACTTATCGTAGTCTAATCGGTTATTGACAAAAATGATCTAGACGTTTGAAAATCATTGGCCAACCTCTTCACTAGATAGAATTTTTATTTCTAACCATTACCTACCTGATACACACACCAAGTTCTGAATCTAGAGATGATCTTGTCTCATTTGTTTATAGACTAAAGAGTATATAAAAGCTGGATTCATGTGGGTCATCCATCATTAATCGTGTTCTTCAATTCACCAACTTCGTAGGTTCCGCATCTTTTGTACTTTCTTTCTATTTTTAATCTTGCAATATCAAAAATAAATATATACACCTTTTAAAAAAATTCTGAATATGCATATGGTAATGGTATCATCAGAAAACATTGAATATTGAATCGTCTATCTACCAATCTCTTCAAGTTGTGAATTTTATTTATCAAAAAAAAAAAAAAAATCAACTGAAACGTCAATGTTATGTTTTGCTTCAATCTAAAGAAAGTTGTACCAAAAATAAAGTACTTTTTTACCAAGAAATTTCGGATTGTAGCCAAAATATGTCTTGTTTTATTTTTTTTGTTCACCAAAAATATGTTAAACTAGTTTTTTGACTTTTTCCCCCATGCGTTGTTGTTGTTATTCGGACGACCAATATTTAATACAGTATTCAAGTGTAGCTAAGCTACTGATTCCAGATAAAGTAAAAAAATGTCTTTGATACCAACTTCACTTTGACCAATTATCGAACTCTTTAATTTCATAATATATAGCTTTGACAAATATCCCATCAGAATTCATAAATCGCCACATGAATCTTATAATTGTCAACTATGTGCAGTCCAATATTAATATCATGGAAAACTAGATTACTAGCATTTAATTTCTTAATTGTATTTAGGTTATAGACTTAACATGGTTTTTCTTCTAGAGCATTTTCACTACATTTTTTTCTTTCTATGTTATTATTTTATGTTTTACTTATTGTTACATCCATTTACAACGATGTTGGATAAAATATTTTTAACTGTTCAGTCCGTAAATGACTAGCTAAATTTTTACGGATATATTTTTACATAAAAAAAGAAATTATTTTTACGATTTACCAATTTAACTCTTCTTTCTCTCTAAGTTTTCATTTATTAAAAATGATAGTTTTTTTAAGAAAGTTATTTGTATTTATTTATTTAAAATTGGATGCAAAAAATTACAAAACTTGGAAGAAATATTGTTAACCCATCTTTATCAGTATAGAATTTCTGATTACTCCCTGCGTTGAAAATAAGAAGATCCATAGAACGTGGTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGCAAGAAATGGTAATGTTAATCAATTAGACTCATGACTAAAGCTGGAAAATTTGACTAAAATGGTATTATCTTGCATTATTACCTAAAAGCTCTTCTTGCATTACTCTTTCATGCAAAATTGCCTCCAAAAGTCATACTTCGAAATCATGGCTTTGTAACTCACCCTTGCCACCATCTATCTAAACTTATTATTGTTTAAAACAAAATTGATTTTCAAAGAAAAAAAAAATATAAACTCCCACCGGTCAATAACTTTTAATTTTCACTTCAATTATTCATAAAATAAATATATACACCTTGATTCTTTCTTAATAACTGGAGTTATTTTGAATTTAAATTACTTTTGAAATACAAAAGAAAGTAAGATAATTTTGCCATTTAAAATGTCTACAACAATTATGTTAACACTTAACATACATTTTTAGAACCAAATGGTAATGGTCCACTAGTTAAAAGATTTCTTATGAATGTCTTTTTATGCAGAGTTCGAATTTTCTCACAACGATTTTAACCATTTTCGTCACTCGCAAAATTTTTAGTGGATAACAAAAAAAAAAAAAAGTTGAAATTTAATGGAAATTTAGGAGATTTGTCCAATTTTTAATTTTCCCGATTAATTTAAAAAATCTACTTTACGCCTTTTATTGACAAAGATGCATATTAACTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA TATTATAAACTAAATTTTGTAGAACCCATCAGAAGAAATTTGTACTTTTAACTTTAAAATCAATTAAAAAATTTCAATTCAAATAAAAAAAAATCCAAAATTGTTTATAAATTCAAGAAATATAACACACAAGTTGACATAAACAGTGGAGAGATTTGTGAAATGTGAACTCTTTTGACGTCTTTCTCATATTTCGTCTCGGGACAATTCACACGCACTGAATCATCTCTCTCACGAGGACTATTCAGCCATTTGCAAACGCACACACAAACGCACACGCGTTTATTTTTTTTTCGCCAAATCAAATCTGAAGAGTTCCTGTATCTTTTAACCGCTCTTCTTCTTCTTCAGAGAGCTTCGTTGATTGAACGGAAAAA