自含式生物指示器 |
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| 申请号 | CN200980138666.0 | 申请日 | 2009-09-03 | 公开(公告)号 | CN102170915A | 公开(公告)日 | 2011-08-31 |
| 申请人 | 美国杀菌器公司; | 发明人 | 马克·爱德华·帕斯莫尔; 菲利普·P.·弗朗西斯克维赫; 特里克拉·A.·克雷格; 艾伦·M.·所罗门; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种用于评价灭菌工艺有效性的自含式灭菌指示器。所述灭菌指示器含有构造用于储存培养基的盖帽，所述盖帽固定于含有一定浓度 微 生物 的容器上中。盖帽含有用于储存培养基的内槽。所述内槽含有开口和 覆盖 开口的易破裂隔层，所述隔层使得培养基封装在盖帽的内槽中。生物指示器适于在选择时间使得易破裂隔层破裂，以将生长培养基引入容器内，从而培养基与微生物 接触 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于确定灭菌工艺有效性的自含式灭菌指示器，所述灭菌指示器包括： |
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| 说明书全文 | 自含式生物指示器技术领域[0001] 本发明涉及灭菌指示器，例如自含式生物指示器，用于评价灭菌工艺的有效性，还涉及使用此类指示器评价灭菌工艺有效性的方法。 背景技术[0002] 使用灭菌工艺对很多种领域的材料灭菌，包括，例如医疗器械和手术器械等的灭菌。通常地，将要灭菌的物品放入槽中，放置到认为足以有效对物品灭菌的条件下，除去其中含有的生物污染物(或至少达到预定的可接受水平)。有多种可有效灭菌的灭菌技术，包括蒸气灭菌、暴露于气体灭菌剂(如环氧乙烷、过氧化氢气体等)以及等离子体灭菌等。不考虑对物品采用的灭菌技术，评价应用的灭菌工艺有效性将有利于确保工艺达到期望的灭菌程度，当对侵入人体的物品如医疗器械和设备进行灭菌时，评价工艺的有效性可能是特别需要的。 [0003] 使用灭菌指示器对灭菌工艺的有效性进行评价，通常评价的是一种具有灭菌抵抗力的挑战材料能否在灭菌工艺中存活。例如，一种典型的生物指示器体系，包括微生物源(如细菌芽孢)、培养基和可见的检测器以表明活性微生物存在或不存在。指示器体系受控于应该足以杀死微生物的灭菌循环。灭菌循环后，微生物源与培养基结合，然后进行培养以促进任何剩余活性微生物的生长。培养阶段中，评价指示器体系以确定是否有微生物存活于灭菌工艺。评价指示器可通过视觉的(如浑浊度或颜色变化)，或使用检测器(如使用分光光度计、荧光计等光谱法)，来测量选择的性能，如pH值变化、荧光性、光吸收的变化等。 [0004] 通常地，商用生物指示器提供的体系通过将培养基装入玻璃安瓿瓶，并且把安瓿瓶放入含有微生物的容器内将培养基与微生物分开。灭菌工艺后，使安培瓶破裂，培养基释放至容器中而激活微生物指示器。 [0005] 商用生物指示器中也可能需要相对较长的培养期来获得可检测水平的芽孢生长晕。例如，商用生物指示器中需要的培养期可能为18小时至多达7天，取决于所要灭菌的物品。如此长的培养期用于评价灭菌工艺有效性可能是不现实的。尤其是，医疗器械和设备灭菌后，在对器械所使用灭菌工艺进行有效性评价的过程中，仍然不可以使用。但是，由于确定是否充分灭菌而导致医疗器械不可使用的时间延长，所需成本是很昂贵的。 [0006] 为了提供一种较快速评价灭菌有效性的指示器，一些体系中评价的是微生物内存在的酶活性而不是微生物的生长。例如，3M公司生产的一种ATTEST 商标下的快速可读指示器，其使用芽孢壁中天然发生的酶将4-甲基伞形酮-α-D葡萄糖苷降解为荧光性的分解产物。与这种酶相关联的荧光信号可以在1-3小时内检测到。该指示器中，加入非荧光性底物到培养基中，底物降解后产生荧光化合物，通过检测该荧光化合物而不是微生物生长来评价灭菌工艺。这种指示器用于评价蒸气灭菌工艺。在灭菌处理中的蒸气热将会导致作用于从非荧光性到产生荧光性的反应的酶的失活。 [0007] 美国专利5,073,488、5,223,401、5,418,167、5,866,356和6,566,090中描述了生物指示器的其它实施例。利用酶的活性与芽孢活力相关联，从而显示了灭菌的有效性。 发明内容[0008] 本发明提供了一种用于评价灭菌工艺的自含式灭菌指示器，该指示器包括用于盛装生长培养基和/或酶反应的底物的盖帽，所述盖帽可固定于用于盛装微生物和/或酶的容器上。一方面，本发明提供了一种用于确定灭菌工艺有效性的自含式灭菌指示器，所述生物指示器包括：盛有一定浓度微生物和/或酶的聚合物容器，所述容器组成为上端、下端、以及上端的开口；聚合物材料组成的盖帽，所述盖帽含有外壁、密封的上端、下端、与盖帽下端邻接的开口，和定义了内槽的内壁，所述内槽具有与所述盖帽下端相邻接的开口，所述内槽中适于盛装培养基和/或酶作用的底物，盖帽中包含一个覆盖和遮盖内槽的开口的易破裂隔层。 [0009] 灭菌指示器中使用玻璃安瓿瓶来储存培养基存在的问题是，必须通过安瓿瓶破裂来激活指示器。通常地，安瓿瓶置于指示器中的容器部分。当将安瓿瓶破碎时，安瓿瓶的碎片可能在指示器置于读数器进行分析时阻碍光路。应用发现，将培养基封装在聚合物材料和/或铝箔材料组成破裂时不会破碎的易破裂隔层的盖帽中，容器内阻碍光路的可能性将会大大降低甚至消失。 [0010] 容器在几何学上是作为光路使用的。应用还发现，通过将微生物储存在容器内和培养基储存在盖帽中，可使用最少量的培养基使得微生物、酶、指示器材料以及底物分子浓缩，当保持增长的光路时使得信号加强。 [0011] 灭菌指示器可设置为通过打开易破裂隔层来激活指示器。一方面，设置容器适于易破裂隔层的打开。可将盖帽固定在容器上并以易破裂隔层未被打开、培养基留在盖帽内的第一、非激活的位置固定在盖帽上。容器可能含有一个适于打开易破裂隔层的突起物或部件，并且所述盖帽可移到容器内的突起物使易破裂隔层打开、以释放培养基进入容器的第二、激活的位置。 [0012] 另一方面，易破裂隔层的打开是由于提供的易破裂隔层具有自身易破裂性的构造。易破裂隔层由可在选择的温度下熔化的聚合物材料形成，可能是自身易破裂性的。另外，提供的自身易破裂隔层也可能是一种热收缩膜。 [0013] 灭菌指示器可能含有一个或多个支持部件。 [0015] 另一方面，本发明提供的一种评价灭菌有效性的方法，包括：提供了一种自含式灭菌指示器，包括(a)含有顶端、底端、顶端开口以及定义了内部区域的容器；和(b)含有用于储存培养基的内槽的盖帽，所述内槽定义的开口与所述盖帽和所述槽的底部相邻接，所述盖帽中还含有覆盖所述槽上的易破裂隔层；在所述容器内接种具有高灭菌抵抗力的微生物，将所述盖帽固定于所述容器上使所述易破裂隔层处于完好状态的第一位置；将所述微生物进行灭菌工艺；使所述盖帽易破裂隔层破裂，生长培养基流入所述容器内部区域，与所述微生物接触；在促进微生物生长得充分的条件下培养所述微生物和所述生长培养基；检测活性微生物的存在。 [0016] 另一方面，本发明提供了一种生物指示器体系，包括：含有密封下端、上端和上端开口的容器；所述容器中储存有一定浓度的微生物；固定于容器上端上面的盖帽，所述盖帽中含有封闭的上端、开口的下端、外壁、定义了具有开口的内槽的内壁、覆盖于所述内槽开口端的易破裂隔层和储存在盖帽内槽中的液体培养基。 附图说明[0018] 附图中类似的部件和特征有类似的参考。大多数附图为示意图，即图中不必是精确比例的或按比例绘制。 [0019] 图1为根据本发明的实施方案的示例性自含式灭菌指示器的透视图，显示盖帽脱离于容器； [0020] 图2为图1指示器(沿线2-2)的横断面视图，显示盖帽固定于容器的第一非激活的位置上； [0021] 图3为图2所示指示器盖帽固定于容器的第二/激活的位置上； [0022] 图4为图3指示器旋转90°的横断面视图； [0023] 图5为图1指示器盖帽的底部透视图； [0024] 图6为根据本发明另一个实施方案的自含式灭菌指示器的透视图，显示盖帽脱离于容器； [0025] 图7为根据图6指示器(沿线7-7)的横断面视图，显示盖帽固定于容器的第一非激活的位置上； [0026] 图8为图6指示器(沿线7-7)的横断面视图，显示盖帽固定于容器的第二激活态位置上； [0027] 图9为图6指示器(沿线9-9)的横断面视图，显示指示器处于第二激活的位置上； [0028] 图10为图6指示器及容器的俯视图，移去所述盖帽后观察容器；和 [0029] 图11为图6-10指示器体系的底部，所述底部适于刚好放入读数器或固定器。 具体实施方式[0030] 说明书和权力要求书中公开的所有范围和比例限制可以以任何方式组合。可以理解为，除非特殊说明，涉及到“a”、“an”和“the”可能包括一个或一个以上；涉及的单个物品也可能包括复数的所述物品。权力要求书中指定的所有组合可以以任何方式组合。 [0031] 术语“灭菌”用来表示一种物质不能进行繁殖、代谢和/或生长。虽然通常用于指物质中完全不含有生物体，所述术语这里可用来指物质不含有生物体为一个上述认为可接受的程度。除非指定，术语“灭菌”这里也可用来指不比灭菌严格的工艺，例如消毒、卫生、净化、清洁等。同样地，术语“灭菌”的变体，例如灭菌剂、杀毒、清洁、净化处理等，这里也可用于指或包含与不比灭菌严格的工艺相联系的相关变体(如消毒剂、消毒处理等)。 [0032] 概括地，本发明提供了一种用于评价灭菌工艺的自含式灭菌指示器，包括：适于储存培养基(这里也用于指生长培养基)的盖帽和适于储存微生物的容器。所述盖帽中含有储存培养基的内槽和覆盖内槽从而封存培养基于槽内的易破裂隔层(这里也用于指易碎隔层)。将充满培养基的盖帽固定于容器上，所述体系适于在选择的时间打破易破裂隔层，使得生长培养基流进包含有微生物的容器内。一个实施方案中，容器适于打破易破裂隔层。另一个实施方案中，设置的易破裂隔层可在特定条件下自己破裂。 [0033] 参照附图，图1-4所示为根据本发明第一个示例性实施方案中的一种灭菌指示器体系10。指示器体系10含有固定于容器30上的盖帽20。所述容器30中含有密封底端31和开口的上端33以及定义了内部空间34。所述盖帽20含有外壁22、开口的下端21和密封的上端23。所述盖帽还包括有内壁24，所述内壁位于盖帽外壁的里面，并定义了内槽26。所述内槽26含有开口25邻接于内壁24的底端。所述内槽26中含有液体50，所述盖帽20中包括置于内槽26开口25处的易破裂隔层40，以使内槽26内包含有液体50。 [0034] 图1-4所示的实施方案中，指示器的设置为，所述盖帽20通过卡扣固定于所述容器30上。如图2-4中所示，容器30中含有接近或邻接于容器上端33的环形突起32形成的脊部或唇缘。盖帽20中包含邻接于盖帽底部的环形突起29形成的脊部或唇缘。通过将盖帽的脊部29滑入容器的脊部32使得盖帽20固定于容器30上。容器30的脊部32与盖帽20的脊部29啮合，防止盖帽20和容器30的脱扣。测定盖帽20和容器30的尺寸使得脊部32施加充分的压力于盖帽20，以防止盖帽20的下滑，而不施加向下的外力于盖帽20。这样，易破裂隔层40与穿刺部件36的尖端38可保持一定的距离，使得在需要激活指示器之前，可使易破裂隔层40不接触穿刺部件和/或不被穿刺部件刺破。 [0035] 如图1-4所示，容器30适于刺破易破裂隔层40。容器中包含的突起物36(这里也用于指“穿刺部件”)含有尖端38，适用于当向下移动易破裂隔层40与突起物36的尖端38接触时刺破或穿刺易破裂隔层40。所示的穿刺部件36延伸自容器的侧壁35和内部、底壁37并与之组成整体。 [0036] 为了评价灭菌工艺，在容器30的内部34布置标准浓度的微生物。微生物可以直接布置于容器壁35，也可以布置于位于容器30内的支持部件上(如支持部件70)。将充满培养基的盖帽20固定于容器30上来对指示器进行组装。如上所述，可以将盖帽20通过卡扣固定于容器30上。参照图2，充满培养基的盖帽20固定于容器30上，并处于第一非激活的(或打开)位置，从而易破裂隔层40没有被穿刺部件36刺破。希望地，在第一非激活的位置时，易破裂隔层40位置远离并且不接触穿刺部件36的尖端38。 [0037] 根据图2中所示来组装指示器10，接着将指示器用于灭菌工艺。所示的盖帽20中含有空隙28，灭菌蒸气通过此空隙流入指示器体系。灭菌剂通过空隙28进入盖帽(即位于外壁22和内壁24之间的空间)，经过盖帽20内壁24外表面和容器30壁35内表面之间的空间60流入容器30。灭菌蒸气流入容器30后，作用于微生物。 [0038] 灭菌工艺完成后，可以通过将盖帽20向下移向容器30到达第二(关闭的或激活的)位置，使指示器激活，如图3和4所示。对盖帽20施加一个足够的向下的力或压力来使得盖帽20下移。盖帽20向下移动，使得易破裂隔层40与穿刺部件36的尖端38接触，最终到达一个位置时，穿刺部件36的尖端38刺破或穿刺易破裂隔层40。易破裂隔层40被刺破后，内槽26的开口25暴露，液体生长培养基50流入容器30的内部区域34，与微生物接触。希望的是采用扭转方式向下移动盖帽20，以在易破裂隔层40处获得较大或最大的开口，从而确保生长培养基完全流入容器内。 [0039] 如图3和4所示，盖帽20的内壁上包含第二环形突起27，向下移动盖帽到达一个位置时，突起27的上部与容器30的脊部32底部啮合，保持盖帽20于第二、关闭/激活的位置。所述第二、关闭/激活的位置使得盖帽20与容器30之间密封，可防止另外的微生物进入体系。然后，在足够长时间下培养指示器10，以确定微生物活力。培养过程中，所有活性微生物将发生代谢和生长，这种代谢和生长将释放副产物到培养基中。可选择的性质例如pH值变化、颜色变化、不透光性和荧光性等用于副产物检测。 [0040] 应了解的是盖帽20不是必须包含第二突起27来保持容器处于关闭位置。在另一个实施方案中，容器30包含另一环形突起或一套稳定装置(未显示)在所述容器30的外部，并且所述突起或稳定装置位于脊部32以下，所述突起或稳定装置适用于啮合盖帽的脊部29，来保持容器30处于关闭位置。美国专利5,770393公开了这样一种构造。另一个备选实施方案中，盖帽20的内表面和容器30的外表面具有螺纹，在容器30上旋转盖帽20，将盖帽20移动到并保持在一个关闭的位置。 [0041] 图6-10所示的为根据本发明的生物指示器第二个示例性实施方案。灭菌指示器100中包含充满培养基的盖帽110和容器120。充满培养基的盖帽110含有外壁112、开口的下端111和密封的上端113。盖帽110含有内槽116，所述内槽116是由与外壁112隔有空间的内壁114定义的。所述内槽定义的开口115存在于内壁114的底部。内槽116适于储存液体140，并且盖帽含有置于开口115处的易破裂隔层130，以使内槽116内包含有液体。 [0042] 容器120中含有密封底部121、开口的上端122、壁123以及定义了内部区域124。容器120中含有的穿刺部件127具有尖端128，适于刺破和/或撕裂易破裂隔层130。 [0043] 盖帽110和容器120适于通过卡扣和螺纹两种啮合将盖帽110固定于容器120上。盖帽110中含有的环形突起117适于滑入容器120上的突起126，从而使得盖帽110与容器120啮合。盖帽110还在壁112的内表面上含有螺纹表面，所述螺纹表面由突起117和凹槽119定义。螺纹表面使得容器120上的突起126(也可作为螺纹突起部分)可与之形成螺钉-螺纹关系，通过在容器120上面旋转盖帽110可将盖帽110移动到完全关闭位置。 应了解的是螺纹组装使得卡扣构造不再成为必需。 [0044] 可以采用与上述指示器10类似的方式来使用指示器100。微生物可放置于容器120的内部124，如垫片190上，并且所述盖帽110可固定于容器120上面。如图7中所示，通过将盖帽110的突起117滑入容器120的突起126，从而使突起126与突起117啮合并且保持盖帽110在所述位置，即所述盖帽110固定于所述容器120第一、打开(非激活)状态的位置上。 [0045] 接着，可以对指示器100进行灭菌工艺。灭菌蒸气通过盖帽110与容器120之间的空间从盖帽110的底端附近进入盖帽110。例如，图6-10所示实施方案中，突起126是不连续的，从而使容器120外表面与壁112内表面之间存有空间或开口。灭菌剂通过这个空间/开口进入壁112和壁114之间的空间118。灭菌剂经过并绕过突起117，到达容器120的开口端122，后通过容器壁125内表面与盖帽110壁114外表面之间的空间即通道150流入容器中，作用于微生物。 [0046] 灭菌处理后，将盖帽110旋转到容器120上移动盖帽110至第二、关闭的位置(图8-9所示)，从而激活指示器100。盖帽110旋转到容器120上使得穿刺部件127的尖端128刺破易破裂隔层130，进而使液体140从盖帽110的内槽116向下流入容器120中，与微生物接触。如图8和9所示，将盖帽110移到一个位置，最上面的螺纹与突起126啮合，从而使得盖帽110与容器之间密封以防止其他微生物进入体系，并且为灭菌培养基的流过提供了曲折路径。在足够长时间下培养指示器100，以确定微生物活力。 [0047] 一般地，盖帽(如盖帽20或110)可具有任何需要的构造、形状和尺寸。另外，其构造，包括形状和内槽的容积(如槽26和116)也是不受限制的，可以按照需要进行选择。 [0048] 如上所述，图1-4中所示实施方案中的盖帽20含有空隙28，灭菌蒸气通过此空隙流入指示器。然而，应了解的是盖帽并不是必须具有这个特征。空隙的数目、尺寸、形状和/或位置可以按照需要进行选择。例如，可以选择盖帽和/或容器中空隙的位置、形状和尺寸以在微生物和周围环境之间灭菌蒸气的进出提供曲折路径。此曲折路径也可用于防止外界污染物的进入。 [0049] 空隙可以位于容器内，此时盖帽中可含有也可不含有空隙。如果盖帽中不含有空隙，则内壁的位置设置为，盖帽的内壁与容器的内表面之间不必有空间。另外，如果容器内含有空隙，则空隙的位置应设置为，当激活指示器时刺破隔层和培养基不会从这些空隙泄漏或溢出。 [0050] 为了达到特定目的来选择容器(如容器30或120)的尺寸和形状。如示例性实施方案所示，容器30和120通常呈圆锥形，即向着容器底端方向侧壁逐渐变小。即，侧壁的截面大体上呈现环形，且接近底部的截取截面的直径小于远离底部截取截面的直径。另外，容器内部的几何形状可以按照特定目的或预期使用来进行选择。通常地，内部区域由锥形侧壁之间的空间决定。增加侧壁的厚度可以使内部区域变小。容器的几何形状一般可设计作为各种检测方法如光谱学检测方法的光路。理想的是光路穿过容器。通过选择一种具有相对较小内部容积的容器(如示例性实施方案中的锥形几何体)，采用较少体积的培养基浓缩有机体、代谢物(如酶)、指示器和底物分子浓度变大。这样，保持光源的光路变长而增强了信号。 [0051] 希望的是，光路中基本上不含有任何可能干扰从光源发出的光的物质。因此，对于具有所示容器30和120中穿刺部件构造的指示器体系，检测器中希望的容器取向为使穿刺部件不会阻碍或干扰光路。图10中箭头160、170和180显示为用光谱学方法分析指示器体系10和100时潜在的光采样路径。应了解的是可以沿着容器任何表面来读取(观察)光。箭头180显示光源可以固定于读数器采光井的底部。 [0052] 盖帽和容器的构造适于将盖帽固定于容器上。固定装置不受特定限制，如指示器体系10和100中所示，盖帽可以通过卡扣或螺钉-螺丝关系来固定于容器上。如指示器体系10和100中所示，可以提供一种卡扣构造，即盖帽和容器上的突起适于互相啮合到一起。这种构型设计是不受限制的。同样地，关于使用螺钉-螺丝固定/关闭方式的指示器体系的设计也是不受限制的。应了解的是其他用于固定的装置也是可以考虑的。例如，指示器体系中装配有一种外部制动装置或其他装置，适于将盖帽固定于容器上和激活指示器。 [0053] 如示例性实施方案中所示，容器中含有至少一个穿刺部件(如穿刺部件36和127)适用于穿刺或撕裂易破裂隔层以激活指示器。穿刺部件的构造、尺寸、形状、位置和数目都可以按照需要进行选择。例如，所示示例性实施方案中含有两个从容器底部延伸出的穿刺部件，应了解的是可以选择一个或多个类似穿刺部件或其他可选择的构造。下面将要描述的是，指示器体系不必含有穿刺部件用于撕裂易破裂隔层。而是，易破裂隔层可设置为在选择的时间和/或特定条件下自己破裂。 [0054] 如图6-10所示实施方案中，容器120中可含有支持部件，如支腿129。一个或多个支持部件可用于提供一种自支持结构和提高指示器的稳定性。支持部件也可以提供附加的接触面，用于提高与热表面(如置于灭菌设备中或具有培养功能的检测器如荧光计)的热交换能力。 [0055] 容器的底部表面可设计为，该表面几何图形适于指示器插入固定器后定位于一个特定灭菌设备、读数器、培养箱等，使得容器可以合适的取向进入选择的固定器、读数器和培养箱内。例如，图6-10中容器120上的支腿129，可作为支持部件来稳定和/或支持容器，也可沿容器120侧面和底部形成表面几何图形。固定器、读数器、培养箱等需要提供含有凹槽的表面，与容器底部或侧面的表面几何图形/设计相适应。例如，图11所示的基座200，位于如灭菌器、读数器、培养箱或固定器等里面，可含有凹穴或凹槽202、204和206，其尺寸和形状设计符合相应的特征，即与如支腿129的底部和容器120的底部121相适应。指示器体系底部和侧壁设计为特定形状，以插入读数器、检测器和培养箱等的特定固定器内，优选是，保证指示器进入并且置于读数器或检测器中，使得容器以合适取向位于读数器中。 例如，如图10中所示，优选地，指示器100以特定取向位于读数器或检测器中，保证容器的取向为样品的读数提供合适的光路。指示器也可以装入特定培养箱内，由于不同有机体常常需要不同的温度进行最优生长，将所述培养箱箱内被设定或设定自己到一个合适温度，以利于所用生物有机体生长。 [0056] 应了解的是容器内不是必须含有支腿129来为容器提供特定表面几何图形，从而适于将指示器插入固定器中。例如，容器的底部，图1-4中所示容器30的底端31的基座，可以含有凹槽、凹穴、突起等用于提供特定表面几何图形。 [0057] 盖帽和容器可以使用任何可以承受住特定灭菌工艺中的温度和化学物质的材料。不同的灭菌技术可能对材料有不同的要求，按照特定目的或预期使用选择所采用的材料。 例如，盖帽和容器可以由聚合物材料制备。适合的聚合物材料包括，但不限于：聚烯烃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚酯、其种或多种任意组合等。适合的聚烯烃的实例包括，聚乙烯、聚丙烯等。聚丙烯是一种典型的用于制备盖帽和容器的材料，可以与各种各样的灭菌剂，包括过氧化氢、水蒸气、环氧乙烷和过氧乙酸共存。容器和盖帽可以由同一种材料制备，也可以由不同的材料制备。为了与检测指示器的性质变化的方法相适应，容器需要具有一些透明度。例如，对于荧光测定和光谱测定方法，容器需要对感兴趣的波长具有一些透明度。根据需要，盖帽和容器可以进行着色。 [0058] 盖帽和容器的成形可以采用任何合适的方法，例如，此项技术中已知的模铸法。易破裂隔层可以按照需要成形，并且可以使用任何合适的材料，以使隔层能被撕裂，从而从盖帽释放液体到容器内。这里所使用的易破裂隔层的结构，不限于必须使用外物刺破隔层(例如分别使用穿刺部件36和127的尖端刺破隔层40和130)。所述“易破裂隔层”也可能包括，特定条件下物理性质或物理性质变化引起“自身易破裂”。 [0059] 在一个如图1-10所示实施方案中，易破裂隔层设计为使用一个外物(例如穿刺部件)穿刺隔层来打破隔层。此类隔层可以由聚合物材料、金属箔或其两种或多种组合形成。合适的聚合物材料包括聚烯烃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚酰亚胺、聚丙烯酰胺或其中两种或多种任意组合等。用于制备易破裂隔层的一种典型聚合物材料是双向拉伸的聚酯。 用于制备易破裂隔层一种典型的金属箔/聚合物组合物是爱尔康DD225，一种具有涂漆侧和聚丙烯涂层侧的金属箔。 [0060] 隔层也可以是一个膜，膜的厚度可根据需要，使得移动盖帽到一个关闭位置时，穿刺部件能刺破膜。一个实施方案中，易破裂隔层的厚度范围约为0.5-10密尔。另一个实施方案中，易破裂隔层的厚度范围约为0.5-2.5密尔。易破裂隔层组成可以为单层结构或多层结构。将易破裂隔层设计为便于穿刺部件刺破隔层。例如，易破裂隔层具有一个较弱区域利于有效地穿刺隔层。较弱区域的形成，例如，提供的隔层中，具有一部分或多部分相对于隔层中的其他部分较薄或易于穿刺(如需要较小穿刺力)的区域。较弱区域的形成，也可通过提供划线、模切线、打孔线等方式的膜。如图1和5所示，膜40中包含模切线42。 [0061] 另一个实施方案中，易破裂隔层可以是自身易破裂的，由加热条件下将发生物理变化的材料制成，这种物理变化导致隔层破裂。例如，一个实施方案中，隔层由具有选择熔点的聚合材料制成，加热指示器(在选择温度下)将激活指示器，从而隔层熔化破裂，释放培养基到容器中。另一个实施方案中，隔层由一种具有相应性质的热收缩膜组成，即置于所选择温度将促进膜的破裂。例如，膜可以是一种具有相对较低撕裂强度的热收缩膜，从而膜由于收缩而撕裂，释放培养基到容器中。由于熔化或(由于收缩)撕裂而破裂的隔层材料由所属领域的技术人员来确定，可根据使用的特定灭菌方法和/或激活指示器的预期条件来选择材料。热收缩膜通常含有取向膜，例如，取向聚丙烯膜。一个实施方案中，隔层适于在灭菌温度或附近范围破裂(前提是隔层破裂前，指示器暴露于灭菌工艺中足够长时间)。另一个实施方案中，优选地，直到指示器暴露于灭菌条件下足够长时间，隔层才发生自身破裂性的物理变化(如熔化、收缩和/或撕裂)。也就是说，优选地，隔层在灭菌温度下不会发生预期的物理性质变化，直到高于灭菌温度的温度时才会发生变化。在这个例子中，指示器暴露在灭菌条件中第一温度经过一段选择性时间后，然后暴露于第二温度(高于灭菌温度)引起隔层破裂(如熔化或收缩或撕裂)。自身易破裂隔层可能尤其适用于水蒸气或干热灭菌工艺中。 [0062] 可以使用任何合适的方法将帽和容器成形为预期的形状和/或构造。聚合物材料形成的盖帽和容器，可以采用各种塑型方法，如注射塑形形成。 [0063] 提供的充满培养基的盖帽具有适于储存液体培养基的内槽的盖帽结构。然后，加入所选择的生长培养基到内槽中，内槽上邻接有封住槽入口的易破裂隔层，从而使培养基包含在内槽中。易破裂隔层可以采用任何合适方法例如，使用粘合剂、声波焊接、热封等邻接于槽上。可将易破裂隔层中的一侧或两侧经过电晕处理、粘合剂处理、涂漆或聚合物膜、或者金属化以便于将膜邻接到槽上。一种典型隔层是漆上铝箔，这将利于其与包括聚丙烯在内的各种聚合物材料之间的热封。 [0064] 微生物的检测可以根据要评价的灭菌工艺需要来进行选择。通常地，检测的微生物应该对所评价的灭菌工艺具有很高的抵抗力。细菌芽孢是典型的微生物，因为通常它们对很多不同的灭菌工艺具有较高的抵抗力。其他适合的微生物包括酵母、真菌以及生长状态的细菌。典型的细菌芽孢包括，例如短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulanis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、嗜热土芽孢杆菌(Geobacillus stearothemrophilus)、耐辐射球菌(Deinococcus radiodurons)、黑曲菌(Aspergillus niger)等。可以采用单一检测微生物或者检测微生物组合。检测微生物的浓度可以根据特5 10 定目的进行选择。一个实施方案中，检测微生物浓度的范围可能在约10-约10 个菌落形成单位(cfu)。 [0065] 如上所述，检测微生物可以接种于容器的底部或槽壁上。或者，微生物可以置于支持物上，然后将支持物放入容器内。可以使用任何合适的支持物材料，包括如，纤维素基支持物、玻璃纤维基支持物或聚合物支持物。以引用的方式并入本文中的美国专利号5,516,648公布的非限制性的合适支持物例子中，在多微孔的亲水膜中包裹或包含芽孢接种成分。 [0066] 培养基可以根据特定目的和预期使用来进行选择。合适的生长培养基实例包括大豆酪蛋白消化肉汤、葡萄糖蛋白胨水溶液和巯基乙酸盐液体。典型的培养基是胰酶大豆肉汤(TSB)。在蒸汽和干热应用中，也可以使用琼脂基培养基。室温下，琼脂基培养基通常为半固态，当暴露于蒸汽或干热时琼脂融化。激活指示器时，易破裂隔层破裂后，融化的琼脂流入含有检测微生物的容器中，通常剩余液体用于检测的温度下。 [0067] 培养基可包含对特定微生物生长可能发生可以被检测和/或测量到的性质变化的指示剂。例如，提供的指示剂可与生长态微生物产生的特定代谢物(如酶)反应，结果导致颜色变化、pH变化、pH和颜色变化、荧光变化(如发荧光或荧光性)，浑浊度变化等。优选是，选择代谢物使得可以相对快速或较早地检测到微生物活性。优选是，灭菌工艺完成后约两个小时(或更短)之内，代谢物存在的情况下，存有指示剂的量，足以提供检测量的指示剂。根据使用的检测微生物和感兴趣的代谢物来选择指示剂。本领域技术人员预先确定合适的代谢物和用于检测代谢物的适合的指示剂。非限制性的合适代谢物例子是一种酶，例如由细菌如枯草芽孢杆菌分泌的α-淀粉酶、蛋白酶等。合适的指示剂包含，但是不限于，生物活性分子、荧光染料、染料、显色物质、色素、酸类、碱类、放射性标记化合物、发荧光分子、荧光熄灭分子等。典型的指示剂是一种荧光性底物，例如，4-甲基伞形酮-α-D葡萄糖苷(MUD)、4-甲基伞形酮-β-D半乳糖吡喃糖苷(MUG)等。 [0068] 根据感兴趣的性质选择的检测方法，包括如荧光计法、视觉的、pH和光谱学检测方法。在设定时间内，检测到指示器性质中的可测量变化，说明微生物的活性和灭菌不充分。在设定时间内，没有检测到可测量变化，说明灭菌工艺使得检测微生物致死，因此灭菌充分。 [0070] 虽然在生物指示器中，已经对灭菌指示器的使用方法进行了描述，应了解的是，指示器使用是不受限制的，也可以作为酶指示器、生物/酶双重指示器等使用。一个实施方案中，灭菌指示器可以作为一种酶指示器使用。在这个应用中，活性酶置于容器中，与酶作用的底物置于盖帽内槽，并被易破裂隔层封在盖帽内槽中。将活性酶浸在载体片上并置于容器内。然后对指示器进行灭菌处理。灭菌剂进入容器，与载体片上的活性酶接触。灭菌处理后，按上述方法通过向下移动盖帽使易破裂隔层破裂(如被容器内的穿刺部件刺破)，底物流体流入容器并与载体片上的酶接触，从而激活指示器。 [0071] 底物可以通过评价酶的活性来对灭菌工艺有效性进行评价。选择酶和底物，使得底物与活性酶反应后形成可检测产品。通常地，酶的失活将与指示器中检测微生物的死亡相关联。生物指示器中选择使用的酶，应该对灭菌工艺具有跟可能作为污染物存在的微生物至少一样的抵抗力(优选是更有抵抗力)。灭菌循环没有杀死污染性微生物时，酶活性的保留应足以形成可检测的酶-底物产物，但是对于灭菌循环杀死污染性微生物，酶应该失去活性。如果使用的灭菌工艺合适，酶在工艺过程中失活，且不存在可检测的产品。如果使用的灭菌不合适，酶没有失活，且酶将作用于底物形成可检测产物。酶-底物产品可通过颜色改变、荧光信号、发光信号等被检测到。 [0072] 酶和底物的选择不受限制，可以根据特定目的和预期使用进行选择。本领域技术人员能够确定和选择合适的底物，其与活性酶作用产生的产物，可通过荧光、颜色变化等被检测。 [0073] 活性酶可从各种来源中获得，如(i)酶，从合适微生物中分离纯化，(ii)微生物，酶土长其中或通过基因工程加入，(iii)微生物，在芽孢形成或生长过程中加入酶，使得酶与微生物结合或联合。合适的包括从芽孢形成微生物如嗜热芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中获得的酶。用于本发明生物指示器的芽孢形成微生物的酶包括，但不限于，从芽孢形成微生物中获得的β-D-葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶、豆蔻脂肪酶、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶、胰凝胶蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、酪氨酸氨基肽酶、苯丙氨酸氨基肽酶、β-D-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨基肽酶、脯氨酸氨基肽酶和脂肪酸酯酶。 [0074] 适于应用在本发明灭菌指示器中，与酶作用形成可检测产物的显色底物和荧光底物为本领域所熟知。根据产生可见信号的方式将底物分为两组。第一组底物与酶作用形成本身显色或发荧光的酶改性产物。第二组底物形成的酶改性产物，必须进一步与另一化合物反应来产生颜色或荧光信号。很多种荧光底物可与商业应用中各种来源酶发生作用，并且已经应用于酶学工艺。其中有多种荧光性4-甲基伞形酮的衍生物(可水解为4-甲基伞形酮)；7-氨基-4-甲基-香豆素的衍生物；二乙酰荧光素衍生物和荧光胺。 [0075] 可使用的4-甲基伞形酮的衍生物包括，但不限于，4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-4，6-邻苄基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷、4-甲基伞形酮醋酸盐、4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷、4-甲基伞形酮-N-乙酰-α-D-氨基葡糖苷、4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷、2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-N-乙酰神经氨酸、4-甲基伞形酮-α-L阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基伞形酮-β-L-阿拉伯糖苷、4-甲基伞形酮丁酸、4-甲基伞形酮-β-D-纤维二糖糖苷、甲基伞形酮β-D-N，N’-二乙酰壳二糖、4-甲基伞形酮反油酸、4-甲基伞形酮-β-D-墨角藻糖苷、4-甲基伞形酮-α-L-墨角藻糖苷、4-甲基伞形酮-β-L-墨角藻糖苷、4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮-α-D-葡萄糖、4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖、4-甲基伞形酮-β-D-葡糖醛酸、4-甲基伞形酮对胍基苯甲酸盐、4-甲基伞形酮庚酸、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮-β-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮油酸、4-甲基伞形酮棕榈酸盐、 4-甲基伞形酮磷酸盐、4-甲基伞形酮丙酸、4-甲基伞形酮硬脂酸、4-甲基伞形酮硫酸、4-甲基伞形酮-β-D-N，N’，N”-三乙酰基壳三糖、4-甲基伞形酮-2，3，5-三-邻苯甲酰基-α-L阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基伞形酮-对三甲胺肉桂酰氯和4-甲基伞形酮-β-D-木糖苷。 [0076] 下面通过实施例来进一步理解本发明。实施例的目的不是通过各种方式限制本发明而是进一步说明本发明的各个部分。 [0077] 实施例 [0078] 图6-10中所示为一种设计包含有盖帽和容器的自含式生物指示器。盖帽和容器由聚丙烯通过模铸工艺形成。盖帽中充满含有荧光底物的0.5ml培养基。培养基的配方如下： [0079] [0080] 向上述培养基中加入0.2g 4-甲基伞形酮-β-D半乳糖吡喃糖苷(MUG)作为荧光底物。充满培养基盖帽的内槽用1密尔厚铝箔漆层形成的易破裂隔层覆盖。5 10 [0081] 容器底部接种10-10 个cfu(菌落形成单位)嗜热土芽孢杆菌。盖帽固定在容器上，并将样品经过高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌后，用大于或等于约41bs/in向下的力旋转盖帽，使得易破裂隔层被穿刺部件刺破，从而激活指示器。采用同样的方法激活含有5 10 10-10 个cfu嗜热土芽孢杆菌的控制指示器。然后，在STERIS公司提供的8孔、2个温度的荧光培养箱/读数器中，55-60℃培养指示器。荧光读数器在365±20nm激发样品，在 420±nm检测来自样品的发射线。 5 10 [0082] 另一个实施方案中，10-10 个cfu萎缩芽孢杆菌取代嗜热土芽孢杆菌，用于评价基于环氧乙烷的灭菌工艺。将得到的激活的指示器在上述的8孔、2个温度的荧光读数器中，37℃培养激活的指示器。 |
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