마이크로플루이딕 장치, 장치의 제조방법 및 하이드로젤에 세포를 담지하는 방법

마이크로플루이딕 장치, 장치의 제조방법 및 하이드로젤에 세포를 담지하는 방법 {Microfluidic system, manufacturing method thereof and method of cell encapsulation in hydrogel}

본 발명은 세포가 하이드로젤에 담지되는 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세기둥 어레이존과 포커싱존을 통과하면서 단일세포로 분산되어 하이드로젤에 담지되는 마이크로플루이딕 장치, 장치의 제조방법 및 하이드로젤에 세포를 담지하는 방법에 관한 것이다.

하이드로젤은 일반적으로 다량의 수분을 함유할 수 있는 삼차원의 친수성 망상구조를 가진 고분자 물질을 의미한다. 하이드로젤은 적어도 전체 중량의 20%이상의 수분을 흡수할 수 있으며, 95%이상의 물을 흡수하는 것을 고흡수성 하이드로젤이라고 부른다. 하이드로젤은 단일중합체 또는 공중합체로 이루어지며, 외부 이력에 의한 유동성이 거의 없는 구조적으로 안정한 삼차원 네트워크 구조를 형성하는데, 이러한 구조는 공유결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적인 응집 등 여러 요인에 의해 형성된다. 수용액 상에서 팽윤된 후에 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적·물리화학적 특성을 지닌다. 또한, 하이드로젤의 팽윤도는 고분자의 화학구조와 친수성, 고분자사슬 간의 가교도에 따라 조절이 가능하므로 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로젤의 제조가 가능하다.

합성고분자는 종류가 다양하며 물리화학적 표면성질 또는 기계적 성질을 폭넓게 변화시킬 수 있다는 장점을 가지고 있다. 생체재료로 사용되는 대표적인 하이드로젤은 PHEMA이다. PHEMA는 곁가지에 친수성인 수산화기(-OH)를 가지고 있어 쉽게 수화 될 수 있다. 합성고분자를 이용한 하이드로젤을 제조하기 위하여 사용되는 대표적인 방법은 친수성의 폴리에틸렌옥사이드에 소수성의 다른 고분자를 블록 공중합시키는 방법이다. PEO-PPOPEO, PEO-폴리에스터(PLA, PCL 및 PLGA등) 유도체 등이 그 대표적인 예이다. 뿐만 아니라 폴리N-이소프로필아크릴아마이드(PNIPAAm) 계열 유도체 또한 온도감응성 하이드로젤로서 많은 연구가 진행되고 있다. 이외에도 폴리아크릴아마이드(PAAm), 폴리메타아크릴산, 폴리말레인산, 폴리비닐알콜(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리N-비닐피롤리돈(PVP) 등과 같은 친수성 단량체들이 하이드로젤 제조을 위해 많이 사용되고 있다. 또한 폴리(MMA-co-HEMA), 폴리(AN-아릴설포네이트), P(GEMA-설페이트) 등 다양한 공중합체로 이루어진 하이드로젤이 개발되어 있다.

고부가가치의 바이오물질을 얻는 데에 있어서, 하이드로젤에 세포를 담지하는 기술이 이용되어 왔다. 특히 마이크로플루이딕 장치를 이용한 세포 담지 기술은 여러 그룹에 의해 진행되었지만, 대부분 동물세포나 형상이 구형인 세포에 한정되어 있다. 하지만 수많은 바이오 물질과 바이오 의약품을 얻을 수 있는 세포가 미생물이기에 구형 이외의 세포나 미생물을 대상으로 하는 기술이 요구되고 있는 실정이다. 그러나 종래의 마이크로플루이딕 장치를 적용하여 미생물 세포를 하이드로젤에 담지하고자 할 경우, 세포의 모양이 구형이 아니기 때문에 적용하기가 어려운 점이 있었고, 하이드로젤과 같은 고분자 물질에 의한 세포의 뭉침 현상이 나타나므로 이를 해결해야하는 과제가 남아 있다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 먼저 하이드로젤에 담지하고자 하는 목적 세포의 모체가 되는 미생물을 주입하는 시료 주입구, 상기 시료 주입구로부터 포커싱존까지 형성된 제 1 미세유로, 다수의 미세기둥들이 상기 제 1 미세유로 상에 형성된 미세기둥 어레이존, 상기 제 1 미세유로를 중심으로 좌측과 우측에 형성된 오일 주입구, 상기 오일 주입구로부터 형성되어 제 1 미세 유로와 만나는 제 2 미세유로, 상기 제 1 미세유로가 상기 제 2 미세유로와 만나는 부근에 형성되며 유로의 폭이 현저히 감소하는 포커싱존, 상기 포커싱존으로부터 시료 유출구까지 형성된 제 3 미세유로 및 상기 제 3 미세유로 종착부로서 상기 포커싱존에서 형성된 하이드로젤 담지 세포가 유출되는 시료 유출구로 구성되는 마이크로플루이딕 장치를 제공한다.

또한 본 발명의 마이크로플루이딕 장치를 이용한 세포 담지 방법으로서, 먼저 분석하고자 하는 세포의 모체가 되는 미생물을 준비한 후, 상기 미생물에 폴리에틸렌글리콜 다이아릴레이트(PEGDA : Polyethylene Glycol Diacrylate)를 첨가한 세포 용액 제조 및 오일에 계면활성제를 넣은 분산매를 제조하여 각각 시료 주입구과 오일 주입구에 시린지 펌프를 이용하여 주입하여, 세포 용액이 제 1 미세유로를 따라 상기 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존을 통과하며 단일세포체로 분산되게 되며, 상기 분산된 단일세포체가 포커싱존에 근접하여 제 2 미세유로를 통해 이동한 분산매와 접촉하게 되며, 상기 단일세포체가 상기 분산매와 함께 상기 마이크로플루이딕 장치의 포커싱존을 통과하며 상기 단일세포체를 내포하는 하이드로젤 방울이 형성되게 되고, 이렇게 형성된 하이드로젤 방울이 제 3 미세유로를 따라 시료 유출구에 도달하면 수거하는 공정을 제공한다.

본 발명의 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치 및 이를 이용한 세포 담지 방법을 적용하면, 세포의 농도를 희석하지 않고 배지 상태 그대로 사용할 수 있으며, 미세기둥 어레이존이라는 구조체를 이용하여 뭉쳐있는 구형이 아닌 미생물 세포를 분산시키고, 포커싱존에서 하이드로젤 방울에 단일 세포의 형태로 담지함으로써, 고분자로 인한 세포의 뭉침 문제를 해결하는 것이 가능하다. 따라서 고부가가치의 바이오물질을 획득하는 기발 기술의 핵심이 될 수 있다.

도 1은 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 주요 구성 평면도이다.
도 2는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 일실시예로서 미세기둥 어레이존과 포커싱존의 확대도이다.
도 3은 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 시료와 오일의 유입 및 하이드로젤 유출 방법을 설명하는 사시도이다.
도 4는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 제조방법 순서도이다.
도 5는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치를 이용한 세포 담지 방법 순서도이다.
도 6은 세포의 모체가 되는 미생물이 본 발명인 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존에 의해 단일세포로 분산되는 과정을 설명하는 설명도이다.
도 7은 세포의 모체가 되는 미생물이 본 발명인 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존에 의해 단일세포로 분산되는 과정을 설명하는 설명도이다.
도 8은 본 발명인 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존에 의해 용액상태의 하이드로젤 내에서 분산된 단일세포가 포커싱존을 통과하며 하이트로젤 방울에 담지되는 과정을 설명하는 설명도이다.
도 9는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존을 통과하는 세포의 분산 과정을 시간경과 순으로 나열한 사진이다.
도 10는 본 발명의 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존 유무에 의한 세포 분산 효과를 비교한 사진이다.
도 11는 본 발명의 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존 유무에 의한 세포 분산 효과를 비교한 그래프이다.
도 12는 세포 농도에 따른 하이드로젤에 담지된 세포의 수 그래프와 실제 하이드로젤에 담지된 세포의 모습 사진이다.

본 발명은 세포가 하이드로젤에 담지되는 기술에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세기둥 어레이존과 포커싱존을 통과하면서 단일세포로 분산되어 하이드로젤에 담지되는 마이크로플루이딕 장치, 장치의 제조방법 및 하이드로젤에 세포를 담지하는 방법에 관한 것으로 이하 첨부되는 도면과 함께 본 발명을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 주요 구성 평면도로서, 하이드로젤에 담지하고자 하는 목적 세포의 모체가 되는 미생물을 주입하는 시료 주입구(10), 상기 시료 주입구(10)로부터 포커싱존(60)까지 형성된 제 1 미세유로(20), 다수의 미세기둥들이 상기 제 1 미세유로(20) 상에 형성된 미세기둥 어레이존(30), 상기 제 1 미세유로(20)를 중심으로 좌측과 우측에 형성된 오일 주입구(40), 상기 오일 주입구(40)로부터 형성되어 제 1 미세 유로와 만나는 제 2 미세유로(50), 상기 제 1 미세유로(20)가 상기 제 2 미세유로(50)와 만나는 부근에 형성되며 유로의 폭이 현저히 감소하는 포커싱존(60), 상기 포커싱존(60)으로부터 시료 유출구(80)까지 형성된 제 3 미세유로(70) 및 상기 제 3 미세유로(70) 종착부로서 상기 포커싱존(60)에서 형성된 하이드로젤 담지 세포가 유출되는 시료 유출구(80)로 구성되어 있다.

특히 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 부분 확대도로서, 도시된 바와 같이 상기 제 1 미세유로(20) 상에 형성되어 있는 미세기둥 어레이존(30)은 실린더 형상의 미세기둥들이 시료 주입구(10)로부터 기둥 간격 또는 지름이 큰 값에서 작은 값을 가지는 순서로 나열되며, 동일 기둥 간격 또는 동일 지름별로 n개의 구간(2≤n≤5)으로 분할 형성되어, 시료 주입구(10)로부터 기둥 간격 또는 지름이 큰 순서대로 제 1 미세기둥 어레이존부터 제 n 미세기둥 어레이존까지 형성된다. 또한 상기 제 1 미세유로(20)에는 상기 제 n개의 미세기둥 어레이존 구간 사이마다 n-1개의 곡률부(21)가 형성되어 유로의 방향을 전환이 가능하도록 하였다.

또한 도 2에 도시된 바와 같이, 상기 제 1 미세유로의 미세기둥 어레이존(30)이 형성되어 있는 구간, 상기 제 1 미세유로의 제 n 미세기둥 어레이존 말단부로부터 상기 포커싱존(60)까지의 구간, 포커싱존(60) 구간, 상기 제 3 미세유로의 포커싱존(60)으로부터 상기 시료 유출구(80)까지 구간의 유로 폭이 상이하게 구성하였으며, 바람직하게는 상기 제 1 미세유로의 미세기둥 어레이존(30)이 형성되어 있는 구간의 폭은 500 ~ 700 ㎛, 상기 제 1 미세유로의 제 n 미세기둥 어레이존 말단부로부터 상기 포커싱존(60)까지의 구간의 폭은 160 ~ 200 ㎛, 상기 포커싱존(60) 구간이 40 ~ 60 ㎛, 상기 제 3 미세유로의 포커싱존(60)으로부터 상기 시료 유출구(80)까지의 구간이 500 ~ 700 ㎛으로 제작한다. 도 2에 도시된 본 발명의 일실시예는 상기 제 1 미세유로의 미세기둥 어레이존(30)이 형성되어 있는 구간의 폭은 600㎛, 상기 제 1 미세유로의 제 n 미세기둥 어레이존 말단부로부터 상기 포커싱존(60)까지의 구간의 폭이 180㎛, 상기 포커싱존(60) 구간이 50㎛, 상기 제 3 미세유로의 포커싱존(60)으로부터 상기 시료 유출구(80)까지의 구간이 580㎛으로 제작하였다.

도 3은 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 시료와 오일의 유입 및 하이드로젤 유출 방법을 설명하는 사시도로서, 시료 주입구(10)와 오일 주입구(40)는 시린지 펌프에 연결되어 세포 용액(100)과 분산매(200)가 주입되는 것과, 단일세포의 형태로서 담지된 하이드로젤을 수거하는 것을 나타내고 있다.

도 4는 상기에서 상술한 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 제조방법 순서도로서, 먼저 포토리소그래피 방법으로 마스터몰드를 제작한다. 이때 마스터몰드는 미세유로 상에 음각으로 형성된 미세기둥들을 가지도록 제작한다. 이렇게 제작된 마스터몰드에 PDMS(Polydimethylsiloxane)를 채워서, 상기 PDMS가 충전된 마스터몰드 중합체를 60 ~ 80℃ 온도조건의 오븐에서 1 ~ 3시간 경화시킨 후, 상기 경화된 PDMS층을 상기 마스터몰드로부터 탈거하여, 마스터몰드에 의하여 기둥 간격 또는 지름이 상이한 실린더 형상의 미세기둥이 양각으로 형성된 PDMS층에 시료 주입구(10)와 시료 유출구(80)를 펀칭 공정으로 형성하여 마이크로플루이딕 장치를 제작한다. 이후 상기 PDMS 기반의 마이크로플루이딕 장치를 에탄올과 증류수로 세척하여 잔여물 및 먼지를 제거함으로써 제작을 완성한다.

도 5는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치를 이용한 세포 담지 방법 순서도로서, 먼저 분석하고자 하는 세포의 모체가 되는 미생물을 준비한 후, 상기 미생물에 폴리에틸렌글리콜 다이아릴레이트(PEGDA : Polyethylene Glycol Diacrylate)를 첨가하여 세포 용액(100)을 제조한다. 또한 오일에 계면활성제를 넣어 분산매(200)를 제조한다. 이렇게 제조된 상기 세포 용액(100)과 상기 분산매(200)를 상기 마이크로플루이딕 장치의 시료 주입구(10)과 오일 주입구(40)에 각각 시린지 펌프를 이용하여 주입한다.

상기 주입된 세포 용액(100)이 제 1 미세유로(20)를 따라 상기 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존(30)을 통과하며 단일세포체로 분산되게 되며, 도 6과 도 7은 세포가 분산되는 과정을 나타내고 있다. 상기에 이어서 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 분산된 단일세포체가 포커싱존(60)에 근접하여 제 2 미세유로(50)를 통해 이동한 분산매(200)와 접촉하게 되며, 상기 단일세포체가 상기 분산매(200)와 함께 상기 마이크로플루이딕 장치의 포커싱존(60)을 통과하며 상기 단일세포체를 내포하는 하이드로젤 방울이 형성되게 되고, 이렇게 형성된 하이드로젤 방울이 제 3 미세유로(70)를 따라 시료 유출구(80)에 도달하면 수거한다.

본 발명의 상기 세포 용액(100)은 LB 배지상태로서 세포의 모체가 되는 3×10 ⁸ ~ 8×10 ⁸ cells/mL의 미생물, 24.51 ~ 26.03 wt%의 폴리에틸렌글리콜 다이아릴레이트(PEGDA : Polyethylene Glycol Diacrylate), 0.78 ~ 1.23 wt%의 포타슘퍼설페이트(KPS : Potassium PerSulphate), 0.25 ~ 0.31 wt%의 D-소르비톨(D-sorbitol) 및 36.44 ~ 37.13 wt%의 증류수를 포함하는 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예는 세포의 모체가 되는 미생물로서 LB 배지상태의 대장균을 0.5mL, 폴리에틸렌글리콜 다이아릴레이트(PEGDA : Polyethylene Glycol Diacrylate)이 0.3g, 포타슘퍼설페이트(KPS : Potassium PerSulphate)이 12.5mg, D-소르비톨(D-sorbitol)이 4mg, 증류수를 0.5mL로 실시하였다.

도 9는 본 발명인 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존을 통과하는 세포의 분산 과정을 시간경과 순으로 나열한 사진이다. 본 발명의 실시예로서 적용한 대장균의 뭉침현상은 반데르발스 힘과 디플레이션 힘으로 설명할 수 있다. 뭉쳐진 세포들은 미세기둥 어레이존을 지나며 단계적으로 분리가 되며, 최종적으로 단일 세포로 하이드로젤에 담지 된다. 세포덩어리를 분산시키는 원리는 세포 용액(100) 내의 세포들은 세포 용액(100) 유체를 따라 미세유로의 방향으로 흐르게 되며, 이때 세포 용액(100) 유체가 세포를 끌어 당기는 힘으로 미세기둥에 부딪히게 된다. 1차적으로는 큰 덩어리의 세포들이 작은 덩어리로 부서지게 되고, 미세기둥에 의해 사이 통로가 좁아졌기 때문에 세포에 가해지는 전단 응력으로 인해 추가적인 세포의 분리 효과가 나타난다.

도 10과 도 11은 본 발명의 세포를 하이드로젤에 담지하기 위한 마이크로플루이딕 장치의 미세기둥 어레이존 유무에 의한 세포 분산 효과를 비교한 사진과 그래프이다. 먼저 도 10의 (a)와 (c)는 미세기둥 어레이존이 없는 구조체이며, 반면에 (b)와 (d)는 본 발명의 미세기둥 어레이존을 갖춘 구조체이다. 미세기둥 어레이존이 없는 (a)와 (c)는 뭉쳐진 세포가 다수 관찰되지만(노란원의 Cell cluster), 미세기둥 어레이존을 갖춘 (b)와 (d)는 뭉쳐진 세포가 거의 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 또한 붉은색 선으로 구획을 나누어 단위 면적당 나타나는 세포의 수를 1개(단일세포)에서 5개(세포 뭉침 결과)까지 분석해 본 결과를 그래프로 나타낸 도 11에 따르면, 미세기둥 어레이존을 갖춘 곳(Microstructure)에서는 1개의 단일세포가 가장 많이 발견된 반면, 미세기둥 어레이존을 갖추지 못한 곳(No Microstructure)에서는 5개의 뭉쳐진 세포가 가장 많이 발견되었음을 확인할 수 있었다.

도 12는 세포 농도에 따른 하이드로젤에 담지된 세포의 수 그래프와 실제 하이드로젤에 담지된 세포의 모습 사진으로서, 미세기둥의 존재로 인한 유체의 흐름 변화로 발생한 효과로 분산된 세포들은 포커싱존 부분으로 흘러가게 되고, 제 2 미세유로를 통해 양쪽에서 흘러들어온 오일에 계면활성제를 섞은 분산매(200)가 양쪽에서 세포 용액(100)을 압축하면서 폭이 현저하게 감소된 유로인 포커싱존을 통과하므로 높은 수준의 신장력이 작용하며, 이 힘의 도움으로 분산된 세포가 하이드로젤 방울에 하나씩 담길 수 있게 된다. 이렇게 하이드로젤에 담지된 세포들이 도 12에 도시되어 있다.

본 발명을 첨부된 도면과 함께 설명하였으나, 이는 본 발명의 요지를 포함하는 다양한 실시 형태 중의 하나의 실시예에 불과하며, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 하는 데에 그 목적이 있는 것으로, 본 발명은 상기 설명된 실시예에만 국한되는 것이 아님은 명확하다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 하기의 청구범위에 의해 해석되어야 하며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서의 변경, 치환, 대체 등에 의해 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함될 것이다. 또한, 도면의 일부 구성은 구성을 보다 명확하게 설명하기 위한 것으로 실제보다 과장되거나 축소되어 제공된 것임을 명확히 한다.

10. 시료 주입구
20. 제 1 미세유로
21. 곡률부
30. 미세기둥 어레이존
31. 제 1 미세기둥 어레이존
32. 제 2 미세기둥 어레이존
33. 제 3 미세기둥 어레이존
40. 오일 주입구
50. 제 2 미세유로
60. 포커싱존
70. 제 3 미세유로
80. 시료 유출구
100. 세포 용액
200. 분산매
300. 세포체
400. 하이드로젤에 담지된 세포체