[0001] 本发明涉及热稳定的碳酸酐酶在升高的温度在CO2提取中的用途，例如，由废气(flue gas)、沼气(biogas)或天然气(natural gas)提取CO2。本发明还涉及用于提取二氧化碳的生物反应器。此外，本发明涉及在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽及编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞。

[0002] 发明背景

[0003] 碳酸酐酶(CA，EC 4.2.1.1，也称作碳酸脱水酶)催化二氧化碳与碳酸氢盐之间的互变 1933年在牛血中发现了该酶(Meldrum和Roughton，1933，J.Physiol.80：113-142)，而且后来发现它广泛分布于自然界中所有生命领域中。这些酶被分成截然不同的三类，称作α-类、β-类和γ-类，及可能的第四类，即δ-类。
这些类自独立的起源(细菌、古细菌、真菌)进化而来，而且除了催化位点处的单个锌原子以外没有显著的序列或结构同一性(综述参见Tripp等，2001，J.Biol.Chem.276：
48615-48618)。对于α-CA，已经在哺乳动物中鉴定了超过11种同工酶。α-CA在所有哺乳动物组织中含量丰富，在那里它们促进CO2清除。β-CA在藻类和植物中普遍存在，在那里它们为光合作用提供CO2摄取和固定。γ-CA据信是第一个进化的。迄今分离和表征的唯一γ-CA来自古细菌嗜热甲烷八叠球菌菌株TM-1(Alber和Ferry，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6909-6913)，然而，Parisi等，2004，Plant Mol.Biol.55：193-207已经提出了许多γ-碳酸酐酶。已经在原核生物中鉴定出了编码所有三类CA的基因，其中β类和γ类占优势。许多原核生物含有来自超过一类的碳酸酐酶基因或同一类的数种基因(综述参见Smith和Ferry，2000，FEMS Microbiol.Rev.24：335-366；Tripp等，2001，J.Biol.Chem.276：48615-48618)。

[0004] 二氧化碳(CO2)排放是全球变暖现象的主要组成部分。CO2是燃烧的副产品，而且它造成操作、经济、和环境问题。可以通过在排放到大气中之前捕捉CO2气体来控制CO2排放。有数种化学办法来控制CO2排放。然而，这些办法中的许多有缺点，诸如能量消耗高、过程缓慢、和使用有生态问题的或有毒的化合物。

[0005] 利用碳酸酐酶以非常高的速率(周转高达105个CO2分子每秒)催化CO2向碳酸氢盐转变的能力的基于酶的解决方案照顾到了与CO2捕捉有关的速度和环境问题。利用碳酸酐酶从气体(诸如燃烧气体或呼吸气体)提取CO2的技术解决方案已经记载于WO2006/089423；US 6,524,842；WO 2004/007058；WO 2004/028667；US 2004/0029257；US
7,132,090；WO 2005/114417；US6,143,556；WO 2004/104160；US 2005/214936。一般而言，这些技术通过是可溶性的或固定化的碳酸酐酶与CO2(其可以是气相的或液相的)接触来运作。碳酸酐酶催化CO2向碳酸氢盐和/或碳酸盐离子的转变。这些离子可被利用来促进藻类或其它微生物的生长，诱发周围介质中的pH变化或供应缓冲容量，提供碳酸氢盐/碳酸盐作为后续化学过程的活性剂，或作为碳酸盐沉淀，或转变回到纯的CO2，其然后可以被使用(例如用在增强油回收中，用于生产尿素，用于食品和饮料加工，或用于向温室供应CO2)、释放(例如自包容的(contained)生命支持环境诸如潜水艇或宇宙飞船释放)、压缩(例如用于穿过管道运输)、或在加压下储存(诸如在地质构造或深海构造中)。

[0006] 哺乳动物、植物和原核生物的碳酸酐酶(α类和β类碳酸酐酶)一般在生理学温度(37℃)或更低的温度发挥功能。然而，它们溶解进入的液体或燃烧气体的温度可容易地超过碳酸酐酶用于捕捉CO2的最佳温度。如此，使用基于酶的解决方案的缺点之一在于在使含CO2的气体/液体接触碳酸酐酶之前可能需要广泛冷却，而且冷却是耗能过程。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明的一个方面是细菌或古细菌或真菌起源的热稳定的碳酸酐酶用于自含二氧化碳的介质提取二氧化碳的用途，但排除来自嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)菌株TM-1(DSM 1825)的γ类碳酸酐酶。在本发明中有用的热稳定的碳酸酐酶在45℃以上的温度保留活性至少15分钟。特别地，在能够提取自燃烧、或者自粗制天然气或合成气(syngas)或沼气排放出的CO2的生物反应器中使用热稳定的碳酸酐酶。在将碳酸酐酶在使用期间或在空闲期间(例如储存在热的仓库中)暴露于温度可超过45℃的环境时，热稳定性也是有用的。

[0009] 在另一个方面，本发明提供了在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽，其选自下组：

[0010] a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQID NO：4的氨基酸序列有至少94％同一性，或与SEQ ID NO：6的氨基酸序列有至少91％同一性，或与SEQ ID NO：8的氨基酸序列有至少96％同一性，或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列有至少87％或89％同一性，或与SEQ ID NO：12的氨基酸序列有至少97％同一性；

[0011] b)由在中等严格条件(medium stringency condition)下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：

[0012] i)编码选自下组的成熟多肽的多核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，

[0013] ii)选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，

[0014] iii)包含在选自下组的多核苷酸序列中的cDNA序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，[0015] iv)(i)、(ii)或(iii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或

[0016] v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和

[0017] c)(a)或(b)的具有碳酸酐酶活性的片段。

[0018] 在又一个方面，本发明提供了包含本发明多肽的组合物及用于制备此类组合物的方法，包括混合本发明多肽和赋形剂(excipient)。

[0019] 在又一个方面，本发明提供了具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸及包含这样的多核苷酸的核酸构建体以及包含这样的核酸构建体的重组载体或重组宿主细胞。

[0020] 在又一个方面，本发明提供了用于生产本发明多肽的方法，其通过培养其野生型形式就能够生成该多肽的菌株，或通过在有利于该多肽生成的条件下培养包含编码本发明多肽的重组表达载体的重组宿主细胞，并回收该多肽。

[0021] 在又一个方面，本发明提供了适用用于提取二氧化碳的生物反应器。

[0022] 附图简述

[0023] 图1是中空纤维包容液膜(contained liquid membrane)生物反应器的示意图。数字代表以下特征：1.二氧化碳(CO2)罐；2.氮气(N2)或甲烷(CH4)罐；3.质量流量控制器(MFC)；4.膜液储液池(reservoir)；5.液泵；6.压力计；7.中空纤维膜生物反应器(模块)；8.废物；9.原料气(feed gas)；10.洗涤气(scrubbed gas)；11.质量流量计(MFM)；
12气体取样阀；13.气相层析；14.原料气入口；15.洗涤气出口；16.液体入口；17.液体出口。

[0024] 发明详述

[0025] 本发明的一个方面关注热稳定的碳酸酐酶用于自含CO2的介质(诸如气体、液体或多相混合物)提取CO2的用途。特别地，本发明在含CO2的介质的温度在商品化碳酸酐酶(诸如自人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II)的最适温度以上的情况中是有用的。

[0026] 本发明的另一个方面是提供适合用于自温度在商品化碳酸酐酶(诸如自人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II)的最适温度以上的气相或溶液提取CO2的热稳定的碳酸酐酶。本发明的热稳定的碳酸酐酶优选是细菌或古细菌或真菌起源的，而且可以是任何不同CA类的；α、β、γ或δ，除了来自嗜热甲烷八叠球菌TM-1(DSM 1825)的γ类碳酸酐酶。在一个优选的实施方案中，碳酸酐酶属于α类或β类，而且更优选的是，它们属于α类。

[0027] 定义

[0028] 术语“古细菌起源”包括自古细菌衍生的诸如多肽、核酸、DNA和RNA衍生物等分子。它还意图包括经过修饰的或经过突变的分子，其中亲本分子最初衍生自古细菌。经过修饰的或经过突变的分子的起源应当仍可识别，优选的是，多肽和核酸序列与亲本分子至少60％相同，更优选的是，它与亲本分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％或99％相同。

[0029] 术语“细菌起源”包括自细菌衍生的诸如多肽、核酸、DNA和RNA等分子。它还意图包括经过修饰的或经过突变的分子，其中亲本分子最初衍生自细菌。经过修饰的或经过突变的分子的起源应当仍可识别，优选的是，多肽和核酸序列与亲本分子至少60％相同，更优选的是，它与亲本分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

[0030] 术语“碳酸酐酶活性”或“CA活性”在本文中定义为催化二氧化碳与碳酸氢盐之间的互变 的EC 4.2.1.1活性。为了本发明的目的，CA活性是根据实施例3或4中所描述的规程测定。一个单位的CA活性是按Wilbur定义的[1U＝(1/tc)-(1/tu)x1000]，其中U是单位，而tc和tu分别代表以秒计的催化的和未催化的反应的时间(Wilbur，1948，J.Biol.Chem.176：147-154)。本发明的多肽具有由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的多肽的CA活性的至少20％、优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、和甚至最优选至少100％。

[0031] 术语“含CO2的介质”用于描述任何可含有至少0.001％CO2、优选至少0.01％、更优选至少0.1％、更优选至少1％、更优选至少5％、最优选10％、甚至更优选至少20％、和甚至最优选至少50％CO2的材料。优选的是，含CO2的介质具有45℃-100℃，更优选45℃-80℃，甚至更优选45℃-60℃，和最优选45℃-55℃的温度。特别地，含CO2的介质是气相、液体或多相混合物，但是也可以是固体。含CO2的气相是例如自油井、气井、和凝析油气井(condensate well)得到的粗制天然气，通过含碳燃料(例如甲烷)气化成包含CO和H2的气体产物而产生的合成气，或来自燃烧过程(例如来自基于碳的发电厂，或来自这些发电厂的废气烟囱、工业炉、火炉、烤炉、或壁炉，或来自飞机或汽车排气)的排放流。或者，含CO2的气相可来自哺乳动物、活的植物和其它CO2排放物种中的呼吸过程，特别是来自温室。
含CO2的气相还可以是来自需氧或厌氧发酵(诸如酿造、用于生产有用产物(诸如乙醇)的发酵、或沼气生产)的废气(off-gas)。如果此类发酵过程受到嗜热微生物促进的话，那么它们能在升高的温度发生，这在例如沼气生产中看到了。或者，含CO2的气相可以是为了使用或储存目的富集了CO2的气相。上文所述气相也可以作为多相混合物存在，其中气体与某种程度的液体(例如水或其它溶剂)和/或固体物质(例如灰或其它微粒)共存。含CO2的液体指任何含有可测量的量的CO2(优选在上文所述水平之一)的溶液或液体，特别是含水液体。含CO2的液体可以通过让含CO2的气体或固体(例如干冰或含可溶性碳酸盐的盐)通入液体来获得。含CO2的液体还可以是压缩的CO2液体(其含有污染物，诸如干洗流体)、或超临界CO2、或CO2溶剂液体(像离子性液体)。

[0032] 术语“CO2提取”应理解为自含CO2的介质减少CO2。这样的提取可以从一种介质到另一种介质地进行，例如气体到液体、液体到气体、气体到液体到气体、液体到液体或液体到固体，但是提取也可以是同一介质中CO2向碳酸氢盐或碳酸盐的转变。术语CO2捕捉还用于指CO2从一种介质到另一种介质的提取或CO2向碳酸氢盐或碳酸盐的转变。

[0033] 在用于本文时，术语“编码序列”指直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开读框决定，其通常以ATG起始密码子或诸如GTG和TTG的替代起始密码子开始。编码序列可以是DNA、cDNA、mRNA、或重组核苷酸序列。

[0034] 术语“多肽的功能性片段”用于描述自更长的多肽衍生的多肽，例如成熟多肽，而且它已经在N-端区和/或C-端区中截短以生成亲本多肽的片段。为了成为功能性多肽，片段必须维持亲本多肽的CA活性的至少20％、优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、和甚至最优选至少100％。

[0035] 术语“真菌起源”包括自真菌衍生的诸如多肽、核酸、DNA和RNA等分子。它还意图包括经过修饰的或经过突变的分子，其中亲本分子最初衍生自真菌或细菌。经过修饰的或经过突变的分子的起源应当仍可识别，优选的是，多肽和核酸序列与亲本分子至少60％相同，更优选的是，它与亲本分子至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

[0036] 术语“同一性”用于描述两种氨基酸序列或两种核酸序列之间的相关性。为了本发明的目的，两种氨基酸序列的比对是使用来自EMBOSS包(http://emboss.org)2.8.0版的Needle程序测定的。Needle程序执行Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453中描述的全局比对算法。所使用的替代矩阵是BLOSUM62，缺口打开罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。两种氨基酸序列之间的同一性程度是以两种序列的比对中精确匹配数目除以最短序列的长度来计算的。结果以百分比同一性来表述。在“第一序列”与“第二序列”在交叠的同一位置具有相同氨基酸残基时(在下文的比对实例中，这以“|”表示)，发生精确匹配。在下文的纯粹假设比对实例中，交叠为序列1的氨基酸序列“HTWGERNL”；或序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在该实例中，以一个“-”表示一个缺口。

[0037] 序列1：ACMSHTWGER-NL (SEQ ID NO：17)

[0038] | ||| ||

[0039] 序列2： HGWGEDANLAMNPS (SEQ ID NO：18)

[0040] 两种核苷酸序列之间的同一性程度是使用与上文所述相同的算法、软件包和设置测定的。

[0041] 术语“表达”包括多肽的生成中所牵涉的任何步骤，包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

[0042] 术语“表达载体”在本文中定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸且该多核苷酸与供用于其表达的额外核苷酸可操作连接。

[0043] 术语“加热稳定的”或“热稳定的”在本文中用于指酶(诸如碳酸酐酶)时，指明了该酶在升高的温度，即，45℃以上、优选50℃以上、更优选55℃以上、更优选60℃以上、甚至更优选65℃以上、最优选70℃以上、最优选80℃以上、最优选90℃以上、和甚至最优选100℃以上，是功能性的或有活性的(即能进行催化)。碳酸酐酶的温度稳定性能通过配制(例如通过酶的固定化)而提高一定程度。要使酶认为是热稳定的，它在升高的温度维持活性至少15分钟、优选至少2小时、更优选至少24小时、更优选至少7天、甚至更优选至少
14天、最优选至少30天、甚至最优选至少50天。一般而言，活性水平是在升高的温度指定时间后测量的。可以将该活性与温度升高前的酶活性进行比较。优选的是，在升高的温度指定时间后的活性是至少40％，更优选的是在升高的温度指定时间后的活性是至少50％，更优选的是在升高的温度指定时间后的活性是至少60％，甚至更优选的是在升高的温度指定时间后的活性是至少70％，最优选的是在升高的温度指定时间后的活性是至少80％，甚至最优选的是该活性是至少90％，和最优选的是在升高的温度指定时间后的活性水平是至少相等的或无变化的。

[0044] 术语“宿主细胞”在用于本文时包括任何对使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等等易感的细胞类型。

[0045] 术语“分离的多肽”在用于本文时指根据SDS-PAGE的测定，至少20％纯、优选至少40％纯、更优选至少60％纯、甚至更优选至少80％纯、最优选至少90％纯、和甚至最优选至少95％纯的多肽。

[0046] 术语“可操作连接”在本文中指如下的构造，其中控制序列位于相对于多核苷酸系列的编码序列适宜的位置，使得控制序列指导多肽编码序列的表达。

[0047] 术语“核苷酸序列中编码成熟多肽的区域”在用于本文时指核苷酸序列中自编码成熟多肽的第一个氨基酸的三联体至编码成熟多肽的最后一个氨基酸的最后一个三联体计数的区域。

[0048] 术语“多肽片段”在本文中定义为自本发明的序列或其同源序列的氨基和/或羧基末端删除了一个或多个氨基酸的多肽，其中该片段具有CA活性。

[0049] 术语“分泌型多肽”在用于本文时应理解为在细胞中表达后被转运和释放至周围的胞外培养基或结合/包埋在细胞膜中使得多肽的至少一部分暴露于周围的胞外培养基的多肽。

[0050] 术语“基本上纯的多肽”在本文中指含有(按重量计)至多10％、优选至少8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、至多3％、甚至更优选至多2％、最优选至多1％、和甚至最优选至多0.5％与其天然相关的其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选的是基本上纯的多肽是至少92％纯的、优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、更优选至少98％纯的、甚至更优选至少99％纯的、最优选至少99.5％纯的、和甚至最优选100％纯的(以制备物中存在的总多肽物质的重量计)。本发明的多肽优选是处于基本上纯的形式。特别地，优选的是多肽是处于“本质上纯的形式”，即，多肽制备物本质上不含与其天然相关的其它多肽物质。这可以通过例如通过公知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽来实现。

[0051] 在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“处于分离的形式的多肽”同义。

[0052] 术语“合成气”或“合成气体”用于描述通过含碳燃料(例如甲烷或天然气)气化成具有热值的气体产物而生成的、含有不同量的一氧化碳和氢气的气体混合物。CO2在合成气反应中产生，而且必须清除以提高热值。

[0053] 与生物体有关的术语“嗜热的”描述在相对较高的温度(即45℃以上)旺盛生长的生物体。超嗜热生物体在极热环境中(也就是比60℃左右还热)旺盛生长，最适温度为80℃以上。

[0054] 热稳定的碳酸酐酶的用途

[0055] 当前知道两种热稳定的碳酸酐酶，即来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)ΔH的β类CA(Cab)(其据报道在高达75℃是热稳定的)(Smith和Ferry，1999，J.Bacteriol.181：6247-6253)和来自嗜热甲烷八叠球菌TM-1的γ类碳酸酐酶(Cam)。Cam是在1994年得到首次分离的(Alber和Ferry，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6909-1913)，而且在1996年显示出在55℃加热时稳定15分钟(Alber和Ferry，1996，J.Bacteriol.178：3270-3274)。Cam是唯一得到分离的γ类酶，而且自其发现之后已经进行了许多表征研究。然而，从未提出过在任何技术用途中开发这些酶的热稳定性。
US 2004/0259231披露了Cam以及非热稳定的人CA同种型IV在CO2溶解和浓缩过程中的用途，然而，没有关于Cam优于CA-IV的迹象。

[0056] 就我们所知，迄今为止没有记载自自然界中存在的生物体分离的热稳定的α类碳酸酐酶(天然存在的热稳定的α-碳酸酐酶)。US 2006/0257990记载了具有某些程度热稳定性的人碳酸酐酶II变体。

[0057] 本发明的一个方面是热稳定的碳酸酐酶在自含CO2的介质(诸如气体、液体或多相混合物)提取CO2中的技术应用。优选的是，将CO2提取至另一种与第一介质分开的介质(诸如气体或液体)，但是提取也可以是同一介质中CO2向碳酸氢盐的转变。特别地，本发明在含CO2的介质的温度在商品化碳酸酐酶(诸如自人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II，其具有大约37℃的最适温度)的最适温度以上的情况中是有用的。

[0058] 在本发明的一个实施方案中，在CO2提取中应用的热稳定的碳酸酐酶是细菌或古细菌或真菌起源的，除了来自嗜热甲烷八叠球菌TM-1(DSM 1825)的γ类碳酸酐酶。在另一个实施方案中，在CO2提取中应用的碳酸酐酶可以来自任何的不同CA类；α、或β或γ，优选的是，它们属于α类或β类。

[0059] 在另一个实施方案中，在CO2提取中应用的碳酸酐酶属于α类，特别地，天然存在的α类碳酸酐酶是优选的。供本发明中使用的其它优选的热稳定的碳酸酐酶是与选自下组的碳酸酐酶至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的那些：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：
10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16，或来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16(NCBI登录号Q5WD44)，或来自耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)(NCBI登录号Q9KFW1)。α类碳酸酐酶一般是单体，受到磺胺类药的抑制，而且拥有酯酶活性(人CA-III是例外，因为这种异构体(isomer)对磺胺类药不敏感，而且不水解对硝基苯基乙酸酯)。另外，α-碳酸酐酶以它们的共有序列基序来鉴定：S-E-[HN]-x-[LIVM]-x(4)-[FYH]-x(2)-E-[LIVMGA]-H-[LIVMFA](2)。α碳酸酐酶一般是分泌型的，这在需要工
5
业规模的表达时是有利。另外，α类碳酸酐酶是具有高达10个CO2分子每秒的最高周转(turnover)的CA类。具有高活性的酶一般是有利的，因为需要的酶量可以降低，或者过程比使用活性较低的酶更迅速。

[0060] 在另一个实施方案中，在CO2提取中应用的碳酸酐酶属于β类。供本发明中使用的优选的热稳定的β-碳酸酐酶是与选自下组的碳酸酐酶至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的那些：来自热自养甲烷杆菌ΔH的β-碳酸酐酶(NCBI登录号Q50565)，来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的β类碳酸酐酶(NCBI登录号YP_176370/Q5WE01)，来自耐盐芽孢杆菌的β-碳酸酐酶(NCBI登录号NP_244152/Q9K7S3)，和来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的β-碳酸酐酶(NCBI登录号Q4WPJ0、A4DA32、Q4WQ18或 A4DA31)。β类碳酸酐酶以二聚体、四聚体、六聚体和
4
八聚体存在。一般而言，β-碳酸酐酶是胞内蛋白质，而且它们每秒周转大约2x10个CO2分子。有些β-碳酸酐酶也能也能以Expasy主页上prosite文件号PDOC00586(www.expasy.org/cgi-bin/prosite-search-ac？PDOC00586)下披露的共有序列基序来鉴定：
C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]。

[0061] 在又一个实施方案中，在CO2提取中应用的碳酸酐酶属于γ类碳酸酐酶，除了来自嗜热甲烷八叠球菌菌株TM-1(DSM 1825)的碳酸酐酶(Cam)(Alber和Ferry，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6909-6913)。γ类碳酸酐酶是三聚体，对磺胺类药的灵敏度低1000-10000倍，而且没有酯酶活性。已知有些γ-碳酸酐酶是分泌型的，而且它们的周转
4
高达7x10个CO2分子每秒。一般而言，γ类碳酸酐酶是一组非常不同的蛋白质，其共享左手平行β-螺旋(LβH)折叠的序列基序特征(Parisi等，2000，Molecular Phylogenetics and Evolution 12：323-334)。

[0062] 特别地，碳酸酐酶(尤其是热稳定的碳酸酐酶)可用于自CO2排放流提取二氧化碳，例如自发电厂中基于碳的或基于碳氢化合物的燃烧，或自来自这些发电厂的废气烟囱、工业炉、火炉、烤炉或壁炉，或自飞机或汽车排气。碳酸酐酶(特别是热稳定的碳酸酐酶)还可用于在工业气体的制备中清除CO2，诸如乙炔(C2H2)、一氧化碳(CO)、氯气(Cl2)、氢气(H2)、甲烷(CH4)、一氧化二氮(N2O)、丙烷(C3H8)、二氧化硫(SO2)、氩气(Ar)、氮气(N2)和氧气(O2)。碳酸酐酶还可用于在天然气加工期间自粗制天然气清除CO2。自粗制天然气清除3
CO2会有助于富集天然气中的甲烷(CH4)含量，由此提高热单位/m。粗制天然气一般是自油井、气井和凝析油气井得到的。在通过常规方法自地质天然气储液池得到时，天然气含有
3％-10％的CO2。碳酸酐酶还可用于纯化天然气，使得它基本上不含CO2，例如，使得CO2含量在1％以下，优选在0.5％、0.2％、0.1％、0.05％以下，和最优选在0.02％以下。与天然气的甲烷富集类似，碳酸酐酶还可用于富集沼气中的甲烷含量。沼气总是会含有相当程度的CO2，因为在发酵过程中所使用的细菌生成甲烷(60-70％)和CO2(30-40％)。沼气生产可使用嗜温或嗜热微生物来进行。嗜温菌株的加工温度为大约25℃-40℃，优选30℃-35℃。
在此温度范围内，碳酸酐酶可以是牛或人起源的，因为对酶的热稳定性没有要求。然而，耐受更高温度的碳酸酐酶在与利用嗜温菌株的沼气加工有关的实际使用和储存中会提供改善的稳健性。嗜热菌株容许发酵在升高的温度发生，例如，40℃-80℃，和优选50℃-70℃，和甚至更优选55℃-60℃。在此类加工中，热稳定的碳酸酐酶对于自甲烷清除CO2是特别有用的。本发明提供了碳酸酐酶用于降低沼气中的二氧化碳含量的用途，优选的是，CO2含量得到降低，使得它占到不足25％，更优选不足20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％，和最优选不足0.1％。在一个优选的实施方案中，碳酸酐酶是热稳定的。此外，碳酸酐酶可以在合成气生产中应用，通过清除由含碳燃料(例如甲烷或天然气)气化产生的CO2，由此富集合成气的CO、H2含量。在合成气生产在升高的温度发生的情况中，使用热稳定的碳酸酐酶是有利的。本发明提供了碳酸酐酶用于在合成气生产中降低二氧化碳的用途。优选的是，CO2含量得到降低，使得它占到不足25％，更优选不足20％、15％、10％、5％、2％、1％、
0.5％，和最优选不足0.1％。在一个优选的实施方案中，碳酸酐酶是热稳定的。优选的是，用于如上所述的CO2提取的碳酸酐酶在升高的温度，在45℃以上、优选50℃以上、更优选55℃以上、更优选60℃以上、甚至更优选65℃以上、最优选70℃以上、最优选80℃以上、最优选
90℃以上、和甚至最优选100℃以上的温度维持活性至少15分钟、优选至少2小时、更优选至少24小时、更优选至少7天、甚至更优选至少14天、最优选至少30天、甚至最优选至少
50天。碳酸酐酶的温度稳定性能通过配制(例如通过酶的固定化)而提高一定程度。

[0063] 在本发明的一个方面，自含CO2的介质提取CO2是在基于酶的生物反应器中进行的。在生物反应器中加工含二氧化碳的介质之前，可以将它纯化至不含可扰乱酶促反应或以其它方式(例如通过使出口或膜凝结(clotting))干扰生物反应器功能性的污染物。在将气体/多相混合物通入生物反应器之前，优选对由燃烧过程排放的气体/多相混合物(例如废气或排气)清除掉灰、微粒、NOx和/或SO2。来自不同区域的粗制天然气可具有不同的组成和分离要求。优选的是，在基于酶的生物反应器中提取CO2之前，清除油、冷凝物、水和天然气液体，如果它们存在于粗制天然气中的话。可以在与除硫相同的工艺中自粗制天然气提取CO2，或者可以在完全分开的工艺中提取CO2。如果此点的气体超过本发明碳酸酐酶的最适温度，那么可需要一定程度的冷却。优选的是，反应温度为45℃-100℃，更优选45℃-80℃，甚至更优选45℃-60℃，和最优选45℃-55℃。然而，由于本发明酶的热稳定性，需要的冷却至少比在生物反应器中应用自人或牛红细胞分离的CA-I或CA-II的情况少
5℃。

[0064] 一类对本发明有用的生物反应器基于如下的过程，其中混合气体流(例如，含有氧气、氮气和二氧化碳)在气体-液体界面处接触酶，碳酸酐酶，以催化气体中所含有的二氧化碳向碳酸氢盐或碳酸盐的转变。这样的生物反应器中的气体-液体界面可通过例如基于酶的中空纤维膜生物反应器(HFMB)来提供。HFMB的一个例子是如Majumdar等，1988，AIChE 1135-1145所述的中空纤维包容液膜(HFCLM)。CLM是通过将核心液体夹在两个聚合物膜之间而制成的。核心液体优选通过液膜溶剂的储液池连续再供给。在生物反应器中有用的另一类基于酶的CLM渗透器记载于Cowan等，2003，Ann.NY Acad.Sci.984：453-469(通过提述并入本文)。总之，此参考文献的生物反应器包含通过将含碳酸酐酶的磷酸盐缓冲溶液夹在两个疏水性微孔聚丙烯膜(例如Celgard PP-2400)之间而构建的液膜。CA浓度优选为100-166μM，而且缓冲液具有50-75mM的磷酸盐浓度和6.4-8.0的pH。CA和缓冲剂的优选浓度是给料CO2浓度的函数。最适pH是CO2浓度和缓冲强度的函数。水相的厚度(thickness)优选是330μm，但是可以通过使用环形间隔物(annular spacer)而自70μm至670μm变化。优选的膜厚度主要由针对其它气体(诸如NO2或O2)的期望选择性且其次由期望渗透决定。液膜流体体积通过来自储液池的流体静力液体添加而维持，确保恒定的液膜厚度并防止聚合物膜与金属支持物之间的分离。CLM的一侧(给料膜)接触含CO2的原料气流，而CLM的另一侧(扫除膜(sweep membrane))接触不含CO2的扫除气流，例如氩气。在这种生物反应器中，来自原料气流的CO2在液相中被转变成碳酸氢盐，然后作为CO2由它能以CO2压缩形式储存之处返回至扫除气体流。整个过程受到碳酸酐酶的催化。上文所述CLM渗透器能够从含低至0.1％CO2的原料气流捕捉CO2。另一种CLM渗透器由中空纤维膜垫构成，例如Celgard X40-200或X30-240，代替疏水性微孔聚丙烯膜。可以对中空纤维CLM使用相同的CA浓度、缓冲剂浓度和pH。可以将中空纤维渗透器布置成不同的设计。在一种设计中，渗透器排列得很像热交换器，而且由多组正交排列的中空纤维给料纤维和中空纤维扫除纤维组成，同时有载流液体填充给料与扫除纤维束之间的空间(参见例如Majumdar等，1988，AIChE 1135-1145)。另一种设计是能以并流(co-current)或逆流(counter-current)模式操作的螺旋缠绕中空纤维设计。WO04/104160更详细地记载了这些和其它中空纤维渗透器设计，特别是参见图1-14(通过提述并入本文)。WO 04/104160记载了磷酸盐缓冲液作为膜液体的用途。在将碳酸酐酶添加至膜液体时，它溶解在磷酸盐缓冲液或1M NaHCO3中。

[0065] 本发明人认识到，在使用碳酸氢盐缓冲液作用膜液体时，缓冲液的pH对于能自废气提取的CO2的量是重要的。碳酸氢盐溶液pH的升高提高二氧化碳向碳酸氢盐的水合速率。在本发明的一个优选实施方案中，膜液体是碳酸氢盐缓冲液，诸如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯或其它合适的碳酸氢盐。碳酸氢盐缓冲液的pH优选8.5以上、更优选9.0以上、甚至更优选9.5以上、甚至更优选9.95以上、和最优选10.5以上或pH 11以上。缓冲液pH的升高容许降低自原料气提取CO2所需要的碳酸酐酶的量。优选的是，碳酸酐酶的量为2g酶蛋白质/L膜液体以下，更优选其为1.5g/L以下、甚至更优选1g/L以下、甚至更优选
0.6g/L以下、甚至更优选0.3g/L以下和甚至更优选0.1g/L以下、和最优选0.01g/L以下、和甚至最优选0.001g/L以下。

[0066] 另一类在本发明中可能有用的生物反应器基于如下的过程，其中气相或多相混合物在气相中的CO2被液相吸收的条件下接触液相，CO2在液相中被碳酸酐酶转变成碳酸氢盐。优选的是，反应温度为45℃-100℃、更优选45℃-80℃、甚至更优选45℃-60℃、和最优选45℃-55℃。通过连续流自反应物清除富集了碳酸氢盐的液体，以确保CO2与碳酸氢盐之间的平衡向着CO2连续转变移动。气相溶解入液相依赖于气体与液体之间的表面接触。大接触面积可通过使液体和含CO2的气体通过填充柱或通过使含CO2的气体鼓泡通过液体，在反应室内生成升高的压力来实现。这些类型的反应器分别记载于美国专利No.6,524,843和WO 2004/007058(将这两篇参考文献完整并入本文)。总之，填充柱可以由填料构成，诸如拉西环(raschig rings)、贝尔鞍形填料(berl saddles)、英特洛克斯金属(intalox metal)、英特洛克斯鞍形填料(intalox saddles)、鲍尔环(pall rings)。填充材料可以是聚合物，诸如尼龙、聚苯乙烯、聚乙烯、陶瓷诸如硅土、或金属诸如铝。在这两类反应器中，液体都是连续交换的，因此必须通过各种手段在反应器中保持碳酸酐酶。在填充柱中，可以将碳酸酐酶固定化在填充材料上(关于固定化CA的方法参见例如WO 2005/114417)。在“鼓泡”反应器中，可以将碳酸酐酶封装在多孔基底中，例如不溶性凝胶微粒，诸如硅土、藻酸盐、藻酸盐/壳聚糖、藻酸盐/羧甲基纤维素，或者可以将碳酸酐酶在液体中在悬浮液中固定化在固体包装上(正如在填充柱中)，或者可以将碳酸酐酶化学连接在清蛋白或PEG网络中。当反应器运转时，水的或有机的溶剂在一端(优选顶部)进入反应器并流至另一端(优选底部)，而含有CO2的气流(原料气)在一端(优选与溶剂对立的那端)(底部)进入反应器，而且气体穿过液体并经对立端(优选反应性的顶部)的气体出口离开。离开反应器的溶剂/液体富集了碳酸氢盐，而且离开的气体与原料气相比降低了CO2含量。含有碳酸氢盐的溶液可以在后续反应中加工，例如用于生成纯的CO2或碳酸氢盐沉淀诸如CaCO3。离开气体还可进行下一轮CO2提取。在本发明的一个优选实施方案中，反应器液体是碳酸氢盐缓冲液，诸如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯或其它合适的碳酸氢盐。碳酸氢盐缓冲液的pH优选为8.5以上、更优选9.0以上和甚至更优选9.5以上、甚至更优选9.95以上、和最优选
10.5以上或pH 11以上。

[0067] 第三类在本发明中有用的生物反应器记载于美国专利No.7,132,090(通过提述并入本文)。总之，通过让CO2气通过气体扩散膜来使CO2气或来自多相混合物的CO2扩散进入捕捉用液体。CO2可通过扩散(压力帮助的)进入液体，或者可通过固定化(例如通过交联或通过将含有碳酸酐酶的凝胶或聚合物基质附着到扩散膜上)在扩散膜上的碳酸酐酶来帮助转移。由于碳酸酐酶与溶解的CO2特异性地起反应，因此它通过加速溶解的CO2和水形成碳酸的反应而有利于CO2气进入液体的运动，由此快速清除CO2并容许CO2自给料流的气体溶解进入水，达到比其它条件更大的程度。优选的是，气体扩散膜具有高表面积以促进气态CO2的大气流穿过膜。合适的膜包括聚丙烯气体交换膜、ePTFE(GORE-TEX)、Nafion膜、沸石、壳聚糖(chytosan)、聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrollidine)、乙酸纤维素、和固定化的液膜。使自气体扩散膜出现的富含CO2/碳酸氢盐的液体穿过含有碳酸酐酶的基质。优选的是，基质包含在与包含扩散膜的室分开的室内。合适的基质的例子包括珠(beads)、织物(fabrics)、纤维(fibers)、膜(membranes)、微粒(particulates)、多孔表面(porous surfaces)、杆(rods)和管(tubes)。合适的基质的具体离子包括氧化铝/矾土、膨润土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支持物、粘土、胶原、玻璃、羟基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚类聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、硅胶和TEFLON牌PTFE。可以将碳酸酐酶固定化至基质，或者将碳酸酐酶封装在基质内。一旦将CO2通入液体，会建立碳酸、碳酸氢根和碳酸根离子之间的平衡，-
即由碳酸酐酶催化的过程。然后可以添加碱(例如OH离子)以使平衡向着有利于碳酸氢根离子形成移动。在最后一步中，向溶液中添加矿物离子以沉淀碳酸氢盐。或者，不添加碱，由此主要生成能使用离子交换树脂或膜来浓缩的碳酸氢根离子。然后可以使用钠、镁或钙离子来沉淀碳酸氢根。在本发明的一个优选实施方案中，捕捉用液体是碳酸氢盐缓冲液，如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯或其它碳酸氢盐。碳酸氢盐缓冲液的pH优选为8.5以上、更优选9.0以上和甚至更优选9.5以上、甚至更优选9.95以上、和最优选10.5以上或pH 11以上。在本发明的一个优选实施方案中，生物反应器以稳态条件运转，由此由碳酸酐酶提供的CO2摄取速率的改善导致生物反应器的整体效率改善。

[0068] 上文所述包括本发明的热稳定的碳酸酐酶的基于酶的生物反应器还用于更多的非常规应用，诸如在飞行员座舱、潜水艇、水中装置(aquatic gear)、安全和消防装置(safety and firefighting gear)及宇航员太空服中，用于保持呼吸不含有毒CO2水平的空气。其它应用有自有限空间清除CO2，诸如自进行发酵的封闭建筑物和酿酒厂内部，及自对CO2敏感的环境(像博物馆和图书馆，用于防止过量的CO2引起对书籍和艺术品的酸损害)降低有害的CO2水平。

[0069] 碳酸酐酶可用作独立的CO2提取催化剂，或者它可以与常规的CO2提取技术联合，TM诸如经由基于胺的溶剂或氨水或物理溶剂诸如Selexol (UnionCarbide)或聚乙二醇醚的化学吸收。本发明人已经显示了，通过将碳酸酐酶添加至MEA溶液，净化效率得到了显著提高。在本发明的又一个实施方案中，将碳酸酐酶(优选热稳定的碳酸酐酶)与二氧化碳吸收化合物组合，诸如基于胺的化合物，诸如含水的链烷醇胺，包括单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、甲基二乙醇胺(MDEA)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)、2-氨基-2-羟甲基-1，
3-丙二醇(AHPD)或其它基于伯胺、仲胺、叔胺或受阻胺的溶剂，或甘氨酸和牛磺酸或其它液体吸收剂(如不同离子强度的NaOH、KOH、LiOH)的含水的盐，不同离子强度的碳酸盐或碳酸氢盐溶液或含水的电解质水溶液和促进剂诸如哌嗪、或聚乙二醇醚、或它们的混合物或其类似物或混合物。或是可以在上文所述生物反应器中应用该组合，或是可以将它应用于早就存在的基于常规技术的CO2净化设备。在常规的生物反应器中，链烷醇胺的浓度通常为
15-30重量百分比。在常规的工艺中，添加专有的抑制剂(诸如Fluor Daniel的EconAmine)来实现提高胺浓度同时降低腐蚀风险。在上文所述生物反应器中，链烷醇胺的浓度通常为
15％(V/V)以下，更优选12％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％以下，和最优选为0.1％(V/V)以下。

[0070] 本发明的另一个方面涉及沼气生产，其中CO2提取是在沼气发酵培养液(broth)中直接进行的，作为如上所述使沼气穿过生物反应器的替代方法。通过将碳酸酐酶添加至厌氧培养基，更多的来自气相的CO2能被转变成碳酸氢盐，其是产甲烷的古细菌的甲烷生成的底物。已经显示对于嗜热甲烷八叠球菌TM-1，碳酸氢盐可能是甲烷生成的限制性因素，例如在低碳酸氢盐溶液(0.6mM)中培养的嗜热甲烷八叠球菌的培养物显示出与含有10倍高碳酸氢盐剂量(6mM)的培养物相比可观的延滞期(即，甲烷生成稍后开始)。另外，在较低碳酸氢盐剂量的情况中的甲烷总产量要低25倍(Murray和Zinder，1985，Appl.Environ.Microbiol.50：49-55)。

[0071] 本发明的另一个方面是将碳酸酐酶添加至发酵培养液，特别是在培养液中的碳酸氢盐浓度是限制性因素的情况中。添加碳酸酐酶能提高甲烷生产。具体而言，甲烷八叠球菌属常常存在于嗜热沼气消化者中(Mladenovska和Ahring，2000，FEMS Microbiol.Ecol.3：225-229)。因此，如果沼气生产是使用一种或多种嗜热微生物(例如能利用CO2/碳酸氢盐作为生长和甲烷生成的碳源的产甲烷菌，像甲烷八叠球菌属菌种)在升高的温度进行的，那么热稳定的碳酸酐酶会是特别有用的。

[0072] 本发明的又一个实施方案是碳酸酐酶(特别是热稳定的碳酸酐酶)作为沼气发酵培养液中的添加剂的用途。

[0073] 多肽

[0074] 与本发明的序列类似的来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的多肽序列披露于NCBI数据库，编号Q5WD44(呈现为SEQ ID NO：14)。该序列是由源自Kao实施的克劳氏芽孢杆菌KSM-K16基因组测序计划的核苷酸序列翻译得到的。根据与其它α类碳酸酐酶的相似性，将该核苷酸序列归入此类，但是就我们所知，它从未表达和表征过。因此，在本申请的实施例中首次克隆了该核苷酸序列和表达了该多肽，而且显示了该多肽在加热至50℃以上的温度15分钟和2小时后拥有碳酸酐酶活性。

[0075] 本发明的一个方面涉及α类型的新颖的热稳定的碳酸酐酶。一个实施方案涉及分离的多肽，其具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少97％、优选至少98％、更优选至少99％、最优选至少100％的同一性程度，该多肽具有碳酸酐酶活性(此后称为“同源多肽”)。在一个优选的实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12的氨基酸序列相差7个氨基酸、优选5个氨基酸、更优选4个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、最优选2个氨基酸、和甚至最优选1个氨基酸的氨基酸序列。具有SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12第1-237位氨基酸的多肽是本发明的成熟多肽。具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12第10-237位氨基酸的多肽是本发明的重组多肽。在又一个优选的实施方案中，本发明的同源多肽在升高的温度具有碳酸酐酶活性，即，45℃以上、优选50℃以上、更优选55℃以上、更优选60℃以上、甚至更优选65℃以上、最优选70℃以上、最优选80℃以上、最优选90℃以上、和甚至最优选100℃以上。

[0076] 本发明的多肽优选包含选自下组的成熟多肽或重组多肽的氨基酸，更优选由选自下组的成熟多肽或重组多肽的氨基酸组成：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、和SEQ ID NO：12或其等位变体；或其具有碳酸酐酶活性的片段，优选其在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽包含选自下组的氨基酸序列，优选由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12。在另一个优选的实施方案中，多肽包含选自下组的氨基酸序列的氨基酸1-237或10-237，优选由选自下组的氨基酸序列的氨基酸1-237或10-237组成：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQID NO：12或其等位变体；或其具有碳酸酐酶活性的片段，优选其在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个甚至更优选的实施方案中，多肽由选自下组的氨基酸序列的氨基酸10-237组成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，且具有N-端氨基酸序列LKASW，其中亮氨酸作为最N-端的氨基酸，不管各序列该位置所示的氨基酸。

[0077] 在又一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其具有碳酸酐酶活性，优选在升高的温度具有碳酸酐酶活性，其由在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与以下各项发生杂交的多核苷酸编码：

[0078] (i)编码选自下组的成熟酶的多核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，

[0079] (ii)选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，

[0080] (iii)包含在选自下组的多核苷酸序列中的cDNA序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，[0081] (iv)(i)、(ii)或(iii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或

[0082] (v)(i)、(ii)、(iii)、或(iv)的互补链(Sambrook、Fritsch、和Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

[0083] SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、或SEQ ID NO：11的子序列含有至少100个连续核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。此外，子序列可编码具有碳酸酐酶活性的、优选在升高的温度具有碳酸酐酶活性的多肽片段。

[0084] 选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9和SEQ ID NO：11的多核苷酸序列或其子序列，以及选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：12的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，用以根据本领域公知方法自预期编码碳酸酐酶的生物体鉴定和克隆编码具有碳酸酐酶活性的、优选在升高的温度具有碳酸酐酶活性的多肽的DNA。生成碳酸酐酶的生物体可以是真核生物，包括哺乳动物、藻类、真菌和植物，原核生物，包括不同属或种的细菌菌株以及古细菌。优选的是，这样的生物体是嗜热的或超嗜热的。甚至更优选的多核苷酸是自嗜热的克劳氏芽孢杆菌菌株得到的，该菌株不是克劳氏芽孢杆菌KSM-K16。特别地，此类探针可用于根据标准的Southern印迹步骤与感兴趣属或种的基因组或cDNA的杂交，用以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针比完整序列短得多，但是应当长至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、和最优选至少70个核苷酸。然而，优选的是，核酸探针长至少100个核苷酸。例如，核酸探针可以长至少200个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、或最优选至少500个核苷酸。DNA和RNA两种探针都能使用。通常标记探针以检
32 3 35
测相应基因(例如用 p、H、S、生物素、或抗生物素蛋白标记)。本发明涵盖此类探针。

[0085] 因此，可以对自此类生物体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上文所述探针发生杂交的和编码具有碳酸酐酶活性的、优选在升高的温度具有碳酸酐酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其它分离技术将来自此类生物体的基因组或其它DNA分开。可以将来自文库的DNA或分开的DNA转移至并固定化于硝酸纤维素或其它合适载体物质上。为了鉴定与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11的序列或其子序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体物质。

[0086] 为了本发明的目的，杂交指核苷酸序列在很低至很高严格条件下杂交至与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11所示核苷酸序列、其互补链、或其子序列对应的带标记物的核酸探针。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可使用X射线胶片来检测。

[0087] 在一个优选的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11的核苷酸1-237、核苷酸238-474、核苷酸
475-711。在另一个优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：
6、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、或SEQ ID NO：12的多肽的多核苷酸序列或其子序列。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11的成熟多肽编码区。

[0088] 对于长至少100个核苷酸的长探针，很低的至很高的严格条件定义为于42℃在5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性鲑鱼精DNA，和25％甲酰胺(用于很低的和低的严格性)、35％甲酰胺(用于中等的和中等-高的严格性)、或50％甲酰胺(用于高的和很高的严格性)中的预杂交和杂交，根据标准Southern印迹步骤进行最佳12-24小时。最后将载体物质用2X SSC，0.2％SDS清洗3次，每次15分钟，优选至少于45℃(很低严格性)、更优选至少于50℃(低严格性)、更优选至少于55℃(中等严格性)、更优选至少于
60℃(中等-高严格性)、甚至更优选至少于65℃(高严格性)、和最优选至少于70℃(很高严格性)。在一个具体的实施方案中，清洗是使用0.2X SSC，0.2％SDS进行的，优选至少于45℃(很低严格性)、更优选至少于50℃(低严格性)、更优选至少于55℃(中等严格性)、更优选至少于60℃(中等-高严格性)、甚至更优选至少于65℃(高严格性)、和最优选至少于70℃(很高严格性)。在另一个具体的实施方案中，清洗是使用0.1X SSC，
0.2％SDS进行的，优选至少于45℃(很低严格性)、更优选至少于50℃(低严格性)、更优选至少于55℃(中等严格性)、更优选至少于60℃(中等-高严格性)、甚至更优选至少于
65℃(高严格性)、和最优选至少于70℃(很高严格性)。

[0089] 对于长约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格条件定义为根据标准Southern印迹步骤，在比使用Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)的算法计算出的Tm低约5℃至约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1XDenhardt氏溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，和0.2mg/ml酵母RNA中进行的预杂交、杂交、和杂交后清洗。将载体物质于比计算Tm低5℃至10℃在6X SCC加0.1％SDS中清洗1次，15分钟和用6X SSC清洗2次，每次15分钟。

[0090] 在另一个方面，本发明涉及人工变体，其中包含对包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12或其成熟或重组多肽或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12或其成熟或重组多肽组成的氨基酸序列进行的一个或多个氨基酸的保守替代、删除、和/或插入。优选的是，氨基酸变化的性质是微小的，就是说不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替代或插入；小删除，通常为1个至约30个氨基酸；氨基或羧基末端小延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一种功能而便于纯化的小延伸，诸如聚-组氨酸束、抗原性表位或结合域。保守替代的例子在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小型氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活的氨基酸替代是本领域已知的，而且记载于例如Neurath和Hill，
1979，于The Proteins，Academic Press，New York。最常见的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。在20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(诸如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α-甲基丝氨酸)可以替代野生型多肽的氨基酸残基。有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸可以替代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能以化学方法合成且优选是可通过商业途经获得的，而且包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3，3-二甲基脯氨酸。

[0091] 根据本领域已知的步骤，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)，能鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并对所得突变体分子测试生物学活性(即碳酸酐酶活性)以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还可参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶或其它生物学相互作用的活性部位也能通过结构的物理分析来测定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，
1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。已经对碳酸酐酶进行了许多这些分析，其中最重要的是例如综述Tripp等，2001，J.Biol.Chem.276：
48615-48618和Lindskog，1997，Pharmacol.Ther.74：1-20。必需氨基酸的身份也能从与根据本发明的多肽的相关多肽的同一性分析来推断。

[0092] 使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，接着是有关的筛选规程，诸如那些披露于Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625，能进行并测试单个或多个氨基酸替代。能使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和定区诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

[0093] 诱变/改组方法能与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。能从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域标准方法快速测序。这些方法容许快速测定感兴趣多肽中氨基酸残基个体的重要性，并能应用于结构未知的多肽。

[0094] 本发明的一个实施方案是选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少94％同一性，或与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少91％同一性，或与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少96％同一性，或与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少89％同一性，或与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的至少97％同一性；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码选自下组的成熟多肽的多核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12，(ii)选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，(iii)包含在选自下组的多核苷酸序列中的cDNA序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的具有碳酸酐酶活性的片段。

[0095] 本发明的一个具体实施方案涉及选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少94％、优选至少96％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％和最优选至少100％同一性，或其功能性片段；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的区域的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中编码成熟酶的多核苷酸序列，(iii)包含在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列中的cDNA序列，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列相差11个氨基酸、优选9个氨基酸、更优选7个氨基酸、更优选5个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。

[0096] 本发明的另一个具体实施方案涉及选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：6的氨基酸序列的至少91％、优选至少94％、更优选至少96％、甚至更优选至少98％、甚至更优选至少99％和最优选至少100％同一性，或其功能性片段；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码SEQ ID NO：6的成熟多肽的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：5中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列，(iii)包含在SEQ ID NO：5中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列中的cDNA序列，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO：6的氨基酸序列相差11个氨基酸、优选9个氨基酸、更优选7个氨基酸、更优选5个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。

[0097] 本发明的另一个具体实施方案涉及选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：8的氨基酸序列的至少96％、优选至少97％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％和最优选至少100％同一性，或其功能性片段；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码SEQ IDNO：8的成熟多肽的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：7中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列，(iii)包含在SEQ ID NO：7中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列中的cDNA序列，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO：8的氨基酸序列相差11个氨基酸、优选
9个氨基酸、更优选7个氨基酸、更优选5个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。

[0098] 本发明的另一个具体实施方案涉及选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：10的氨基酸序列的至少89％、优选至少91％、更优选至少94％、更优选至少96％、甚至更优选至少98％、甚至更优选至少99％和最优选至少100％同一性，或其功能性片段；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码SEQ ID NO：10的成熟多肽的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：9中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列，(iii)包含在SEQID NO：9中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列中的cDNA序列，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO：10的氨基酸序列相差11个氨基酸、优选9个氨基酸、更优选7个氨基酸、更优选5个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。

[0099] 本发明的另一个具体实施方案涉及选自下组的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的分离的多肽：(a)具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有与SEQ ID NO：12的氨基酸序列的至少97％、优选至少97.5％、更优选至少98％、甚至更优选至少99％和最优选至少100％同一性，或其功能性片段；(b)由在中等严格条件下与以下各项发生杂交的核酸序列编码的多肽：(i)编码SEQ ID NO：12的成熟多肽的多核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列，(iii)包含在SEQ ID NO：11中编码成熟酶的区域的多核苷酸序列中的cDNA序列，(iv)(i)或(ii)中至少100个连续核苷酸的子序列，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链；和(c)(a)或(b)的在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。在一个优选的实施方案中，多肽具有与SEQ ID NO：12的氨基酸序列相差11个氨基酸、优选9个氨基酸、更优选7个氨基酸、更优选5个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、和最优选1个氨基酸的氨基酸序列。

[0100] 本发明的多肽是分离的多肽，优选的是，本发明的多肽的制备物含有至多90％(以重量计)可能与本发明多肽天然相关的其它多肽物质(更低百分比的其它多肽物质是优选的，例如，至多80％(以重量计)、至多60％(以重量计)、至多50％(以重量计)、至多40％(以重量计)至多30％(以重量计)、至多20％(以重量计)、至多10％(以重量计)、至多9％(以重量计)、至多8％(以重量计)、至多6％(以重量计)、至多5％(以重量计)、至多4％(以重量计)至多3％(以重量计)、至多2％(以重量计)、至多1％(以重量计)和至多0.5％(以重量计))。如此，优选的是，本发明的分离的多肽是基本上纯的，优选的是，多肽是至少92％纯的，即，本发明的多肽占到制备物中总多肽物质的至少92％(以重量计)，而且更高的百分比是优选的，如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、和至多99.5％纯的。具体而言，优选的是，本发明的多肽是“本质上纯的形式”，即，多肽制备物本质上不含与本发明多肽天然相关的其它多肽物质。这能通过例如依靠公知的重组方法制备本发明的多肽来实现。

[0101] 本发明的多肽可以是合成制备的、天然存在的或其组合。在一个具体的实施方案中，本发明的多肽可以自微生物获得，诸如原核细胞、古细菌细胞或真核细胞，特别是真菌细胞。该细胞可以通过遗传工程来进一步修饰。

[0102] 多核苷酸

[0103] 本发明还涉及多核苷酸，特别是分离的多核苷酸，其包含编码本发明多肽的核苷酸序列或由编码本发明多肽的核苷酸序列组成。在一个优选的方面，本发明的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。在另一个优选的方面，核苷酸序列是选自下组的多核苷酸中的成熟多肽编码区：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。本发明还涵盖编码具有选自下组的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12或其成熟多肽，该核苷酸序列由于遗传密码的简并性而分别不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11。本发明还涉及选自下组的子序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQID NO：11，其分别编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、和SEQ ID NO：12的具有碳酸酐酶活性的、优选在升高的温度具有碳酸酐酶活性的片段。

[0104] 本发明还涉及突变的多核苷酸，其在选自下组的成熟多肽编码序列中包含至少一处突变：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11，其中该突变的核苷酸序列分别编码由SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12氨基酸10-237组成的多肽。

[0105] 用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。通过例如使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共享结构特征的克隆DNA片段，能实现从此类基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见例如Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可使用其它核酸扩增方法，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从任何预期编码碳酸酐酶的生物体克隆多核苷酸，此类生物体可以是真核生物，包括哺乳动物、藻类和植物，原核生物，包括不同属或种的细菌菌株，以及古细菌。优选的是，生物体是嗜热的或超嗜热的。甚至更优选的是，多核苷酸是自不是克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的克劳氏芽孢杆菌菌株得到的。

[0106] 修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成包含如下氨基酸序列的多肽可为必需的，该氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：12中所包含的成熟多肽的氨基酸序列相比具有至少一处替代、删除和/或插入。

[0107] 对于本领域技术人员显而易见的是，能在保留酶的功能的情况中进行此类修饰，即能在对于酶的功能至关重要的区域以外进行此类修饰。因此，优选对对于功能至关重要的氨基酸残基不进行修饰，诸如替代。可以根据本领域已知方法，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定对功能至关重要的氨基酸残基。在后一种技术中，将突变引入到分子中的每一个带正电荷的残基处，并对所得突变分子测试碳酸酐酶活性，以鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点能通过分析三维结构确定，如通过诸如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记等技术来测定(参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，
1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters
309：59-64)。此外，编码本发明酶的核苷酸序列可通过引入不产生由核苷酸序列编码的酶的另一氨基酸序列但符合意欲用于生产酶的宿主生物体的密码子选择的核苷酸替代来修饰。将突变引入核苷酸序列以用一个核苷酸更换另一个核苷酸可使用本领域已知方法通过定点诱变来实现。特别有用的是利用具有感兴趣插入物的超卷曲双链DNA载体和两个含有期望突变的合成引物的方法。寡核苷酸引物(每一个都分别与载体的相对链互补)依靠Pfu DNA聚合酶在温度循环期间延伸。在掺入引物后，生成了含有交错缺口的突变质粒。在温度循环后，用对甲基化的和半甲基化的DNA特异性的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板和选择含有突变的合成DNA。也可使用其它本领域已知方法。关于核苷酸替代的一般说明，可参考例如Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

[0108] 本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明多肽的核苷酸序列，优选由编码本发明多肽的核苷酸序列组成，该核苷酸序列在很低严格条件、优选低严格条件、更优选中等严格条件、更优选中等-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选很高严格条件下与选自下组的多核苷酸探针发生杂交：

[0109] i)选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11，

[0110] ii)包含在选自下组的多核苷酸序列中的cDNA序列：SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11，或

[0111] iii)(i)或(ii)中编码分泌型成熟多肽的子序列，该子序列具有包含在SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：12中的相应成熟多肽的功能；或

[0112] iv)(i)、(ii)、或 (iii)的 互 补 链 (Sambrook、Fritsch、和 Maniatis，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

[0113] 应当理解，关于核苷酸序列杂交的详情和细节是与本发明题为“多肽”的部分中所讨论的杂交各方面相同的或类似的。

[0114] 本发明还涵盖适合在电子装置、优选数字装置中使用的存储介质，其包含本发明多肽的氨基酸序列或本发明多核苷酸的核苷酸序列的信息，特别是电子形式或数字形式(诸如二进制码或其它数字码)的任何本发明多肽或多核苷酸序列。合适的是，存储介质可以是磁盘或光盘和电子装置计算装置，而且信息可以特别地以数字形式存储在存储介质上。

[0115] 重组表达载体

[0116] 本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组表达载体。本发明的核酸构建体包含分离的本发明多核苷酸，优选可操作连接至一种或多种在与控制序列相容的条件下在合适的宿主细胞中指导编码序列表达的控制序列的。或者，可以将本发明的多核苷酸序列或包含该多核苷酸序列的核酸构建体插入适宜的载体中以进行表达。在创建表达载体中，将编码序列定位于载体中，使得编码序列与适宜的表达控制序列可操作连接。控制序列可以是由载体提供的，或者是由被插入载体中的核酸构建体提供的。

[0117] 控制序列可以是适宜的启动子序列，即受到宿主细胞识别来表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变的、截短的、和杂合的启动子，而且可以得自编码与宿主细胞同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因。此类启动子是本领域公知的。控制序列也可以是合适的转录终止子序列，即受到宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列是可操作连接至编码多肽的核苷酸序列的3’端的。任何在所选择的宿主细胞中有功能的终止子都可在本发明中使用，此类终止子是本领域公知的。控制序列也可以是合适的前导序列，即mRNA中对于由宿主细胞进行的翻译重要的非翻译区。前导序列是可操作连接至编码多肽的核苷酸序列的5’端的。任何在所选择的宿主细胞中有功能的前导序列都可在本发明中使用，此类前导序列是本领域公知的。控制序列也可以是信号肽区，其编码连接至多肽的氨基末端并引导所编码多肽进入细胞的分泌途经的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列的5’端可以固有地含有在翻译读框中与编码区中编码分泌型多肽的区段天然连接的信号肽编码区。或者，编码序列的5’端可以含有对于编码序列是外来的信号肽编码区。在编码序列天然不含信号肽编码区的情况中，可需要外来信号肽编码区。或者，外来信号肽编码区可仅仅是替换天然信号肽编码区，以增强多肽的分泌。然而，任何引导所表达的多肽进入所选择的宿主细胞的分泌途经的信号肽编码区都可在本发明中使用。控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即可操作连接至核苷酸序列的3’端且在转录时被宿主细胞识别成向所转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号的序列。任何在所选择的宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可在本发明中使用。可能还期望添加容许相对于宿主细胞的生长来调节多肽表达的调节序列。调节系统的例子是那些引起基因的表达应答化学或物理刺激(包括调节性化合物的存在)而开启或关闭的。

[0118] 可以以多种方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。根据表达载体，可能期望或必须在插入载体之前对多核苷酸的序列进行操作。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域公知的。另外，可以向多肽添加可帮助多肽的纯化或固定化的标签。这样的标签可以是例如聚组氨酸标签(His标签)。优选的是，标签位于多肽的N-端或C-端，而且可以是由载体编码的。或者，标签可以位于多肽的内部，只要它不影响多肽的功能性。

[0119] 重组表达载体可以是任何能常规进行重组DNA步骤且能实现核苷酸序列表达的载体(例如，质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒)。载体的选择通常会取决于载体与其中要引入该载体的宿主细胞的相容性。

[0120] 载体可以是线性的或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。

[0121] 载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一的载体或质粒，或者共同含有要引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者可以使用转座子。

[0122] 本发明的载体优选地含有一种或多种选择标志，其容许简单选择经过转化的细胞。选择标志是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、给营养缺陷型提供原养性(prototrophy to auxotrophs)等的基因。细菌选择标志的例子是来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的dal基因，或赋予抗生素抗性的标志，所述抗生素抗性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标志是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)(anthranilate synthase)、以及它们的等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉(Aspergillus oryzae)的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

[0123] 本发明的载体优选含有容许载体稳定整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。

[0124] 为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列或任何其它用于通过同源或非同源重组使载体稳定整合入基因组的载体元件。或者，载体可以含有别的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组。所述别的核苷酸序列使得载体能够在染色体中的精确位置处整合入宿主细胞基因组。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应优选含有足够数目(诸如100至1,500碱基对、优选400至1,500碱基对、和最优选800至1,500碱基对)的与相应的靶序列高度同源的核苷酸，以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组或通过随机整合而整合到宿主细胞的基因组中。

[0125] 为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地复制。细菌复制起点的例子是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子是2μm复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合，和ARS4与CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的例子是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能根据披露于于WO 00/24883中的方法来实现。复制起点可以是具有使其在宿主细胞中以对温度敏感的方式发挥功能的突变的复制起点(参见例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1433)。载体还可以包含两个或更多个复制起点，每一个复制起点容许在不同的宿主细胞中复制，例如细菌复制起点和酵母复制起点。

[0126] 可以将多于一个拷贝的本发明核苷酸序列插入宿主细胞以提高基因产物的生成。核苷酸序列拷贝数的增加能如下获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或在核苷酸序列中包括可扩增的选择标志基因，其中能通过在存在适宜的选择剂的情况中培养细胞来选择含有选择标志基因的扩增拷贝，并由此含有核苷酸序列的额外拷贝的细胞。

[0127] 用于连接上文所述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，见上文)。

[0128] 重组宿主细胞

[0129] 本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞，其在多肽的重组生产中有利地使用。将包含本发明的核苷酸序列的载体导入宿主细胞中，使得该载体作为染色体的成分或作为自复制的染色体外载体得到维持，如较早所描述的。

[0130] 宿主细胞可以是原核生物(诸如细菌细胞)、古细菌或真核生物(诸如真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞)。

[0131] 有用的原核生物是细菌细胞，诸如革兰氏阳性细菌，包括，但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌细胞(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌或大肠埃希氏菌(E.coli)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性的芽孢杆菌。

[0132] 可以例如通过原生质体转化(参见例如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneral Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见例如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见例如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6：742-751)、或接合(conjugation)(参见例如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)将载体导入细菌宿主细胞中。

[0133] 在一个优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”在用于本文时包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth和Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK所定义的)以及卵菌门(如Hawksworth等，于Ainsworth和Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，UniversityPress，Cambridge，UK，页171中所引用的)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，于Ainsworth和Bisby’s Dictionary of TheFungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK)。在一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”在用于本文时包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，酵母应定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner、Passmore、和Davenport，编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述的。

[0134] 在一个甚至更优选的实施方案中，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、(糖)酵母属(Saccharomyces)、裂殖(糖)酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。在一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母或啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的实施方案中，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

[0135] 在另一个更优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK定义的)的所有丝状形式。丝状真菌的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖、和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在一个甚至更优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是但不限于枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、或木霉属(Trichoderma)的菌种的细胞。在一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在一个甚至最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是镶片镰孢(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

[0136] 可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法以本身已知的方式转化真菌细胞。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法记载于EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 81：1470-1474。用于转化镰孢属物种的合适方法记载于Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787。可以使用由如下文献记载的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson和Simon，编，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology 194：182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；及Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

[0137] 本发明的一个具体的实施方案是经选自下组的多核苷酸转化的重组宿主细胞：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15。优选的是，这样的宿主细胞不含有固有的碳酸酐酶编码基因，或者这样的基因已经遭到破坏。由此，重组碳酸酐酶是本发明的重组宿主细胞所生成的唯一碳酸酐酶。

[0138] 用于制备碳酸酐酶的方法

[0139] 本发明还涉及用于生产本发明的碳酸酐酶的方法，包括：(a)培养包含编码碳酸酐酶的核苷酸序列的宿主细胞，该菌株能够表达和分泌碳酸酐酶，并(b)回收碳酸酐酶。在一个具体的实施方案中，宿主细胞是野生型克劳氏芽孢杆菌菌株，其固有地含有碳酸酐酶编码基因。更优选的是，野生型菌株是以NCIB 10309保藏的克劳氏芽孢杆菌菌株。在另一个实施方案中，宿主细胞是如上所述的重组宿主细胞。

[0140] 在本发明的这些方法中，使用本领域已知方法在适合用于生产酶的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适的培养基中和在容许表达和/或分离多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料-分批、或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。由于酶被分泌到营养培养基中，因此该酶能从所述培养基中直接回收。如果酶不分泌，那么它能从细胞裂解物(lysate)回收。

[0141] 可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、或酶底物的消失。例如，可使用酶测定法(enzyme assay)来测定碳酸酐酶活性，例如，Wilbur，1948，J.Biol.Chem.176：147-154记载的方法。设置(set up)基于由如方程式1： 所示自二氧化碳形成碳
酸氢盐引起的测定混合物pH变化。实施这种活性测定法的一种具体方式记载于Chirica等，2001，Biochim.Biophys.Acta 1544：55-63。另外，可通过其将对硝基酚乙酸酯切割成硝基酚和乙酸的能力来评估碳酸酐酶的动力学。

[0142] 本发明的酶可以通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden，编，VCH Publishers，New York，1989)。

[0143] 包含多肽的组合物及其制备方法

[0144] 本发明提供了包含本发明碳酸酐酶和优选的赋形剂的组合物，及用于制备这样的组合物的方法，其包括将本发明的多肽与赋形剂混合。

[0145] 在一个具体的实施方案中，本发明的碳酸酐酶是组合物(例如单组分组合物)中的主要(多肽)成分。赋形剂在此语境中应理解为任何用于配制组合物的助剂或化合物，包括溶剂(例如，水、无机盐、填充剂、色素、蜡)、载体、稳定剂、交联剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂等。

[0146] 组合物可进一步包含一种或多种额外的酶，诸如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱羧酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、单加氧酶、腈水解酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

[0147] 可以根据本领域已知方法来制备组合物，而且组合物可以是液体或固体组合物的形式。例如，可以使用本领域已知的技术将酶和/或药物产品配制到例如有包衣的或无包衣的颗粒或微粒中的方法来配制酶组合物。如此，可以以颗粒、优选无尘微粒，液体、特别是稳定化液体，浆体或受保护多肽的形式提供本发明的多肽。

[0148] 对于某些应用，多肽的固定化可为优选的。固定化的酶包含两种关键功能，即设计用于帮助分离(例如自应用环境分离催化剂，重复使用催化剂和控制工艺)的非催化功能和设计用于在期望的时间和空间内转变靶化合物(或底物)的催化功能(Cao，Carrier-bound Immobilized Enzymes：Principles，Applications and Design，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim，Germany，2005)。若酶是固定化的，则它变得对于它帮助转变的靶化合物(例如底物)和所使用的溶剂是不溶性的。可以将固定化的酶产品与应用环境分开以促进其重复使用，或降低所需要的酶量，或在连续地递送底物且连续地自酶附近清除产物的工艺中使用酶(这例如降低酶的花费)。此外，常常通过固定化来稳定化酶。牵涉固定化的酶的工艺常常是连续的，其便于容易的工艺控制。固定化的酶可以作为异质催化剂通过机械手段或通过包括在限定空间中来保持。后者可通过微囊化来进行，例如在半透膜中或通过包括在UF系统中，使用例如中空纤维模块等。在多孔载体上的固定化也是常用的。这包括使酶结合至载体，例如通过吸附、络合/离子/共价结合、或仅仅是可溶性酶简单吸附在载体上，和随后清除溶剂。酶的交联也可用作固定化的手段。通过包括在载体内进行的酶的固定化也在产业上应用(Buchholz等，Biocatalysts and Enzyme Technology，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA，Weinheim，Germany，2005)。固定化酶(诸如碳酸酐酶)的具体方法包括但不限于：将酶与包含多官能胺的液体介质和包含交联剂的液体介质一起喷雾到微粒多孔载体上，如WO 2007/036235(通过提述并入本文)中所述；用交联剂(例如戊二醛)将碳酸酐酶连接至卵清蛋白层，该卵清蛋白层继而粘附至聚合物支持物上的粘合层，如WO 2005/114417(通过提述并入本文)中所述；或将碳酸酐酶偶联至硅土载体，如美国专利No.5,776,741中所述或偶联至硅烷，或CNBr活化的载体表面，如玻璃；或碳酸酐酶与甲基丙烯酸盐/酯在聚合物珠上的共聚合，如Bhattacharya等，2003，Biotechnol.Appl.Biochem.38：111-117(通过提述并入本文)中所述。在本发明的一个实施方案中，碳酸酐酶是固定化在基质上的。基质可以例如选自下组：珠、织物、纤维、中空纤维、膜、微粒、多孔表面、杆、结构化包装(structured packing)和管。合适基质的具体例子包括氧化铝/矾土、膨润土、生物聚合物、碳酸钙、磷酸钙凝胶、碳、纤维素、陶瓷支持物、粘土、胶原、玻璃、羟基磷灰石、离子交换树脂、高岭土、尼龙、酚的聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝胶、Sephadex、Sepharose、硅胶、沉淀硅土(precipitated silica)和TEFLON牌PTFE。在本发明的一个实施方案中，根据Methods in Enzymology卷XLIV(章：ImmobilizedEnzymes，页118-134，Klaus Mosbach编，Academic Press，New York，
1976)(通过提述并入本文)中所记载的技术将碳酸酐酶固定化在尼龙基质上。

[0149] 可以根据本领域已知方法使要包括在组合物中的多肽稳定化，例如通过添加抗氧化剂或还原剂以限制多肽的氧化来使组合物中的多肽稳定化，或者可以通过添加聚合物诸如PVP、PVA、PEG、糖、寡聚物、多糖或其它已知对固体或液体组合物中的多肽的稳定性有益的合适聚合物来使多肽稳定化。可以添加防腐剂(诸如Proxel)来延长保存期或应用中的性能。

[0150] 在又一个实施方案中，本发明的组合物是在二氧化碳捕捉中可应用的组合物。

[0151] 实施例

[0152] 实施例1：枯草芽孢杆菌中克劳氏芽孢杆菌碳酸酐酶的克隆和表达

[0153] 通过对来自不同克劳氏芽孢杆菌菌株的基因组DNA进行的PCR筛选鉴定了碳酸酐酶序列。来自克劳氏芽孢杆菌菌株的基因组DNA是使用Qiagen血液DNA试剂盒遵循制造商的规程制备的。

[0154] PCR筛选

[0155] 在50μl总体积中进行了PCR(1)，添加了以下试剂：缓冲液#1(Roche)中的Expand聚合酶，1μl基因组DNA制备物(模板)，10pmol每一种引物(Bcaf1和Bcarl)，和dNTP。PCR条件为94℃2min；9个循环的94℃15sec，55℃45sec，68℃1min；接着是68℃10min；4℃20min和15℃直至PCR程序结束。

[0156] 用于PCR筛选的引物为：

[0157] Bcaf1 gcttctgctgctagtttcctgtca(SEQ ID NO：19)

[0158] Bcar1 ataatgaaaaccgatttctctgtcgc(SEQ ID NO：20)

[0159] 得到的PCR产物(SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11和13)具有大约700bp的长度，进行大小排阻，并用上述引物测序。来自PCR(1)的PCR产物的氨基酸翻译呈现于SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12和14。成熟的天然酶自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12和14的第1位起始。下文表1指出了由PCR产物翻译的天然酶之间在多肽水平的同一性。

[0160] 表1：同一性矩阵

[0161]SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO：10 NO：6 NO：2 NO：4 NO：14 NO：12 NO：8
SEQ ID NO：10 100 97 91 92 89 91 90
SEQ ID NO：6 100 92 93 91 93 92
SEQ ID NO：2 100 99 94 96 95
SEQ ID NO：4 100 94 96 96
SEQ ID NO：14 100 97 96
SEQ ID NO：12 100 100
SEQ ID NO：8 100

[0162] 用于SOE PCR的PCR片段的生成

[0163] 用与PCR(1)相同的引物进行了PCR(2)，只是引物和模板替换成10pmol每一种引物blcaTSP和bcl1362rev及1ul自PCR(1)纯化的产物(SEQ 1，7，9，11和13)。

[0164] bclaTSP： cttgctgcctcattctgcagccgcgttgaaagcatcatggtc(SEQ ID NO：21)[0165] bcl1362rev：tccgatccccttttccattctactttaatgataatgaaaaccga(SEQ ID NO：22)[0166] PCR产物具有700bp的大致长度，并且纯化了PCR产物。这些PCR产物适合于后续SOE PCR融合反应(见PCR(3))。由于引物bclaTSP的本性，此PCR(2)产物的翻译氨基酸序列变成了LLPHSAAALKASW...，其中LLPHSAAA代表amyL基因的片段(见下文SOE融合反应)，而LKASW代表通过CA的重组表达获得的截短型成熟肽的N-端。因此，所有克隆的CA的成熟重组肽以SEQ IDNO：2，8，10，12和14中的第10位起始，而且具有N-端氨基酸序列LKASW，其中亮氨酸作为最N-端的氨基酸，不管相应序列该位置所示氨基酸。

[0167] SOE融合

[0168] 在PCR(3)，通过如WO 99/43835(通过提述并入本文)中所记载的SOE融合以符合读码框的方式将来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶的信号肽融合至PCR(2)中得到的编码碳酸酐酶的DNA。通过同源重组将自PCR(3)得到的含有碳酸酐酶编码序列的核苷酸片段整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。在三重启动子系统(如WO 99/43835中所记载的)的控制下表达该基因构建体。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标志(如Diderichsen等，1993，Plasmid30：312-315中所记载的)。

[0169] 通过DNA测序分析了氯霉素抗性转化体以证实构建体的正确DNA序列。为每一种重组序列选择了一个表达克隆(SEQ ID NO：2，8，10，12和14在第10位以LKASW起始)。

[0170] 将碳酸酐酶表达克隆个体在旋转摇床上在每个装有400ml基于大豆的培养基并补充有34mg/L氯霉素的1L带挡板的锥形瓶中发酵。将克隆于37℃发酵4天。根据Wilbur，1948，J.Biol.Chem.176：147-154测定培养液中的碳酸酐酶活性(见实施例4)。或者，根据Chirica等，2001，Biochim.Biophys.Acta1544(1-2)：55-63用对硝基酚乙酸酯作为底物测量酯酶活性作为碳酸酐酶活性(见实施例5)。

[0171] 实施例2：自耐盐芽孢杆菌克隆CA

[0172] 根据实施例1及以下修改克隆了来自耐盐芽孢杆菌的CA(SEQ ID NO：16)。没有进行筛选。作为替代，使用耐盐芽孢杆菌菌株C-125(JCM9153)的基因组DNA作为模板，而用于PCR(2)的引物为：

[0173] cahTSP ctgcctcattctgcagccgcgccttccacagaaccagtcgat(SEQ ID NO：23)[0174] cahrev：tccgatccccttttccattctactctattcagtgatcacgtcat(SEQ ID NO：24)。

[0175] 由于引物cahTSP的本性，此PCR(2)产物的翻译氨基酸序列变成了LPHSAAAPSTEPVD...，其中LPHSAAA代表amyL基因的片段(见下文SOE融合反应)，而PSTEPVD代表通过CA的重组表达获得的成熟肽的N-端。根据实施例1进行了最后的SOE PCR。

[0176] 实施例3：酶的纯化

[0177] 通过同一种同样的规程纯化了六种重组碳酸酐酶(如实施例1中所述克隆的SEQ ID NO：2，8，10，12，和14，及如实施例2中所述克隆的SEQ ID NO：16)：将培养液离心(26,000xg，20min)，并将上清液通过Whatman 0.45μm滤器过滤。0.45μm滤出液为大约pH7，而电导率为大约20mS/cm。将0.45μm滤出液通过G25 Sephadex层析转移至10mM HEPES/NaOH，pH 7.0并应用于在10mM HEPES/NaOH，pH 7.0中平衡的100ml Q-Sepharose FF柱。
用平衡缓冲液清洗柱后，用线性NaCl梯度(0→0.5M)在3个柱体积里洗脱所结合的蛋白质。在洗脱期间收集级分，并对这些级分测试碳酸酐酶活性(见实施例4)。鉴定出两个具有CA活性的峰。N-端测序揭示了第一个洗脱峰含有超氧化物歧化酶，而第二个洗脱峰(峰B)含有碳酸酐酶。将峰B用去离子水稀释7倍，并应用于在10mM HEPES/NaOH，pH 7.0中平衡的40ml SOURCE 30Q柱。将柱用平衡缓冲液清洗，并用线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱。对来自柱的洗脱级分分析CA活性，并通过SDS-PAGE分析阳性级分。将在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显示出主要条带的级分合并成碳酸酐酶批次(batch)。与SEQ ID NO：2，
8，10和12对应的CA的酶纯度估算为80％纯的，而与SEQ IDNO：14和16对应的酶为95％以上纯的。

[0178] 实施例4：碳酸酐酶活性的检测

[0179] 用于检测碳酸酐酶的测试描述于Wilbur，1948，J.Biol.Chem.176：147-154。设置基于由如方程式1： 所示自二氧化碳形成碳酸氢盐引起的测定混合物pH变化。

[0180] 此研究中所使用的活性测定法衍生自Chirica等，2001，Biochim.Biophys.Acta1544(1-2)：55-63的方法。在测定前大约45分钟至1小时，使用注射器尖头将CO2鼓泡入
100ml蒸馏水中，由此制备含有大约60-70mM CO2的溶液。将CO2溶液在冰-水浴中冷却。
为了测验碳酸酐酶的存在，将2ml 25mM Tris，pH 8.3(含有足够的溴百里酚蓝来产生独特且可见的蓝色)添加至两个在冰浴中冷却的13x100mm试管。向一个管中添加10-50μl含酶的溶液(例如培养液或纯化的酶)，并向另一个管添加等量的缓冲液以充当对照。使用
2ml注射器和长套管，非常迅速地且平稳地(smoothly)将2ml CO2溶液添加至每个管的底部。在添加CO2溶液的同时，启动秒表(stopwatch)。记录溶液从蓝色变成黄色所需要的时间(溴百里酚蓝的转变点是pH 6-7.6)。CO2水合反应期间氢离子的生成降低溶液的pH，直至达到溴百里酚蓝的颜色转变点。颜色变化所需要的时间与样品中所存在的碳酸酐酶的量成反比。为了结果的可再现性，管在测定期间必须保持浸泡在冰浴中。通常，未催化反应(对照)需要大约2分钟来发生颜色变化，而酶催化反应在5-15秒内完成，取决于所添加的酶量。颜色变化的检测有些主观，但是催化反应的一式三份测量的误差在0-1秒差异的范围内。1个单位按Wilbur[1U＝(1/tc)-(1/tu)x1000]定义，其中U是单位，而tc和tu分别代表以秒计的催化和未催化反应的时间(Wilbur，1948，J.Biol.Chem.176：147-154)。这些单位也称作Wilbur-Anderson单位(WAU)。

[0181] 实施例5：使用对硝基苯基乙酸酯进行的碳酸酐酶活性动力学测定法

[0182] 将20μl如实施例3中所述获得的纯化的CA酶样品(在0.01％Triton X-100中稀释)置于微量滴定板(MTP)孔的底部。通过在MTP孔中添加200μl对硝基酚乙酸酯(pNp-乙酸，Sigma，N-8130)底物溶液，于室温启动测定法。底物溶液是临测定前通过混合100μl pNP-乙酸原液(50mg/ml溶于DMSO的pNP-乙酸，冻存)与4500μl测定缓冲液(0.1M Tris/HCl，pH 8.0)来制备的。监测OD405的升高。在测定中包括缓冲液空白(buffer blind)(用20μl测定缓冲液代替CA样品)。样品与缓冲液空白之间OD405升高的差异是碳酸酐酶活性的量度(CA活性＝ΔOD405(样品)-ΔOD405(缓冲液))。

[0183] 实施例6：温度稳定性测定法

[0184] 将纯化的CA酶(如实施例3中所述获得的SEQ ID NO：2，8，10，12，14和16)在50mM HEPES/NaOH，pH 7.5中稀释10x，并将等分试样在不同温度(15-80℃)温育15分钟。
另外将SEQ ID NO：14的CA酶在不同的温度温育2小时。温育后，如实施例5中所述测量残余活性。温度稳定性测定法的结果显示于表2。显然，来自嗜热甲烷八叠球菌、耐盐芽孢杆菌和克劳氏芽孢杆菌的CA显示出比人CAII更高的热稳定性。另外，克劳氏芽孢杆菌CA在热稳定性方面优于嗜热甲烷八叠球菌CA。人CAII和嗜热甲烷八叠球菌的数据取自Alber和Ferry，1996，J.Bacteriol.178：3270-3274。

[0185] 表2：不同碳酸酐酶的温度稳定性

[0186]

[0187] n.d.＝未测定

[0188] 差示扫描量热法(DSC)

[0189] 将纯化的CA酶(如实施例3中所述获得的SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16)在50mM HEPES/NaOH，pH 7.5中稀释至大约1mg/ml。以90℃/小时的扫描速率和20℃-90℃的扫描范围进行DSC。克劳氏芽孢杆菌(SEQ ID NO：14)和耐盐芽孢杆菌(SEQ ID NO：16)CA的熔点分别是67.4℃和63.1℃。

[0190] 实施例7：氨基末端蛋白质测序

[0191] 通过Edman测序法对纯化的重组CA(如实施例3中所述获得的SEQ IDNOs：2，8，10，12，14和16)测序。测定出的序列显示于表3。所有序列匹配预测的成熟肽序列，除了来自耐盐芽孢杆菌的CA(SEQ ID NO：16)，其中在纯化后获得以SEQ ID NO：16第18位起始的截短的酶。通过电喷射电离-飞行时间质谱法(ES-TOF MS)测定了重组CA的蛋白质分子量。

[0192] 表3：重组CA的N-端序列

[0193]SEQ ID NO 蛋白质序列(Edman) MS测出的分子量
2 LKASWSYEGE(SEQ ID NO：25) 25551Da
8 LKASWSYEGD(SEQ ID NO：26) 25522Da
10 LKASWSYEGE(SEQ ID NO：27) 25286Da
12 LKASWSYEGD(SEQ ID NO：28) 25566Da
14 LKASWSYE(SEQ ID NO：29) 25628Da
16 GGAHEVHWSY(SEQ ID NO：30) 26143Da

[0194] 实施例8：使用Wilbur-Anderson测定法的热稳定性

[0195] 测量了与SEQ ID NO：2，8，10，12和14对应的纯化的CA酶及牛碳酸酐酶(Sigma，目录号C3934)的热稳定性。CA是如实施例3中所述获得的。

[0196] 如下测量热稳定性：将10μl每一种酶在1M NaHCO3溶液(pH＝8.05)中稀释10倍，并在期望的温度温育15分钟或2小时。也在相同的温度加热1M NaHCO3溶液作为对照。在进行测定之前使溶液冷却至室温。根据实施例4的步骤及以下微小变化测量经过加热的酶溶液的Wilbur-Anderson活性。CO2溶液是在测定前30分钟制备的，用4℃水浴代替冰浴，酶的量为10μl，而未催化反应(对照)进行大约40-50秒。在升高的温度温育后的残余活性呈现于表4。

[0197] 表4：不同碳酸酐酶的温度稳定性

[0198]

[0199] n.d.＝未测定

[0200] 实施例9：中空纤维生物反应器中自混合气体流提取CO2

[0201] 建立了实验室规模的中空纤维包容液膜生物反应器(HFB)来选择性地自能类似废气的气体流捕捉CO2。

[0202] 中空纤维膜生物反应器设置

[0203] 多孔的、疏水的中空纤维膜提供了气体流与膜液之间的大接触表面积。作为结果，它们促进液体的碳酸盐化作用或自液体清除CO2。所选择的模块由23002
根平行的中空纤维组成，该中空纤维的活性表面积为0.18m，平均孔径大小为
0.01x0.04μm( 1x5.5，购 自 Membrana，North Carolina，
USA)。这些膜易于放大至工业规模，而且已经在工业上用于废水处理和饮料碳酸盐化。图
1显示了生物反应器设置的示意图。在该设置中，使用容积式泵(positive displacement pump)使膜液流过中空纤维内腔。液体流速设定为约2ml/min。含有15％CO2(9立方厘米/min(CCM))和85％N2(51CCM)的混合物的气体流(原料气)逆流地进入中空纤维的给料侧，而经过处理的气体流(洗涤气)在中空纤维的扫除侧离开模块。在整个实验期间使用两个质量流量控制器以一致的浓度混合氮气和二氧化碳。使用质量流量计来监测洗涤气和原料气在离开反应器时的流量。调节气体和液体的流量和压强(pressure)以避免在模块中液体进入气相和气体鼓泡入液相。

[0204] 此设置的目的是使CO2水合成碳酸氢盐，其通过使用气相层析(GC)分析原料气和洗涤气中的CO2浓度来测量。

[0205] 气相层析法(GC-TCD)

[0206] 将配有热导率检测器和气体取样阀的Shimadzu 2010气相层析仪用于CO2浓度测量。使用毛细管Carboxen Plot 1010柱来检测氮气和二氧化碳。将柱在35℃等温加热7分钟，将温度以20℃/min的速率升高至200℃，并将它在200℃维持2分钟。注入器和检测器温度维持在230℃。柱流速为1ml/min，分流比为10对1，而载气为氦气。分别在6.4和15.3分保留时间检测到氮气和二氧化碳峰。使用三种二氧化碳标准品校准CO2峰，即氮气中的1000ppm、1％和10％CO2(购自Scott Specialty Gases，Pennsylvania，USA)。

[0207] 膜液

[0208] 首先，选择1M碳酸氢钠pH＝8作为膜液。然而，发现碳酸氢钠溶液在此pH对CO2饱和，作为结果，它对于水合反应(碳酸盐化作用)不是非常合适的膜液。pH 9或以上的1M碳酸氢钠溶液对于CO2水合更合适，因为它没有对二氧化碳/碳酸氢盐饱和。使用没有酶的1M碳酸氢钠溶液，pH 9.0作为对照溶液。在另一个实验中，在用去离子(DI)水漂洗中空纤维模块后，使用8份1M碳酸氢钠pH 9.6+2份SEQ ID NO：14的碳酸酐酶的溶液(对应于CA终浓度为0.6g纯酶蛋白质/L)作为膜液。通过GC分析使用这些膜液的原料气和洗涤气中的CO2浓度。每一个实验使用不同模块至少重复三次，而且对GC进行至少三次注入。

[0209] 结果

[0210] 表5显示了使用每一种膜液收集到的数据。发现，离开HFCLMB的洗涤气中的二氧化碳浓度高度依赖于膜液中碳酸氢钠对照溶液的pH。碳酸氢盐溶液的pH的升高提高二氧化碳变成碳酸氢盐的水合作用的速率。

[0211] 此外，发现，在室温向碳酸氢钠溶液添加SEQ ID NO：14的碳酸酐酶时，洗涤气中的CO2的量显著减少，而且反应器对CO2的选择性显著升高。还作为膜液测试了酶-pH 9.95的碳酸氢盐溶液，而且在洗涤气中没有检测到CO2峰。换言之，在pH 9.95观察到自原料气几乎完全清除CO2。

[0212] 表5：膜液对离开中空纤维膜生物反应器的气体流中CO2浓度的影响

[0213]膜液 洗涤气中的 原料气中的 被清除的
％CO2 ％CO2 ％CO2
(平均值) (平均值) (平均值)
DI水 13.6 14.2 4.8
1M NaHCO3 pH 9.0 11.6 15.0 22.7
1M NaHCO3 pH 9.5 10.2 15.3 33.1
1M NaHCO3 pH 9.5中的0.6g/L CA 0.85 14.3 94.1
1M NaHCO3 pH 9.95中的0.6g/L CA ＜0.1 15.3 ＞99

[0214] 这些结果指明了，与对照相比，SEQ ID NO：14的碳酸酐酶即使在低剂量(～0.6g酶蛋白质/L)也显著提高中空纤维膜反应器的效率。

[0215] 实施例10：中空纤维CLM生物反应器中自混合气体流提取CO2

[0216] 建立了实验室规模的中空纤维包容液膜生物反应器(HFB)来选择性地自能类似沼气组合物的气体流捕捉CO2。

[0217] 生物反应器设置本质上与实施例9中所述相同，只是气体流含有40％CO2(8CCM)与60％CH4(12CCM)的混合物，其进入中空纤维的给料侧。离开中空纤维膜的气体称作富集气，因为此设置的目的是显示使用含碳酸酐酶的生物反应器自所生成的气体流捕捉CO2能提高沼气流中的甲烷百分比。通过气体混合物中的CO2组分选择性地水合成液相中的碳酸氢根离子，这是有可能的。通过使用气相层析(GC)分析原料气和富集气中的甲烷浓度来测量这种后处理的效率。

[0218] 气相层析法(GC-FID)

[0219] 将配有火焰离子化检测器和气体取样阀的Shimadzu 2010气相层析仪用于CH4浓度测量。使用毛细管Carboxen Plot 1010柱来检测甲烷。将柱在200℃等温加热3.5分钟。注入器和检测器温度维持在230℃。柱流速为2.35ml/min，分流比为20对1，而载气为氦气。氢气和空气流速分别为45和450mL/min。在1.9分钟保留时间检测到甲烷峰。使用四种甲烷标准品校准CH4峰，即氮气中的1000ppm、1％、10％和99％甲烷(购自Scott Specialty Gases)。

[0220] 膜液

[0221] 所使用的膜液是pH 9.3的1M碳酸氢钠溶液，作为对照。碳酸酐酶的酶和浓度如实施例9中所述。

[0222] 结果

[0223] 表6显示了使用CO2-CH4混合物收集到的数据。由此可以看出，在室温，在向膜液添加碳酸酐酶时，自气体流中清除的CO2的量显著增加。因此，生物反应器中捕捉的CO2的量显著增加，而且作为结果，离开气流中的甲烷含量显著升高。

[0224] 表6：膜液对离开中空纤维膜生物反应器的沼气流的甲烷浓度的影响

[0225]膜液 富集流中的 给料流中的 被清除的
％CH4 ％CH4 ％CO2
(平均值) (平均值) (平均值)
DI水 62.9 59.4 ～9
1M NaHCO3 pH 9.3 83.0 59.4 ～59
1M NaHCO3 pH 9.3中的0.6g/L CA 95.7 59.4 ～90

[0226] 实施例11：膜液中含有MEA的中空纤维膜生物反应器中自混合气体流提取CO2[0227] 本实验举例说明向常规二氧化碳吸收剂添加碳酸酐酶的效果。

[0228] 生物反应器设置本质上与实施例9中所述相同，只是气体流含有28.6％CO2(20CCM)与71.4％N2(50CCM)的混合物，其进入中空纤维的给料侧。气相层析法是与实施例9同样的。

[0229] 膜液

[0230] 所使用的对照膜液是水中的单乙醇胺溶液(MEA)(1％V/V)。将这与由含有10份CA和1份MEA和89份水的MEA-CA水溶液构成的膜液(对应于CA终浓度为0.3g纯酶蛋白质/L溶液)进行比较。

[0231] 结果

[0232] 数据呈现于表7。总之，用1％MEA溶液进行的HFB能清除原料气中总CO2的48.6％。添加0.3g/L碳酸酐酶将1％MEA溶液中的CO2清除显著提高至84.3％。

[0233] 这显示了SEQ ID NO：14的碳酸酐酶在存在MEA的情况中是有活性的，而且能显著改善含MEA的溶液中的CO2吸收。令人惊讶的是，与本领域所知道的相比，在存在CA时，溶液中只需要少量的MEA就能实现高水平的CO2清除。典型的基于胺的CO2稀释剂水溶液含有15-30％范围内的胺。

[0234] 表7：膜液对离开中空纤维膜生物反应器的气体流中CO2浓度的影响

[0235]