[0001] 本发明的目的涉及用于预防或治疗过敏性疾病的药物组合物和食品工业组合物及其制备方法。

[0002] 发明背景

[0003] 近些年，许多科学出版物(FEBS Lett.317：1-4，1993；Természetgyógyászat10：29-32，1996；Kisállatorvoslás 3：114-5，1996；Erfahrungsheilkunde 7：381-88，
1997；J.R.Heys和D.G.Melillo(编辑)同位素标记化合物的合成与应用(Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds).John Wiley和Sons Ltd.pp.137-141，1997)以及匈牙利专利(登记号：208084，209787，214593，214824)均是基于天然存在的氘在调控细胞分化中起着重要作用的认识。除了所提及专利中描述的动物实验外，在人测试实验中也证实了低氘水(deuterium-depleted water)(简称为“Dd水”且氘在下文简称为D)的抗癌效应。在历时两年的人II期双盲临床研究中(其中无论主治医生还是受试者都不知道哪些患者接受了活性剂和哪些接受了安慰剂)，在前列腺癌患者的治疗组和对照组间观察到显著性差异。所述研究明确证实了我们早期的动物和人的研究的结果。

[0004] 不依赖于临床试验，在过去的15年里总共1290个患者消耗了400吨Dd水。这些病例突显癌细胞对氘贫化反应灵敏，且在绝大多数病例中(70-80％)，不能适应降低的氘浓度，导致癌组织部分或完全消退。

[0005] 在历时15年多的患者随访期间进行了一些有趣的观察。关于过敏的患者的观察产生了出乎预料的结果：Dd水降低或消除了通常对过敏性疾病的主诉(详述见下文)。

[0006] 本发明是基于消耗作为饮用水的Dd水预防、降低或消除过敏性疾病的症状的观察，因此本发明适用于预防或治疗所述疾病。

[0007] 发明概述

[0008] 第一方面，本发明涉及包含具有0.01-135ppm氘含量的水的药物组合物和食品组合物的制备方法，其适用于预防或治疗过敏性疾病。所应用的具有0.01-135ppm氘含量的Dd水优选通过已知的电解和/或地蒸馏制备或通过其它方法制备[Howard K.Rae(编辑)氢同位素的分离(Separation of Hydrogen Isotopes)，American Chemical Society Symposium Series 68，华盛顿.1978；Stelio Villani(编辑)同位素分离(Isotope Separation).American Nuclear Society 1983]并通过加入常用的添加剂(例如：矫味剂、香料等)和通过应用本领域常用的方法，尤其是被应用于制备药物、非酒精饮料或啤酒的方法，将所获得的水配制成药物组合物或食品组合物。

[0009] 另一方面，本发明涉及

[0010] a)用于预防或治疗过敏性疾病的药物组合物，其包含具有0.01至135ppm氘含量的水及在制药工业所应用的常用添加剂；和

[0011] b)用于预防或治疗过敏性疾病的食品组合物，其包含具有0.01至135ppm氘含量的水及在食品工业所应用的常用添加剂。

[0012] 在上述的两种组合物中，具有0.01至135ppm氘含量的水是通过已知的电解和/或蒸馏或任何其它已知的产生Dd水的方法而制备。

[0013] 在优选的实施方案中所应用的Dd水的氘浓度为5至125ppm、更优选50至110、并且还更优选75至90ppm。然而，对于人消耗而言，尤其在治疗最初的2-3个月，优选的Dd含量是105至130ppm且在治疗的下一个2-3个月，优选的Dd含量是80-105ppm。

[0014] 应指出的是如果所施用的Dd水未成功预防，那么可在治疗阶段应用具有更低D-浓度的Dd水。此外，在用Dd水成功治疗后，具有相同或不同D-浓度的Dd水可被用作应对将来过敏性发作的预防剂。因此，就Dd水而言，可被应用于预防和治疗，彼此互补。

[0015] 发明详述

[0016] 基于O-D键在4μm波长的最大吸收，通过红外光谱测定水的氘浓度。将水样装入比色皿中，经过水的红外光会依据氘含量的成比例地被吸收，其为仪器所检测到。用已知D含量的水校正仪器后，可测定测试样品中D的量(Analytical Biochemistry 98：208-213，1979)。

[0017] 以下描述生产Dd水的两个优选的方法，即电解和蒸馏，其适用于以相对低的成本大量制备Dd-水。

[0018] a)通过彼此分开的阴极和阳极在直流电2-5伏的电压下将15-20％的KOH水溶液电解。在阴极释放的且含有降低浓度的氘的氢被燃烧，并使正在形成的水蒸气凝结且单独收集。所获得的水具有30-40ppm的氘含量(氢同位素的分离(Separation of Hydrogen Isotopes)编辑：Howard K.Rae，American Chemical Society Symposium Series 68，华盛顿.1978；同位素的分离(Isotope Separation)编辑：Stelio Villani，American Nuclear Society1983)。所获得的水的氘含量通过进一步电解可被进一步降低6至20ppm。

[0019] b)在50至150塔板数的分馏柱上，在50至60mbar的压力且在45至50℃的温度下将水蒸馏。在蒸馏过程中的逆流值是12至13，且在蒸馏期间应用的是底部十倍稀释。应用这些参数，初产品的氘浓度是在0.1至30ppm之间(氢同位素的分离(Separation of Hydrogen Isotopes)编辑：Howard K.Rae，American Chemical Society Symposium Series
68，华盛顿1978；同位素的分离(Isotope Separation)编辑：Stelio Villani，American Nuclear Society 1983)。通过改变操作柱过程中的参数，例如：通过显著提高柱的负载量，可大量生产高于30ppm的D浓度的Dd-水。还可以使Dd-水在相似的、连接的柱经过进一步的分馏蒸馏处理来进一步降低水的D-浓度。

[0020] 通过上述的(或通过任何其它)方法产生的Dd水被用作起始的原料。

[0021] 在本说明书中所应用的术语“药物组合物”也包括兽医学组合物。

[0022] 对于术语“过敏性疾病”我们可给出以下的解释：

[0023] 当免疫系统对环境中的无害物起反应时，过敏反应发生。免疫系统是极其复杂的，因此有很多可能让其产生故障。当免疫系统开始对环境中的无害物起反应时，这可导致过敏反应，其是对通常无害物质的扩大的、有损害性的免疫应答。

[0024] 当患过敏疾病的人暴露于通常的环境物质，诸如房尘满或草花粉，一种类型的白细胞(B淋巴细胞)对所述物质产生被称作IgE的特定抗体。然后所述的IgE将自身附于另一类型的白细胞(肥大细胞)上，且当肥大细胞再次与这物质接触时，它们激发导致过敏反应复杂的免疫应答。

[0025] 具有过敏反应的不同的人对不同物质过敏。人们通常过敏的一些物质包括：房尘螨、来自草和树的花粉、包括猫、狗、马的动物皮屑、霉菌、包括木本坚果、花生、贝壳类动物、鱼、奶、鸡蛋、小麦等的食品。

[0026] 具有过敏反应的不同的人当他们暴露于他们过敏的物质时的反应也是不同的。一些通常的反应包括：过敏性湿疹或荨麻疹、过敏性鼻炎(花粉热)、过敏性哮喘、过敏症、打喷嚏、鼻充血和眼刺激。相似的症状也可发生在某些动物上。

[0027] 在依据本发明配制药物组合物或食品组合物的过程中，可应用任何常用的添加剂[例如：甜味剂、着色剂、增稠剂、矫味剂(香料)、pH-调节剂、表面活性剂、香料、果汁浓缩剂、稳定剂等]，这些添加剂为制药工业(包括生产兽医学组合物的工业)和食品工业所熟知，在食品工业中尤其是应用在制备啤酒和非酒精饮料的那些添加剂。在此，要强调的是添加剂可以是具有正常(天然)氘含量的水。

[0028] 在依据本发明制备组合物的过程中，可应用制药和食品工业(也包括生产兽医学组合物的工业)任何标准的(已知的)配制方法。

[0029] 由于Dd水在所发明的组合物的制备方法中的应用，液体形式是有利的制品类型。然而，尤其在食品工业化应用中，所制备的组合物可以是固体(或半固体、凝胶、胶体混合物等)形式。在这种情况下所述的制品仅包含Dd水，即通过消耗该制品，所治疗的个体的平均氘含量没有增加，即这些制品可以补充由液态形式组合物构成的基本治疗。

[0030] 本发明方法的主要优势如下：

[0031] a)它可以在不存在合成的“药物”时干扰过敏过程且可有益地影响病程，[0032] b/本方法中所应用的Dd水没有毒副作用。

[0033] c/生产过程没有产生有害废物。

[0034] d/所述组合物易于被制备。

[0035] 如上所述，在我们的实验中发现了Dd水在治疗过敏性疾病中的一些重要的正面作用。最有价值的结果归纳如下：

[0036] 一组过敏反应患者(10个患者)每年主要在春季遭受花粉热。他们向我们工作组报告在消耗具有105或125ppm的D-含量的Dd水后，症状完全消失或显著减弱。

[0037] 另一个患者每年遭受打喷嚏、鼻充血和眼刺激的较强症状，但是在通常出现所述症状前3-4星期开始消耗Dd水(85ppm)后，它们均可被预防。

[0038] 一个具有严重过敏反应的患者服药很长时间来缓解症状。在她已经开始消耗Dd水(85ppm)后，她可以停止服用药物。

[0039] 考虑到Dd水在兽医学应用的可能性，我们可报告Dd水对遭受非常严重的鼻充血的马的正面作用。在马饮用了约150-200升具有85ppm D-含量的Dd水后，就变得没有症状了。最令人吃惊的结果是在此之后，仅用Dd水治疗，在后来的几年所述的症状没有出现。

[0040] 正如来自于上述的实践经验，通过本发明的方法所获得组合物适用于预防或治疗过敏性疾病。正在研究的是在所述作用中可能起至关重要的分子机制。初步结果表明在有机体中由Dd水所诱导的D水平的降低可能影响某些基因的表达。对于改善或消除症状的解释可能是由Dd水所诱导的基因表达的改变对触发过敏症状的病因适当地反应。Dd水在人类中所获得的结果证实本发明所述方法在治疗过敏性疾病中的适用性。

[0041] 下面的考察可用以揭示所发现的药物作用的理论背景，虽然还没有开展详细的统计学上支持的药理学研究。然而，就过敏反应复杂的且大部分未被发现的理论背景而言，我们未将自己束缚于以下所讨论的理论。

[0042] 药理学研究和实验

[0043] 过敏反应是对通常无害的或不能在所有人产生免疫应答物质的超敏免疫反应。

[0044] 淋巴细胞是在免疫和过敏反应中都起着关键作用的白细胞。它们被分为两种类型，T和B淋巴细胞。每种类型负责免疫系统特定的分支。T-淋巴细胞的的职责是准备直接实行攻击外源性物质(细胞-介导的免疫)。某些T-淋巴细胞是“杀伤”专家(细胞毒性或杀伤T细胞)，而其它则辅助免疫应答并被命名为“辅助”细胞(TH细胞)。TH细胞根据它们释放的蛋白质进一步被划分成TH1(感染斗士)和TH2(过敏反应促进者)。T-淋巴细胞的伴侣是B-淋巴细胞。B-淋巴细胞是生产帮助破坏外源性物质的抗体的小抗体工厂，该行为由TH细胞激发。

[0045] 嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞是在过敏反应中起着重要作用的其它白细胞。在过敏条件下T细胞经常调用这些细胞产生作用。嗜酸性粒细胞的血浓度在有哮喘和其它过敏性疾病的人群中通常是升高的。

[0046] 细胞因子是由淋巴细胞释放的小蛋白质，其能增强或降低免疫应答。一种细胞因子，白介素4(IL4)是产生IgE所必需的。白介素5(IL5)和其它的细胞因子在吸引其它细胞中是很重要的，所述其它细胞特别是嗜酸性粒细胞，该细胞随后可促进炎症。TH2淋巴细胞也可释放这一系列的细胞因子，因此进一步促进过敏性炎症。

[0047] 对于治疗过敏性疾病提出了治疗性介入的三个要点。A)第一个可能性是阻断免疫应答的引发且从而防止疾病的发展-促进T辅助2(TH2)对过敏原的应答：例如，通过在生命早期介入。B)第二个可能性是直接地或间接地通过作用于存在抗原的细胞，阻断过敏原-特异性的TH2细胞的活化：例如，通过用抗炎症药物治疗，诸如糖皮质激素，或通过过敏原免疫治疗。C)第三个可能性是阻断产生过敏性疾病临床症状的效应分子：例如，通过用抗组胺剂、白三烯拮抗药，TH2细胞因子的特异性的中和抗体或IgE的特异性抗体治疗。IL，白细胞介素；TCR，T-细胞受体(Nature Reviews Immunology 5，271-283(2005年4月)在过敏和哮喘中白介素10分泌型调控T细胞的潜在作用(Potential role of interleukin-10-secreting regulatory T cells in allergy and asthma)C.M.Hawrylowicz & A.O′Garra)。

[0048] 其它结果显示酪氨酸磷酸化在IL-2-介导的信号转导中是很关键的且MAP激酶是在该通路中涉及的一个细胞中介物。(通过重组白细胞介素-2活化胚细胞植物凝集素中的丝裂原激活的蛋白激酶/ERK-2：与CD3活化的特征比较(Activation of mitogen-activated protein kinase/ERK-2 in phytohaemagglutin in blasts by recombinant interleukin-2：contrasting features with CD3 activation).R M Fairhurst，M Daeipour，M C Amaral，and 和 A E NeI，Immunology.1993 May；79(1)：112-118.))。另一篇论文也证实在IL-诱导的趋化因子释放中涉及MAP激酶(在人的气道平滑肌细胞中IL-1β-诱导的趋化因子释放中涉及p38 MAPK、JNK，p42/p44 ERK和NF-Kb(Involvement of p38 MAPK，JNK，p42/p44 ERK and NF-κB in IL-\β-induced chemokine release in human airway smooth muscle cells)Wim A.Wuyts，Bart M.Vanaudenaerde，Lieven J.Dupont，Maurits G.Demedts 和 Geert M.Verleden.Respiratory Medicine 2003年7月，97(7)：811-817)。

[0049] 为了揭示氘贫化应用于减弱或预防过敏反应的特定通路需要进一步的基础和临床研究，但是基于已提供的结果，已有Dd水影响在过敏反应中起关键作用分子机制的明确证据。

[0050] 如上所述直接地或间接地通过作用于存在抗原的细胞，阻断过敏原特异性的TH2细胞的活化(例如，通过用抗炎症药物治疗)是治疗过敏性疾病的一种可能性。

[0051] 公知非甾体抗炎药的主要靶标是负责前列腺素合成的COX-2基因。用来源于人结肠的肿瘤细胞系(腺癌)开展实验。所述细胞在二氧化碳恒温箱(5％CO2：95％空气)中含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI基质中培养。当细胞几乎充满培养皿(70％融合值)的空间时，抽取血清24小时。在去除了血清后，下一步将细胞培养在低氘水制备的RPMI基质中，在24小时后，进行MTT(microculture tetrazolinum)分析以测定细胞增殖。我们用蛋白印迹分析测定上文所详述处理的细胞的COX-2含量。分析已显示Dd-水(20-60ppm)强烈地抑制HT-29人结肠癌细胞系的COX-2基因表达。与细胞增殖实验的结果相似，这也证实作用呈浓度依赖性。图1.显示D2O浓度对COX-2基因表达的影响。图2.显示D-浓度和细胞内前列腺素的量之间的相关性证实Dd水对COX-2基因表达的抑制作用导致细胞中前列腺素的浓度较低(Gabor Somlyai：让我们战胜癌症(Let′s defeat cancer).Akademiai Kiadó出版，邮政信箱245.H-1519布达佩斯，www.akkrt.hu，ISBN 963 05 78076)。

[0052] 这些结果可表明Dd水对过敏性患者的一种作用模式可以是COX-2基因的抑制作用。然而，应该明白的是COX-2基因抑制作用不产生抗过敏效应。该现象揭示可以在治疗过敏反应中起作用的一种作用。

[0053] 上面也提到MAP激酶(ERK)磷酸化在IL-2-介导的信号转导中很关键。图3.显示(未发表的结果)在正常水(150ppm)中磷酸化键出现在诱导后的2分钟，但是在Dd水(20ppm)中磷酸化键没有出现。这明确地表明Dd水的应用介入信号转导通路且可抑制IL-介导的信号转导。然而，应该明白的是磷酸化的抑制作用不产生抗过敏效应。该现象揭示可以在治疗过敏反应中起作用的一种作用。

[0054] 如上面所讨论的，该信号转导系统对过敏反应起作用，但是作用方式是非常复杂的且大部分未被发现。正如在研究D-浓度改变不同IL的水平的作用的研究中所获得的结果(表1：这些实验在有资格的独立的实验室中完成)所知，可以说Dd水对IL水平具有复杂的作用。然而，基于所获得的实验结果(对于不同的IL，发现主要是降低但是有时水平提高)不能预测所发现的对治疗过敏性疾病的正面作用。从所述的结果中仅能得出一个事实：Dd水对在过敏反应中起着重要作用IL水平具有影响。

[0055] 下表1至3概述了Dd水对细胞因子浓度(水平)的作用。显著高于灭菌水对照值(p≤0.05)以加粗显示。显著低于灭菌水对照值(p≤0.05)以加粗和斜体显示。应指出的是在本稀释设计中IL-8、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的水平在所有组中均太高以至于无法定量。

[0056] 表1(DDW:Dd水)

[0057]

[0058] 表2(DDW:Dd水)

[0059]

[0060] 表3(DDW:Dd水)

[0061]

[0062] 在全层皮肤等同物培养物中也考察了低氘水的作用。在治疗24小时后，低氘水对培养物的活力、前胶原Ic-肽产生或透明质酸产生没有影响，因此没有发现毒性作用。

[0063] 附图简述

[0064] 图1显示不同浓度D2O对HT％-29细胞中COX-2表达的影响

[0065] 图2显示不同浓度DDW对HT-29细胞中前列腺素产生的影响

[0066] 图3显示D2O对HT-29细胞中FCS-诱导的MAP激酶(ERK)磷酸化的影响。实施例

[0067] 通过以下的实施例证明了本发明的方法，其并非对保护范围限制：

[0068] 实施例1

[0069] 生产具有有利的矿物组成的饮用水

[0070] 将Dd水和具有已知盐组成的天然矿物水(诸如匈牙利品种Csillaghegyi、Balfi、gyémánt)按以下的比率混合：

[0071] a)0.25体积份的含90ppm D含量的水+0.75体积份的矿物水；最终的D浓度135ppm。

[0072] b)0.5体积份的含90ppm D含量的水+0.5体积份的矿物水；最终的D浓度120ppm。

[0073] c)0.75体积份的含90ppm D含量的水+0.25体积份的矿物水；最终的D浓度105ppm。

[0074] d)0.25体积份的含60ppm D含量的水+0.75体积份的矿物水；最终的D浓度127.5ppm。

[0075] e)0.5体积份的含60ppm D含量的水+0.5体积份的矿物水；最终的D浓度105ppm。

[0076] f)0.75体积份的含60ppm D含量的水+0.25体积份的矿物水；最终的D浓度82.5ppm。

[0077] 实施例2

[0078] 由具有有利的盐组成的人工浓缩物设定Dd水的阳离子和阴离子含量。该储备液可能具有以下组成：

[0079] KCl 5.7g

[0080] MgCl2·6H2O 199.65g

[0081] CaCl2·6H2O 236.25g

[0082] +Dd水至1000ml。

[0083] 这种方式制备的储备液得到以下的终浓度：Mg2+：23.8mg/L；Ca2+：64.1mg/L；K+：-
3mg/L；Cl ：192mg/L。

[0084] 实施例3

[0085] 制备具有降低D含量的果汁饮料和碳酸饮料。

[0086] 将30ppm D含量的蒸馏水与水或浓缩果汁按以下的比率混合：

[0087] a)0.13体积份的含30ppm D含量的水+0.67体积份的水+0.20体积份浓缩果汁；最终的D浓度约128-130ppm。

[0088] b)0.20体积份的含30ppm D含量的水+0.60体积份的水+0.20体积份浓缩果汁；最终的D浓度约118-120ppm。

[0089] c)0.24体积份的含30ppm D含量的水+0.56体积份的水+0.20体积份浓缩果汁；最终的D浓度约111-113ppm。

[0090] 实施例4

[0091] 制备低氘啤酒

[0092] 首先，将用于生产酿造啤酒的麦芽的大麦浸渍在Dd水中(D浓度：0.01至135ppm)，然后铺成成5至15cm厚层并在低温(5至15℃)、良好通风下制麦芽。长麦芽在56至75℃间用干燥器干燥，然后去除胚芽根的残余物并把麦芽磨碎。将磨碎的麦芽与适量的Dd水(D水平：0.01至135ppm)混合，保持在50至75℃，然后过滤并用酒花处理。
将酒花处理后的啤酒麦芽汁过滤，放冷，然后灌输预先生长的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，主发酵在5至6℃持续10至14天。最终的发酵在0℃密闭的容器中持续几星期完成。然后将啤酒过滤、装瓶、巴氏消毒。主要通过所使用水的D含量确定所生产的啤酒的氘含量，也影响乙醇和其它组分的D含量。