用于改善认知的方法和组合物 |
|||||||
| 申请号 | CN201680019604.8 | 申请日 | 2016-02-05 | 公开(公告)号 | CN107405382A | 公开(公告)日 | 2017-11-28 |
| 申请人 | 加利福尼亚大学董事会; | 发明人 | 德娜·杜波; | ||||
| 摘要 | 本文提供了用于改善个体的认知功能的klotho多肽组合物和方法，所述方法包括利用klotho多肽的 治疗 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于改善有需要的个体的认知功能的方法，所述方法包括： |
||||||
| 说明书全文 | 用于改善认知的方法和组合物[0002] 本申请要求于2015年2月6日提交的美国临时专利申请号62/113,300的优先权权益，该申请通过引用并入。 [0003] 发明背景 [0004] 脑健康是最大的生物医学挑战之一，如果有的话，有效医疗手段也很少。认知是脑健康的很重要的和主要的表现，在正常衰老、众多的神经变性疾病、神经疾病和精神疾病、 儿童发育综合征、创伤性脑损伤和应激中其受损或被扰乱。认知还被飞行时差反应(jet lag)、药物副作用和某些医疗手段，诸如用于癌症的那些所扰乱。因此，增强认知或对抗认 知紊乱的潜力在整个人类生命中在健康和疾病方面具有巨大的关联性。 [0005] 发明简述 [0006] 本文提供了通过全身施用klotho或包含klotho或其功能片段的蛋白来改善认知的方法和组合物。在一些实施方案中，该方法包括改善个体的认知，包括向所述个体施用有 效量的包含Klotho多肽或其功能变体或片段的蛋白，由此改善所述个体的认知功能。在一 些实施方案中，所述施用是全身性的、外周性的或经鼻的。在一些实施方案中，所述蛋白是 Klotho多肽或其片段。在一些实施方案中，所述施用是口服的、粘膜的或通过注射执行。在 一些实施方案中，所述注射是静脉内注射、腹膜内注射、皮下注射或肌内注射。在一些实施 方案中，所述施用借助于输注，例如，使用储蓄库或微型渗透泵的连续输注。 [0007] 在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述人至少具有正常的认知功能并且与所述给药之前相比所述施用导致认知功能改善。在一些实施方案中，所述人 为50岁或更大的年纪(例如，至少60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、100岁或更大的 年纪)。在一些实施方案中，所述个体正在经受年龄相关的认知减退。在一些实施方案中，所 述施用导致认知减退的速率减小，例如，使得短期记忆不如基于治疗前或年龄分组下降所 期望的那样快速地下降。在一些实施方案中，所述个体小于50岁。 [0008] 在一些实施方案中，所述个体具患有神经变性疾病，例如，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia)、进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)、皮质基底节变性(corticobasalar degeneration)、轻度认知功能 损害(mild cognitive impairment)、血管性痴呆(vascular dementia)、雷维小体痴呆 (Lewy body dementia)、多系统萎缩(multiple system atrophy)、肌萎缩性侧索硬化症 (amyotropic lateral sclerosis)、朊病毒病症(prion disorder)和HIV相关痴呆(HIV- related dementia)。在一些实施方案中，所述个体患有精神或心境障碍，例如，抑郁症 (depression)、精神分裂症(schizophrenia)、注意力缺陷/多动症(attention deficit/ hyperactivity disorder)、自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder)、智力障碍 (intellectual disability)、心境障碍(mood disorder)或精神病性障碍(psychotic disorder)。在一些实施方案中，所述个体具有选自下列的病况：创伤性脑损伤(traumatic brain injury)、卒中(stroke)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、神经自身免疫性疾 病(neuroautoimmune disease)、癫痫(epilepsy)、谵妄(delirium)和副肿瘤病症 (paraneoplastic disorder)。在一些实施方案中，所述个体具有选自下列的病况：X-连锁 精神障碍(X-linked mental disorder)、唐氏综合征(Down’s syndrome)、安吉尔曼综合征 (Angelman’s syndrome)和雷特综合征(Rett’s syndrome)。在一些实施方案中，所述个体 具有选自下列的病况：苯丙酮尿症(phenylketonuria)、莱施-奈恩病(Lesch-Nyhan)、半乳 糖血症(galactosemia)和肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)。在一些实施方 案中，所述个体正在接受放射治疗或化学疗法以治疗癌症。在一些实施方案中，所述个体正 在经历或预期经历(例如，在大约2小时至2周，约12-48小时，或约24小时)应激、疼痛、睡眠 剥夺或飞行时差反应。 [0009] 在一些实施方案中，所述人具有受损的运动功能，与施用前相比，所述施用导致改善的运动功能。 [0010] 在一些实施方案中，所述klotho多肽与可溶的人klotho(SEQ ID NO：1的氨基酸34-979)具有至少75％的同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或 100％的同一性)。在一些实施方案中，所述klotho多肽是包含与人klotho的KL1结构域具有 至少75％同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的多肽的功能片段。在一些实施方案中，所述klotho多肽是包含与人klotho的KL2结构域具有至 少75％同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的多肽的功能片段。在一些实施方案中，所述klotho多肽保留了可溶性人klotho的至少一种活性 水平的至少40、50、60、70、80、90或100％。 [0011] 在一些实施方案中，所述klotho多肽以0.1-50,000μg/kg体重(例如，0.5-10μg/kg，0.5-500μg/kg，1-2000μg/kg，1-250μg/kg，5-250μg/kg，10-100μg/kg，1000-20,000μg/kg，或约10，25，50，100，或1000μg/kg)的剂量施用于所述个体。在一些实施方案中，所述 klotho多肽每天一次、每周两次、每周一次、或每两周一次施用。在一些实施方案中，所述 klotho多肽在需要改善认知的事件之前(例如，2、6、12、24或48小时)或响应于需要改善认 知的事件而施用，所述需要改善认知的事件例如，应激、飞行时差反应、睡眠剥夺或预期繁 重的脑力劳动。 [0012] 在一些实施方案中，在施用前测试所述个体的认知能力。在一些实施方案中，在施用后测试所述个体的认知能力。在一些实施方案中，在施用前后，或在疗程期间多次测试所 述个体的认知能力。在一些实施方案中，测试所述个体的语义记忆、情节记忆、程序记忆、启 动记忆、和/或工作记忆。在一些实施方案中，测试所述个体的语言能力、执行功能、视空间 功能或痴呆。在一些实施方案中，当认知能力不再显著增加时，增加klotho多肽的施用剂量 或频率。 [0013] 在一些实施方案中，提供了改善运动功能的方法。在一些实施方案中，提供了改善有需要的个体的运功功能的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的包含Klotho多肽或 其功能片段的蛋白，其中所述施用是全身性的或外周性的，由此与所述施用之前相比改善 所述个体的认知功能。在一些实施方案中，所述klotho多肽与可溶的人klotho(SEQ ID NO： 1的氨基酸34-979)具有至少75％的同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99或100％的同一性)。在一些实施方案中，所述klotho多肽是包含与人klotho的KL1结 构域具有至少75％同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的多肽的功能片段。在一些实施方案中，所述klotho多肽是包含与人klotho的KL2结 构域具有至少75％同一性(例如，至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的多肽的功能片段。在一些实施方案中，所述klotho多肽保留了可溶性人klotho的至 少一种活性的水平的至少40、50、60、70、80、90或100％。在一些实施方案中，所述klotho多 肽以0.1-50,000μg/kg体重(例如，0.5-10μg/kg，0.5-500μg/kg，1-2000μg/kg，1-250μg/kg， 5-250μg/kg，10-100μg/kg，1000-20,000μg/kg，或约10、25、50、100、或1000μg/kg)的剂量施用于所述个体。在一些实施方案中，所述klotho多肽每天一次、每周两次、每周一次、或每两 周一次施用。 [0014] 在一些实施方案中，运动功能受损的个体患有脑或脊髓的卒中(缺血性或出血性)、神经变性疾病(帕金森病、雷维小体痴呆、多系统萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、朊病毒病 症、亨廷顿舞蹈病、核上性麻痹)、震颤麻痹(Parkinsonism)、创伤性脑损伤、神经传染性脑 损伤、多发性硬化症以及相关的自身免疫和脱髓鞘疾病、脊髓损害(压缩性、传染性、毒性或 代谢性、自身免疫、肿瘤性)、脑肿瘤、癫痫、副肿瘤病症、神经发育病症(线粒体、常染色体遗 传)、肌肉疾病(多肌炎(polymyositis)、皮肌炎(dermatomyositis)、包涵体肌炎 (inclusion body myositis)、传染性、内分泌、代谢性、毒性、先天性肌病、先天性肌营养不 良(congential muscular dystrophy)、遗传性)、神经病(吉兰-巴雷综合征(Guillain- Barre syndrome)、轴突和脱髓鞘性、糖尿病性、毒性、代谢性、传染性、危重病性、卡压性 (entrapment))、蜱性麻痹(tick paralysis)、重症肌无力(myasthenia gravis)和脊髓性 肌萎缩症(spinal muscular atrophy)。 [0016] 图1A-J.在小鼠中Klotho递送增强认知。在腹膜内(i.p.)递送赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)(10μg/kg)(4月龄)后以认知任务测试小鼠。数据为平均数±SEM。 [0017] 图1A.在用赋形剂或klotho治疗后18小时在Y迷宫中测试小鼠。显示了4分钟探索Y迷宫期间各臂间的交替百分比(percent alternation)(n＝4只雄性小鼠/组)。 [0018] 图1B-J.在每天用赋形剂或klotho治疗后在Morris水迷宫中测试小鼠(显示两个独立群组：群组1和群组2)。 [0019] 图1B.显示在群组1中当平台被隐藏时的空间学习曲线。在测试前4小时施用Veh或KL。数据代表在第1-4天到达隐藏平台所行走的总距离的每天平均值。第0天代表第1天的第 一次试验所行走的距离。在第5天，当可见到平台时，Veh-和klotho-治疗的小鼠同样好地查 找到该位置。(n＝4只雄性小鼠/组) [0020] 图1C.在群组1中Veh-和klotho-治疗的小鼠以相同的速度游泳，如通过在第4天来自隐藏训练的平均速率来测量。 [0021] 图1D.显示在群组2的独立小鼠群组中当平台被隐藏时的空间学习曲线。在测试前18小时施用Veh或KL。数据代表在第1-4天到达隐藏平台所行走的距离的每天平均值。(n＝ 7-10只小鼠/组；包括雄性和雌性) [0022] 图1E-J.在群组1中在Veh-和klotho-治疗的小鼠中在隐藏平台训练结束后1小时和24小时用来评估当移除平台时的空间记忆的探索实验的结果。 [0023] 图1E.在1小时探索中在目标中心处的逗留时间显示了在原始平台位置处所花费的时间。 [0024] 图1F在1小时探索中的目标平台跨越显示了跨越原始平台位置的频率。 [0025] 图1G.在1小时探索中，与在其他象限中所花费的平均时间相比，在目标象限中所花费的时间百分比。*p＜0.05(t-检验) [0026] 图1H.在24小时探索中在目标中心处的逗留时间。 [0027] 图1I.在24小时探索中的目标平台跨越。 [0028] 图1J在24小时探索中在目标象限中所花费的时间百分比。 [0029] 图2A-B.短期递送klotho增强老年小鼠的认知。在训练前24小时腹膜内递送赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)(10μg/kg)后测试小鼠在大型Y-迷宫中的空间和工作记忆 (每个实验组n＝8-9只小鼠，性别平衡组，18月龄，获自NIH colony of aging mice(NIH衰 老小鼠种群))。训练后18小时，小鼠经历测试并且在探索迷宫期间测量在新异臂和熟悉的 臂中所经历的逗留时间。(图2A)新异臂偏好性显示为在整个指示的探索时间内以及在(图 2B)3分钟时与熟悉的臂相比在新异臂中所花费的时间比率。*p＜0.05(t-检验)。数据为平 均数±SEM。 [0030] 图3.短期递送klotho诱导长期认知增强。在最后一次腹膜内递送赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)(0.5或2.5μg/kg)后的16天时测试小鼠在大型Y-迷宫中的空间和工作 记忆，其中赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)每天给药一次持续5天(每个实验组n＝8-10 只小鼠，性别平衡组，5-5.5月龄)。训练后18小时，在探索迷宫期间测量在新异臂和熟悉的 臂中所经历的逗留时间。新异臂偏好性显示为在5分钟探索时与熟悉的臂相比在新异臂中 所花费的时间比率。**p＝0.01(Bonferroni-Holm检验)。数据为平均数±SEM。 [0031] 图4A-B.短期递送klotho改善表达人α-突触核蛋白的转基因hSYN小鼠中的认知缺陷。在训练前22小时时以及之后的测试前14小时时腹膜内递送赋形剂(Veh)或重组小鼠 klotho(KL)(2.5μg/kg)后，测试小鼠在大型Y-迷宫中的空间和工作记忆(每组n＝6-9只雄 性小鼠，2.5-6月龄)。训练后18小时，在探索迷宫期间测量在新异臂和熟悉的臂中的逗留时 间和进臂次数。数据为平均数±SEM。 [0032] 图4A.新异臂偏好性显示为在5分钟探索时与熟悉的臂相比在新异臂中所花费的时间比率。双向ANOVA：hSYN效应p＝0.026，KL效应p＝0.07；*p＜0.05，#p＝0.07 (Bonferroni-Holm检验) [0033] 图4B.新异臂偏好性显示为在5分钟探索时与熟悉的臂相比进入新异臂的次数比率。双向ANOVA：hSYN效应p＝0.07，KL效应p＝0.03；#p＝0.07(t-检验)。 [0034] 图5.短期递送klotho改善表达人α-突触核蛋白的转基因hSYN小鼠中的早期运动缺陷。在测试前大约17小时时腹膜内递送赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)(2.5μg/kg) 后测试小鼠在旋转任务(rotarod task)中的运动功能(每个实验组n＝6-10只雄性小鼠， 2.5-6月龄)。在旋转棒上没有掉落所经过的时间以秒(s)表示。在hSYN小鼠中，KL-治疗改善 了早期运动功能，如在试验1-3期间在旋转棒上所经过的平均逗留时间增加所示。双向 ANOVA：hSYN效应0.0025；**p＜0.01，*p＜0.05(Bonferroni-Holm检验)。数据为平均数± SEM。 [0035] 图6.短期递送klotho不改变小鼠的总活动。在腹膜内递送赋形剂(Veh)或重组小鼠klotho(KL)(2.5μg/kg)后的16小时时，测试小鼠在旷场任务中的总运动和总活动水平 (每个实验组n＝8只小鼠；性别平衡组；5月龄)。绘制了5分钟内的总运动。数据为平均数± SEM。 [0036] 发明详述 [0037] I.介绍 [0038] Klotho是相对大的蛋白，其分泌形式大约130kD，且预期不会穿越血脑屏障。然而，本文提供的结果显示Klotho在几小时的全身给药内以及其半衰期清除后长时间地对认知 发挥阳性作用。这些结果是非常出人意料地，并且与直接向大脑给药或直接进入脑脊液相 比提供了更安全、更便利的疗法的优势。 [0039] II.定义 [0040] 除非另外规定，否则本文所用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。参见，例如，Lackie，DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY(细 胞生物学词典)，Elsevier(第4版，2007)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL(分子克隆，实验室手册)，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY 1989)。与本文所述的那些相似或等效的任何方法、装置和材料可以用于本发明 的实施中。提供下列定义以促进对本文中频繁使用的某些术语的理解并且不意在限制本公 开的范围。 [0041] 除非另外指明，术语“klotho”或“klotho多肽”是指可溶性klotho多肽，以及其功能变体和片段。可溶性klotho是在流体(例如，血清、脑脊液等)中循环的任何形式的 klotho，其不包括跨膜或细胞内成分。Klotho可以由其跨膜形式裂解并释放到流体中，或以 另外的方式由细胞分泌或脱落。Klotho RNA也可以备选地被剪接并且直接分泌至周围流体 中(即，不形成跨膜蛋白)。两种形式包括在术语可溶性klotho多肽、klotho多肽和klotho 中。 [0042] 如本文所用，术语“全身性”或“外周性”是指通过不涉及直接注射(或其他给药)至脑脊液(CSF)或中枢神经系统(CNS)的途径的给药。即，全身性和外周性给药涵盖给药至血 脑屏障的“血液”侧。全身和外周途径的实例包括口服和粘膜、静脉内、腹膜内、肌肉内和皮 下注射，以及静脉内滴注。 [0043] 术语“认知”、“认知能力”、“认知功能”和类似术语是指思维任务和功能的集合体，包括但不限于：记忆(例如，语义记忆、情节记忆、程序记忆、启动记忆或工作记忆)；定向；语 言；解决问题；视觉感知，构造和整合；计划；组织技能；选择性注意；抑制性控制；和心理处 理信息的能力。 [0044] 术语“改善的认知”、“增加的认知能力”、“改善的认知功能”和类似术语是指在给定的条件(例如，用klotho治疗)下与缺少该条件(例如，缺少利用klotho的治疗)下的认知 相比，认知有改善。对于经历认知减退的个体来说，认知的改善可以是认知减退的速率减慢 (即，与缺少治疗相比的改善)，而不是认知能力的实际改善。认知能力的增加也可以是在特 定区域中脑活动的增加，例如，如通过MRI测定，或抑制脑活动导致更好的全脑功能。认知能 力的增加也可以是如本文更详细描述的认知表现的改善。认知能力的改善或增加可以是在 任一个认知方面或功能中，或单个认知功能的任意组合中。 [0045] 需要改善认知功能的个体是指具有下述的个体：年龄相关的认知减退；神经变性疾病；精神或心境障碍；创伤性脑损伤；发育迟缓；导致认知能力下降的遗传性疾病；由于卒 中、脑癌、MS、癫痫、放疗或化疗引起的脑损伤等。需要改善认知功能的个体还可以包括希望 增加心理机能以对抗应激、睡眠剥夺、飞行时差反应、或疼痛的作用，或为了加强对特定工 作的能力的个体。这类个体的更完全和特定的列表包括在本文的“认知病况和障碍”章节 中。 [0046] 词语“蛋白”、“肽”和“多肽”可互换地用来说明氨基酸聚合物或一组两种以上相互作用的或结合的氨基酸聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然 存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物，含有修 饰残基的那些，以及非天然存在的氨基酸聚合物。 [0047] 术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及功能上与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及 以后被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似 物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，例如，与氢、羧基、氨基、和 R基团结合的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物可以 具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的 基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但功能与天然 存在的氨基酸相似的化学化合物。 [0048] 在本文中氨基酸可以由它们普遍已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号来表 示。同样地，核苷酸可以由它们普遍接受的单字母代码来表示。 [0049] “保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中所述核酸不编码 氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的或相关联的(例如，天然相邻的)序列。由于遗传代 码的简并性，大量功能上相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU均 编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每一个位置处，该密码子可以被改变成所 述的对应密码子中的另一个，而不会改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其 是保守修改变异中的一类。本文中的编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的沉默变异。 技术人员将认识到在某些背景下，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG以外，AUG通常是仅 用于蛋氨酸的密码子，TGG通常是仅用于色氨酸的密码子)可以被修饰以产生功能上相同的 分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变异在所述的序列中关于表达产物经常是不明确的，但 关于实际的探针序列则是明确的。 [0050] 对于氨基酸序列，技术人员将认识到对于核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个置换、缺失或添加(其在所编码的序列中改变、添加或删除单一氨基酸或小百分比的氨基酸)是 “保守修饰的变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相 似的氨基酸的保守置换表在本领域中是众所周知的。这样的保守修饰变体是另外的，并且 不排除本发明的多形态变体、种间同系物和等位基因。下列的氨基酸是典型的相互的保守 置换：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸 (F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见， 例如，Creighton，Proteins(蛋白)(1984))。 [0051] 在两个以上核酸，或两个以上多肽的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”是指这样的两条以上序列或子序列：它们是相同的或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨 基酸(即，当在比较窗上或标注区域上比较和比对最大对应性时，在特定区域上约60％的同 一性，优选65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％， 98％，99％，或更高的同一性)，如使用具有缺省参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法测 量，或通过人工比对和目测测量。参见，例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。这样的序 列然后称为“基本上相同”。此定义也称为，或可以适用于核苷酸测试序列的编辑。该定义还 包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的那些序列。如下所述，算法可以说明空位 等。典型地，同一性在包括抗体表位的区域上存在，或在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸 的序列上存在，或在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在，或在参比序列的整个 长度上存在。 [0052] 术语“重组”当关于例如，细胞、或核酸、蛋白或载体使用时，指示所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白或改变天然核酸或蛋白而被修饰，或所述细胞来 源于如此被修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达所述细胞的天然(未重组)形式内不存在 的基因或表达以另外的方式被异常表达、表达下调或根本不表达的天然基因。 [0053] 术语“异源”当关于蛋白或核酸的部分使用时，指示所述蛋白或核酸包含两条以上在自然界中没有发现彼此处于相同关系的子序列。例如，所述蛋白或核酸典型地被重组产 生，具有两条以上来自不相关基因的序列，所述序列排列以组成新的功能核酸，例如，来自 一个来源的启动子，和来自另一个来源的编码区，或功能性嵌合蛋白。 [0054] 术语“激动剂”、“激活剂”、“诱导剂”和类似术语是指与对照相比增加(例如，klotho或klotho信号传导途径)活性或表达的试剂。激动剂是例如，刺激、增加、激活、增强 激活、敏化或上调klotho或klotho信号传导途径的活性的试剂。所述表达或活性可以比对 照中增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在某些情况 下，与对照相比，所述激活是1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、10-倍或更高。 [0055] 术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“下调节剂”可互换地指与对照相比导致可检测到地较低表达或活性水平的物质。被抑制的表达或活性可以是对照的10％，20％， 30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更少。在某些情况下，与对照相比，所述抑制是 1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、10-倍或更高。 [0056] “对照”样品或值是指充当参比的样品，通常是已知的参比，用于与测试样品比较。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，在测试化合物的存在下，并且与来自己知条件的 样品进行比较，例如，在缺少测试化合物的条件下(阴性对照)，或在已知化合物的存在下 (阳性对照)。对照还可以代表由多个测试或结果收集的平均值。本领域技术人员将认识到 对照可以设计用于评估任何数量的参数。例如，对照可以被设计成基于药理学数据(例如， 半衰期)或治疗措施比较治疗益处(例如，比较益处和/或副作用)。对照可以被设计用于体 外应用。本领域技术人员将理解哪种对照在给定的情况下是有价值的并且能够基于与对照 值的比较分析数据。对照还有价值的用于确定数据的显著性。例如，如果用于给定参数的值 在对照中大幅变化，则测试样品中的变化将不被认为是显著的。 [0057] “标记”或“可检测部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测到的组成成分。例如，可用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例 如，如ELISA中所普遍使用的)、生物素、洋地黄毒苷、或半抗原和蛋白或可以制成为可检测 到的其他实体，例如，通过将放射性标记掺入到可与靶肽特异性反应的肽或抗体中。可以采 用用于将蛋白缀合到标记上的任何已知方法，例如，使用Hermanson，Bioconjugate Techniques(生物缀合技术)1996，Academic Press，Inc.，San Diego中所述的方法。 [0058] “标记的”分子(例如，klotho多肽)是通过接头或化学键共价结合，或通过离子键、范德华力、静电或氢键非共价结合标记，使得分子的存在可以通过检测与所述分子结合的 标记的存在来检测到。 [0059] 术语“诊断”是指在个体中存在病症的相对可能性。相似地，术语“预后”是指某种未来结果可能在所述个体中发生的相对可能性。例如，在本公开的背景下，预后可以指个体 患有认知减退的可能性，或疾病的可能严重性(例如，症状的严重性，功能减退的速率等)。 所述术语不意在是绝对的，如医学诊断领域中任一技术人员所理解的那样。 [0060] “生物样品”可以获自患者，例如，活检，获自动物，诸如动物模型，或获自培养的细胞，例如，从患者移除并且在培养物中生长的用于观察的细胞系或细胞。生物样品包括组织 和体液，例如，脑脊液(CSF)、血液、血液级分、淋巴、唾液、尿液、粪便等。 [0061] 术语“疗法”、“治疗”和“改善”是指症状(认知减退)的严重性的任何减少，或认知功能的改善，或在运动功能受影响的情况下，指运动功能的改善。如本文所用，术语“治疗” 和“预防”不意在是绝对的术语。治疗和预防可以指认知减退的任何延缓，症状(例如，思维 混乱、谵妄)的改善等。治疗和预防可以是完全的或部分的，使得认知好于不治疗情况下所 预期的认知(例如，与治疗前同一个体中的认知相比或与相似的未治疗个体中的认知相 比)。治疗的作用可以与不接受治疗的个体或大量个体相比较，或与治疗前或处于治疗期间 不同时间的同一患者相比较。在一些方面，与例如，给药前的个体或与不经历治疗的对照个 体相比，认知提高至少1％。在一些实施方案中，使用认知测试、分子代用品(molecular proxies)、或与脑功能相关联的结构变化确定，认知提高至少2，3，5，7，10，15，20，25％， 50％，75％，80％，或90％或更高。在一些方面，与例如，给药前的个体相比或与不经历治疗 的对照个体相比，运动功能提高至少1％。在一些实施方案中，使用运动功能的测试确定，运 动功能提高至少2，3，5，7，10，15，20，25％，50％，75％，80％，或90％，或更高。 [0062] 术语“有效量”、“有效剂量”、“治疗有效量”等是指足以改善如上所述的病症的治疗剂的量。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示疗效增加或减少至少1％，2％，5％， 10％，15％，20％，25％，40％，50％，60％，75％，80％，90％，或至少100％。治疗效力也可以表示为“-倍”增加或降低。例如，治疗有效量可以产生对照的至少1.2-倍、1.5-倍、2-倍、5- 倍或更多的作用。 [0063] 如本文所用，术语“药学上可接受的”与生理学上可接受的和药理学上可接受的作为同义词使用。药学组合物通常将包含用于缓冲和储存保存的试剂，并且可以包含缓冲液 和用于适宜地递送的载体，这取决于给药途径。 [0064] 术语“剂量”和“药量”在本文中可互换使用。剂量是指在每次给药时给予个体的活性成分的量。对于本发明，剂量是指Klotho多肽的量。剂量将根据许多因素而变化，包括给 药频次；个体的尺寸和耐受性；病况的类型和严重性；副作用的风险；以及给药途径。本领域 技术人员将认识到可以根据上述因素或基于治疗进展修改剂量。术语“剂型”是指药物的特 定形式，并且取决于给药途径。例如，剂型可以是液体，例如注射用盐水溶液。 [0065] “受试者”、“患者”、“个体”等术语可互换使用，并且除了指示的情况以外，是指哺乳动物诸如人和非人灵长类动物，以及犬、马、猪、小鼠、大鼠和其他哺乳动物物种。所述术 语不必要指示所述受试者已经被诊断为特定的疾病，但典型地是指处于医疗监督下的个 体。患者可以是正在寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。 [0066] III.Klotho [0067] Klotho是一种多效蛋白和衰老调节剂，其在整个身体和大脑内循环(Imura等人(2004)FEBS Letters 565：143；Kurosu等人(2005)Science 309：1829)。人Klotho记述于 GenBank登录号NC_000013和Uniprot登录号Q9UEF7。存在多种物种同源物，包括小鼠和大鼠 Klotho，它们与人Klotho多肽(显示为SEQ ID NO：1)具有86％和85％的同一性。其以跨膜形 式存在，所述跨膜形式可以被裂解使得细胞外部分(氨基酸34-979)作为激素释放 (Shiraki-lika等人(1998)FEBS Letters 424：6)。Klotho还具有剪接变体，所述剪接变体 产生了蛋白的549个氨基酸分泌形式，该分泌形式也是有功能的(Wang和Sun(2009)Ageing Res.Rev.8：43)。裂解的和分泌的klotho两者都是可溶的并且在身体中都是有功能的，但由 于剪接变化在C-末端处具有序列变化。氨基酸535-549是用于裂解的可溶性人Klotho的 DTTLSQFTDLNVYLW(SEQ ID NO：2)，以及用于剪接的可溶性人Klotho的SQLTKPISSLTKPYH (SEQ ID NO：3)。全长可溶性Klotho包含两个与β糖苷酶蛋白具有同源性的保守结构域(KL1 和KL2)。保守的β-葡糖苷酶/6-磷酸-β-葡糖苷酶/β-半乳糖苷酶基序在人蛋白中跨越62- 497，在小鼠中跨越64-499。保守的KL1序列记述于Chateau等人(2010)Aging 2：567和 Matsumura等人(1998)Biochem Biophys Res Commun中，并且包含人Klotho蛋白的氨基酸 34-549，其中糖苷水解酶共有区跨越人Klotho蛋白的氨基酸57-506(小鼠的59-508)。 Klotho不具有β-糖苷酶活性，但显示一些β-葡糖醛酸糖苷酶活性。 [0068] Klotho抑制胰岛素和wnt信号传导，调节离子通道和它们的运输，并且促进FGF23的功能。参见，例如，Chang等人(2005)Science 310：490；Imura等人(2007)Science 316： 1615；Kurosu(2005)；Liu等人(2007)Science 317：803；和Urakawa等人(2006)Nature 444： 770)。 [0069] 在小鼠中，klotho的转基因过表达延长寿命并且与正常和患病大脑中更好的认知功能相关(Kurosu(2005)；Dubal等人(2014)Cell Reports 7：1065；Dubal等人(2015) J.Neuroscience)。在人类中，KLOTHO基因的KL-VS变体的单一等位基因增加分泌的klotho， 促进长寿(Arking等人，2002；Arking等人，2005；Invidia等人，2010)并且也与衰老人群中 较好的基线认知功能相关。参见，例如，Arking等人(2002)PNAS 99：856；Arking等人(2005) Circ.Res.96：412；Dubal等人(2014)Cell Reports 7：1065；Yokoyama等人(2015) Ann.Clin.Translational Neurology 2：215。 [0070] 可以用于给药的Klotho多肽包括物种同源物(例如，非人灵长类动物，小鼠，大鼠)，等位基因变体，功能片段，以及保留了认知改善活性的野生型序列的功能变体。实例包 括分泌的Klotho，包含KL1结构域的片段，包含KL2结构域的片段，包含KL1和KL2结构域的片 段，包含KL1结构域的变体(其中KL1结构域中的至少一个(例如，1-20个，5-50个，25-100个) 非保守氨基酸被不同的氨基酸置换或缺失)，包含KL2结构域的变体(其中KL2结构域中的至 少一个非保守氨基酸被不同的氨基酸置换)。 [0071] 如本文所述可以使用的Klotho多肽的功能片段包括细胞外结构域(例如，与人Klotho的氨基酸34-979对应或基本上相同或相似)，分泌的Klotho(例如，与549个氨基酸的 形式对应或基本上相同或相似)，KL1结构域(例如，与人Klotho的氨基酸34-549对应或基本 上相同或相似)，糖基水解酶共有序列(例如，与人Klotho的氨基酸57-506对应或基本上相 同或相似)，或β-葡糖苷酶/6-磷酸-β-葡糖苷酶/β-半乳糖苷酶共有序列(例如，与人Klotho 的氨基酸62-497对应或基本上相同或相似)。在一些实施方案中，Klotho多肽包含人Klotho 的氨基酸34-549或与人Klotho的氨基酸34-549基本上相同或相似。在一些实施方案中， Klotho多肽是较大融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含如本文所述 的Klotho多肽并且进一步包含不超过100、75、50或30个额外的氨基酸。在一些实施方案中， Klotho多肽不与成纤维细胞生长因子(FGF)融合。在一些实施方案中，Klotho多肽包含(例 如，融合至)亲和标签(例如，组氨酸标签)或缀合物以增加体内的稳定性或半衰期。 [0072] Klotho的功能变体或片段是保留klotho任意活性的变体或片段，例如，可溶性klotho的任意活性的水平的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或100％。 可溶性klotho活性包括上述的那些，并且包括结合FGF-23，结合至FGFR1c，β-葡糖醛酸糖苷 酶活性，抑制wnt信号传导，抑制胰岛素信号传导，抑制TFG-β1活性，增加GluN2B表达和/或 突触定位，c-fos诱导。其他的Klotho活性包括导致核磁共振成像(MRI)脑扫描的改变，例 如，功能性MRI、脑电图(EEG)、和经颅磁电刺激(TMS和TES)；以及在神经心理测试和认知能 力方面的改善的表现。 [0073] IV.Klotho的给药 [0074] 本文提供了改善个体的认知和/或运动功能的方法，包括向所述个体施用Klotho。在一些实施方案中，治疗方法包括向个体施用有效量的Klotho多肽(或其功能变体或片 段)。在一些实施方案中，所述治疗是预防性的，例如，用于预期应激(例如，飞行时差反应， 军事表演(military performance))的个体或用来预防与衰老相关的认知减退。在一些实 施方案中，所述个体已经被诊断患有认知病症。在一些实施方案中，所述个体正在接受或已 经接受了用于认知病症的疗法或用于与认知功能相关的病况(例如，响应于化疗的认知减 退)的疗法。 [0075] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过分子代用品(例如，改变脑中的NMDA受体或c-fos激活，或GluN2B水平)，MRI脑扫描的变化(例如，功能性MRI)，EEG的改变，TMS和 TES的改变，神经心理测试评分的改变，或认知能力测试(例如，用于学习、短期或长期记忆、 执行功能、语言能力和视空间功能)来监测所述个体的认知能力。在一些实施方案中，使用 上述测试中的一种以上以任意组合监测所述个体。在一些实施方案中，基于所述个体的治 疗进展来确定每次给药Klotho多肽的剂量，例如，如果所述个体对疗法反应不足则施用较 高的剂量。 [0076] 在一些实施方案中，Klotho多肽以含有生理学上(即，药学上)可接受的载体的药学组合物施用。术语“载体”是指用作诊断或治疗药剂的稀释剂或赋形剂的典型惰性物质。 该术语还涵盖对所述组合物施加粘聚性的典型惰性物质。生理学上可接受的载体可以是液 体，例如，生理盐水，磷酸盐缓冲液，生理缓冲盐水(normal buffered saline，135-150mM NaCl)，水，缓冲水，0.4％盐水，0.3％甘氨酸，糖蛋白以提供增强的稳定性(例如，白蛋白，脂 蛋白，球蛋白等)等。由于生理学可接受的载体部分地由被施用的特定组合物以及用来施用 该组合物的特定方法来决定，因此本发明的药物组合物存在大量的合适制剂(参见，例如， Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1989)。 [0077] 本发明所述的组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术来灭菌，或可以在无菌条件下制备。水溶液可以被包装用于使用或在无菌条件下过滤并冻干，在给药前所述冻 干的制剂与无菌水溶液混合。所述组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅料物质以接 近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、润湿剂，等等，例如，乙酸钠、乳酸钠、 氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。也可以包含糖类用于稳 定所述组合物，诸如用于冻干的抗体组合物的稳定剂。 [0078] 剂型可以制备用于粘膜(例如，鼻的、舌下、阴道、含服、或直肠)、胃肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉内或动脉内注射，推注或输注)、口服或透皮给药给患者。剂型的实例包括， 但不限于：分散体；栓剂；油膏；泥敷剂(膏状药)；糊剂；粉针剂；敷料；乳膏剂；贴膏剂；溶液 剂；贴剂；气雾剂(例如，喷鼻剂或吸入剂)；凝胶剂；适合于口服或粘膜施用给患者的液体剂 型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬液、水包油乳液，或油包水液体乳液)、溶液剂 和酏剂；适合于胃肠外施用至患者的液体剂型；和可以被重构以提供适合用于胃肠外施用 至患者的液体剂型的无菌固体(例如，结晶固体或非晶态固体)。 [0079] 可注射组合物可以包括悬浮在可接受的载体诸如水性载体中的Klotho多肽的溶液。可以使用多种水性载体中的任一种，例如，水，缓冲水，0.4％盐水，0.9％等渗盐水， 0.3％甘氨酸，5％葡萄糖等，并且可以包含糖蛋白用于增加稳定性，诸如白蛋白，脂蛋白，球 蛋白等。在一些实施方案中，使用生理缓冲盐水(135-150mM NaCl)。所述组合物可以包含药 学上可接受的辅料物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂，例 如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。 [0080] 适合于胃肠外给药(诸如，例如，通过关节内(在关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径给药)的剂型，包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、 缓冲液、抑菌剂和使得所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌 混悬液，其可以包含混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射液和混悬液也可以由无 菌粉针剂、颗粒剂和片剂制备。在一些实施方案中，所述组合物通过静脉内输注、局部地、腹 膜内、膀胱内或鞘内给药。Klotho多肽制剂可以以单位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和 小瓶来提供。 [0081] Klotho多肽组合物，单独地或与其他合适的组分组合，可以制成为气雾剂制剂(“被雾化”)从而经吸入给药。气雾剂制剂可以被置于可接受的加压推进剂中，诸如二氯二 氟甲烷、丙烷和氮中。 [0082] 药物制剂可以以单位剂型的方式包装或制备。以这种形式，制剂被细分成含有适当量的活性成分(例如，根据Klotho多肽的剂量)的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂， 所述包装含有不同量的制剂。如果需要，所述组合物也可以含有其他配伍的治疗剂。在一些 实施方案中，Klotho多肽组合物可以配制在用于给药的试剂盒中。 [0083] 在一些实施方案中，包含klotho多肽的药物组合物口服给药。在一些实施方案中，包含klotho多肽的药物组合物粘膜给药，例如，经鼻给药。在一些实施方案中，包含klotho 多肽的药物组合物通过注射给药，例如，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射。在一些实施方 案中，包含klotho多肽的药物组合物通过输注给药，例如，使用储蓄库或微型渗透泵进行。 [0084] 药物组合物的给药实例包括将Klotho多肽以10mg/ml在4℃保存在无菌等渗盐水溶液中，并在向患者给药前将其稀释在适宜的注射用溶液中。在一些实施方案中，Klotho多 肽组合物可以通过静脉内输注在0.25-2小时的时程内给药。在一些实施方案中，所述给药 程序经由推注进行。 [0085] 在治疗应用中，Klotho多肽可以以约0.1μg/kg至约1000μg/kg每天一次的初始剂量给药并随时间推移而进行调整。可以使用约1μg/kg至约500μg/kg，或约10μg/kg至约100μ g/kg，或约30μg/kg至约50μg/kg的日剂量范围。剂量根据患者的需求、被治疗的病况的严重 性和给药途径而变化。例如，对于Klotho多肽的注射，有效剂量典型地在10-100μg/kg的范 围内，而对于向中枢神经系统(CNS)的直接递送，有效剂量较低，例如，5-30μg/kg。对于口服 给药，有效剂量较高，例如，在50-10,000μg/kg(例如，100μg/kg-2mg/kg)的范围内。选择剂 量以便为患者提供有效的治疗。剂量可以以适宜的频率重复，所述频率可以在每天一次或 两次，每周一次或两次至每三个月一次的范围内，取决于Klotho多肽组合物的药代动力学 (例如，循环中的半衰期)和药物动力学响应(例如，治疗效应的持续时间)。 [0086] 给药可以是周期性的。取决于给药途径，所述剂量可以例如，每1、3、5、7、10、14、21或28天或更长时间施用一次(例如，每2、3、4或6个月一次)。在一些情况下，给药更为频繁， 例如，每天2或3次。可以监测患者以根据治疗进展和任何不良的副作用调整给药的剂量和 频次，如本领域技术人员所认识的那样。 [0087] 可以考虑特定患者所诊断的认知病况的类型和严重性来经验性地确定剂量。在本公开的背景下，给药至患者的剂量应当足以随时间推移影响患者中的有益治疗反应。剂量 的大小也将通过伴随任何特定组合物在特定患者中的给药的任何不良副作用的存在、性质 和程度来确定，如熟练的执业医生所认识的那样 [0088] 在一些实施方案中，将Klotho多肽组合物给药于至少具有正常认知功能的个体(例如，人)。如本文所述，已经出人意料地发现Klotho不仅可以改善认知受损的个体的认 知，而且Klotho还可以改善至少具有正常认知的个体的认知。因此在一些实施方案中，接受 Klotho多肽组合物的个体初始地以至少具有正常认知开始，并且在施用Klotho多肽组合物 后，与初始认知水平相比获得提高的认知。个体的认知水平可以如本领域中已知的那样确 定。正常认知功能通过来自多组认知测试的评分确定，所述评分被编译成总认知评分，如 Dubal DB等人(2014)Cell Reports 7：1065-1076所述。这样的认知测试包括执行功能和工 作记忆的测试，诸如实验A和实验B(Dubal DB等人(2014)Cell Reports 7：1065-1076)。在 一些实施方案中，Klotho的给药导致认知(无论初始是至少正常的还是受损的)提高至少 5％、10％、20％或更多。 [0089] 在一些实施方案中，给药导致改善的运动功能。在一些实施方案中，Klotho多肽组合物给药于运动功能受损的个体(例如，人)。例如，在一些实施方案中，所述个体具有脑或 脊髓的卒中(缺血性或出血性)、神经变性疾病(帕金森病、雷维小体痴呆、多系统萎缩、肌萎 缩性侧索硬化症、朊病毒病症、亨廷顿舞蹈病、核上性麻痹)、震颤麻痹、创伤性脑损伤、神经 传染性脑损伤、多发性硬化症和相关的自身免疫和脱髓鞘疾病，脊髓病变(压缩性、传染性、 毒性或代谢性、自身免疫、肿瘤性)、脑肿瘤、癫痫、副肿瘤病症、神经发育病症(线粒体、常染 色体遗传)、肌肉疾病(多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、传染性、内分泌、代谢性、毒性、先天性 肌病、先天性肌营养不良、遗传性)、神经病(吉兰-巴雷综合征、轴突和脱髓鞘性、糖尿病性、 毒性、代谢性、传染性、危重病性、卡压性)、蜱性麻痹、重症肌无力和脊髓性肌萎缩症。运动 功能改变可以如本领域中已知的那样评估。示例性的运动功能测定包括但不限于肌电图和 神经传导研究，对强度、张力和肌肉体积的直接或装置辅助的临床测试，反射检查、协调检 查和步态分析。用于测试引起运动功能缺陷的病因学的测定包括但不限于对中枢神经系统 的磁共振成像、肌肉活检、神经活检和实验室研究。 [0090] 因此，在一些实施方案中，额外的给药取决于患者的进展，例如，在给药之间监测患者。例如，在第一次给药或第一轮给药后，监测患者的认知能力或副作用，例如，虚弱、眩 晕、恶心等。 [0091] 在一些实施方案中，所述个体具有慢性病症，使得klotho无限期地给药，例如，持续患者的一生。在这种情况下，给药典型地是周期性的。被认为是长期的或慢性的疾病包 括，但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病，和与高血压和心脏病相关的认知减 退。 [0092] 在一些实施方案中，Klotho多肽与稳定部分相连，所述稳定部分诸如PEG、糖基化，或脂质体或其他纳米载体。美国专利号4,732,863和7892554以及Chattopadhyay等人 (2010)Mol Pharm 7：2194描述了将多肽连接至PEG、PEG衍生物和纳米粒子(例如，脂质体) 的方法。含有磷脂酰-乙醇胺(PE)的脂质体可以通过如本文所述的已建立的程序制备。PE的 纳入在脂质体表面上提供了活性功能位点用于连接。在一些实施方案中，Klotho多肽连接 到亲和标签，例如，组氨酸标签(例如，4-16组氨酸残基)、链霉抗生物素或抗体靶标。 [0093] Klotho多肽也可以被配制成缓释制剂(例如，在固体疏水聚合物(例如，聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)，聚乳酸)的半渗透基质中)。Klotho 多肽可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的纳米粒子中，例如，分别处于胶 体药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或处于粗乳液 中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。 [0094] 在一些实施方案中，Klotho多肽被标记，例如，用于在身体内或离体追踪。Klotho多肽可以用本领域中已知的任何诊断剂标记，如例如下面文献中所提供的：Armstrong等 人，Diagnostic Imaging，第5版，Blackwell Publishing(2004)；Torchilin，V.P.，编， Targeted Delivery of Imaging Agents，CRC Press(1995)；Vallabhajosula，S.， Molecular Imaging：Radiopharmaceuticals for PET and SPECT，Springer(2009)。诊断 剂可以被多种方式检测到，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂。可检测信号包括， 但不限于，γ-发射，放射性，回声的，光学的，荧光的，吸收性的，磁性的，或断层扫描信号。 用于对诊断剂成像的技术可以包括，但不限于，单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，磁 共振成像(MRI)，光学成像，正电子发射计算机断层扫描术(PET)，计算机断层扫描术(CT)， x-线成像，γ射线成像等。术语“可检测试剂”，“可检测部分”，“标记”，“成像剂”等术语在本文中同义地使用。 [0095] 在一些实施方案中，标记可以包括光学试剂诸如荧光剂，磷光剂，化学发光剂等。大量的试剂(例如，染料、探针、标记或指示剂)在本领域中是已知的并且可以用在本发明 中。(参见，例如，Invitrogen，The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies(手册——荧光探针和标记技术指南)，第十版(2005))。荧光剂可 以包括多种多样的有机和/或无机小分子或多种多样的荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂 可以包括但不限于青色素，酞菁，卟啉，靛青(indocyanines)，若丹明，吩噁嗪，苯基呫吨 (phenylxanthenes)，吩噻嗪，吩硒嗪(phenoselenazines)，荧光素，苯并卟啉，方酸 (squaraines)，二吡咯并嘧啶酮，并四苯，喹啉，吡嗪，可啉(corrins)，克酮酸 (croconiums)，吖啶酮，菲啶，若丹明，吖啶类、蒽醌类，chalcogenopyrylium类似物，二氢卟 吩，萘酞菁(naphthalocyanines)，次甲基染料，吲哚啉染料(indolenium dyes)，偶氮化合 物，甘菊蓝，氮杂甘菊蓝(azaazulenes)，三苯甲烷染料，吲哚，苯并吲哚，吲哚羰花青 (indocarbocyanines)，苯并吲哚羰花青，和BODIPYTM衍生物。荧光染料在例如美国专利号4, 452,720、美国专利号5,227,487和美国专利号5,543,295中讨论。 [0096] 所述标记还可以是放射线同位素，例如，释放γ射线、正电子、β和α粒子和X-射线225 72 211 11 128 212 75 77 的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于 Ac，As， At，B， Ba， Bi，Br，Br ，14C，109Cd，62Cu，64Cu，67Cu，18F，67Ga，68Ga，3H，166Ho，123I，124I，125I，130I，131I，111In，177Lu，13N， 15O，32P，33P，212Pb，103Pd，186Re，188Re，47Sc，153Sm，89Sr，99mTc，88Y和90Y。在一些实施方案中，放射性试剂可以包括111In-DTPA，99mTc(CO)3-DTPA，99mTc(CO)3-ENPy2，62/64/67Cu-TETA，99mTc(CO)3- 99m IDA，和 Tc(CO)3三胺(环状的或线性的)。在一些实施方案中，所述试剂可以包括DOTA及其 具有111In，177Lu，153Sm，88/90Y，62/64/67Cu，或67/68Ga的各种类似物。在一些实施方案中，纳米粒子可以通过掺入与螯合物连接的脂质(如DTPA-脂质)来标记，如下面文献中所提供的那样： Phillips等人，Wiley Interdisciplinary Reviews：Nanomedicine and Nanobiotechnology，1(1)：69-83(2008)；Torchilin，V.P.&Weissig，V.，编辑.Liposomes， 第2版：Oxford Univ.Press(2003)；Elbayoumi，T.A.&Torchilin，V.P.， Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging 33：1196-1205(2006)；Mougin-Degraef，M.等人，Int’l J.Pharmaceutics 344：110-117(2007)。 [0097] 在一些实施方案中，诊断剂可以与二级结合配体缔合或与酶(酶标签)缔合，所述第二结合配体或酶在与显色底物接触时生成有色产物。合适的酶的实例包括尿素酶，碱性 磷酸酶，(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。二级结合配体包括，例如，如本领域中已知的 生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素化合物。 [0098] V.认知病况和病症 [0099] Klotho多肽(及其功能变体和片段)可以被施用以提高许多病况和状况的认知。这包括治疗具有低于正常或减退的认知能力的个体，或预防性治疗需要改善或提高的认知能 力的个体。 [0100] Klotho多肽(及其功能变体和片段)可以用来防止或减少与衰老相关的认知减退，例如，在50岁以上的个体中，或在有认知减退的初步征象时。 [0101] Klotho多肽(及其功能变体和片段)还可以用来治疗具有年龄相关的、非年龄相关的或疾病相关的病况的个体，所述病况包括，但不限于： [0102] 神经变性疾病和痴呆：阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈病，额颞叶痴呆，进行性核上性麻痹，皮质基底节变性，轻度认知功能损害，血管性痴呆，雷维小体痴呆，肌萎缩性 侧索硬化症，朊病毒病症，HIV相关痴呆； [0103] 精神或心境障碍：抑郁症，精神分裂症，注意力缺陷/多动症，自闭症谱系障碍，智力障碍，心境障碍和精神病性障碍； [0104] 儿童神经发育性综合征和脑肿瘤：X-连锁的智力障碍或迟钝，星形细胞瘤(astrocytoma)，室管膜瘤(ependymoma)，髓母细胞瘤(medulloblastoma)，少突神经胶质瘤 (oligodendroglioma)； [0105] 影响学习的遗传综合征：唐氏综合征，安吉尔曼综合征，雷特综合征； [0106] 影响认知的代谢紊乱：苯丙酮尿症，莱施-奈恩病，半乳糖血症和肾上腺脑白质营养不良； [0107] 与化疗和/或放疗相关的认知减退；和 [0108] 其他的病况和病症：疼痛相关的认知效应，创伤性脑损伤，卒中，多发性硬化症，神经自身免疫性疾病，癫痫，谵妄，副肿瘤病症，发育迟缓，和脑白质营养不良。 [0109] Klotho多肽(及其功能变体和片段)还可以被施用从而为需要改善认知的个体提供提高的认知，例如，所述需要改善认知的个体为暴露于应激、睡眠剥夺或飞行时差反应的 个体，或对需要较佳认知功能的个体，诸如外科医生、空中交通管制员和军事人员提供提高 的认知。在这样的情况下，klotho多肽组合物可以在所需的效应之前2-24小时施用，所述效 应对于工作记忆可以持续约3-5天，对空间记忆可以持续约2周。 [0110] 可以使用本领域中已知的任何方法测量认知能力，例如，测试记忆，语言能力，执行功能，视觉空间功能，痴呆，或多参数神经心理能力。在一些实施方案中，Klotho施用在标 准认知能力测试(例如，施用后1-3天测量)评分方面导致至少1％，2％，5％，7％，10％， 15％，20％，30％，50％或更高的改善。在一些实施方案中，所述测试对于个体执行多于一 次，例如在用Kloth治疗的过程中执行一次或多次。 [0111] 例如，可以实施用于记忆和学习的标准测试，例如，以确定语义记忆、情节记忆、程序记忆、启动记忆和/或工作(即，短期)记忆。常见的测试包括剑桥前瞻性记忆测试 (Cambridge prospective memory test，CAMPROMPT)，记忆评估量表(memory assessment scales，MAS)，雷氏听觉语言学习测试(Rey auditory verbal learning test)，Rivermead 行为记忆测试，记忆学习测试(Test of memory and learning，TOMAL)，Wechsler记忆量表 (WMS)，和记忆伪装测试(Test of memory malingering，TOMM)。用于语言功能的测试包括， 例如，波士顿诊断性失语症检查(Boston Diagnostic Aphasia Examination，BDAE)，综合 失语症测试(Comprehensive aphasia test，CAT)，和多语种失语症检查(Multilingual aphasia examination，MAE)。 [0112] 执行功能(例如，问题解决、计划、组织、抑制性控制)可以使用执行功能缺陷综合征的行为学评价(Behavioral assessment of dysexecutive syndrome，BADS)，CNS生命体 征(Brief Core Battery)，控制的口语词汇联想测试(Controlled oral word association test，COWAT)，Delis-Kaplan执行功能系统(Delis-Kaplan Executive Function System，D-KEFS)，数字警戒测试，Kaplan Baycrest神经认知评价(Kaplan Baycrest neurocognitive assessment，KBNA)，Hayling和Brixton测试，注意力变量测试 (Tests of variables of attention，TOVA)，威斯康星卡片分类测试(Wisconsin card sorting test，WCST)，或日常注意力测试(Test of everyday attention，TEA)。视觉空间 能力(例如，视觉感知、构造和整合)可以使用时钟测试、Hooper视觉组织任务(VOT)或Rey- Osterrieth复杂图形测试来检测。痴呆可以使用临床痴呆评级或痴呆评级量表来量化。 [0113] 用于神经心理功能(例如，认知功能)的多参数测试包括但不限于巴塞罗那神经心理测试(Barcelona neuropsychological test，BNT)，剑桥自动化成套神经心理测试 (Cambridge neuropsychological test automated battery，CANTAB)、认知量表 (Cognistat)、认知评价筛查测试(Cognitive assessment screening instrument，CASI)、 认知功能扫描仪(Cognitive function scanner，CFS)、Dean-Woodcock神经心理评价系统 (Dean-Woodcock neuropsychology assessment system，DWNAS)、全科医生认知评价 (General practitional assessment of cognition，GPCOG)、简短精神状态检查(Mini mental state examination，MMSE)、NEPSY或CDR计算机化评价系统。 [0114] 备选地，可以使用用于认知活动的结构性或分子代用品测定认知，例如，随时间推移比较来检测变化。认知改变可以例如通过观察脑结构、连通性、激活、抑制或突触可塑性 的变化来检测，例如，通过MRI，fMRI，EEG，TMS和TES，和/或这些的任意组合来检测。在一些 实施方案中，观察脑活动。在一些实施方案中，Klotho给药导致脑活动的1.5-倍、2-倍、5- 倍、7-倍、10-倍、或更大的增加(例如，给药后1-3天测量)。用于认知提高的分子代用品包 括，但不限于：大脑中的GluN2B的水平增加，增加的GluN2B突触定位，增加的NMDA受体激活， 和/或增加的c-fos激活。这些测量与认知特别相关。这样的方法可以包括，例如，从个体获 取神经组织或CSF的样品并且使用标准测定来测定基因表达或激活。 [0115] 类似地，在小鼠和其他非人动物中，认知能力可以利用，例如，执行功能(工作记忆，注意力，处理速率，定势转移)，视觉空间学习和记忆，客体记忆，模式识别，恐惧记忆，被 动回避记忆，习惯化和新物体识别的量度来检测。常见的测试包括但不限于Morris水迷宫， Barnes迷宫，放射状水迷宫，y-迷宫，T-迷宫和旷场习惯化。脑成像技术类似地适用。 VI.实施例 [0116] 实施例1： [0117] A.材料和方法 [0118] 小鼠。所有小鼠均为C57BL/6J背景并且保持于12-小时光/暗周期，随意进食(Picolab Rodent Diet 20，Labdiet)和饮水。除了水迷宫研究期间的单只圈养以外，标准 圈养组为每笼5只小鼠。在光周期期间执行所有认知和行为研究。所有研究均以设盲的方式 进行。 [0119] 治疗。在小鼠的行为测试之前经腹膜(i.p.)注射赋形剂或klotho(重组小鼠klotho，氨基酸35-982，具有C-末端His标签，R&D Systems)。 [0120] Morris水迷宫认知行为测试。如Dubal等人(2014)Cell Reports 7：1065；Dubal等人(2015)Journal of Neuroscience 35：2358所述进行水迷宫研究。小鼠在测试前4小时用 赋形剂或klotho(10μg/kg)腹膜内注射进行治疗，每天一次持续5天。简言之，小鼠在具有白 色不透明水(21°±1℃)的池(直径，122cm)中测试。正方形的14-cm2平台在表面下2cm处。在 隐藏平台训练之前，小鼠通过游动穿过一个通道从而爬上隐藏平台而经历两个训练前实 验。在隐藏平台训练的过程中，平台位置保持恒定，而下降位置在各实验间是变化的。小鼠 经历两个训练期，所述训练期由每个60秒的两个实验组成，每天一次持续4天。对于探索实 验测试，去除平台并且使小鼠游泳60秒。在1小时和24小时探索实验后，测试小鼠在经过两 个训练期发现标记以线索(平台上的15-cm杆)的可见平台的能力。作为研究的一部分，还记 录了游泳速度。 [0121] Y-迷宫认知行为测试。如Dubal等人(2014)Cell Reports 7：1065中所述执行Y-迷宫研究。在测试前18小时对小鼠用赋形剂或klotho(10μg/kg)腹膜内注射进行治疗。简言 之，在测试前30分钟使小鼠适应房间。然后，将小鼠置于Y-迷宫(三个相同的臂，120°分隔) 的一个臂中并探索4分钟。记录进入臂次数，并且在小鼠以连续的臂进入进入三个臂中的每 一个的任何时候记录交替(alternation)；交替机会为22％。在测试期之间，将装置用70％ 酒精清洗。由记录的数据计算交替百分比。 [0122] B.全身klotho递送增强幼鼠中的工作记忆 [0123] 为了调查klotho的治疗递送是否能够增强认知，我们用重组klotho(腹膜内)注射小鼠，并且18小时后，测试在Y-迷宫中的工作记忆。与赋形剂治疗的小鼠相比，klotho治疗 的小鼠显示更多的交替，指示较佳的工作记忆(图1A)。因此，全身klotho递送增强工作记 忆，工作记忆是一个涉及额叶皮质脑区的过程。 [0124] C.全身klotho递送增强幼鼠中的空间学习 [0125] 我们下一步测试了klotho治疗是否增强在Morris水迷宫中的空间学习。我们在一组小鼠(群组1)中在测试前4小时向小鼠注射重组klotho(腹膜内)，每天一次持续5天。与赋 形剂治疗的小鼠相比，klotho治疗的小鼠在隐藏平台位置的空间学习中表现更好(图1B)。 两组以相等的速度游泳(图1C)。在独立的一组小鼠(群组2)中，我们在测试前18小时每天注 射一次重组klotho(腹膜内)。同样，与赋形剂治疗的小鼠相比，klotho-治疗的小鼠在空间 学习方面表现更好(图1D)。因此，全身klotho递送增强空间学习，空间学习是一个涉及额叶 皮质和海马脑区的过程。 [0126] D.全身klotho递送增强幼鼠中的空间记忆 [0127] 为了确定klotho治疗是否可以增强空间记忆，我们去除了平台，并且在Morris水迷宫中的隐藏训练后进行探索测试。在群组1的探索实验中，通过测量小鼠对靶区域的亲近 性(affinity)评估空间记忆保留。在1小时时的探索测试中，klotho-治疗的小鼠在靶标中 心处花费更多的时间(图1E)，与赋形剂治疗的对照相比，显示了穿越靶标的频率增加(图 1F)，在靶标象限中的时间增加(图1G)。在24小时时的探索测试中，与赋形剂治疗的小鼠相 比，klotho-治疗的小鼠继续显示更多的中心逗留时间(图1H)，穿越频率(图1I)，和在靶标 象限中的时间百分比(图1J)。因此，全身klotho递送增强空间记忆，空间记忆是一个与海马 脑区有密切关系的过程。 [0128] 数据显示全身递送klotho增强了小鼠中的正常认知。Klotho治疗在多个测试和测量中改善了学习和记忆，包括工作记忆、空间学习和空间记忆。这些发现提供了用于增强认 知功能的直接治疗应用，相关的但不限于下列的疗法：对正常大脑和由于正常衰老引起的 认知障碍、大量的神经变性疾病、神经疾病和精神疾病、儿童发育综合征、创伤性脑损伤和 应激的认知增强。 [0129] 实施例2 [0130] 方法。 [0131] 小鼠。所有小鼠均为C57BL/6J背景并且保持于12-小时光/暗周期，随意进食(Picolab Rodent Diet 20，Labdiet)和饮水。除了水迷宫研究期间的单只圈养以外，标准 圈养组为每笼5只小鼠。在光周期期间执行所有运动、认知和行为研究。所有研究均以设盲 的方式进行。 [0132] 年老的小鼠(18月龄)获自NIH衰老种群并且在实验中使用。在实验中利用对与α-突触核蛋白毒性相关的人神经变性疾病建模的转基因小鼠；这些小鼠由小鼠Thy-1启动子 表达全长人α-突触核蛋白(Rockenstein E，等人(2002)J Neurosci Res 68：568-578)并且 表现出运动、认知和行为缺陷。在人的病况中，人α-突触核蛋白的表达增加促成几种神经变 性疾病，包括但不限于，帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、雷维小体痴呆(LBD)和多系统萎 缩(MSA)。 [0133] 治疗。如指示的那样，在小鼠的行为测试之前腹膜内(i.p.)注射赋形剂或α-klotho(重组小鼠α-klotho，氨基酸35-982，具有C-末端His标签，R&D Systems)。所有动物 研究得到旧金山加利福尼亚大学的机构动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of California，San Francisco)批准并且 按照NIH指南进行。 [0134] 认知和运动行为 [0135] Morris水迷宫。水迷宫研究如所述的那样进行(Zarei M，等人(2013)J Neurol Neurosurg Psychiatry 84：875-881；Dubal DB等人(2014)Cell Reports 7：1065-1076)。 小鼠在测试前4小时用赋形剂或klotho(10μg/kg)腹膜内注射进行治疗，每天一次持续5天。 简言之，小鼠在具有白色不透明水(21°±1℃)的池(直径，122cm)中测试。正方形的14-cm2 平台在表面下2cm处。在隐藏平台训练之前，小鼠通过游动穿过一个通道从而爬上隐藏平台 而经历两个训练前实验。在隐藏平台训练的过程中，平台位置保持恒定，而下降位置在各实 验间是变化的。小鼠经历两个训练期，所述训练期由每个60秒的两个实验组成，每天一次持 续4天。对于探索实验测试，去除平台并且使小鼠游泳60秒。在1小时和24小时探索实验后， 测试小鼠经过两个训练期发现标记以线索(平台上的15-cm杆)的可见平台的能力。作为研 究的一部分，还记录了游泳速度。 [0136] Y-迷宫。如所述的那样(Dubal DB等人(2014)Cell Reports 7：1065-1076)执行Y-迷宫研究。在测试前18小时对小鼠用赋形剂或klotho(10μg/kg)腹膜内注射进行治疗。简言 之，在测试前30分钟使小鼠适应房间。然后，将小鼠置于Y-迷宫(三个相同的臂，120°分隔) 的一个臂中并探索4分钟。记录进入臂次数，并且在小鼠以连续的臂进入进入三个臂中的每 一个的任何时候记录交替；交替机会为22％。在测试期之间，将装置用70％酒精清洗。由记 录的数据计算交替百分比。 [0137] 大型Y-迷宫。如所述的那样(Dellu F，等人(1992)Brain Res 588：132-139)执行大型Y-迷宫研究(稍加改动)。大型Y-迷宫设备由三个相同的臂组成，分隔120°，在两个臂的 后端具有明显的和不同的视觉线索；第三个没有视觉线索的臂是起始臂。在训练或测试之 前，使小鼠对灯光灰暗的房间适应60分钟。在训练期间，用实心分隔物挡住带有视觉线索的 一个臂，并将小鼠置于起始臂的末端。使小鼠探索开放臂5分钟，然后使其返回到它们的笼 中。在训练中使用的开放臂(熟悉臂)在整个群组测试中是平衡的。训练后16小时，小鼠经历 测试。在测试期间，去除分隔物。将小鼠置于起始臂中并使其探索带有新的和熟悉的视觉线 索的臂(新异臂和熟悉臂)5分钟。记录并测量在新异臂和熟悉臂中进入的次数和经历的逗 留时间。计算新异臂与熟悉臂进入次数或逗留时间的比率以评估空间和工作记忆。在测试 期之间将装置用70％酒精清洗。 [0138] 转棒。在每期之前使小鼠适应房间60分钟。将5只小鼠同时放在以16rpm的恒定速率旋转的旋转棒(转棒(Rota Rod)，Med Associates Inc，VT)上持续最大300秒。在每个实 验中记录到掉落的潜伏期。连续进行三次实验，实验间休息10分钟。在测试期之间将装置用 70％酒精清洗。 [0139] 旷场。如所述(Dubal DB，等人(2015)J Neurosci 35：2358-2371)的那样利用自动Flex-Field/Open Field光子束活动系统(San Diego Instruments，San Diego，CA)测量旷 场中的总活动。使小鼠对测试房间适应30分钟，然后在明亮的塑料室(41x30em)中用两个测 量运动的光子束阵列测试5min。在测试期之间将装置用70％酒精清洗。 [0140] 结果。 [0141] 全身klotho递送增强年老小鼠的认知。为了确定治疗递送klotho是否可以增强年老小鼠的认知，我们用重组klotho(i.p.，10μg/kg)注射小鼠一次，然后训练它们进行任务 从而在24小时后测量在大型Y-迷宫中的工作和空间记忆。然后，训练后18小时(klotho递送 后42小时)，小鼠经历测试。在基线处，并且在不利用klotho治疗的条件下，年老小鼠没有显 示新异臂偏好性，这指示认知缺陷。与赋形剂治疗的小鼠比较，klotho-治疗的小鼠在整个 探索期间显示主要对新异臂的持久偏好性(图2A，B)，这指示更好的认知，这涉及额叶和海 马脑区。这些数据显示klotho增强具有年龄引起的认知缺陷的小鼠的认知。这些数据表明 klotho的治疗递送增强了衰老大脑的认知。 [0142] 全身性klotho递送以持久的方式增强认知。为了确定klotho的治疗递送是否可以以延长超出其7小时的半衰期的方式引起持久的认知增强(Hu MC，等人(2015)J Am Soc Nephrol.)，在5天的每天一次klotho治疗(i.p.，0.5或2.5μg/kg)和认知测试后大约两周， 我们测试了幼鼠。如期望的那样，赋形剂治疗的小鼠没有显示对新异臂的偏好性，这指示在 两周后对视觉线索的记忆丧失。相反，klotho-治疗的小鼠显示对迷宫的新异臂具有明显的 偏好性——甚至在最后一次治疗后两周并且以剂量依赖的方式(图3)。这些数据指示在正 常的幼鼠中的klotho-介导的认知增强是持久的并且在其半衰期以外延长至少两周。这些 数据表明klotho的治疗递送引起大脑中的组织结构变化，这些变化增强了神经功能。 [0143] 全身klotho递送在神经变性疾病的建模小鼠中改善了认知障碍。我们下一步测试klotho的短期治疗递送是否可以在神经变性疾病的小鼠模型中改善现有的认知缺陷。在这 个充分表征的疾病模型中，小鼠表达人α-突触核蛋白(hSYN)，其是一种导致认知和运动缺 陷并且促进帕金森病、阿尔茨海默病、雷维小体痴呆和多系统萎缩的致病蛋白。在这些小鼠 中，在大-Y迷宫中评估认知功能。这个任务是最适的，因为其利用了小鼠探索的天然倾向， 避免了测试诱导的应激源，并且不受限制其他测试的运动困难(诸如不能在水迷宫中适当 地游泳)的影响。与非转基因(NTG)小鼠相比，hSYN小鼠显示对新异臂的偏好性减少，如减少 的逗留时间所示(图4A)。显著地，对hSYN小鼠的klotho治疗(i.p.，2.5μg/kg)增加新异臂偏 好性(图4A，B)，这指示极大的和治疗性的认知改善。klotho治疗的总体效应是增强记忆，如 增加新异臂偏好性所指示(双向ANOVA KL效应p＜0.05)(图4B)。这些数据提示klotho的治 疗递送可以逆转或改善神经变性疾病中由α-突触核蛋白毒性所引起的认知缺陷。要注意的 是，klotho-介导的认知增强可以促进改善的运动学习。 [0144] 全身klotho递送在建模神经变性疾病的小鼠中改善早期运动障碍。由于α-突触核蛋毒性诱导运动功能缺陷(这是神经变性疾病中的主要临床问题)，因此我们测试了klotho 的治疗递送是否可以改善hSYN小鼠中的此关键量度。在旋转棒(即Rota rod)上评估运动功 能。与NTG小鼠相比，hSYN小鼠显示出减少的运动功能(图5)。显著地，对hSYN小鼠的klotho 治疗(i.p.，2.5μg/kg)极大地增加了运动功能，如旋转棒上的较长潜伏期所示(图5)。这些 数据指示klotho治疗极大地改善了hSYN小鼠中的早期运动功能。这些数据提示klotho的治 疗递送可以改善神经变性疾病中由α-突触核蛋白毒性所引起的与运动问题相关的缺陷。 [0145] 全身klotho递送不改变小鼠的总运动或活动。为了检验klotho递送是否改变小鼠的总运动和活动，我们检查了小鼠对旷场的探索。在Veh-或KL-治疗的(i.p.，2.5μg/kg)小 鼠之间总运动没有差异(图6)。这些数据提示klotho的治疗效应特异性针对认知和运动功 能，并且不受非特异的动作诸如多动的影响。 [0146] 讨论 [0147] 我们的数据显示全身递送klotho(其不穿越血脑屏障)以持久的方式增强幼鼠中的正常认知，改善正常幼鼠和年老小鼠中的认知缺陷；其还改善对主要的神经变性疾病建 模的转基因小鼠中的认知和运动缺陷，所述神经变性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病、雷 维小体痴呆和多系统萎缩。 [0148] 这些发现提供了用于增强正常脑的认知功能和改善年老和神经变性疾病中的脑功能的直接治疗应用。此治疗应用还与下列相关但不限于下列：由于大量的神经疾病和精 神疾病、儿童发育综合征、创伤性脑损伤和应激引起的认知障碍。 [0149] 我们的数据显示： [0150] 1.在从幼鼠(2-7月龄)至年老(18月龄)雄性和雌性小鼠一生中，全身施用小鼠重组klotho形式增强正常认知。 [0151] 2.当在测试前4小时至16天给药时，全身klotho治疗有效地增强认知。在大量的认知训练后，所述认知增强效应持续至少两周。 [0152] 3.小鼠klotho的在0.5μg/kg至10μg/kg之间的全身剂量在所测试的条件下增强认知。 [0153] 4.利用重组klotho的全身治疗增强神经变性疾病的小鼠模型中的认知，所述神经变性疾病与阿尔茨海默病、帕金森病、雷维小体痴呆和多系统萎缩相关但不限于这些。 [0154] 5.除了改善神经变性疾病的小鼠模型中的认知缺陷以外，klotho治疗还改善早期运动功能。 [0155] 6.klotho在增强认知方面的治疗效应延长远远超出其大约7小时的半衰期。 [0156] 7.klotho的治疗效应似乎特异性针对认知和运动功能，并且不受非特异性的动作(诸如多动)影响。 [0157] 提供上面的实施例以说明本发明但不限制其范围。本发明的其他变化形式对于本领域普通技术人员是显而易见的，并且由附带的权利要求涵盖。本文所引用的所有出版物、 数据库、互联网资源、专利、专利申请和登录号整体地通过引用并入本文用于所有目的。 [0159] SEQ ID NO：1：人Klotho蛋白 [0160] [0161] |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈