用于检测分析物的核磁共振系统和方法 |
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| 申请号 | CN201180061890.1 | 申请日 | 2011-10-19 | 公开(公告)号 | CN103384724B | 公开(公告)日 | 2017-11-17 |
| 申请人 | T2生物系统公司; | 发明人 | T.J.劳尔里; M.J.奥德; M.布兰科; J.F.谢平; V.德马斯; R.丹达; M.L.弗里策梅尔; I.科; S.库马; L.A.尼利; B.莫泽列斯基; D.L.普劳尔德; C.W.里特肖斯; P.维尔曼; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的特征在于用于检测分析物的系统和方法、以及它们在 疾病 的 治疗 和诊断中的用途。 | ||||||
| 权利要求 | 1.磁性粒子在制备用于检测病原体在全血样品中的存在的方法中的试剂中的用途，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 用于检测分析物的核磁共振系统和方法技术领域背景技术[0002] 磁敏感器已被设计成用于检测多种介质(包括生物流体、食品、土壤样品和其它介质)中的分子相互作用。在靶结合后，这些敏感器导致样品中相邻水分子(或者任何具有游离氢的溶剂分子)的性质发生变化，可以利用磁共振(NMR/MRI)技术来检测该变化。因此，通过在液体样品中使用这些敏感器，有可能在非常低的浓度下使用磁敏感器检测分析物(小分子、DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、生物、代谢产物和病原体(例如，病毒))的存在以及可能确定它们的量。 [0003] 一般来说，磁敏感器是结合或连接到其预定分子靶以形成团簇(聚集体)的磁性粒子。据信当磁性粒子组装进团簇且有效横断面积变得较大(并且团簇的数密度变得较小)*时，与水或其它溶剂分子的相互作用被改变，导致测量的弛豫率(例如，T2、T1、T2)、磁化率（susceptibility）、旋进频率（frequency of precession）的变化以及其它物理变化。此外，团簇形成可被设计成是可逆的(例如，利用温度变化、化学切割、pH变化等)，由此“正向”或“反向”(竞争性和抑制)测定可以被开发用于对特定分析物的检测。正向(集聚)和反向(去集聚)型的测定可以用于检测种类广泛的生物相关材料。以前描述了MRS(磁共振开关（magnetic resonance switch）)现象(见美国专利公开第20090029392号)。 [0004] 许多诊断测定要求具备在皮摩尔或亚皮摩尔范围内的灵敏度。目前的对传染原、核酸、小分子、生物战剂和微生物、以及分子靶(生物标记)或者分子与免疫测定靶的组合的检测通常需要预先制备样品、分析样品的时间、以及对各单独分析物的单一检测。对于适用于具有如下四种独特特征和性质的磁性纳米敏感器的、快速且可商业化的基于NMR的分析物检测装置存在着需求：(1)很少的样品制备甚至无需样品制备、(2)跨越多种分子类型的多重检测、(3)对诊断信息的快速提取和(4)用于即时临床决策的准确信息。 发明内容[0005] 本发明的特征在于用于检测分析物的系统和方法。 [0006] 本发明的特征在于一种用于检测分析物在液体样品中的存在的方法，该方法包括：(a)使溶液与磁性粒子接触以制备包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×7 8 7 9 8 10 9 11 10 13 10至1×10、1×10至1×10、1×10至1×10 、1×10至1×10 、或者1×10 至1×10 个) 磁性粒子/毫升液体样品的液体样品，其中磁性粒子具有150 nm至699 nm(例如，150至250、 200至350、250至450、300至500、450至650、或500至699 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1× 11 10 12 -1 -1 10 、或1×10 至1×10 mM s )的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分；这些结合部分的作用是在分析物或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(b)将液体样品置于装置中，该装置包括限定容纳包含磁性粒子、多价结合剂和分析物的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后测量信号；以及(e)基于步骤(d)的结果来检测分析物。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂（blocking agent）所修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、 0.2%至0.4%、或0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至 100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含多价结合剂，该多价结合剂携带缀合到聚合物支架的多个分析物。例如，分析物可以是肌酸酐，液体样品可以包含携带多个肌酸酐缀合物的多价结合剂，并且磁性粒子可以包括用肌酸酐抗体修饰的表面。在另一个实施方案中，分析物可以是他克莫司，液体样品可以包括携带多个他克莫司缀合物的多价结合剂，并且磁性粒子可以包括用他克莫司抗体修饰的表面。在该方法的具体实施方案中，步骤(d)包括测量液体样品的T2弛豫响应，并且其中增加液体样品中的团聚导致样品的观察的T2弛豫率增加。在某些实施方案中，分析物是靶核酸(例如，从白细胞或病原体中提取的靶核酸)。 [0007] 本发明的特征在于一种用于检测分析物在液体样品中的存在的方法，该方法包括：(a)使溶液与磁性粒子接触以制备包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品的液体样品，其中磁性粒子具有700 nm至1200 nm(例如，700至 850，800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×109至1×1012 mM-1s-1(例如，1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且具有在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在分析物存在下改变磁性粒子的聚集；(b)将液体样品置于装置中，该装置包含限定容纳包含磁性粒子、多价结合剂和分析物的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后测量信号；以及(e)基于步骤(d)的结果来检测分析物的存在或浓度。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、 0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、 0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包含用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、 50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。例如，分析物可以是肌酸酐，液体样品可以包含携带多个肌酸酐缀合物的多价结合剂，并且磁性粒子可以包含用肌酸酐抗体修饰的表面。在另一个实施方案中，分析物可以是他克莫司，液体样品可以包含携带多个他克莫司缀合物的多价结合剂，并且磁性粒子可以包含用他克莫司抗体修饰的表面。在本发明方法的具体实施方案中，步骤(d)包括测量液体样品的T2弛豫响应，并且其中增加液体样品中的团聚导致样品的观察的T2弛豫率的提高。在某些实施方案中，分析物是靶核酸(例如，从白细胞或病原体中提取的靶核酸)。 [0008] 本发明的进一步特征在于一种用于检测病原体在全血样品中的存在的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者的全血样品；(b)将全血样品与红细胞裂解剂溶液混合以制备裂解的红细胞；(c)在步骤(b)之后，对样品进行离心以形成上清液和沉淀物，丢弃部分或全部的上清液，并且使沉淀物再悬浮而形成提取物，任选地在使沉淀物再悬浮之前洗涤沉淀物(例如，用TE缓冲液)并且任选地重复步骤(c)；(d)裂解提取物中的细胞以形成裂解物；(e)将步骤(d)的裂解物置于检测管中并且扩增裂解物中的靶核酸以形成包含靶核酸的扩增的裂解物溶液，其中靶核酸是待检测病原体的特征；(f)在步骤(e)之后，向检测管中添加 6 13 6 8 7 1×10 至1×10 个磁性粒子/毫升扩增的裂解物溶液(例如，1×10至1×10、1×10至1× 108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个磁性粒子/毫升)，其中磁性粒子具有700 nm至1200 nm(例如，700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在靶核酸或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(g)将检测管置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和靶核酸的检测管的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(h)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(i)在步骤(h)之后，测量来自检测管的信号；以及(j)基于步骤(i)的结果来检测病原体。在某些实施方案中，步骤(a)至步骤(i)是在4小时内(例如，在3.5小时、3.0小时、2.5小时、2小时、 1.5小时、或者1小时内)完成。在另一个实施方案中，步骤(i)是在不对扩增的裂解物溶液进行任何预先纯化(即，形成后不对裂解物溶液进行分级)的情况下执行。在具体实施方案中，步骤(c)包括在使沉淀物再悬浮以形成提取物之前洗涤沉淀物。在具体实施方案中，步骤(d)包括将提取物与珠混合以形成混合物并且搅拌该混合物以形成裂解物。磁性粒子可以包含具有缀合到它们表面的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群、以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在靶核酸存在下改变磁性粒子的聚集。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，裂解物还包含：缓冲液、 0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。裂解物可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。 [0009] 本发明的特征在于一种用于检测靶核酸在全血样品中的存在的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者全血样品的一个或多个细胞；(b) 裂解细胞以形成裂解物；(c)扩增裂解物中的靶核酸以形成包含靶核酸的扩增的裂解物溶液；(d)在步骤(c)之后，向检测管中添加扩增的裂解物溶液和1×106至1×1013个磁性粒子/毫升扩增的裂解物溶液，其中磁性粒子具有700 nm至1200 nm的平均直径以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在靶核酸或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(e)将检测管置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和靶核酸的检测管的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(f)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(h)在步骤(f)之后，测量来自检测管的信号；以及(i)基于步骤(h)的结果来检测靶核酸。在具体实施方案中，在步骤(d)之前纯化靶核酸。在具体实施方案中，步骤(b)包括将提取物与珠混合以形成混合物并且搅拌该混合物以形成裂解物。磁性粒子可以包含具有缀合到它们表面上的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群、以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在靶核酸存在下改变磁性粒子的聚集。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包含用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，裂解物还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子任选地包含用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至 100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。裂解物可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。 [0010] 本发明的进一步特征在于一种用于检测靶核酸在全血样品中的存在的方法，该方法包括：(a)提供通过如下方法制备的提取物：裂解来自受试者的全血样品中的红细胞，离心该样品以形成上清液和沉淀物，丢弃部分或全部的上清液，并且使沉淀物再悬浮而形成提取物，任选地在使沉淀物再悬浮之前洗涤沉淀物(例如，用TE缓冲液)并且任选地重复步骤(a)的离心、丢弃和洗涤；(b)裂解提取物中的细胞以形成裂解物；(c)将步骤(b)的裂解物置于检测管中并且扩增在检测管中的核酸以形成包含40%(w/w)至95%(w/w)(例如，40至60%、60至80%、或85至95%(w/w))的靶核酸以及5%(w/w)至60%(w/w)(例如，5至20%、20至40%、或40至60%(w/w))的非靶核酸的扩增的裂解物溶液；(d)在步骤(c)之后，向检测管中添加1×106至1×1013个磁性粒子/毫升扩增的裂解物溶液，其中磁性粒子具有700 nm至1200 nm的平均直径以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在靶核酸或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(e)将检测管置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和靶核酸的检测管的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(f)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(g)在步骤(f)之后，测量来自检测管的信号；以及(h)基于步骤(g)的结果来检测靶核酸，其中步骤(g)是在不对扩增的裂解物溶液进行任何预先纯化的情况下执行。在具体实施方案中，步骤(b)包括将提取物与珠混合以形成混合物并且搅拌该混合物以形成裂解物。磁性粒子可以包含具有缀合到它们表面上的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，该测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群，以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在靶核酸存在下改变磁性粒子的聚集。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，裂解物还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、 0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。裂解物可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。 [0011] 本发明的特征在于一种用于检测念珠菌属物种在液体样品中的存在的方法，该方法包括：(a)裂解液体样品中的念珠菌属细胞；(b)在正向引物和反向引物存在下扩增待检测的核酸以形成包含念珠菌属扩增子的溶液，各引物对于多种念珠菌属物种而言是通用的；(c)使该溶液与磁性粒子接触以制备包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×7 8 7 9 8 10 9 11 10 13 10至1×10、1×10至1×10、1×10至1×10 、1×10至1×10 、或者1×10 至1×10 个) 磁性粒子/毫升液体样品的液体样品，其中磁性粒子具有700 nm至1200 nm(例如，700至 850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×109至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或1× 10 12 -1 -1 10 至1×10 mM s )的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在念珠菌属扩增子或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(d)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和念珠菌属扩增子的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体以及RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(e)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(f)在步骤(e)之后，测量信号；以及(g)基于步骤(f)的结果来确定样品中是否存在念珠菌属物种。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包含用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包含用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。该液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。正向引物可以包含例如：序列5’-GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC-3’(SEQ ID NO.1)。反向引物可以包括例如：序列5’-GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG GT-3’(SEQ ID NO. 2)。在某些实施方案中，(i)念珠菌属物种是白色念珠菌，第一探针包含寡核苷酸序列5’-ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC-3’(SEQ ID NO.3)，并且第二探针包含寡核苷酸序列5’-AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA-3’(SEQ ID NO. 4)；(ii)念珠菌属物种是克柔念珠菌，并且第一探针和第二探针包括选自以下序列的寡核苷酸序列：5’-CGC ACG CGC AAG ATG GAA ACG-3’(SEQ ID NO.5)，5’-AAG TTC AGC GGG TAT TCC TAC CT-3’(SEQ ID NO.6)，和5’-AGC TTT TTG TTG TCT CGC AAC ACT CGC-3’(SEQ ID NO.15)；(iii)念珠菌属物种是光滑念珠菌，第一探针包含寡核苷酸序列：5’-CTA CCA AAC ACA ATG TGT TTG AGA AG-3’(SEQ ID NO.7)，并且第二探针包括寡核苷酸序列：5’-CCT GAT TTG AGG TCA AAC TTA AAG ACG TCT G-3’(SEQ ID NO.8)；以及(iv)念珠菌属物种是近平滑念珠菌或热带念珠菌，并且第一探针和第二探针包括选自以下序列的寡核苷酸序列：5’-AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTCNitIndAA-3’(SEQ ID NO.9)、5’-CCG NitIndGG GTT TGA GGG AGA AAT-3’(SEQ ID NO.10)、AAA GTT ATG AAATAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC(SEQ ID NO.16)、ACC CGG GGGTTT GAG GGA GAA A(SEQ ID NO.17)、AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA(SEQ ID NO.18)和CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT(SEQ ID NO.19)。在某些实施方案中，步骤(a)至(h)是在4小时内(例如，在3.5小时、3.0小时、2.5小时、2小时、1.5小时、或1小时或更短时间内)完成。在具体实施方案中，磁性粒子包含两个群，第一群在其表面上携带第一探针，并且第二群在其表面上携带第二探针。在另一实施方案中，磁性粒子是在磁性粒子表面上同时携带第一探针和第二探针的单一群。磁性粒子可以包含具有缀合到它们表面的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到念珠菌属扩增子的第一区段并且第二探针的作用是结合到念珠菌属扩增子的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群，以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在念珠菌属扩增子存在下改变磁性粒子的聚集。在具体实施方案中，该方法可以产生：(i)在念珠菌属阳性样品中小于20%的T2值的变异系数；(ii)在掺料进50个单独的健康患者血样的样品中在小于或等于5个细胞/mL下至少95%的正确检测；(iii)在掺料进50个单独的不健康患者血样的样品中在小于或等于5细胞/mL下至少95%的正确检测； 和/或(iv)在以2 mL血液为起始的临床阳性患者样品(即，利用其它技术(例如细胞培养)确定念珠菌属阳性)中大于或等于80%的正确检测。 [0012] 本发明的特征在于一种用于检测念珠菌属物种在全血样品中的存在的方法，该方法包括：(a)提供通过裂解来自受试者的全血样品中的红细胞而制备的提取物；(b)对该样品进行离心以形成上清液和沉淀物，丢弃部分或全部的上清液；(c)通过将沉淀物与缓冲液混合而洗涤沉淀物(例如，用TE缓冲液)，搅拌样品(例如，通过涡旋)，对样品进行离心以形成上清液和沉淀物，丢弃部分或全部的上清液；(d)任选地重复步骤(b)和(c)；(e)在缓冲液(例如，TE缓冲液)存在下对沉淀物进行珠击打以形成裂解物；(f)对样品进行离心以形成含有裂解物的上清液；(g)扩增步骤(f)的裂解物中的核酸以形成念珠菌属扩增子；以及(h)检测念珠菌属扩增子的存在，其中该方法可以产生：(i)在掺料进50个单独健康患者血样的样品中在小于或等于5个细胞/mL下至少95%的正确检测；(ii)在掺料进50个单独的不健康患者血样的样品中在小于或等于5个细胞/mL下至少95%的正确检测；和/或(iii)在以2 mL步骤(a)的血液为开始的临床阳性的患者样品(即，通过细胞培养确定念珠菌属阳性)中大于或等于80%的正确检测。 [0013] 本发明的特征在于一种用于检测病原体在全血样品中的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供0.05至4.0 mL的全血样品(例如，0.05至0.25、0.25至0.5、0.25至0.75、0.4至0.8、0.5至0.75、0.6至0.9、0.65至1.25、1.25至2.5、2.5至3.5、或者3.0至 4.0 mL的全血)；(b)将步骤(a)的样品的等分试样置于容器中并且扩增样品中的靶核酸以形成包含靶核酸的扩增的溶液，其中靶核酸是待检测病原体的特征；(c)将扩增的液体样品置于检测装置中；(d)基于步骤(c)的结果来检测病原体，其中病原体选自细菌和真菌，并且其中该方法能够检测全血样品中10个细胞/mL(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、 45或者50个细胞/mL)的病原体浓度。该检测装置可以通过对扩增的液体样品进行光学、荧光、质量、密度、磁、色谱和/或电化学测量来检测病原体。在某些实施方案中，步骤(a)至(d)是在3小时内(例如，在3.2、2.9、2.7、2.5、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6或1.5小时或 1小时内)完成。在其它实施方案中，步骤(c)是在不对扩增的溶液进行任何预先纯化的情况下执行，和/或步骤(c)的液体样品包含全血蛋白和非靶寡核苷酸。在某些实施方案中，病原体选自细菌和真菌。病原体可以是本文所描述的任何细菌或真菌病原体。 [0014] 本发明的进一步特征在于一种用于检测病原体在全血样品中的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供来自受试者的全血样品；(b)将0.05至4.0 mL全血样品(例如，0.05至0.25、0.25至0.5、0.25至0.75、0.4至0.8、0.5至0.75、0.6至0.9、0.65至1.25、1.25至 2.5、2.5至3.5、或者3.0至4.0 mL的全血)与红细胞裂解剂溶液混合以制备裂解的红细胞； (c)在步骤(b)之后，离心该样品以形成上清液和沉淀物，丢弃部分或全部的上清液，并且使沉淀物再悬浮而形成提取物，任选地在使沉淀物再悬浮之前洗涤该沉淀物(例如，用TE缓冲液)并且任选地重复步骤(c)；(d)裂解提取物的细胞以形成裂解物；(e)将步骤(d)的裂解物置于容器中并且扩增裂解物中的靶核酸以形成包含靶核酸的扩增的裂解物溶液，其中靶核酸是待检测病原体的特征；(f)在步骤(e)之后，将扩增的裂解物溶液与1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1× 1011、或者1×1010至1×1013个磁性粒子/毫升)磁性粒子/毫升扩增的裂解物溶液混合以形成液体样品，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至350、250至450、 300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、 1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在靶核酸或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(g)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和靶核酸的检测管的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号； (h)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(i)在步骤(h)之后，测量来自液体样品的信号；以及(j)基于步骤(i)的结果来检测病原体，其中病原体选自细菌和真菌，并且其中该方法能够检测全血样品中10个细胞/mL(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、 45、或者50个细胞/mL)的病原体浓度。在某些实施方案中，步骤(a)至步骤(i)是在3小时内(例如，在3.2、2.9、2.7、2.5、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5或1小时或更短时间内)完成。在其它实施方案中，步骤(i)是在不对扩增的裂解物溶液进行任何预先纯化的情况下执行，和/或步骤(i)的液体样品包含全血蛋白和非靶寡核苷酸。在某些实施方案中，病原体选自细菌和真菌。病原体可以是本文中所描述的任何细菌或真菌病原体。在具体实施方案中，该方法能够以小于15%的变异系数测量全血样品中10个细胞/mL的病原体浓度(例如，小于15%、10%、7.5%、或5%的变异系数的10个细胞/mL；或者小于15%、10%、7.5%、或5%的变异系数的25个细胞/mL；或者小于15%、10%、7.5%、或5%的变异系数的50个细胞/mL；或者小于 15%、10%、7.5%、或5%的变异系数的100个细胞/mL)。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、 0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至 0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包含用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至 70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。用于监测的方法可以包括本文中所描述的任何磁力辅助团聚法。磁性粒子可以包括具有缀合到它们表面的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群，以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在靶核酸存在下改变磁性粒子的聚集。 [0015] 本发明的进一步特征在于一种用于检测病毒在全血样品中的存在的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供来自受试者的血浆样品；(b)将0.05至4.0 mL(例如，0.05至0.25、0.25至0.5、0.25至0.75、0.4至0.8、0.5至0.75、0.6至0.9、0.65至1.25、1.25至2.5、2.5至 3.5、或者3.0至4.0 mL的全血)的血浆样品与裂解剂混合以制备包含裂解的病毒的混合物； (c)将步骤(b)的混合物置于容器中并且扩增在滤液中的靶核酸以形成包含靶核酸的扩增的滤液溶液，其中靶核酸是待检测病毒的特征；(d)在步骤(c)之后，将扩增的滤液溶液与1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1× 10 9 11 10 13 10 、1×10至1×10 、或者1×10 至1×10 个磁性粒子/毫升)磁性粒子/毫升扩增的滤液溶液混合以形成液体样品，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至 350、250至 450、300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者 1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1 8 10 9 10 9 11 10 12 -1 -1 ×10至1×10 、1×10至1×10 、1×10至1×10 、或者1×10 至1×10 mM s )的T2弛 豫率、以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在靶核酸或多价结合剂存在下改变磁性粒子的聚集；(e)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和靶核酸的检测管的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(f)将液体样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(g)在步骤(f)之后，测量来自液体样品的信号；以及(h)基于步骤(g)的结果来检测病毒，其中该方法能够检测全血样品中小于100的病毒拷贝(例如，小于80、70、60、50、40、30、20、或者10的拷贝)。在某些实施方案中，步骤(a)至(g)是在3小时内(例如，在3.2、2.9、2.7、2.5、2.3、2.2、2.1、2.0、 1.9、1.8、1.7、1.6、1.5小时、或1小时或更短时间内)完成。病毒可以是本文中所描述的任何病毒病原体。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至 0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。用于监测的方法可以包括本文中所描述的任何磁力辅助团聚法。磁性粒子可以包含具有缀合到它们表面的第一探针和第二探针的一个或多个群，第一探针的作用是结合到靶核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到靶核酸的第二区段，其中磁性粒子在靶核酸存在下形成聚集体。可替换地，测定可以是解聚测定，其中磁性粒子包含具有在它们表面上的第一结合部分的第一群以及具有在它们表面上的第二结合部分的第二群，以及包含第一探针和第二探针的多价结合部分，第一探针的作用是结合到第一结合部分并且第二探针的作用是结合到第二结合部分，所述结合部分和多价结合部分的作用是在靶核酸存在下改变磁性粒子的聚集。 [0016] 在本发明的任何执行PCR扩增的系统和方法中，PCR法可以是对存在于样品中的靶核酸的量进行定量的实时PCR。 [0017] 本发明的进一步特征在于一种通过扩增在检测管中的扩增反应混合物中的靶核酸分子(例如，利用PCR或者等温扩增)从而导致对应于靶核酸分子的扩增子的形成而对样品中靶核酸分子进行定量的方法。在此方法中，扩增反应混合物包含：(1)靶核酸分子、(2)对靶核酸分子特异性的扩增引物、以及(3)超顺磁性粒子。在此方法中，在装置中执行扩增，该装置包括限定用于容纳包含超顺磁性粒子和靶核酸分子的检测管的孔的支架并且具有设置在该孔周围的射频线圈；该射频线圈被构建成用于检测通过将样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号。此方法的扩增包括以下步骤： [0018] (a)执行一个或多个扩增循环； [0019] (b)将扩增反应混合物或者其等分试样暴露在允许超顺磁性粒子发生聚集或解聚的条件中， [0020] (c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中； [0021] (d)在步骤(c)之后，测量来自检测管的信号； [0022] (e)重复步骤(a)-(d)直到获得期望量的扩增；以及 [0023] (f)基于步骤(d)的结果来对在相应扩增循环中存在的扩增子进行定量。 [0024] 在此方法中，基于在各扩增循环中所确定的扩增子数量来确定样品中靶核酸分子的初始数量。 [0025] 在任何前述对靶核酸分子进行定量的方法中，检测管可以在整个扩增反应期间保持密封。这些方法的超顺磁性粒子的直径可以大于或小于100 nm(例如，直径为30 nm)。 [0026] 另外，在任何前述对靶核酸分子进行定量的方法中，所述方法还可以包括在测量来自检测管的信号之后向检测管施加磁场，从而将超顺磁性粒子吸集到检测管的侧面，并且在完成一个或多个额外扩增循环之后释放磁场。 [0027] 另外，在任何前述对靶核酸分子进行定量的方法中，样品可以例如在步骤(a)之前不包含分离的核酸分子(例如，在步骤(a)之前样品可以是全血或者不包含靶核酸分子)。 [0028] 本发明的特征在于一种监测来源于患者的液体样品中的一种或多种分析物以便对患者的医学状况进行诊断、控制或治疗的方法；该方法包括：(a)将1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品与液体样品混合，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至350、250至450、300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径以及每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且其中磁性粒子在它们表面上具有结合部分，这些结合部分的作用是在一种或多种分析物或多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集；(b)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和一种或多种分析物的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体以及RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后，测量信号；(e)基于步骤(d)的结果来监测一种或多种分析物；以及(f)利用步骤(e)的结果来诊断、控制或治疗该医学状况。在一个实施方案中，一种或多种分析物包括肌酸酐。在另一个实施方案中，患者是免疫妥协的，并且一种或多种分析物包含选自病原体相关分析物、抗生素、抗真菌剂和抗病毒剂的分析物（例如，一种或多种分析物可以包含念珠菌属物种、他克莫司、氟康唑和/或肌酸酐）。在又一实施方案中，患者患有癌症，并且一种或多种分析物选自抗癌剂和存在于癌细胞中的遗传标记。患者可以患有感染或者具有被感染的危险性，并且一种或多种分析物包含选自病原体相关分析物、抗生素、抗真菌剂和抗病毒剂的分析物。患者可以患有免疫炎症，并且一种或多种分析物包含选自抗炎剂和TNF-α的分析物。患者可以患有心脏病，并且一种或多种分析物可以包含心脏标志物。患者可以患有HIV/AIDS，并且一种或多种分析物可以包含CD3、病毒载量和AZT。在某些实施方案中，该方法是用于监测患者的肝功能，并且其中一种或多种分析物选自白蛋白、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、胆红素、甲胎蛋白、乳糖酶脱氢酶、线粒体抗体和细胞色素P450。例如，一种或多种分析物包括细胞色素P450多态性，并且对患者代谢药物的能力进行评价。该方法可以包括将患者鉴别为弱代谢者、正常代谢者、中速代谢者、或者超快速代谢者。该方法可以用于通过以下步骤来确定患者中治疗剂的合适剂量：(i)将治疗剂施用给患者；(ii)在步骤(i)之后从患者中获得包含治疗剂或其代谢产物的样品；(iii)使该样品与磁性粒子接触并且将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中并且检测由该样品所产生的信号；以及(iv)基于步骤(iii)的结果来确定治疗剂或其代谢产物的浓度。治疗剂可以是抗癌剂、抗生素、抗真菌剂、或者本文中所描述的任何治疗剂。在任何上述监测方法中，监测可以是间歇性(例如周期性)监测、或者是连续监测。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、 0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。 液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。用于监测的方法可以包括本文中所描述的任何磁力辅助团聚法。 [0029] 本发明的特征在于一种诊断受试者中的脓毒症的方法，该方法包括(a)获得来源于患者血液的液体样品；(b)通过将1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品与一部分的液体样品混合而制备第一测定样品，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至350、250至450、300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径以及每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且其中磁性粒子在它们表面上具有结合部分，所述结合部分的作用是在一种或多种病原体相关分析物或多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集；(c)通过将1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、 1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品与一部分的液体样品混合而制备第二测定样品，其中磁性粒子具有150 nm至 1200 nm(例如，150至 250、200至350、250至 450、300至500、450至650、500至700 nm、700至 850，800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径以及每个粒子的1×108至1× 1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且其中磁性粒子在它们表面上具有结合部分，所述结合部分的作用是在一种或多种是脓毒症特征的分析物存在下改变磁性粒子的特异性聚集，该分析物选自GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL- 1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、TNF-α、C-反应蛋白(CRP)、CD64、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ABP- 26)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、脂多糖结合蛋白和原降钙素；(d)将各测定样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和一种或多种分析物的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(e)将各测定样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(f)在步骤(e)之后，测量由第一测定样品产生的信号和由第二测定样品产生的信号；(g)基于步骤(f)的结果来监测第一测定样品的一种或多种分析物以及监测第二测定样品的一种或多种分析物；以及(h)利用步骤(g)的结果来诊断受试者。在一个实施方案中，第一测定样品的一种或多种病原体相关分析物是来源于与脓毒症相关的病原体，该病原体选自鲍氏不动杆菌、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatis）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、脆弱拟杆菌（B. fragilis）、blaSHV、洋葱博克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、空肠弯曲杆菌/结肠弯曲杆菌、吉利蒙念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌（C. glabrata）、克柔念珠菌、鲁希特念珠菌（C. Lusitaniae）、近平滑念珠菌、热带念珠菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium pefringens）、凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase negative Staph）、产气肠杆菌（Enterobacter aeraogenes）、阴沟肠杆菌、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金氏金菌（Kingella Kingae）、奥克西托克雷白杆菌、肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）、单核细胞增多性李斯特菌、Mec A基因(MRSA)、Morganella morgana、脑膜炎奈瑟菌、非脑膜炎奈瑟菌的奈瑟菌属物种（Neisseria spp. non-meningitidis）、颊普雷沃菌（Prevotella buccae）、中间普氏菌（P. intermedia）、产黑色素普雷沃菌（P. melaninogenica）、痤疮丙酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌（S. haemolyticus）、嗜麦芽窄食单胞菌（S. maltophilia）、腐生性葡萄球菌（S. saprophyticus）、嗜麦芽窄食单胞菌 （Stenotrophomonas maltophilia）、嗜麦芽窄食单胞菌（S. maltophilia）、无乳链球菌（Streptococcus agalactie）、牛链球菌、停乳链球菌（S. dysgalactie）、缓症链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和血链球菌（S. sanguinis）。一种或多种病原体相关分析物可来源于对治疗耐药的细菌株，例如耐青霉素、耐甲氧西林、耐喹诺酮、耐大环内酯和/或耐万古霉素细菌株(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或者耐万古霉素肠球菌)。在某些实施方案中，第二测定样品的一种或多种分析物选自GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、TNF-α、C-反应蛋白(CRP)、CD64和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。在一个具体实施方案中，该方法还包括制备第三测定样品以监测在受试者血流中循环的抗病毒剂、抗生素或抗真菌剂的浓度。在某些实施方案中，受试者可以是免疫妥协受试者、或者具有变为免疫妥协的危险性的受试者。在任何的上述监测方法中，监测可以是间歇性(例如，周期性)监测或者是连续检测。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺，或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，该液体样品还包括缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至 2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。该液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。该用于监测的方法可以包括本文中所描述的任何磁力辅助团聚法。 [0030] 本发明的进一步特征在于一种监测来源于患者的液体样品中的一种或多种分析物以便对患者中的脓毒症或SIRS进行诊断、控制或治疗的方法，该方法包括：(a)将1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品与液体样品混合，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至 250、200至350、250至450、300至500、450至650、 500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径以及每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、 1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且其中磁性粒子在它们表面上具有结合部分，这些结合部分的作用是在一种或多种分析物或者多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集；(b)将该液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子和一种或多种分析物的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和 RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后，测量信号；(e)基于步骤(d)的结果来监测一种或多种分析物；以及(f)利用步骤(e)的结果来诊断、控制或治疗脓毒症或SIRS。该方法可以包括(i)监测病原体相关分析物，以及(ii)监测是脓毒症特征的第二分析物，该第二分析物选自GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、TNF-α、C-反应蛋白(CRP)、CD64、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ABP-26)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、脂多糖结合蛋白和原降钙素。在某些实施方案中，病原体相关分析物是来源于与脓毒症相关的病原体，该病原体选自鲍氏不动杆菌、烟曲霉菌、脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌、blaSHV、洋葱博克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌/结肠弯曲杆菌、吉利蒙念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、鲁希特念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠杆菌科、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金氏金菌、奥克西托克雷白杆菌、肺炎克雷伯氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、Mec A基因(MRSA)、Morganella morgana、脑膜炎奈瑟菌、非脑膜炎奈瑟菌的奈瑟菌属物种、颊普雷沃菌、中间普氏菌、产黑色素普雷沃菌、痤疮丙酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、腐生性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、无乳链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、缓症链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和血链球菌。病原体相关分析物可来源于对治疗耐药的细菌株，例如耐青霉素、耐甲氧西林、耐喹诺酮、耐大环内酯和/或耐万古霉素的细菌株(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或者耐万古霉素肠球菌)。在具体实施方案中，第二分析物选自GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、TNF-α、C-反应蛋白(CRP)、CD64和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。在一个具体实施方案中，该方法还包括制备第三测定样品以监测在受试者血流中循环的抗病毒剂、抗生素、或抗真菌剂的浓度。在某些实施方案中，受试者可以是免疫妥协受试者、或者具有转变为免疫妥协危险的受试者。在任何上述监测方法中，监测可以是间歇性(例如，周期性)监测、或者连续监测。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至 0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。用于监测的方法可以包括本文中所描述的任何磁力辅助团聚法。 [0031] 本发明的进一步特征在于一种用于检测一种或多种分析物的系统，该系统包括：(a)第一单元，该单元包括(a1)限定磁场的永久磁体；(a2)支架，该支架限定用于容纳包含磁性粒子和一种或多种分析物的液体样品的孔，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用永久磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；以及(a3)与该射频线圈连接的一个或多个电气元件，所述电气元件被构建成用于放大、调整、传输和/或数字化信号；以及(b)第二单元，该第二单元包括尺寸被设计成便于插入系统和从系统中移除的可移除的药筒，其中可移除的药筒是模块化药筒，该药筒包括：(i)试剂模块，该试剂模块用于容纳一种或多种测定试剂；以及(ii)检测模块，该检测模块包括用于容纳包含磁性粒子和一种或多种分析物的液体样品的检测室，其中试剂模块和检测模块可在使用前组装入模块化药筒，并且其中检测室可从模块化药筒中移除。模块化药筒还可以包括入口模块，其中入口模块、试剂模块和检测模块可在使用前组装入模块化药筒，并且其中入口模块是可灭菌的。在某些实施方案中，该系统还包括具有用于执行测定方案和存储测定数据的处理器的系统计算机，并且其中可移除的药筒还包括(i)显示待检测分析物的可读标签、(ii)显示待执行测定方案的可读标签、(iii)显示患者识别号的可读标签、(iv)显示药筒中所含有的测定试剂的位置的可读标签、或者(v)包含可编程处理器的指令的可读标签。该系统可以包括：药筒单元、搅拌单元、离心机、或者本文中所描述的任何其它系统部件。 [0032] 本发明的进一步特征在于一种用于检测一种或多种分析物的系统，该系统包括：(a)一次性试样架，该试样架限定用于容纳液体样品的孔并且具有容纳在一次性试样架内且设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用永久磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号，其中一次性试样架包括一个或多个熔丝连接（fusable links）；以及(b)MR读数器，该读数器包括(b1)限定磁场的永久磁体；(b2)RF脉冲序列和检测线圈；(b3)与射频线圈连接的一个或多个电气元件，所述电气元件被构建成用于放大、调整、传输和/或数字化信号；以及(b4)一个或多个电气元件，所述电气元件与熔丝连接相连接并且被构建成用于向该熔丝连接施加过量电流，从而在预定工作寿命后导致该连接断开并致使线圈不可运行。在某些实施方案中，与射频线圈连接的电气元件感应耦合（inductively coupled）到射频线圈。 [0033] 本发明的特征在于一种用于检测肌酸酐、他克莫司和念珠菌属的系统，该系统包括：(a)第一单元，该第一单元包括(a1)限定磁场的永久磁体；(a2)支架，该支架限定用于容纳包含磁性粒子和肌酸酐、他克莫司和念珠菌属的液体样品的孔，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用永久磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；以及(a3)与射频线圈连接的电气元件，所述电气元件被构建成用于放大、调整、传输和/或数字化信号；以及(b)第二单元，该第二单元包括尺寸被设计成便于插入系统和从系统中移除的可移除的药筒，其中可移除的药筒是模块化药筒，该药筒包括：(i)用于容纳一种或多种测定试剂的多个试剂模块；以及(ii)包括用于容纳包含磁性粒子以及肌酸酐、他克莫司和念珠菌属的液体样品的检测室的多个检测模块，其中多个试剂模块包括(i)第一群的磁性粒子，具有150 nm至699 nm(例如，150至 250、200至350、250至 450、300至500、450至650、或者500至699 nm)的平均直径，每个粒子的1× 108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及缀合到它们表面的肌酸酐抗体； (ii)被设计成在肌酸酐不存在下与第一群的磁性粒子形成聚集体的携带多个肌酸酐缀合物的多价结合剂；(iii)第二群的磁性粒子，具有150 nm 至699 nm(例如，150至250、200至 350、250至450、300至500、450至650、或者500至699 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1 12 -1 -1 8 9 8 10 9 10 9 11 ×10 mM s (例如，1×10至1×10、1×10至1×10 、1×10至1×10 、1×10 至1×10 、 或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及缀合到它们表面的他克莫司抗体；(iv)被设计成在他克莫司不存在下与第二群的磁性粒子形成聚集体的携带多个他克莫司缀合物的多价结合剂；(v)第三群的磁性粒子，具有700 nm至1200 nm(例如，700至850、800至950、 9 12 -1 -1 900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×10至1×10 mM s (例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率，并且具有被选择以在念珠菌属核酸存在下形成聚集体的缀合到它们表面的第一探针和第二探针，第一探针的作用是结合到念珠菌属核酸的第一区段并且第二探针的作用是结合到念珠菌属核酸的第二区段。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、 0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。 该液体样品可以包含 携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。在另一个实施 6 13 6 8 7 8 7 方案中，液体样品包含1×10至1×10 个(例如，1×10至1×10 、1×10至1×10 、1×10至 1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品。 [0034] 本发明的特征在于一种用于测量液体样品中肌酸酐的浓度的方法，该方法包括：(a)将溶液与(i)磁性粒子以及(ii)被设计成在肌酸酐不存在下与磁性粒子形成聚集体的携带多个肌酸酐缀合物的多价结合剂接触以制备包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至 1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品的液体样品，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至350、250至450、300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至 950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及缀合到它们表面的肌酸酐抗体；(b)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子、多价结合剂和肌酸酐的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体和RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后测量信号；以及(e)基于步骤(d)的结果来确定液体样品中肌酸酐的浓度。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包括缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至 3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至 0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。该液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。 [0035] 本发明的特征在于一种多价结合剂，该结合剂包含2个或更多个共价结合到支架的肌酸酐部分。在某些实施方案中，该多价结合剂是式(I)的化合物： [0036] (A)n-(B) (I) [0037] 其中(A)是 [0038] [0039] (B)是共价结合到各个(A)的聚合物支架，m为2至10的整数，并且n为2至50的整数。 [0040] 本发明的特征在于一种包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升溶液的溶液，其中磁性粒子具有150 nm至600 nm(例如，150至250、200至350、2508 12 至 450、300至500、450至650、或者500至600 nm)的平均直径，每个粒子的1×10 至1×10 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及携带肌酸酐缀合物(A)的表面，其中(A)选自： [0041] [0042] 并且m为2至10的整数。 [0043] 本发明还涉及包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、17 9 8 10 9 11 10 13 ×10至1×10、1×10至1×10 、1×10至1×10 、或者1×10 至1×10 个)磁性粒子/毫 升溶液的溶液，其中磁性粒子具有150 nm至600 nm(例如，150至250、200至350、250至450、 300至500、450至650、或者500至600 nm)的平均直径，每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及携带对肌酸酐缀合物(例如，本文中所述的肌酸酐缀合物)具有亲和力的抗体的表面。 [0044] 本发明的进一步特征在于一种用于测量液体样品中他克莫司的浓度的方法，该方法包括：(a)使溶液与(i)磁性粒子以及(ii)被设计成在他克莫司不存在下与磁性粒子形成聚集体的携带多个他克莫司缀合物的多价结合剂接触以制备包含1×106至1×1013 个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升液体样品的液体样品，其中磁性粒子具有150 nm至1200 nm(例如，150至250、200至350、250至 450、300至500、450至650、500至700 nm、700至850、800至950、900至1050、或者1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及缀合到它们表面的他克莫司抗体；(b)将液体样品置于装置中，该装置包括限定用于容纳包含磁性粒子、多价结合剂和他克莫司的液体样品的孔的支架，并且具有设置在该孔周围的射频线圈，该射频线圈被构建成用于检测通过将液体样品暴露在利用一个或多个磁体以及RF脉冲序列所产生的偏置磁场中而产生的信号；(c)将样品暴露在偏置磁场和RF脉冲序列中；(d)在步骤(c)之后测量信号；以及(e)基于步骤(d)的结果来确定液体样品中他克莫司的浓度。在某些实施方案中，磁性粒子是基本上单分散的；在分析物和多价结合剂不存在下显示非特异性的可逆性；和/或磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)。在具体实施方案中，液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、 0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至 0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合。在其它实施方案中，磁性粒子包括用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至 70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子所修饰的表面。液体样品可以包含携带缀合到聚合物支架的多个分析物的多价结合剂。 [0045] 本发明的特征在于一种包含2个或更多个他克莫司部分的多价结合剂，该他克莫司部分包含本文中所描述的他克莫司代谢产物或者抗体对其具有共价结合到支架的亲和力的结构上类似的化合物。在某些实施方案中，多价结合剂是式(II)的化合物： [0046] (A)n-(B) (II) [0047] 其中(A)是 [0048] [0049] (B)是共价结合到各个(A)的聚合物支架，并且n为2至50的整数。 [0050] 本发明的特征在于一种包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子/毫升溶液的溶液，其中磁性粒子具有150 nm至600 nm(例如，150至250、200至350、2508 12 至450、300至500、450至650、或者500至600 nm)的平均直径，每个粒子的1×10 至1×10 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及携带具有对他克莫司缀合物的亲和力的抗体的表面： [0051] [0052] 其中(B)是聚合物支架。 [0053] 在任何上述溶液的一个实施方案中，(i)磁性粒子是基本上单分散的；(ii)磁性粒子在血浆中显示非特异性的可逆性；(iii)磁性粒子还包括用封闭剂修饰的表面，该封闭剂选自白蛋白、鱼皮明胶、丙种球蛋白、溶菌酶、酪蛋白、肽酶和携带胺的部分(例如，氨基聚乙二醇、甘氨酸、乙二胺、或者氨基葡聚糖)；(iv)液体样品还包含：缓冲液、0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂、或者其组合；和/或(iv)磁性粒子包含用40 μg至100 μg(例如，40 μg至60 μg、50 μg至70 μg、60 μg至80 μg、或者80 μg至100 μg)的一种或多种蛋白质/毫克磁性粒子修饰的表面。该溶液可以用于本文中所述的任何系统或方法。 [0054] 本发明的特征在于一种可移除的药筒，该药筒的尺寸被设计成便于插入本发明系统中以及从其中移除，其中可移除的药筒包含用于容纳多个试剂模块的一个或多个室，所述试剂模块用于容纳一种或多种测定试剂，其中试剂模块包括：(i)用于容纳1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至 1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子的室，该磁性粒子具有100 nm至699 nm(例如， 150至250、200至350、250至450、300至500、450至650、或者500至699 nm)的平均直径、每个粒子的1×108至1×1012 mM-1s-1(例如，1×108至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1010、 1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分，这些结合部分的作用是在一种或多种分析物或多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集；以及(ii)用于容纳缓冲液的室。在一个相关方面，本发明的特征在于一种可移除的药筒，该药筒的尺寸被设计成便于插入本发明系统中以及从其中移除，其中可移除的药筒包含用于容纳多个试剂模块的一个或多个室，所述试剂模块用于容纳一种或多种测定试剂，其中试剂模块包括(i)用于容纳1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1× 108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1×1011、或者1×1010至1×1013个)磁性粒子的室，该磁性粒子具有700 nm至1200 nm(例如，700至850、800至950、900至1050、或者 1000至1200 nm)的平均直径、每个粒子的1×109至1×1012 mM-1s-1(例如，1×109至1×1010、 1×109至1×1011、或者1×1010至1×1012 mM-1s-1)的T2弛豫率、以及在它们表面上的寡核苷酸结合部分，该寡核苷酸结合部分的作用是在一种或多种分析物存在下改变磁性粒子的特异性聚集；以及(ii)用于容纳缓冲液的室。磁性粒子可以是本文中所描述的任何磁性粒子，可用本文所描述的任何结合部分来修饰，以便检测本文中所描述的任何分析物。在可移除的药筒的具体实施方案中，磁性粒子和缓冲液共同容纳于药筒内的单个室中。在其它实施方案中，缓冲液包含0.1%至3%(w/w)的白蛋白、0.01%至0.5%的非离子表面活性剂、裂解剂、或者其组合。该可移除的药筒还可以包括包含用于裂解细胞的珠的室；包含聚合酶的室； 和/或包含引物的室。 [0055] 本发明的特征在于一种可移除的药筒，该药筒的尺寸被设计成便于 插入本发明系统中以及从其中移除，其中可移除的药筒包含用于容纳多个试剂模块的一个或多个室，所述试剂模块用于容纳一种或多种测定试剂，其中试剂模块包括(i)用于容纳1×108至1×1010个磁性粒子的室，该磁性粒子具有100 nm至350 nm的平均直径、每个粒子的5×108至1 10 -1 -1 ×10 mM s 的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分(例如，抗体、缀合的分析物)，这些结合部分的作用是在一种或多种分析物或者多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集；以及(ii)用于容纳包含0.1%至3%(w/w)(例如，0.1%至0.5%、0.3%至0.7%、0.5%至1%、 0.8%至2%、或者1.5%至3%(w/w))的白蛋白、0.01%至0.5%(例如，0.01%至0.05%、0.05%至 0.1%、0.05%至0.2%、0.1%至0.3%、0.2%至0.4%、或者0.3%至0.5%)的非离子表面活性剂或者其组合的缓冲液的室。在一个实施方案中，磁性粒子和缓冲液共同容纳于药筒内的单个室中。 [0056] 在任何本发明的系统、试剂盒、药筒和方法中，液体样品可以包含1×108至1×10108 10 个磁性粒子，该磁性粒子具有100 nm至350 nm的平均直径、每个粒子的5×10 至1×10 mM-1s-1的T2弛豫率、以及在它们表面上的结合部分(例如，抗体，缀合的分析物)，这些结合部分的作用是在一种或多种分析物或者多价结合剂存在下改变磁性粒子的特异性聚集。 [0057] 在任何本发明的用于检测全血样品中任何分析物的系统、试剂盒、药筒和方法中，可利用红细胞裂解剂(即，裂解缓冲液、或者非离子型去污剂)执行红细胞的破裂。可以用于本发明方法的红细胞裂解缓冲液包括但不限于：等渗氯化铵溶液(任选地包含碳酸盐缓冲液和/或EDTA)和低渗溶液。可替换地，红细胞裂解剂可以是非离子型去污剂的水溶液(例如，壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚(Triton-X100)、Brij-58、或者相关的非离子表面活性剂、及其混合物)。红细胞裂解剂使至少部分的红细胞破裂，从而能够使全血的某些成分(例如，某些全血蛋白)中的大部分从存在于全血样品中的白细胞、酵母细胞和/或细菌细胞中分离(例如，作为离心后的上清液)。在红细胞裂解和离心后，使所形成的沉淀物重构以形成提取物。 [0058] 本发明的方法、试剂盒、药筒和系统可构建成用于检测病原体相关分析物的预定名单（panel）。例如，该名单可以是念珠菌属真菌名单，其被构建成用于个别地检测吉利蒙念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、鲁希特念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌中的三种或更多种。在另一个实施方案中，该名单可以是细菌名单，其被构建成用于个别地检测凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的三种或更多种。在一具体实施方案中，该名单可以是病毒名单，其被构建成用于个别地检测巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、BK病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒；流感病毒A、流感病毒A亚型H1、流感病毒A 亚型H3、流感病毒B、人疱疹病毒6、人疱疹病毒8、人类偏肺病毒(hMPV)、鼻病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3和腺病毒中的三种或更多种。该名单可以是细菌名单，其被构建成用于个别地检测大肠杆菌、CoNS(凝固酶阴性葡萄球菌)、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯氏菌中的三种或更多种。该名单可以是细菌名单，其被构建成用于个别地检测烟曲霉菌和黄曲霉菌中的三种或更多种。该名单可以是细菌名单，其被构建成用于个别地检测鲍氏不动杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、奥克西托克雷白杆菌、奇异变形杆菌、粘质沙雷氏菌、溶血性葡萄球菌、嗜麦芽黄单胞菌、无乳链球菌、缓症链球菌、肺炎链球菌和化脓性链球菌中的三种或更多种。该名单可以是脑膜炎名单，其被构建成用于个别地检测肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、HSV1、HSV2、肠道病毒、李斯特菌属、大肠杆菌、B组链球菌中的三种或更多种。该名单可以被构建成用于个别地检测淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、CoNS和博氏疏螺旋体中的三种或更多种。该名单可以被构建成用于个别地检测艰难梭状芽胞杆菌、毒素A和毒素B中的三种或更多种。该名单可以是肺炎名单，其被构建成用于个别地检测肺炎链球菌、MRSA、军团杆菌属、肺炎衣原体和肺炎支原体中的三种或更多种。该名单可以被构建成用于个别地检测选自mecA、vanA、vanB、NDM-1、KPC和VIM的对治疗耐药的突变株中的三种或更多种。该名单可以被构建成用于个别地检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、幽门螺旋杆菌、弯曲杆菌属、布氏杆菌属、军团杆菌属和嗜麦芽窄食单胞菌中的三种或更多种。该名单可以被构建成用于检测由CMV、EBV、BK病毒、HIV、HBV和HCV所导致的总病毒载量。该名单可以被构建成用于检测真菌载量和/或细菌载量。可使用标准曲线并且参考该标准曲线来测量样品，或者利用对样品中病原体进行定量的一些其它方法来确定病毒载量。定量测量方法可包括实时PCR、竞争性PCR(两种竞争信号的比率)或者本文所提及的其它方法。该名单可以被构建成用于通过监测PCT、MCP-1、CRP、GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、Th1、Th17和/或TNF-α来检测受试者的免疫反应。该名单可以被构建成用于个别地检测埃里希氏体属（Ehrlichea）、分枝杆菌、梅毒、博氏疏螺旋体、隐球菌属、组织胞浆菌属和芽生菌属中的三种或更多种。该名单可以是流感病毒名单，其被构建成用于个别地检测流感病毒A、流感病毒B、RSV、副流感病毒、偏肺病毒、鼻病毒和腺病毒中的三种或更多种。 [0059] 本发明的方法、试剂盒、药筒和系统可以被构建成用于通过在杂交（hybridization）前后确定磁共振信号而减小样品间的变异性。在执行方法前将衍生化纳米粒子添加入样品中以增强集聚（clustering）可提供基线、内部的T2信号，该信号可以在分析物-衍生化的粒子结合和集聚之后被扣除或者用于调整T2信号。此方法也可用于确定或控制试剂盒间的变异性。 [0060] 术语“聚集”、“团聚”和“集聚”在本文中所述磁性粒子的上下文中可互换地使用，并且表示2种或更多种磁性粒子互相地结合，例如经由多价分析物、分析物的多聚体形式、抗体、核酸分子、或者其它结合分子或实体。在一些情况下，磁性粒子的团聚是可逆的。 [0061] “分析物”表示待分析样品的物质或者成分。示例性的分析物包括下述的一种或多种中的一个或多个种：蛋白质、肽、多肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、RNA、DNA、抗体、碳水化合物、多糖、葡萄糖、脂质、气体(例如，氧气或二氧化碳)、电解质(例如，钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、BUN、镁、磷酸盐、钙、氨、乳酸盐)、脂蛋白、胆固醇、脂肪酸、糖蛋白、蛋白聚糖、脂多糖、细胞表面标志(例如，CD3、CD4、CD8、IL2R、或者CD35)、细胞质标志(例如，CD4/CD8或者CD4/病毒载量)、治疗剂、治疗剂的代谢产物、用于检测武器的标志(例如，化学或生物武器)、生物体、病原体、病原体副产物、寄生虫(例如，原生动物或蠕虫)、原生生物、真菌(例如，酵母菌或霉菌)、细菌、放线菌、细胞(例如，整个细胞、肿瘤细胞、干细胞、白细胞、T细胞(例如，显示CD3、CD4、CD8、IL2R、CD35、或者其它表面标志)、或者用一种或多种特定的标志鉴别的另一种细胞)、病毒、蛋白酶传染性因子、植物成分、植物副产物、藻类、藻类副产物、植物生长激素、杀虫剂、人造毒素、环境毒素、油成分、以及源自上述的成分。本文中使用的术语“小分子”是指药物、医药、药剂、或者预期用于人治疗用途的其它化学合成的化合物。本文中使用的术语“生物的”是指预期用于人治疗用途的从生物源中得到而并非合成的物质。“生物标记”是可以用作特定疾病状态或者生物体的特定生理状态的指示物的生物物质，通常生物标记是蛋白质或者在体液中测量的其它天然化合物，其浓度反映了疾病状态或功能障碍的存在或严重性或者阶段，可用于监测对疾病或病患或功能障碍的治疗的治疗进展、或者可以用作临床结果或发展的替代量度。本文中使用的术语“代谢生物标记”是指用于确定患者或受试者肝或肾功能状态的合成或者通过生物途径获得的物质、分子或者化合物。本文中使用的术语“基因分型”是指确定可能会或者可能不会影响特定基因的表现型的特定基因中的遗传差异的能力。本文中使用的术语“表现型”是指由基因型所确定的蛋白质所形成的生物表达(新陈代谢或者生理学的)。本文中使用的术语“基因表达谱分析（gene expression profiling）”是指以暂时性或空间的方式来确定特定组织中基因产物的生成的速率或量或者基因转录的活性的能力。本文中使用的术语“蛋白质组学分析”是指用于鉴别正常和患病组织中蛋白质或肽的主要差异的蛋白质图谱或蛋白质阵列。本文中描述了其它示例性的分析物。术语“分析物”还包括这样的样品的成分：初始靶分析物的扩增的生物化学方法的直接产物，例如核酸扩增反应的产物。 [0062] “分离的”核酸分子表示从其天然存在的环境中取出的核酸分子。例如，存在于细胞的基因组中或者作为基因库一部分的天然存在的核酸分子是未分离的，但作为例如克隆事件、扩增或者富集的结果的从该基因组剩余部分中分离的相同分子是“分离的”。通常，分离的核酸分子中无该核酸分子所紧邻的、在天然存在的基因组的5'或3'端的核酸区(例如，编码区)。这种分离的核酸分子可以是载体或组合物的一部分并且可以仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其自然环境中的一部分。 [0063] 本文中使用的“连接的”表示通过共价键、非共价键联结或结合，和/或通过范德华力、氢键和/或其它分子间力连接的。 [0065] 本文中使用的“非特异性的可逆性”是指在液体样品中的胶体稳定性以及磁性粒子对抗非特异性聚集的稳健性，并且可通过在特定集聚部分(即，分析物或者团聚剂（agglomerator）)不存在下将粒子置于预定的测定条件中而确定。例如，可以通过在0.45T均匀磁场(定义为<5000 ppm)中37℃温育3分钟前后测量磁性粒子溶液的T2值而确定非特异性的可逆性。如果将磁性粒子置于预定测定条件前后T2值的差异变化小于10%(例如，变化小于9%，8%、6%、4%、3%、2%、或者1%)，则认为磁性粒子具有非特异性的可逆性。如果该差异大于10%，那么粒子在测试的缓冲液、稀释剂和基质中显示不可逆性，并且可能要求处理粒子和基质性质(例如，涂层和缓冲液制剂)以制备其中粒子具有非特异性的可逆性的系统。在另一实施例中，可通过在1高斯/mm-10000高斯/mm的梯度磁场中温育前后测量磁性粒子溶液的T2值来应用测试。 [0066] 本文中使用的术语“NMR弛豫率”是指在样品中测量下述中的任意一种：T1、T2、T1/T2混合、T1rho、T2rho和T2*。本发明的系统和方法被设计成产生表征液体样品中是否存在分析物的NMR弛豫率。在一些情况下，NMR弛豫率表征了分析物在液体样品中存在的量。 [0067] 本文中使用的术语“T1/T2混合”是指将T1与T2测量合并的任何检测方法。例如，T1/T2混合的值可以是通过将两种或更多种不同的T1和T2测量之间的比率或差异进行组合所获得的复合信号。T1/T2 混合可以例如通过使用脉冲序列（其中T1和T2以交错的方式交替地测量或获取）来获得。此外，T1/T2混合信号可利用脉冲序列获得，所述脉冲序列测量由T1和T2弛豫率或机制构成的弛豫率。 [0068] “病原体”表示导致其宿主患上疾病或病患的因子，例如能够在另一种生物体中引起疾病的生物体或传染性粒子，其包括但不限于细菌、病毒、原生动物、蛋白酶传染性因子、酵母菌和真菌或者病原体副产物。“病原体副产物”是由可对宿主有害或者刺激过度宿主免疫反应的病原体所产生的生物物质，例如一种或多种病原体抗原、代谢物、酶、生物物质、或毒素。 [0069] “病原体相关分析物”表示表征了样品中存在病原体(例如，细菌、真菌、或病毒)的分析物。病原体相关分析物可以是来源于病原体的特定物质(例如，蛋白质、核酸、脂质、多糖、或者由病原体产生的任何其它物质)或者来源于病原体的混合物(例如，整个细胞、或者整个病毒)。在某些情况下，选择病原体相关分析物以表征被检测病原体的属、种或者特定株。可替换地，选择病原体相关分析物来确定病原体的特性，例如对特定治疗的抗性。例如，病原体相关分析物可以是表征了在许多不同的细菌物种中的万古霉素耐药的基因，例如Van A基因或Van B基因。 [0070] “脉冲序列”或者“RF脉冲序列”表示待施加给样品的一个或多个射频脉冲，并且被设计成测量例如某些NMR弛豫率，例如自旋回波序列。脉冲序列还可以包括在一个或多个脉冲之后的信号采集，用以使噪声最小化并且提高所生成信号值的准确度。 [0071] 本文中使用的术语“信号”是指NMR弛豫率、频移、敏感性测量、扩散测量、或者相关测量。 [0072] 本文中所使用磁性粒子的“尺寸”是指利用显微镜、光散射或者其它方法测量的磁性粒子混合物的平均直径。 [0073] 本文中使用的术语“基本上单分散的”是指具有粒径分布多分散性(如利用光散射测量中的粒径分布曲线的形状所确定的那样)的磁性粒子的混合物。粒子分布曲线的FWHM(半高全宽)小于峰位置的25%被认为是基本上单分散的。另外，在光散射实验中应仅观察到1个峰并且该峰位置应当在已知单分散粒子的群的1个标准差内。 [0074] “每个粒子的T2弛豫率”表示在磁性粒子群中每个粒子的平均T2弛豫率。 [0075] 本文中使用的“未分级的”是指其中在把磁性粒子添加到样品中之后且在NMR弛豫测量之前不除去被测试样品中的任何成分的测定。 [0076] 可以想到请求保护的本发明的单元、系统、方法和过程包括利用本文中所描述实施方案的信息所作出的变更和调整。在整个说明书的描述中，如果单元和系统被描述成具有、包含、或者包含特定部件（成分），或者如果过程和方法被描述成具有、包含、或者包含特定步骤，那么可以额外地想到存在基本上由或者由所述部件（成分）所构成的本发明的单元和系统，以及存在基本上由或者由所述加工步骤所构成的根据本发明的过程和方法。应当理解的是，除非另有说明，只要本发明仍然是可操作的，则步骤的顺序或进行某些操作的顺序并不是重要的。此外，在许多情况下可以同时执行2个或更多个步骤或操作。 附图说明[0078] 图1A是根据本发明一个说明性实施方案的、用于检测样品对RF脉冲序列的信号响应的NMR单元的示意图。 [0079] 图1B描绘了用于测量20 μL样品中的弛豫信号的、围绕样品管的典型线圈构造。 [0080] 图2A-图2E示出了根据本发明的一个说明性的实施方案的可以用于NMR(用于激发和/或检测)的微线圈的几何形状；设计包括但不限于：非闭合螺线管线圈(图2A)、平面型线圈(图2B)、MEMS螺线管线圈(图2C)、MEMS Helmholz线圈(图2D)和鞍形线圈(图2E)。也建立了用于MR检测的进行了良好地表征的线圈的三维石版线圈制造法(dimensional lithographic coil fabrication)并且其可用于这些用途:Demas等人“Electronic characterization of lithogragphically patterned microcoil for high sensitivity NMR detection” J Magn Reson 200：56(2009)。 [0081] 图3A是描绘本发明的聚集测定的图。磁性粒子(点)用结合剂(即，抗体、寡核苷酸等)包覆，以便在分析物或多价结合剂存在下形成聚集体。虚线的圆圈代表扩散球体或者在T2测量期间溶液分子可经由其扩散而经历(experience)的总流体体积的部分(水分子所行进的具体路径是随机的，并且此图并未以比例尺制图)。聚集(右手侧)减小干扰水T2信号的微观磁非均匀性的样品的部分，从而导致T2弛豫的增加。 [0082] 图3B是描绘多分散模型的图，并且显示当粒子形成特定尺寸的团簇时T2 将该曲线上的两个点之间发生转换(transition)。对于分析物添加而言该响应曲线将是线性的，但是对于团簇的体积分数而言是非线性的，因为粒子在状态1与状态2之间发生转换。该反应曲线的斜率与测定的灵敏度直接成正比。 [0083] 图4A-图4C是描绘本发明测定的不同测定形式的图。图4A描绘了团聚夹心免疫测定，其中两个群的磁性粒子被设计成结合到分析物的2种不同的表位。图4B描绘了竞争性免疫测定，其中液体样品中的分析物结合到多价结合剂(多价抗体)，由此抑制聚集。图4C示出了杂交介导的团聚测定，其中两个群的粒子被设计成分别结合到核酸靶的第一和第二部分。 [0084] 图5示出了在可分别地封装和储存的部分中的模块化药筒构思。设计出这样的构思,例如,使得入口模块(显示为抬高的,贴附有倒立的一次性使用真空采血管)可被灭菌，同时在中间的容纳试剂的模块不被灭菌。这允许含试剂的部件是仅有的被冷冻的部件。 [0085] 图6A-6F描绘了一次性使用真空采血管入口模块。图6A示出了在使用者已从一次性使用真空采血管中移除盖并且将药筒置于其上之后其处在倒立位置。图6B示出了一旦将药筒的右侧转向上血液将流出一次性使用真空采血管并流入样品加载区的成型路径。该箔密封件可以是通道的底侧，从而形成具有密闭通道的低成本的模制部件。图6C是显示当血液离开并填充样品区时允许空气进入小瓶的透风管的剖视图。图6D-图6F示出了用于样品等分地抽样的入口模块，该入口模块被设计成与未加盖一次性使用真空采血管接界,并且设计成等分地抽样可用于执行例如念珠菌属测定的两个样品体积。入口模块具有两个硬塑料部件，这两个塑料部件被超声焊接到一起并且用箔密封，以形成通道的网络,从而允许流道形成在第一孔中,再溢出到第二样品孔。软的一次性使用真空采血管密封部件是用于一次性使用真空采血管的密封。它具有一个用于样品流动的口、以及允许流动发生的透气口。 [0086] 图7A是描绘实施例6的肌酸酐竞争性测定的各成分的图。将用肌酸酐修饰的磁性粒子与肌酸酐抗体组合使用，以形成聚集系统。存在于液体样品中的肌酸酐与磁性粒子竞争抗体，从而当肌酸酐浓度增加时导致聚集的减小。随着液体样品水分子中的氢核的T2弛豫率的变化，观察到聚集的变化。通过将液体样品的观察的T2弛豫率与标准曲线进行比较而确定肌酸酐的浓度。 [0087] 图7B是描绘实施例9的他克莫司竞争性测定体系结构的图。 [0088] 图7C是描绘实施例10的念珠菌属团聚夹心测定体系结构的图。 [0089] 图8A-8C是显示肌酸酐竞争性测定的响应曲线的一系列图。图8A是显示使观察的T2弛豫率与肌酸酐在液体样品中的浓度相互关联的、实施例6的肌酸酐竞争性测定的标准曲线的图。图8B示出了采用2种不同的抗体制剂的肌酸酐修饰的粒子的T2响应。制剂1是预先制备(用聚集的抗体)并且制剂2是纯化制备(不存在聚集的抗体)。图8C示出了采用未聚集的抗体、生物素化抗体和精细多聚化抗体的肌酸酐修饰的粒子的T2响应，并且确认了多价团聚剂的增加的集聚能力。 [0090] 图9是显示使观察的液体样品的T2弛豫率与液体样品中他克莫司浓度相互关联的、实施例9的他克莫司竞争性测定的标准曲线的图。 [0091] 图10是描绘使用抗体包覆的粒子和氨基-葡聚糖-肌酸酐多价结合剂来诱导集聚(通过与存在于样品中的任何靶分析物(肌酸酐)竞争以导致粒子集聚)的肌酸酐抑制曲线(见实施例7)的图。所使用的结合剂是具有大约10个肌酸酐/葡聚糖分子的40kDa葡聚糖。 [0092] 图11是描绘通过执行滴定对Tac-葡聚糖缀合物的集聚能力进行评价(见实施例8)的图。如所观察的那样，Tac-葡聚糖分子量增加导致T2信号得到改进。 [0093] 图12是描绘通过执行滴定对Tac-葡聚糖缀合物的集聚能力进行评价(见实施例8)的图。如所观察的那样，较高的取代改进T2信号。 [0094] 图13是描绘通过执行类似于用于Tac-葡聚糖缀合物的滴定而对Tac-BSA缀合物的集聚能力进行评价(见实施例8)的图。如所观察的那样，集聚性能随他克莫司取代比率变化而变化。 [0095] 图14是描绘用于在血液和PBS基质中使用所制备的磁性粒子来检测抗生物素抗体(如实施例1中所描述)的T2测定的结果的图。 [0096] 图15是描绘用于使用所制备的具有(空心圆)和不具有(实心圆)蛋白质封闭(protein block)的磁性粒子来检测抗生物素抗体(如实施例8和实施例9中所描述)的T2 测定的结果的图。 [0097] 图16是描绘用于使用所制备的具有BSA封闭(黑色填充的菱形、正方形、三角形)或者FSG封闭(浅灰色X和圆圈)的磁性粒子来检测抗生物素抗体(如实施例2中所描述)的T2 测定的结果的图。 [0098] 图17A和17B是所提供的粒子涂层的示意图。 [0099] 图18A-18B描述了用于在实施例4中所描述的竞争性测定形式中检测生物素的T2 测定的结果。图18A描绘了缓冲液中的实验结果，而图18B描绘了在裂解的血液中的实验结果。 [0100] 图19A是表并且19B是图，分别描绘根据本发明方法的在8天期间内念珠菌属测量的可重复性。为了确定对白色念珠菌感染的人全血的T2测量的可重复性，我们进行了8天研究，其中每天将相同的供体掺料的和扩增的样品杂交到超顺磁性粒子(n=3)，并且记录所得的T2值(见实施例13)。批内分析精度示于图19A，并且一般来说是紧密的(tight):所有测量的CV小于12%。在8天期间内观察的可重复性示于图19B(在8天的期间内从相同的供体掺料的和扩增的样品中测量的平均T2值+/-95%置信区间)，并且CV在整个念珠菌属浓度的范围内小于10%,并且阴性对照的CV为小于6%。 [0101] 图20是描述用于检测全血样品中细菌或真菌病原体的工作流的方案(见实施例14和实施例17)。 [0102] 图21A和21B是描绘来自供体样品的结果的图。图21A是描绘从16个被设计用来评价6个掺料了一定范围的白色念珠菌细胞的不同供体血样的测定性能的实验中所获得的结果的图(见实施例13)。各数据点是平均值+/-95%置信区间(n=48)。在最低检测浓度(10个细胞/mL)下，我们在37%的时间内未能检测出白色念珠菌(16个实验中的6个实验)；然而在100个细胞/mL下在100%的时间内检测出白色念珠菌。这表明测定在白色念珠菌浓度大于或等于100个细胞/mL下可以可靠地检测，并且无通过供体血样所引入的主要性能抑制。图21B是描绘从7个被设计用来评价6个掺料了一定范围的克柔念珠菌细胞的不同供体血样的测定性能的实验中所获得的结果的图(见实施例13)。各数据点是平均值+/-95%置信区间(n=21)。在任何实验批次中我们没在10个细胞/mL下检测出,但在所有实验批次中在100个细胞/mL下检测出。这表明LOD是在10和100个细胞/mL之间。 [0103] 图22是显示以0至1E4个细胞/mL浓度掺料进400 μL全血中的5种白色念珠菌临床分离株的T2测量值的点图。对其进行作图的结果是平均值+/-1SD。这些数据表明虽然在不同分离株中所获得的绝对T2值分散开，但在50个细胞/mL下所有值超过无念珠菌属对照的值(来自20个独立测定的3次重复测量，总共60个不同的集聚反应)。 [0104] 图23A和23B是在10个细胞/mL(图23A)和50个细胞/mL(图23B)下所产生的T2结果的ROC图。在10个细胞/mL下曲线下面积为 0.72(95CI=0.56至0.88)而在50个细胞/mL下曲线下面积为0.98(95CI=0.95至1.001)。曲线下面积经常被用于定量诊断准确度；在此情况下我们能够区别具有10个细胞/mL或50个细胞/mL感染的念珠菌血症患者与无念珠菌血症患者。在10个细胞/mL下曲线下面积为0.72，这表示如果在随机选择的具有10个细胞/mL的感染水平的念珠菌血症的人中进行T2测定，那么存在72%的概率:他们的T2值将高于无念珠菌血症的人。在50个细胞/mL下该检测的临床准确度高出许多，曲线下面积为0.98。再次表明，在患有此水平的感染的念珠菌血症的人中，在98%的时间内T2测定将会得出高于来自无念珠菌血症患者的样品的值。参见实施例13。 [0105] 图24是描绘使用标准热循环(大约3小时的出报告时间)以及将退火/延伸步骤(大约2小时、13 分钟的出报告时间)合并的过程的测定的灵敏度的图。在热循环中将退火步骤和延伸步骤合并将总测定TAT减小至2.25小时并且不影响测定灵敏度。 [0106] 图25是描绘PCR循环的T2信号变化的图(见实施例14)。这些结果显示本发明的方法和系统可以用于执行实时PCR并且提供关于存在于样品中的靶核酸的量的定量信息。 [0107] 图26是显示简单的磁分离器/PCR块插入物的一系列照片。 [0108] 图27是显示通过扩增下述各项所产生的DNA的量的图像：(1)在3’和5’白色念珠菌单个探针纳米粒子存在下扩增的白色念珠菌基因组的100个拷贝；在PCR期间利用磁场将这些粒子保持在侧壁上，(2)在无纳米粒子的情况下扩增的白色念珠菌基因组的100个拷贝，以及(3)在3’和5’白色念珠菌单个探针纳米粒子存在下扩增的白色念珠菌基因组的100个拷贝;无磁场。 [0109] 图28A-28E是含有可磁化金属泡沫(阴影)、磁性粒子(圆圈)和分析物(三角形)的固定化部分的样品管的示意图。可磁化金属泡沫(例如由镍制成)可插入导管中并且通过暴露于热而固定化，其围绕金属泡沫收缩导管，从而形成紧密的密封。然后，在导管的一端引入包含磁性粒子和分析物的样品(图28A)。接着，将导管暴露在磁体中(图28B)，并且将磁性粒子吸引到金属泡沫并磁力地将磁性粒子束缚在其孔或裂缝内。金属泡沫中的孔的平均直径为例如在100-1000微米之间。可通过结合到磁性粒子而将分析物分子运送到金属泡沫，或者可驱使流体经过金属泡沫以到达被束缚的磁性粒子。在被束缚在金属泡沫中时，磁性粒子具有增强的相互作用，因为它们现在被限制并且更接近其它磁性粒子，并且团簇形成被增强。然后使金属泡沫去磁(图28C)，即，金属泡沫的磁场变得可以忽略。磁性粒子和分析物团簇复合物的大部分仍然保留在金属泡沫中，因为磁性粒子团簇的扩散相对较低，尽管分析物部分地自然扩散入和扩散出金属泡沫(图28D)。可替换地，可磁化金属泡沫(空心的圆柱体)在具有磁性粒子(圆圈)和分析物(星形)的样品管内自由地漂浮。该自由漂浮的金属泡沫的磁化和去磁用于提高聚集体形成的速率。 [0110] 图29是描绘32个临床样本的T2MR结果的表，该结果显示14个样本为念珠菌属阳性。该检测鉴别了含有克柔念珠菌或光滑念珠菌的4个样本、含有白色念珠菌或热带念珠菌的7个样本和含有近平滑念珠菌的3个样本。黑实线指示决策阈值(T2=128毫秒)(见实施例16)。 具体实施方式[0111] 本发明的特征在于用于快速检测分析物或者确定样品中分析物浓度的系统、装置和方法。本发明的系统和方法使用：磁性粒子、NMR单元、任选地在不同温度下的一个或多个温育站、任选地一个或多个涡旋混合器（vortexer）、任选地一个或多个离心机、任选地流控操作站、任选地机器人系统、以及任选地一个或多个模块化药筒。本发明的系统、装置和方法可以用于测定生物样品(例如，血液、汗液、眼泪、尿液、唾液、精液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、粪便、阴道液体或组织、痰液、鼻咽抽吸物或用拭子取出的鼻咽化验标本、泪液、粘液、或者用拭子取出的上皮化验标本 (用拭子取出的颊部化验标本)、组织、器官、骨、牙齿、或者肿瘤等)。可替换地，本发明的系统、装置和方法是用于监测环境状况(例如，植物生长激素、杀虫剂、人造或环境毒素、对于昆虫抗药性/敏感性重要的核酸序列、藻类和藻类副产物)；作为生物排污程序的一部分、用于养殖植物或动物、或者鉴别环境危害。类似地，本发明的系统、装置和方法是用于检测和监测生物战或生物战剂，例如蓖麻毒蛋白、鼠伤寒沙门氏菌菌、肉毒杆菌毒素、黄曲霉毒素、霉菌毒素、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularesis)、天花、炭疽等。 [0112] 可用结合部分(即，抗体、寡核苷酸、适体等)包覆磁性粒子，以便在分析物或多价结合剂存在下形成聚集体。聚集减小干扰溶剂T2信号的微观磁非均匀性的样品的部分，从而导致T2弛豫的增加(见图3)。 [0113] T2测量是对通常持续1-10秒的全体测量中的全部自旋的单次测量，该持续时间使溶剂能够行进数百微米，这相对于液体样品中的微观非均匀性而言是长距离。各溶剂分子从液体样品中取出一定体积的试样，且T2信号是样品中溶剂分子上的全部(核自旋)的平均值(净总信号)；换句话说，T2测量是溶剂分子所处整个环境的净测量，并且是样品中所有微观非均匀性的平均测量。 [0114] 液体样品中溶剂分子的所观察到的T2弛豫率由磁性粒子决定，这些磁性粒子在磁场存在下形成高磁偶极矩。在磁性粒子不存在下，液体样品的所观察到的T2弛豫率通常较长(即，T2(水)=大约2000 ms，T2(血液)=大约1500 ms)。随着粒子浓度增加，样品中的微观非均匀性增加，并且溶剂扩散（通过这些微观非均匀性）导致自旋去相干（spin decoherence）的增加和T2 值的下降。所观察到的T2值以非线性方式取决于粒子浓度，并且取决于每个粒子的弛豫率参数。 [0115] 在本发明的聚集测定中，磁性粒子的数量和聚集的粒子(如果存在)的数量在测定期间保持恒定。当这些粒子聚集时，粒子的空间分布发生变化。聚集改变溶剂分子的平均“经历(experience)”，因为聚集促进粒子定位入团簇而不是获得更均匀的粒子分布。在高度的聚集下，许多溶剂分子不经历由磁性粒子所造成的微观非均匀性并且T2值接近溶剂的T2值。随着液体样品中聚集的磁性粒子的分数增加，所观察的T2值是聚集的和单个(未聚集)磁性粒子的非均匀悬浮液的平均值。本发明的测定被设计成用聚集使T2值的变化最大化，以提高对分析物存在和分析物浓度差异的测定灵敏度。 [0116] 存在两种粒子集聚的方式(regimes)且T2基于粒径而影响(见图3B，边界通常为约100 nm粒径)。对于任何给定的液体样品测定，粒径为250 nm的磁性粒子的粒子计数可为大约1×107个粒子，而粒径为30 nm的磁性粒子的粒子计数可为大约1×1013。这是因为较小粒子具有较低的每个粒子的弛豫率(对于相同类型的材料)，从而导致固有的灵敏度方面的缺点。在本发明的一个典型测定中，对磁性粒子加以选择使得T2值随着聚集粒子的分数增加而增加。 [0117] 本发明的测定可以被设计成在分析物存在下改变T2的方向(见图4A-4C)。例如，测定可以是团聚夹心免疫测定其中两个群的磁性粒子结合到分析物的不同表位(见图4A)；竞争性测定，其中分析物与多价结合剂竞争从而抑制磁性粒子的聚集(见图4B)；或者杂交介导的团聚，其中两个群的磁性粒子结合到寡核苷酸的第一和第二部分(见图4C)。其它竞争形式可以包括当两个粒子结合部分在无团聚剂（agglomerator）情况下的结合(例如，DNA寡核苷酸被设计成使得两种纳米粒子具有两种不同的寡核苷酸并且它们可以退火（anneal）到一起，并且当加热时分析物或扩增子或靶DNA竞争或干扰np对合)。 [0118] 可以使用用于执行本发明测定的其它形式，例如：(i)可以在已用对靶分析物和多价结合剂特异性的结合部分修饰的磁性粒子存在下对靶样品进行温育，在抑制测定中分析物与磁性粒子的结合阻碍磁性粒子与多价结合剂的团聚；(ii)可以在已用对靶分析物和多价结合剂特异性的结合部分所修饰的磁性粒子存在下对靶样品进行温育，在解聚测定中将分析物暴露于预先形成的多价结合剂与磁性粒子的聚集体，并且分析物置换多价结合剂以降低液体样品中的聚集；或者(iii)可以在已用对靶分析物特异性的结合部分所修饰的磁性粒子存在下对靶样品进行温育，并且靶分析物自身形成自组装的单个群的磁性粒子，在抑制测定或者解聚测定中分析物与磁性粒子的结合的存在阻碍了磁性粒子的自我团聚；或者(iv)可以在可溶性团聚剂以及用分析物或分析物类似物所修饰的磁性粒子存在下对靶样品进行温育，在抑制测定中分析物与可溶性团聚剂的结合的存在阻碍了粒子的团聚。 [0119] 在使用多价结合剂(团聚剂)的情况下，将诸分析物连接到载体上(例如，简单的合成支架、或者较大的载体蛋白或多糖，例如BSA(牛血清白蛋白)、运铁蛋白、或葡聚糖)。 [0120] 磁性粒子 [0121] 本文中所述磁性粒子包括例如美国专利第7,564,245和美国专利申请公开第2003-0092029号中所描述的那些磁性粒子，其内容以参考的方式并入本文中。这些磁性粒子通常为缀合物的形式，亦即具有连接于其上的一个或多个结合部分(例如，寡核苷酸、核酸、多肽、或者多糖)的磁性粒子。结合部分导致与靶分析物的特定相互作用。结合部分特异性地结合到经选择的靶分析物，例如核酸、多肽、或者多糖。在一些情况下，结合导致缀合物的聚集，从而导致水溶液中相邻的水质子(或者非水溶剂中的质子)的自旋-自旋弛豫时间(T2)发生变化，例如减小(例如，在较小磁性粒子的情况下)或增加(例如，在较大磁性粒子的情况下)。可替换地，在竞争性解聚测定中分析物结合到预先形成的聚集体(例如，由多价结合剂和磁性粒子形成的聚集体)，或者在抑制测定中与多价结合剂竞争磁性粒子上的结合部分(即，在分析物存在下抑制聚集体的形成)。 [0122] 缀合物具有高弛豫率，这是因为这些缀合物的铁、金属氧化物或者其它亚铁化合物(ferro)或亚铁磁性纳米材料具有超顺磁性。铁、钴和镍化合物及它们的合金、稀土元素(例如钆)、以及某些金属间化合物(例如金和钒)是铁磁物质，因此可以用于制造超顺磁性粒子。磁性粒子可以是单分散的(磁性材料如金属氧化物(如超顺磁性氧化铁)的单晶/每个磁性粒子)，或者是多分散的(例如，诸晶体/每个磁性粒子)。磁性金属氧化物也可以包含钴、镁、锌、或者这些金属与铁的混合物。可用于制造缀合物的磁性粒子的重要特征和因素包括：(i)高弛豫率，即对水(或其它溶剂)弛豫的强影响、(ii)结合部分可以共价结合的官能团、(iii)相互作用部分对磁性粒子的低非特异性结合和/或(iv)在溶液中的稳定性，即磁性粒子仍然悬浮于溶液中而不沉淀和/或诸np保持它们应用于所描述方法的能力(即诸np具有保存期)。 [0123] 磁性粒子可经由官能团连接到结合部分。在一些实施方案中，磁性粒子可以与包含所选择官能团的聚合物部分地结合，以增加磁性粒子的非特异性的可逆性。该聚合物可以是合成聚合物，例如但不限于聚乙二醇或硅烷、天然聚合物、或者合成或天然聚合物的衍生物、或者它们的组合。该聚合物可以是亲水性的。在一些实施方案中，聚合物“涂层”不是在磁性金属氧化物周围的连续膜，而是连接到且包围金属氧化物的延伸的聚合物链的“网孔”或“云状物”。该聚合物可以包含多糖及其衍生物，包括葡聚糖、普鲁兰多糖、羧基葡聚糖、羧甲基葡聚糖和/或还原羧甲基葡聚糖。金属氧化物可以是一组相互接触或者单独地被聚合物束缚或包围的一个或多个晶体。 [0124] 可替换地，磁性粒子可以与非聚合物官能团组合物结合。合成无结合的聚合物的稳定、官能化磁性粒子的方法描述于例如Halbreich等人，Biochimie,80:379(1998)。 [0125] 磁性粒子通常包含每晶体直径为大约1-25 nm，例如大约3-10 nm或者大约5 nm的金属氧化物单晶和多晶。磁性粒子也可以包含芯和/或涂层(例如大约5至20 nm厚或更厚)形式的聚合物成分。磁性粒子的总尺寸可以是例如20至50 nm、50至 200 nm、100至300 nm、250至500 nm、400至600 nm、500至750 nm、700至1,200 nm、1,000至1,500 nm、或者1,500至 2,000 nm。 [0126] 可通过多种方式制备磁性粒子。优选的是，磁性粒子具有将磁性粒子连接到结合部分的官能团。例如，可以根据Gorman的方法来制备羧基官能化磁性粒子(见PCT公开WO00/61191)。在此方法中，由市售的葡聚糖合成还原羧甲基(CM)葡聚糖。将羧甲基葡聚糖与铁盐混合到一起，然后用氢氧化铵中和。所形成的羧基官能化磁性粒子可用于缀合氨基官能化寡核苷酸。羧基官能化磁性粒子也可通过在强碱中与溴乙酸或氯乙酸反应以连接羧基而由多糖包覆的磁性粒子制成。另外，羧基官能化粒子可以通过使用试剂(例如丁二酸酐或顺丁烯二酸酐)将氨基转换成羧基而由氨基官能化磁性粒子制成。 [0127] 可以通过调整反应条件来控制磁性粒子的尺寸，例如在用碱中和铁盐期间采用低温，如美国专利第5,262,176号中所描述。也可以通过利用离心、超滤或凝胶过滤对粒子进行分级而制造均匀粒径材料，例如美国专利第5,492,814号中所描述。 [0128] 也可根据Molday的方法来合成磁性粒子(Molday,R.S.和D.MacKenzie,“Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells”,J.Immunol. Methods,52:353(1982))，并且用高碘酸盐处理形成醛基。然后，含醛的磁性粒子可与二胺(例如，乙二胺或己二胺)反应，从而形成席夫碱，接着用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原。 [0129] 可以制造葡聚糖包覆的磁性粒子并且用环氧氯丙烷交联。添加的氨与环氧基反应而产生胺基，见Hogemann,D.等人的“Improvement of MRI probes to allow efficient detection of gene expression” Bioconjug.Chem.,11:941(2000)，和Josephson等人的“High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-Tat peptide conjugates”，Bioconjug. Chem.,10:186(1999)。此材料被称为交联氧化铁或者“CLIO”并且当用胺官能化被称为胺-CLIO或者NH2-CLIO。可以通过使用水溶性碳二亚胺和二胺类(例如乙二胺或已二胺)将羧基官能化磁性粒子转化成氨基官能化磁性粒子。 [0130] 可以由铁磁液体(即，磁性粒子的稳定胶体悬浮液)形成磁性粒子。例如，磁性粒子可以是包含尺寸为数十纳米且分散于含有表面活性剂的液体中的多个金属氧化物晶体的复合物，表面活性剂吸附到这些粒子上并使它们稳定，或者通过在金属离子溶液的碱性介质中沉淀。合适的铁磁液体是由Liquids Research有限公司基于以下索引销售的:WHKS1S9(A、B或C),其为包含直径为10 nm的磁石(Fe3O4)的基于水的铁磁液体；WHJS1(A、B或C)，其为包含直径为10 nm的磁石(Fe3O4)颗粒的基于异链烷烃的铁磁液体；以及BKS25葡聚糖，其为包含直径为9 nm的磁石(Fe3O4)颗粒的用葡聚糖稳定的基于水的铁磁液体。用于本发明系统和方法的其它合适的铁磁液体是可从Ademtech获得的油酸稳定铁磁液体，该液体包括大约70重量%的α-Fe2O3颗粒(直径为大约10 nm)、15重量%的辛烷和15重量%的油酸。 [0131] 这些磁性粒子通常是包含多个金属氧化物晶体和有机基质的复合物，并且具有用将结合部分连接到磁性粒子表面的官能团(即，胺基或羧基)所修饰的表面。例如，可用于本发明方法的磁性粒子包括由Dynal、Seradyn、Kisker、Miltenyi Biotec、Chemicell、Anvil、Biopal、Estapor、Genovis、Thermo Fisher Scientific、JSR micro、Invitrogen和Ademtech销售的磁性粒子，以及美国专利第4,101,435、4,452,773、5,204,457、5,262,176、5,424,419、6,165,378、6,866,838、7,001,589和7,217,457号中所描述的磁性粒子，其各自以参考的方式并入本文中。 [0132] 亲合素或链霉亲和素可以连接到用于使用生物素化的结合部分(例如寡核苷酸或多肽)的磁性粒子(参见，例如Shen等人的“Magnetically labeled secretin retains receptor affinity to pancreas acinar cells”Bioconjug. Chem.,7:311(1996))。类似地，生物素可连接到用于使用亲合素标记的结合部分的磁性粒子。可替换地，结合部分共价连接到磁性粒子表面；可用IgG分子修饰这些粒子；可用抗His抗体修饰这些粒子；或者可用His-标记的FAb修饰这些粒子。 [0133] 在使用前可以利用超滤、透析、磁力分离或者其它手段从磁性粒子中分离出低分子量材料。例如，可以通过磁性分离或尺寸排阻色谱法从磁性粒子缀合物中分离出未反应的结合部分和连接剂。在某些情况下，可以根据尺寸对磁性粒子进行分级以制备具有特定的尺寸范围和平均直径的粒子的混合物。 [0134] 对于要求高灵敏度的某些测定而言，使用T2弛豫测定的分析物检测可能要求选择合适的粒子以实现足够敏感的分析物引起的团聚。可以使用在单个较大聚合物基质或铁磁液体组合体(assembly)内(100 nm-1200 nm 总直径，例如具有100 nm、200 nm、250 nm、300 nm、500 nm、800 nm或者1000 nm平均直径的粒子)含有多个超顺磁性氧化铁芯(直径为5-15 nm)的粒子，或者通过使用较高磁矩材料或者具有较高密度的粒子和/或具有较高铁含量的粒子，来实现较高的灵敏度。不受理论的限制，假定大得多的每个粒子的铁原子数量导致这些类型的粒子提供大于100×的灵敏度增益，其被认为是导致了灵敏度的提高(由于存在于测定溶液中的粒子数减小以及较高数量的超顺磁性铁有可能受各集聚事件的影响)。 [0135] 每个粒子的弛豫率和粒径是用于选择高灵敏度测定的最佳粒子的一个有用术语。理想地，此术语将尽可能地大。每个粒子的弛豫率是各粒子对测量的T2值的影响的量度。此数字越大，引起给定的T2响应所需的粒子数量就越少。此外，降低反应溶液中的粒子浓度可以提高测定的分析灵敏度。每个粒子的弛豫率可以是更加有用的参数，因为铁密度和弛豫率可以根据用于制造这些粒子的成分的不同而在不同磁性粒子之间变化(参见表1)。每个粒子的弛豫率与超顺磁性材料的饱和磁化成正比。 [0136] 表1 铃动力直径(Hydroynamic Diameter)(nm) 每个粒子的金属原子数 每个粒子的弛豫率(mM-1s-1) 10-30 1.0E+03至1.0E+06 1.0E+6至1.0E+11 10-50 8.0E+02至4.0E+04 1.0E+04至4.0E+06 10-50 1.0E+04至5.0E+05 1.0E+06至1.0E+08 50-100 1.0E+04至1.0E+07 1.0E+06 至1.0E+09 100-200 5.0E+06至5.0E+07 5.0E+08至8.0E+09 200-300 1.0E+07至1.0E+08 3.0E+09至1.0E+10 300-500 5.0E+07至1.0E+09 7.0E+09至5.0E+10 500-800 1.0E+08至4.1E+09 1.0E+10至5.0E+11 800-1000 5.0E+08至5.0E+09 5.0E+10至5.0E+11 1000-1200 1.0E+09至7.0E+09 1.0E+11至1.0E+12 [0137] 用于本发明系统和方法的基础粒子可以是表2中所示的任何市售粒子。 [0138] 表2 目录号 来源/描述 直径(μm) Kisker MAv-1 聚苯乙烯，亲合素包覆的磁体粒子 1.0-1.9 PMSt-0.6 聚苯乙烯，链霉亲和素包覆的磁体粒子 0.5-0.69 PMSt-0.7 聚苯乙烯，链霉亲和素包覆的磁体粒子 0.7-0.9 PMSt-1.0 聚苯乙烯，链霉亲和素包覆的磁体粒子 1.0-1.4 PMB-1 聚苯乙烯，生物素共价结合到BSA涂层的磁体粒子 1.0-1.9 PMP-200 基于葡聚糖，无涂层，纯的(plain) 0.2 PMP-1000 基于葡聚糖，无涂层，纯的 0.10 PMP-1300 基于葡聚糖，无涂层，纯的 0.13 PMP-2500 基于葡聚糖，无涂层，纯的 0.25 PMN-1300 基于葡聚糖，NH2-包覆的 0.13 PMN-2500 基于葡聚糖，NH2-包覆的 0.25 PMC-1000 基于葡聚糖，COOH-包覆的 0.10 PMC-1300 基于葡聚糖，COOH-包覆的 0.13 PMC-2500 基于葡聚糖，COOH-包覆的 0.25 PMAV-1300 基于葡聚糖，亲合素包覆的 0.13 PMAV-2500 基于葡聚糖，亲合素包覆的 0.25 PMSA-1000 基于葡聚糖，链霉亲和素包覆的 0.1 PMSA-1300 基于葡聚糖，链霉亲和素包覆的 0.13 PMSA-2500 基于葡聚糖，链霉亲和素包覆的 0.25 PMB-1000 基于葡聚糖，生物素包覆的 0.1 PMB-1300 基于葡聚糖，生物素包覆的 0.13 PMB-2500 基于葡聚糖，生物素包覆的 0.25 PMPA-1000 基于葡聚糖，蛋白质A包覆的 0.1 PMPA-1300 基于葡聚糖，蛋白质A包覆的 0.13 PMPA-2500 基于葡聚糖，蛋白质A包覆的 0.25 PMC-0.1 基于葡聚糖，COOH官能化的 0.1-0.4 PMC-0.4 基于葡聚糖，COOH官能化的 0.4-0.7 PMC-0.7 基于葡聚糖，COOH官能化的 0.7-0.9 PMC-1.0 基于葡聚糖，COOH官能化的 1.0-1.4 PMN-1.0 基于葡聚糖，NH2官能化的 1.0-1.4 PMC-0.1 基于葡聚糖，COOH官能化的 0.1-0.4 Accurate Chemical ADM01020 羧基官能化 0.2 ADM01030 羧基官能化 0.3 ADM02020 羧基官能化 0.2 ADM02133 高羧基官能化 0.3 ADM02150 羧基官能化 0.5 ADM02220 非常高的氨基官能化 0.2 ADM02230 非常高的氨基官能化 0.3 ADM02250 羧基官能化 0.5 ADM02030 高羧基官能化 0.3 ADM02110 高羧基官能化 0.1 ADM02120 非常高的羧基官能化 0.2 ADM02130 非常高的羧基官能化 0.3 ADM02252 羧基官能化 0.5 ADM03120 链霉亲和素官能化 0.2 ADM03121 链霉亲和素官能化 0.2 Chemicell 1201-5 1 Si-(CH2)3-COOH 0.5 1201-5 1 Si-(CH2)3-COOH 0.75 1201-5 1 Si-(CH2)3-COOH 1.0 1202-5 1 Si-(CH2)3-SO3H 0.5 1202-5 1 Si-(CH2)3-SO3H 0.75 1202-5 1 Si-(CH2)3-SO3H 1.0 1205-1 Si-(CH2)3-PO3H2 0.5 1205-1 Si-(CH2)3-PO3H2 0.75 1205-1 Si-(CH2)3-PO3H2 1.0 Estapor M1-130/12 羧基化的聚苯乙烯 0.7-1.3 M1-180/12 羧基化的聚苯乙烯 0.9-1.3 M1-180/20 羧基化的二乙烯基苯 0.8-1.2 M1-050/20 羧基化的聚苯乙烯 0.5-0.7 M1-070/40 羧基化的聚苯乙烯 0.7-1.3 M1-070/60 羧基化的聚苯乙烯 0.7-1.3 M1-020/50 羧基化的聚苯乙烯 0.16-0.24 M1-030/40 羧基化的聚苯乙烯 0.3-0.5 Genovis AMI-25 葡聚糖 80-150 Thermo Fisher 4515-2105 羧基化改性的(MG-CM) 1.0 7815-2104 中性抗生物素蛋白(MG-NA) 1.0 5915-2104 链霉亲和素(MG-SA) 1.0 2415-2105 羧基化改性的(MG-CM) 1.0 4415-2105 羧基化改性的(MG-CM) 1.0 JSR micro MB100 羧基化的 1.1 Invitrogen 354-01 羧基化的 1 355-00 甲苯磺酰基活化的(Tosylactivated) 1 650-11 羧基化的 1 655-11 甲苯磺酰基活化的 1 Biopal M02Q05 氨基活化的 1.5 M02Q05 生物素活化的 1.5 M02Q05 链霉亲和素活化的 1.5 [0139] 用于本发明系统和方法的磁性粒子可以具有10 nm至1200 nm的铃动力直径，并且含有平均18×102至1×1010个金属原子/粒子，并且具有每个粒子的1×104至1×1013 mM-1s-1的弛豫率。本发明的系统和方法中所使用的磁性粒子可以是任何设计、复合物、或者上述来源，并且可以进一步如本文中所描述方式加以修饰而用作磁共振开关。 [0140] 除了每个粒子的弛豫率外，在磁性粒子的选择和设计中必须设法解决若干其它实际问题，以便实现高分析灵敏度测定。 [0141] 例如，为了使铁含量和每个粒子的弛豫率最大化，使用大粒子(即，1000 nm或更大)可能是合乎需要的。然而，我们已观察到该尺寸的粒子易于从溶液中快速沉降出来。我们已观察到如果将磁性粒子的尺寸保持在低于500 nm那么粒子沉降通常不会干扰测定。当在所述测定中使用大于500 nm的粒子或者如果使用具有高密度的较小粒子，则对沉降进行监测并确定沉降对T2测量的影响。我们已发现尺寸为约100-300 nm的磁性粒子对于沉降方面的稳定性来说是理想的，甚至在官能化后(增加铃动力直径达大约50 nm至300 nm)，并且提供由于高的每个粒子的弛豫率所造成的高灵敏度。粒子密度无疑在浮力中起作用。因此，溶液与粒子的相对密度在粒子的沉降中起到重要的作用。因此，此问题的一个可能的解决方法是使用易浮的磁性粒子(即，空心粒子、或者含有低密度骨架和高密度金属氧化物二者的粒子)。沉降可影响T2检测，因此可利用溶液添加剂来改变粒子与溶液密度的比率。如果存在大量超磁顺材料从测量的液体体积中的沉降，那么T2检测可以受到沉降的影响。可以通过将这些粒子稀释至使UV-V在410 nm处的吸光度在0.6-0.8吸光度单位之间的浓度然后监测吸光度达90分钟，来评估沉降。如果发生沉降，初始吸光度与终点吸光度之间的差值除以初始吸光度将大于5%。如果沉降%超过5%，那么该粒子通常不适合用于要求高分析灵敏度的测定。本发明的测定中所使用的磁性粒子可以是但不限于不沉降磁性粒子。高沉降意味着处理困难并且会造成可重复性问题。 [0142] 对于粒径为100 nm或更大的磁性粒子，通常包含粒子芯的多个超顺磁性氧化铁晶体当存在外部磁场时产生净偶极矩，即该偶极矩是足以是克服布朗运动的力。非特异性的可逆性是胶体稳定性和对抗非特异性聚集的稳健性是量度。通过测量在均匀磁场(定义为<5000 ppm)中温育前后粒子溶液的T2值来评估非特异性的可逆性。对于具有0.01 mM Fe铁浓度的粒子，起始T2值通常为200 ms。如果在均匀磁场中的温育前后T2值的差值小于20 ms，那么这些样品被认为是可逆的。此外，10%是使起始T2测量能够反映测定粒子浓度的阈值。 如果差值大于10%，那么这些粒子在被测试缓冲液、稀释剂和基质中显示不可逆性。可以按本文中所描述方式改变磁性粒子的非特异性的可逆性。例如，胶体稳定性和对抗非特异性聚集的稳健性可受粒子的表面特性、结合部分、测定缓冲液、基质和测定处理条件的影响。 胶体稳定性和对非特异性结合的抗性的维持可以被结合化学、封闭方法、缓冲液修饰和/或测定处理条件的变化所改变。 [0143] 我们已观察到对于可靠且可重现测定而言非常重要的特性是所使用磁性粒子粒径分布的单分散性，在包覆后多分散粒子与包覆前单分散粒子之间观察到差别。多分散批次的磁性粒子会缺乏可重复性且损失了灵敏度。多分散样品也会存在获得均匀涂层方面的问题。对于某些高度灵敏度测定，理想的是磁性粒子的粒径分布基本上是单分散的(即，具有小于大约0.8-0.9的多分散性指数)。可替换地，本发明的测定可被设计成适应多分散磁性粒子的使用。 [0144] 假设本发明的测定要求监测团聚测定的集聚状态的改变，并且测量集聚的变化可能需要大量的集聚的粒子(例如，一般认为>1-10%)，应使测定中粒子的总数最小化，以便能够获得最高灵敏度。然而，必须存在足够数量的粒子从而允许采用T2检测动态范围。我们已发现当磁性粒子的数量(或者摩尔当量)与被检测分析物的数量(或者摩尔当量)以及所采用多价结合剂的数量(或者摩尔当量)大致处在同一数量级时，观察到最高灵敏度(即，在抑制测定中)。 [0145] 对于蛋白质样品，也可能要求修饰磁性粒子表面来降低背景蛋白质对磁性粒子的非特异性结合。背景蛋白质对粒子的非特异性结合可以引起或阻止粒子集聚，从而导致假信号和/或假的信号缺乏。例如，在一些情况下，磁性粒子表面可以包括共价连接到磁性粒子表面的、降低背景蛋白质的非特异性结合的封闭剂。存在可以用于获得期望效果的多种试剂，并且在一些情况下，最佳的是多种试剂的组合(见表3；示例性的粒子、涂层和结合部分)。 [0146] 表3 [0147] 。 [0148] 因此，我们已发现可能要求进行蛋白质封闭来获得测定活性和灵敏度，尤其是在蛋白质样品(例如，血浆样品或全血样品)中，这与非蛋白质缓冲液样品中的结果具有可比性。可用于提供的制剂中的一些常用蛋白封闭剂包括例如：牛血清白蛋白(BSA)、鱼皮明胶(FSG)、牛丙种球蛋白(BGG)、溶菌酶、酪蛋白、肽酶、或者脱脂奶粉。在某些实施方案中，磁性粒子涂层包括BSA或者FSG。在其它实施方案中，涂层的组合是表3中所列出的那些示例性的涂层的组合。 [0149] 此外，非特异性结合可以是由于生物样品中的脂质或者其它非蛋白质分子所造成。对于非蛋白质介导的非特异性结合，可通过选择pH值和缓冲液离子强度的变化来增加粒子排斥力，但不足以限制预期相互作用的结果。 [0150] 测定试剂 [0151] 本发明的测定可以包括用于减小对磁性粒子的非特异性结合的试剂。例如，测定可以包括一种或多种蛋白质(例如，白蛋白(例如，人或牛白蛋白)、鱼皮明胶、溶菌酶、或者运铁蛋白)；低分子量(<500道尔顿)胺类(例如，氨基酸、甘氨酸、乙胺、或者巯基乙醇胺)；和/或水溶性非离子型表面活性剂(例如，聚乙二醇、Tween® 20、Tween®80、Pluronic®、或者Igepal®)。 [0152] 表面活性剂可选自种类广泛的水溶性非离子型表面活性剂，包括由GAF公司通常以IGEPAL的商品名销售的表面活性剂。IGEPAL液体非离子表面活性剂是聚乙二醇对异辛基苯基醚化合物，并且可以各种分子量表征获得，例如IGEPAL CA720、IGEPAL CA630和IGEPAL CA890。其它合适的非离子型表面活性剂包括由BASF Wyandotte公司以商品名TETRONIC909销售的产品。此材料是终止于伯羟基的四官能嵌段共聚物表面活性剂。合适的非离子型表面活性剂也可以VISTA ALPHONIC的商品名从Vista化学公司购得，这种材料是非离子型可生物降解的乙氧基化物，其是由各种分子量的线性伯醇掺混物获得。表面活性剂也可以选自泊洛沙姆（例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物（例如以商品名Synperonic PE series(ICI)、Pluronic®系列(BASF)、Supronic、Monolan、Pluracare和Plurodac销售的产品））、聚山梨醇酯表面活性剂(例如Tween®20(PEG-20脱水山梨醇单月桂酸酯)、以及二醇类(例如乙二醇和丙二醇)。 [0153] 通过选择这种非离子表面活性剂，可在不对测定反应产生有害作用的情况下为测定提供适量的去污力。特别是，反应混合物中可包含表面活性剂，用以抑制本发明聚集测定中各种成分之间的非特异性相互作用。通常以0.01%(w/w)至5%(w/w)的量，将非离子表面活性剂添加到前面的液体样品中。 [0154] 非离子表面活性剂也可与先前以0.01%(w/w)至5%(w/w)的量添加到液体样品中的一种或多种蛋白质(例如，白蛋白、鱼皮明胶、溶菌酶、或者运铁蛋白)一起使用。 [0155] 此外，本发明的测定、方法和药筒单元可以包含：其它合适的缓冲液成分(例如，Tris碱，被选择以提供反应环境中大约7.8至8.2的pH值)；以及螯合剂，用于清除阳离子(例如，EDTA二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、酒石酸、葡萄糖醛酸、糖质酸、或者其合适的盐)。 [0156] 结合部分 [0157] 一般来说，结合部分是特异性地结合或连接到(例如共价或非共价结合到)靶分子或者与靶分子杂交，或者与其它结合部分(或者，在某些实施方案中，与引起聚集的分子)杂交的合成或天然的分子。例如，该结合部分可以是指向抗原的抗体、或者任何蛋白质-蛋白质相互作用。可替换地，结合部分可以是结合到相应的靶的多糖或者杂交到特定互补核酸靶的合成寡核苷酸。在某些实施方案中，结合部分可被设计成或者被选择成当结合到另一结合部分时充当靶分子(例如溶液中的酶)的底物。 [0158] 结合部分包括，例如，寡核苷酸结合部分(DNA、RNA、或者取代或衍生化的核苷酸置换物)、多肽结合部分，抗体结合部分、适体和多糖结合部分。 [0159] 寡核苷酸结合部分 [0160] 在某些实施方案中，结合部分是利用多种化学方法中的任一种，通过单个键(例如共价键)而附连/连接到磁性粒子上（例如在3’或5’端附着/连接到磁性粒子上的官能团）的寡核苷酸。这种结合部分可用于本发明的系统、装置和方法中，以检测突变(例如，SNP、易位、大缺失、小缺失、插入、置换)或者监测基因表达(例如，表达的存在、或者基因表达水平的变化、监测RNA转录)、或者表征病原体的存在、疾病状态、或者疾病发展的CHP分析。 [0161] 可利用化学合成来构建寡核苷酸结合部分。可以利用本领域已知的程序通过酶连接反应（enzymatic ligation reactions）构建双链DNA结合部分。例如，核酸(例如，寡核苷酸)可以利用天然存在的核苷酸或者不同地修饰的核苷酸(被设计用来提高分子的生物稳定性或者提高在互补链之间所形成的双链体的物理稳定性)来化学合成，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。也可以使用将核酸亚克隆入其中的表达载体，通过生物方法而生产核酸。 [0162] 一种方法使用至少两个群的寡核苷酸磁性粒子，其各自对水(或者其它溶剂)的弛豫具有强作用。当寡核苷酸-磁性粒子缀合物与靶寡核苷酸反应时，它们形成聚集体(例如，磁性粒子的团簇)。长时间静置(例如在室温下过夜)后，这些聚集体形成大的团簇(微米尺寸的团簇)。利用本发明的方法，可以通过采用磁力辅助团聚的多次循环而更迅速地形成大的团簇。利用磁共振来确定溶剂的弛豫特性，该弛豫特性当磁性寡核苷酸磁性粒子的混合物与靶核酸反应而形成聚集体时被改变。 [0163] 某些实施方案使用至少两种类型的磁性金属氧化物磁性粒子的混合物，其各自具有特定的寡核苷酸序列，并各自具有多于一个的附着的寡核苷酸的拷贝（例如共价地附着在每个磁性粒子上）。例如，测定方案可包括：制备各群的寡核苷酸-磁性粒子缀合物的混合物，并且使该混合物与靶核酸反应。可替换地，寡核苷酸-磁性粒子缀合物可以相继的方式与靶反应。某些实施方案的特征在于：利用磁共振来检测寡核苷酸-磁性粒子缀合物与靶核酸的反应。当存在靶时，分散的缀合物自组装而形成小聚集体。 [0164] 例如，寡核苷酸结合部分可以通过共价连接到官能化聚合物从而连接到金属氧化物、或者连接到非聚合物表面官能化金属氧化物。在后一种方法中，可以根据Albrecht等人，Biochimie,80:379(1998)的方法合成磁性粒子。将二巯基丁二酸缀合到氧化铁，并提供羧基官能团。 [0165] 在某些实施方案中，可利用与金属氧化物结合的官能化聚合物将寡核苷酸连接到磁性粒子。在一些实施方案中，聚合物是亲水性的。在某些实施方案中，使用具有末端氨基、巯基或磷酸酯基的寡核苷酸以及携带在亲水性聚合物上的氨基或羧基的超顺磁性氧化铁磁性粒子来制造缀合物。存在若干种用于合成羧基和氨基衍生化的磁性粒子的方法。 [0166] 在一个实施方案中，寡核苷酸通过配体-蛋白质结合相互作用(例如生物素-链霉亲和素)连接到粒子，其中配体共价连接到寡核苷酸并且蛋白质共价连接到粒子，反之亦然。此方法可以实现更快速的试剂制备。 [0167] 可以使用其它形式的寡核苷酸。例如，适体是长度为15至60个碱基的单链RNA或DNA寡核苷酸，其在溶液中形成分子内相互作用，该作用将线性核酸分子折叠成三维复合体，然后该复合体可以利用高亲和力结合到特定的分子靶；经常具有在1 pM至1 nM范围内的平衡常数，这类似于一些单克隆抗体-抗原相互作用。适体可以特异性地结合到其它核酸分子、蛋白质、小有机化合物、小分子和细胞(生物体或病原体)。 [0168] 多肽结合部分 [0169] 在某些实施方案中，结合部分是利用多种化学方法中的任一种，通过单个共价键，以不影响多肽的生物活性的方式附着的多肽(即，蛋白质、多肽、或者肽)。在一个实施方案中，附着是利用单个反应性半胱氨酸残基的巯基来完成，其修饰不影响多肽的生物活性。在这方面，在C-末端或N-末端具有半胱氨酸的线性多肽的使用，以类似于烷硫醇（alkanethiol）在寡核苷酸的3’或5’端提供巯基的方式提供单个巯基。与磁性粒子的氨基和多肽的巯基发生反应的类似的双功能缀合试剂(例如SPDP)可以用于任何携带巯基的结合部分。用作结合部分的多肽类型可以是抗体、抗体片段、以及天然和合成的多肽序列。肽结合部分具有结合配偶体，亦即它们所选择性地结合的分子。 [0170] 使用肽作为结合部分提供若干优点。例如，可以通过设计使多肽在远离生物活性所需的残基的部位具有独特的反应性残基，用于附着到磁性粒子。该反应性残基可以是半胱氨酸巯基、N-末端氨基、C-末端羧基或者天门冬氨酸或谷氨酸的羧基等。肽上的单个反应性残基是用于确保独特的附着位点。这些设计原理可以适用到化学合成肽或者生物方法制造的多肽中。 [0171] 结合部分也可以含有来源于天然存在的(野生型)多肽或蛋白质的氨基酸序列。例如，天然多肽可以是激素(例如，细胞因子、生长因子)、血清蛋白、病毒蛋白(例如，血凝素)、细胞外基质蛋白、凝集素、或者细胞表面蛋白质的外功能区。另一个例子是配体结合蛋白，例如链霉亲和素或者亲合素（其结合生物素）。一般来说，所形成的结合部分-磁性粒子是用于测量在测试介质中与结合部分反应的分析物的存在。 [0172] 此外，多肽结合部分可以用于通用试剂构建，其中使结合部分的靶(例如，小分子、配体、或者结合配偶体)预先连接到靶分析物，以形成标记的分析物，该标记的分析物在多肽修饰的粒子的存在下诱导集聚。 [0173] 可用作结合部分的蛋白质激素的例子包括但不限于：与PDGF受体结合的血小板衍生生长因子(PDGF)；与Igf受体结合的胰岛素样生长因子-I和-II(Igf)；与NGF受体结合的神经生长因子(NGF)；与FGF受体(例如，aFGF和bFGF)结合的成纤维细胞生长因子(FGF)；与EGF受体结合的表皮生长因子(EGF)；与TGF受体结合的转化生长因子(TGF，例如TGF-α和TGF-β)；与促红细胞生成素受体结合的促红细胞生成素；与生长激素受体结合的生长激素(例如，人生长激素)；以及全部与胰岛素受体结合的前胰岛素、胰岛素、A-链胰岛素和B-链胰岛素。 [0174] 受体结合部分可用于对在细胞表面上集聚的受体进行检测和成像。有用的外功能区包括：缺刻蛋白（Notch protein）、δ蛋白、整联蛋白、钙粘着蛋白和其它细胞粘附分子。 [0175] 抗体结合部分 [0176] 其它多肽结合部分包括含有至少一个免疫球蛋白结构域以及通常含有至少两个这种结构域的免疫球蛋白结合部分。“免疫球蛋白结构域”是指抗体分子的结构域，例如可变区或恒定区。“免疫球蛋白超家族结构域”是指具有与免疫球蛋白结构域有关的三维结构的结构域，但是其来自非免疫球蛋白分子。免疫球蛋白结构域和免疫球蛋白超家族结构域通常包括两个由大约7个β-链所形成的β-折叠（β-sheets）、以及保守的二硫键(见，例如Williams和Barclay,Ann.Rev Immunol.,6:381(1988))。包含Ig超家族结构域的结构域的蛋白质包括：T细胞受体、CD4、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和细胞间粘附分子(ICAM)。 [0177] 一种类型的免疫球蛋白结合部分是抗体。本文中使用的术语“抗体”是指全长度双链免疫球蛋白分子、以及其抗原结合蛋白和片段，包含合成变体。典型的抗体包括两个重(H)链可变区(本文中缩写为VH)、以及两个轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。VH和VL区可以进一步被细分成诸高度可变区，称为“互补决定区”(CDR)，其与称为“框架区”(FR)的更保守的区散布。框架区和CDR的范围已被精确地定义(见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，以及Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。各VH和VL是由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4从氨基末端排列到羧基末端。 [0178] 抗体也可以包括作为轻链或重链的一部分的恒定区。轻链可以包括在COOH-末端的κ或λ-恒定区基因(称为CL)。重链可以包括例如γ-恒定区(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；编码大约330个氨基酸)。γ-恒定区可以包括例如CH1、CH2和CH3。术语“全长抗体”是指包括包含VL和CL的一个多肽以及包含VH、CH1、CH2和CH3的第二多肽的蛋白质。 [0179] 本文中使用的术语抗体“抗原结合片段”是指保持特异性地结合到靶的能力的全长抗体的一个或多个片段。抗原结合片段的例子包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab’)2 片段，为二价片段，包含由在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341:544(1989))；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因所编码，但可以利用重组方法通过合成的连接基将它们加以连接，所述合成的连接基使得它们被制成单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成一价分子(称为单链Fv(scFv)；见例如，Bird等人，Science 242：423(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA,85:5879(1988))。这种单链抗体也包括在术语“抗原结合片段” 内。 [0180] 单域抗体(sdAb,纳米抗体)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段，并且也可用于本发明的系统和方法。如同一个完整抗体，sdAb能够选择性地结合到特异性抗原。因为分子量仅为12-15 kDa，所以单个结构域抗体远小于由两条重蛋白质链和两条轻链所组成的常见的抗体(150-160 kDa)，并且甚至小于Fab片段(大约50 kDa，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(大约25 kDa，两个可变结构域，一个来自轻链而一个来自重链)。 [0181] 多糖结合部分 [0182] 在某些实施方案中，结合部分是例如利用多种化学方法中的任一种，通过单键(例如共价键)在两端中的一端连接到磁性粒子上的官能团的多糖。该多糖可以是合成或天然的。可以使用单糖、二糖、三糖和多糖作为结合部分。当与合适的附着化学方法一起使用结合到磁性粒子时，这些结合部分包括例如，苷类、N-糖基胺类、O-酰基衍生物、O-甲基衍生物、脎类、糖醇类、糖酸类、糖磷酸酯类。 [0183] 实现连接的一种方法是将亲合素缀合到磁性粒子并且使亲合素-磁性粒子与市售的生物素化多糖反应，以形成多糖-磁性粒子缀合物。例如，基于唾液酸化Lewis的多糖（sialyl Lewis based polysaccharides）是以生物素化试剂市售的，并且将与亲合素-CLIO发生反应(见Syntesome，Gesellschaft fur medizinische Biochemie mbH.)。唾液酸化Lewis四糖(Slex)被称为选择蛋白的蛋白质所识别，所述选择蛋白存在于粒性白细胞表面并且起到粒性白细胞的募集的炎症级联反应中的一部分的作用。 [0184] 其它靶向部分包括：非蛋白质元件，例如糖基修饰(例如Lewis抗原)或者另一种非蛋白质有机分子。另一种方法是使蛋白质共价缀合到磁性粒子。 [0185] 该方法的另一个特征包括：利用任何上述结合部分来鉴别特定的细胞类型，以便进行血液学或组织病理学研究(例如CD4/CD3细胞计数和循环的肿瘤细胞)。 [0186] 多价结合剂 [0187] 本发明的测定可以包括多价结合剂，其(i)携带多个连接到载体(例如，简单的合成支架、或者较大的载体蛋白质或多糖，例如BSA、运铁蛋白、或者葡聚糖)的分析物、或者携带多个用于结合到例如两个或更多个群的磁性粒子以形成聚集体的表位。 [0188] 在使用多价结合剂的情况下，可将多个分析物连接到载体(例如，简单的合成支架、或者较大的载体蛋白质或多糖，例如BSA、运铁蛋白、或者葡聚糖)。可替换地，多价结合剂可以是被设计成结合到两个或更多个群的磁性粒子的核酸。这种多价结合剂起团聚剂的作用，并且测定结构由被检测分析物与多价结合剂之间的竞争所表征(例如，在抑制测定、竞争测定、或者解聚测定中)。 [0189] 分析物中存在的官能团可以用于与载体形成共价键。可替换地，可使分析物衍生化而提供终止于官能团(即，醇、胺、羧基、巯基、或磷酸酯基)的连接基(即，使分析物与缀合物中的载体分离的间隔区)，所述官能团用于与载体形成共价键。 [0190] 可利用连接基来影响分析物与载体的共价连接，所述连接基含有能够与分析物和载体中所存在的这种官能团反应的反应性部分。例如，分析物的羟基可与连接基的羧基或者其活化的衍生物发生反应，从而形成连接这两者的酯。 [0191] 能够与巯基发生反应的部分的例子包括：XCH2CO-(其中X=Br、Cl或I)类型的α-卤代乙酰基化合物，XCH2CO-显示对巯基的特异性反应性，但也可以用于修饰咪唑基、硫醚、苯酚和氨基，如Gurd，Methods Enzymol.11:532(1967) 所描述。N-马来酰亚胺衍生物也被认为对巯基具有选择性，但可额外地在某些条件下用于缀合到氨基。通过氨基转化而引入巯基的试剂，例如2-亚氨基四氢噻吩（2-iminothiolane）(Traut等人，Biochemistry 12:3266(1973))，可以被看作是巯基试剂（如果通过二硫桥的形成而发生连接）。 [0192] 能够与氨基发生反应的反应性部分的例子包括例如：烷基化剂和酰化剂。代表性的烷化基剂包括：(i)α-卤代乙酰基化合物，其在反应性巯基不存在下显示对氨基的特异性并且属于XCH2CO-(其中X=Cl、Br或I)的类型，例如由Wong，Biochemistry 24:5337(1979)所述；(ii) N-马来酰亚胺衍生物，其可利用Michael型反应或者利用酰化（通过加成到环羰基中）而与氨基发生反应，例如由Smyth等人，J.Am.Chem.Soc. 82:4600(1960)和Biochem.J.91:589(1964)所描述；(iii)卤代芳烃，例如反应性硝基卤代芳香族化合物； (iv)卤代烃，例如由McKenzie等人，J.Protein Chem.7：581(1988)所描述；(v)能够与氨基形成席夫碱的醛类和酮类，通常是通过还原得到稳定的胺而使所形成的加成物稳定化； (vi)环氧化物衍生物，例如环氧氯丙烷和双环氧乙烷，其可与氨基、巯基或酚羟基发生反应；(vii)均三嗪（s-triazines）的含氯衍生物，其对亲核体(例如氨基、巯基和羟基)具有非常强的反应性；(viii) 基于上面详述的均三嗪化合物的氮丙啶类，例如由Ross， J.Adv.Cancer Res.2:1(1954)所描述，其通过开环与亲核体(例如氨基)发生反应；(ix)方酸二乙酯（squaric acid diethyl esters），如Tietze,Chem.Ber.124：1215(1991)所描述； 以及(x)α-卤代烷基醚，其是由于由醚氧原子所导致的活化而比常用的卤代烷更具反应性的烷化剂，如由Benneche等人，Eur.J.Med.Chem.28:463(1993)所描述。 [0193] 代表性的氨基反应性酰化剂包括：(i)异氰酸酯类和异硫氰酸酯类，特别是芳香族衍生物，其分别形成稳定的脲和硫脲衍生物；(ii)磺酰氯类，其已经由Herzig等人,Biopolymers 2:349(1964)所描述；(iii)酰卤类；(iv)活性酯类，例如硝基苯基酯类或者N-羟基琥珀酰亚氨基酯类（N-hydroxysuccinimidyl esters）；(v)酸酐，例如混合、对称、或者N-羧基酸酐类；(vi)用于酰胺键形成的其它有用试剂，例如由M. Bodansky,Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，1984所描述；(vii)酰叠氮类，例如其中叠氮基团是利用亚硝酸钠由预先形成的酰肼衍生物所产生，如由Wetz等人，Anal. Biochem.58:347(1974) 所描述；以及(viii)亚氨酸酯类，其在与氨基反应后形成稳定的脒类，例如由Hunter和Ludwig,J.Am.Chem.Soc.84:3491(1962)所描述。醛类和酮类可与胺类发生反应而形成席夫碱，该席夫碱可有利地通过还原胺化而稳定化。烷氧基氨基部分容易地与酮类和醛类反应而产生稳定的烷氧基胺类（alkoxamines），例如由Webb等人，Bioconjugate Chem.1:96(1990)所描述。能够与羧基发生反应的反应性部分的例子包括重氮化合物，例如重氮乙酸酯类和重氮乙酰胺类，其以高特异性发生反应而产生酯基，例如由Herriot,Adv.Protein Chem.3：169(1947)所描述。也可使用羧基修饰试剂，例如碳二亚胺类，其经过O-酰基脲形成接着形成酰胺键而反应。 [0194] 应当理解的是，若需要可在反应前将分析物和/或载体中的官能团转化成其它官能团，例如赋予额外的反应性或选择性。若需要，所谓的零长度连接基，包括在不引入其它连接材料的情况下分析物的反应性化学基团与载体的反应性化学基团的直接共价连接，可用于本发明。然而，最常见地，连接基将包括被间隔区元件所连接的两个或多个反应性部分，如上所述。这种间隔区的存在允许双功能连接基与分析物和载体内的特定官能团发生反应，从而在两者之间形成共价连接。连接基中的反应性部分可以是相同的(同双功能连接基)或者是不同的(异双功能连接基，或者如果存在若干不同的反应性部分，则称作异多功能连接基)，从而提供可以引起分析物与载体之间的共价连接的潜在试剂的多样性。连接基中的间隔区元件通常是由直链或支链组成并且可包括C1-10 烷基、1至10个原子的杂烷基、C2-10烯烃、C2-10炔烃、C5-10芳基、3至10个原子的环系统、或者-(CH2CH2O)nCH2CH2-（其中n为1至4）。通常，一个多价结合剂将包括2、3、4、5、6、7、8、15、50、或者100个(例如，3至100、3至30、4至25、或者6至20个)缀合的分析物。多价结合剂的尺寸通常为10 kDa至200 kDa并且可以按各实施例中所描述的方式制备。 [0195] 分析物 [0196] 本发明的实施方案包括用于检测和/或测量样品中的一种或多种分析物（例如：蛋白质、肽、酶、多肽、氨基酸、核酸、寡核苷酸、治疗剂、治疗剂的代谢产物、RNA、DNA、循环DNA(例如，来自细胞、肿瘤、病原体、或者胎儿)、抗体、生物体、病毒、细菌、碳水化合物、多糖、葡萄糖、脂质、气体(例如，氧气和/或二氧化碳)、电解质(例如，钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、BUN、镁、磷酸盐、钙、氨和/或乳酸盐)、一般化学分子(肌酸酐、葡萄糖)、脂蛋白、胆固醇、脂肪酸、糖蛋白、蛋白聚糖和/或脂多糖)浓度的装置、系统和/或方法。分析物可包括细胞或特定细胞类型的鉴别。分析物（诸分析物）可包括一种或多种生物活性物质和/或代谢产物（诸代谢产物）、标志（诸标志）和/或生物活性物质的其它指示物（诸其它指示物）。生物活性物质可被描述成单个实体或者多个实体的组合。术语“生物活性物质”包括但不限于：药物；维生素；矿物补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓和疾病或疾患的物质；或者影响身体结构或功能的物质；或者前体药物，在将其置于预定生理环境中之后变得具有生物活性或者活性加强；或者生物毒性剂，例如用于生物战的生物毒性剂，其包括生物体，例如炭疽、埃博拉（ebola）、鼠伤寒沙门氏菌、马尔堡病毒、鼠疫、霍乱、土拉弗朗西斯菌（Francisella tulariesis）(野兔病)、布鲁氏菌病、Q热、玻利维亚出血热、球孢子菌病（Coccidioidesmycosis）、鼻疽病、类鼻疽、志贺氏菌属、落基山斑疹热、斑疹伤寒、鹦鹉热、黄热病、日本乙型脑炎、裂谷热和天花；可以用作武器的天然存在的毒素，包括蓖麻毒蛋白、黄曲霉毒素、SEB、肉毒杆菌毒素、蛤蚌毒素、以及许多霉菌毒素。分析物还可包括生物体，例如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、烟曲霉菌、脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌、blaSHV、洋葱博克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌/结肠弯曲杆菌、吉利蒙念珠菌、鲁希特念珠菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠杆菌科物种、流感嗜血杆菌、金氏金菌、奥克西托克雷白杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、携带Mec A基因的细菌(MRSA)、Morganella morgana、脑膜炎奈瑟菌、非脑膜炎奈瑟菌的奈瑟菌属物种、颊普雷沃菌、中间普雷沃菌、产黑色素普雷沃菌、痤疮丙酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、溶血性葡萄球菌、Staphylococcus maltophilia、腐生性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、无乳链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、缓症链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、血链球菌、Van A基因、Van B基因。分析物也可包括病毒生物体，例如dsDNA 病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)；ssDNA病毒(+)义DNA(例如，细小病毒)；dsRNA 病毒(例如，呼肠孤病毒)；(+)ssRNA病毒(+)义RNA(例如，小核糖核酸病毒、披膜病毒)；(-)ssRNA 病毒(-)义RNA(例如，正粘病毒、杆状病毒)；在生命周期中具有DNA中间体的ssRNA-RT病毒(+)义RNA(例如，反转录病毒)；和dsDNA-RT病毒(例如，肝脱氧核糖核酸病毒)。 [0197] 可以利用本发明的系统和方法所检测的机会感染包括但不限于：真菌、病毒、细菌、原生动物感染，例如：(1)真菌感染，例如念珠菌属物种(耐药和非耐药株)、白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和烟曲霉菌引起的感染；(2)革兰氏阴性感染，例如大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯氏菌/奥克西托克雷白杆菌，和绿脓杆菌引起的感染；以及(3)革兰氏阳性感染，例如葡萄球菌属物种、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠球菌属物种(粪肠球菌和屎肠球菌)引起的感染。所述感染可以是凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌属物种、梭形杆菌属物种、摩氏摩根菌、杰氏肺囊虫(以前称为卡氏肺囊虫)、F. hominis、化脓性链球菌、绿脓杆菌、多瘤病毒JC多瘤病毒(引起进行性多灶性脑白质病的病毒)、鲍氏不动杆菌、刚地弓形虫、巨细胞病毒、曲霉属物种、卡波西氏肉瘤、隐孢子虫属物种、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌引起的感染。 [0198] 可利用本发明的装置、系统和方法所检测的广泛类别的分析物的非限制性例子包括但不限于以下治疗剂类别：同化激素类药、抗酸药、抗哮喘药、抗胆固醇血症药和降脂药（anti-lipid agents）、抗凝血剂、抗痉挛药、抗腹泻药、止吐剂、抗感染剂、抗炎剂、抗躁狂剂、止恶心药、抗肿瘤药、减肥药、退热药和镇痛剂、解痉药、抗血栓剂、抗尿酸血症药、抗心绞痛药、抗组胺药、镇咳药、食欲抑制药、生物制剂、脑血管扩张剂、冠状血管扩张药、解充血剂、利尿剂、诊断试剂、红细胞生成剂、祛痰剂、胃肠镇静剂、促血糖增高药、催眠药、降血糖药、离子交换树脂、轻泻药、矿物补充剂、粘痰溶解药、神经肌肉药、外周血管扩张药、拟精神药物、镇静剂、兴奋剂、甲状腺和抗甲状腺药、子宫松弛药、维生素和前体药物。 [0199] 可利用本发明的装置、系统和方法检测的生物活性物质包括但不限于用于胃肠道或消化系统的药物，例如抗酸药、返流抑制剂、抗胃肠气胀药、抗多巴胺能药物、质子泵抑制剂、H2-受体拮抗剂、细胞保护剂、前列腺素类似物、轻泻药、解痉药、抗腹泻药、胆汁酸多价螯合剂和阿片类物质；用于心血管系统的药物，例如β-受体阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、强心苷类、抗心律不齐药、硝酸酯、抗心绞痛药、血管收缩药、血管扩张药、外周激活剂、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、α-阻断剂、抗凝血剂、肝素、HSGAG类、抗血小板药、纤溶剂、抗血友病因子、止血药、降血脂药和他汀类；用于中枢神经系统的药物，例如催眠药、麻醉剂、抗精神病药、抗抑郁药、止吐药、抗惊厥药、抗癫痫药、抗焦虑药、巴比妥类、运动障碍药、兴奋剂、苯并二氮杂类药、环吡咯酮类药、多巴胺拮抗剂、抗组胺剂、胆碱能药物、抗胆碱能药物、催吐剂、大麻素类、5-HT拮抗剂；用于疼痛和/或意识的药物，例如非甾体抗炎药类、阿片类物质和毒品（orphans）例如对乙酰氨基酚、三环类抗抑郁药和抗惊厥药；用于肌-骨骼障碍的药物，例如非甾体抗炎药、肌肉松弛药、神经肌肉药物、抗胆碱酯酶药；用于眼睛的药物，例如肾上腺素能神经元阻断剂、收敛剂、眼润滑剂、局部麻醉剂、拟交感神经药、副交感神经阻滞药、扩瞳剂、睫状肌麻痹剂、抗生素、局部抗生素、磺胺药、氨基糖苷类、氟喹诺酮类药、抗病毒药、抗真菌剂、咪唑类药、多烯类药物、非甾体抗炎药、皮质类固醇、肥大细胞抑制剂、肾上腺素能激动剂、β-受体阻断剂、碳酸酐酶抑制剂/高张剂（hyperosmotiics）、胆碱能药物、缩瞳剂、拟副交感神经药、前列腺素激动剂/前列腺素抑制剂、硝酸甘油；用于耳、鼻和口咽的药物，例如，拟交感神经药、抗组胺药、抗胆碱能药物、非甾体抗炎药、甾体药物、防腐剂、局部麻醉剂、抗真菌剂、溶耵聍剂（cerumenolytics）；用于呼吸系统的药物，例如支气管扩张药、非甾体抗炎药、抗过敏药、镇咳药、粘液溶解剂、解充血药、皮质类固醇、β-受体拮抗剂、抗胆碱能药、甾体药物；用于内分泌问题的药物，例如雄激素、抗雄激素、促性腺激素、皮质类固醇、生长激素、胰岛素、抗糖尿病药、甲状腺激素、抗甲状腺药、降钙素、二膦酸盐（diphosponate）和血管升压素类似物；用于生殖系统或泌尿系统的药物，例如抗真菌药、碱化剂、喹诺酮类药、抗生素、胆碱能药物、抗胆碱能药物、抗胆碱酯酶药、解痉药、5-α还原酶抑制剂、选择性α-1阻断剂和西地那非；用于避孕的药物，例如口服避孕药、杀精子剂和长效避孕药；用于产科和妇科的药物，例如非甾体抗炎药、抗胆碱能药、止血药、抗纤维蛋白溶解药、激素替代治疗、骨调节剂、β-受体激动剂、促卵泡激素、黄体生成素、LHRH全顺十八碳-6,9,12-三烯酸、促性腺激素释放抑制剂、孕酮、多巴胺激动剂、雌二醇、前列腺素、促性腺素释放激素、克罗米酚、他莫昔芬和己烯雌酚；用于皮肤的药物，例如润肤剂、止痒剂、抗真菌药、消毒剂、杀疥螨剂、灭虱药、焦油产品、维生素A衍生物、维生素D类似物、角质层分离剂、磨蚀剂、全身用抗生素、局部用抗生素、激素类、desloughing agents、渗出物吸收剂、纤溶剂、蛋白水解剂、防晒剂、止汗剂和皮质类固醇；用于感染和侵染的药物，例如，抗生素、抗真菌剂、抗麻风药、抗结核病药、抗疟药、驱肠虫剂、抗阿米巴药、抗病毒药、抗原生动物药和抗血清； 用于免疫系统的药物，例如疫苗、免疫球蛋白、免疫抑制剂、干扰素、单克隆抗体；用于变态反应性疾病的药物，例如，抗过敏药、抗组胺药和非甾体抗炎药；用于营养的药物，例如滋补品、铁制剂、电解质、维生素、减肥药、蛋白同化类药物、生血药物和食品药物；用于肿瘤性疾病的药物，例如细胞毒药物、性激素、芳香酶抑制剂、生长抑素抑制剂、重组白细胞介素、G-CSF和促红细胞生成素；用于诊断的药剂，例如造影剂；以及用于癌症的药物(抗癌剂)。 [0200] 可利用本发明的装置、系统和方法所检测的生物活性物质包括但不限于：血液病药物，例如抗贫血剂、造血性抗贫血剂、凝血剂、抗凝血剂、止血凝血剂、血小板抑制剂凝血剂、溶栓酶凝血剂和血容量扩充药；抗凝血剂、肝素、HSGAG类、抗血小板药物、纤溶剂、抗血友病因子、止血药。可利用本发明的装置、系统和方法所检测的抗血栓药(例如，溶栓剂、抗凝血剂和抗血小板药)的例子包括：维生素K拮抗剂，例如醋硝香豆素、氯茚二酮、双香豆素、二苯茚酮、双香豆乙酯、苯丙香豆素、苯茚二酮、噻氯香豆素和华法林；肝素类(血小板聚集抑制剂)，例如抗凝血酶III、贝米肝素（bemiparin）、达肝素（dalteparin）、达那肝素、依诺肝素、肝素、那屈肝素、帕肝素（parnaparin）、瑞维肝素、舒洛地希和亭扎肝素（tinzaparin）；其它血小板聚集抑制剂，例如阿昔单抗、乙酰水杨酸(阿司匹林)、阿洛泼林、贝前列素、地他唑、卡巴匹林钙、氯克罗孟、氯吡格雷、双嘧达莫、依前列醇、依替巴肽、吲哚布芬、伊洛前列素、吡考他胺、普拉格雷、噻氯匹定、替罗非班、曲前列环素（treprostinil）和三氟醋柳酸；酶类，例如阿替普酶、安克洛酶、阿尼普酶、纤维蛋白酶、替加色罗α（drotrecogin alfa）、纤维蛋白溶酶、procein C、瑞替普酶、沙芦普酶、链激酶、替奈普酶和尿激酶；直接凝血酶抑制剂，例如阿加曲班、比伐卢定、地西卢定、来匹卢定、美拉加群和希美加群；其它抗血栓药，例如达比加群、去纤苷、硫酸皮肤素、磺达肝癸(fondaparinux)和瑞瓦若西班等；以及其它药物，例如柠檬酸盐、EDTA和草酸盐。 [0201] 可利用本发明的装置、系统和方法所检测的其它生物活性物质包括Basic and Clinical Pharmacology(LANGE Basic Science),Katzung和Katzung，ISBN 0071410929，McGraw-Hill Medical，第9版(2003) 中所提及的那些。 [0202] 医学状况 [0203] 本发明的方法可用于在任意大范围的医学状况的诊断、控制和/或治疗中监测一种或多种分析物。各种类型的医学状况包括，例如，疼痛性病症；体温改变的病症(例如，发热)；神经系统功能障碍的病症(例如，晕厥、肌痛、运动障碍、麻木、感觉缺失、谵妄、痴呆、记忆丧失、或者睡眠障碍)；眼、耳、鼻和喉的病症；循环系统和/或呼吸系统功能的病症(例如，呼吸困难、肺水肿、咳嗽、咯血、高血压、心肌梗塞、低氧、紫绀、心血管性虚脱、充血性心力衰竭、水肿、或者休克)；胃肠功能的病症(例如，吞咽困难、腹泻、便秘、胃肠道出血、黄疸、腹水、消化不良、恶心、呕吐)；肾功能和泌尿道功能的病症(例如，酸中毒、碱中毒、液体和电解质失衡、氮质血症、或者尿异常)；性功能和生殖的病症(例如，勃起功能障碍、月经不调、多毛症、男性化、不育症、妊娠相关病症和标准测量)；皮肤病症(例如，湿疹、银屑病、痤疮、酒渣鼻、皮肤感染、免疫性皮肤病、或者光过敏)；血液病症(例如，血液学)；基因病症(例如，遗传病症)；药物反应的病症(例如，不利的药物反应)；以及营养病症(例如，肥胖症、进食障碍疾患、或者营养评价)。本发明实施方案可应用的其它医学领域包括：肿瘤学(例如，肿瘤、恶性肿瘤、血管生成、副肿瘤综合征、或者肿瘤急症)；血液学(例如，贫血症、血红蛋白病、巨幼细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血、脊髓发育不良、骨髓衰竭、真性红细胞增多症、骨髓增生性疾病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴恶性肿瘤、浆细胞病、输血生物学（transfusion biology）、或者移植)；止血法(例如，凝血和血栓形成的病症、或者血小板和血管壁的病症)；以及传染病(例如，脓毒症、脓毒性休克、未知原因的发热、心内膜炎、咬伤、烧伤、骨髓炎、脓肿、食物中毒、盆腔炎性疾病、细菌(例如，革兰氏阳性、革兰氏阴性、混杂的(诺卡氏菌属、actimoyces、混合型)、分枝杆菌（mycobacterial）、螺旋体、立克次体、或者支原体)；衣原体；病毒(DNA、RNA)、真菌和藻类感染；原生动物和蠕虫感染；内分泌障碍性疾病；营养病；代谢性疾病。 [0204] 本发明实施方案可应用的其它医学状况和/或领域包括：Harrison’s Principles of Internal Medicine，Kasper等人,ISBN 0071402357，McGraw-Hill Professional，第16版(2004年)中所提到的那些，以及Robbins Basic Pathology，Kumar、Cotran和Robbins编辑，ISBN1416025340，Elsevier，第7版(2005)中所提到的那些。 [0205] 可利用本文中所描述的本发明的各种实施方案执行的医学检测(例如，血液检测、尿检测和/或其它人或动物组织检测)包括，例如，一般化学检测(例如，分析物包括白蛋白、血液尿素氮、钙、肌酸酐、镁、磷、总蛋白和/或尿酸)；电解质检测(例如，分析物包括钠、钾、氯化物和/或二氧化碳)；糖尿病检测(例如，分析物包括葡萄糖、血红蛋白A1C和/或微量白蛋白)；脂质检测(例如，分析物包括载脂蛋白A1、载脂蛋白B、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和/或高密度脂蛋白胆固醇)；营养评价(例如，分析物包括白蛋白、前白蛋白、运铁蛋白、视黄醇结合蛋白、α1-酸糖蛋白和/或铁蛋白)；肝脏检测(例如，分析物包括丙氨酸转氨酶、白蛋白、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、直接胆红素、γ-谷氨酰转移酶、乳酸脱氢酶、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、前白蛋白、总胆红素和/或总蛋白)；心脏检测(例如，分析物包括载脂蛋白A1、载脂蛋白B、心肌钙蛋白-1、肌酸激酶、肌酸激酶 MB同工酶、高灵敏度CRP、质量肌酸激酶MB同工酶肌红蛋白（mass creatine kinase MB isoenzyme myoglobin）和/或N-末端脑利钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide）)；贫血症的检测(例如，分析物包括铁蛋白、叶酸、高半胱氨酸、结合珠蛋白、铁、可溶性运铁蛋白受体、总铁结合力、运铁蛋白和/或维生素B12)；胰腺检测(例如，分析物包括淀粉酶和/或脂肪酶)；肾病(例如，分析物包括白蛋白、αl-微球蛋白、α2-巨球蛋白、β2-微球蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、视黄醇结合蛋白和/或运铁蛋白)；骨检测(例如，分析物包括碱性磷酸酶、钙和/或磷)；癌标志监测(例如，分析物包括总PSA)；甲状腺检测(例如，分析物包括游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、促甲状腺激素和/或三碘甲状腺原氨酸)；生育力检测(例如，分析物包括 β-人绒毛膜促性腺激素)；治疗药物监测(例如，分析物包括卡马西平、地高辛、洋地黄毒苷、庆大霉素、利多卡因、锂、N-乙酰基普鲁卡因酰胺、苯巴比妥、苯妥英、普鲁卡因酰胺、茶碱、妥布霉素、丙戊酸和/或万古霉素)；免疫抑制药(例如，分析物包括环孢素A、西罗莫司和/或他克莫司)；补体活性和/或自身免疫性疾病的检测(例如，分析物包括C3补体、C4 补体、C1抑制剂、C-反应蛋白和/或类风湿因子)；多克隆/单克隆丙种球蛋白病(例如，分析物包括免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、1 g 轻链（κ和/或λ型）、免疫球蛋白G的1、2、3和/或4亚型)；传染病的检测(例如，分析物包括抗链球菌溶血素O)；炎性疾病的检测(例如，分析物包括α1-酸糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、C-反应蛋白和/或结合珠蛋白)；变应性检测(例如，分析物包括免疫球蛋白E)；尿蛋白检测(例如，分析物包括α1-微球蛋白、免疫球蛋白G、1 g 轻链（κ和/或λ型）、微量白蛋白和/或尿蛋白/脑脊液蛋白)；蛋白质-CSF的检测(例如，分析物包括免疫球蛋白 G和/或尿蛋白/脑脊液蛋白)；毒性检测(例如，分析物包括血清对乙酰氨基酚、血清巴比妥类、血清苯二氮类、血清水扬酸盐、血清三环类抗抑郁药和/或尿乙醇)；和/或对药物滥用的检测(例如，分析物包括苯丙胺、可卡因、巴比妥类、苯二氮类、迷魂药（ecstasy）、美沙酮、阿片类物质、苯环己哌啶、四氢大麻素类、丙氧芬和/或安眠酮)。可利用本发明的方法、装置、药筒和试剂盒所检测的特定癌标志包括但不限于：17-β-羟基类固醇脱氢酶1型、Abl交互子2（Abl interactor 2）、肌动蛋白相关蛋白 2/3复合体亚单位1A、白蛋白、醛缩酶A、碱性磷酸酶、胎盘型、α1抗胰蛋白酶、α-1-酸糖蛋白1、α-2-HS-糖蛋白、α-乳白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、血管生成素核糖核酸酶 RNase A家族 5、血管生成素1、血管生成素 2、由单克隆抗体Ki-67所识别的抗原、抗白细胞蛋白酶1（Antileukoproteinase 1）(SLPI)、载脂蛋白A1、ATP7B、β2-微球蛋白、B-细胞 CLL/淋巴瘤2、BCL2相关X蛋白、BRCA1、BRCA2、BrMS1、丁酸盐诱导的转录物1（Butyrate -induced transcript 1）、CA15.3/CA27-29、癌抗原125、癌抗原15.3、癌抗原 19.9、癌抗原602、癌抗原72-4/TAG-72、癌相关半乳糖基转移酶抗原、癌相关血清抗原(CASA)、癌胚抗原(CEA)、连环蛋白β1、组织蛋白酶D、组织蛋白酶成员8、CC趋化因子4(HCC- 4)、CCL21(小诱导细胞因子A21（small inducible cytokine A21）)、CCL5、CD15、CD24、CD34、CD44、细胞分裂蛋白激酶5、血浆铜蓝蛋白、子宫颈癌1原癌基因蛋白p40、c-Ets1、含有TCP1的伴侣蛋白（Chaparonin containing TCP1）、亚单位3、趋化因子(c-c基序)配基4小诱导细胞因子A4(CCL4、MIP-1-β)、趋化因子配体5、壳多糖酶-3样蛋白1(YKL-40)、氯离子细胞内通道4（Chloride intracellular channel 4）(CLIC4)、绒毛膜促性腺激素β链、紧密连接蛋白-3（Claudin-3）、紧密连接蛋白-4、丛生蛋白、凝血因子II(凝血酶原)、凝血因子III、凝血因子XIII a链、凝血因子XIIIb链、胶原Ic-末端肽、集落刺激因子2、集落刺激因子3、补体成分3、c-反应蛋白、肌酸酐激酶脑（Creatinine kinase brain）(CKB)、CTD小磷酸酶样（CTD small phosphatase-like）、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(p21)、环氧化酶-1、细胞色素c氧化酶Va、细胞色素c-1、结蛋白、肌营养不良蛋白聚糖1、CD105淋巴细胞抗原（Endoglin）、内皮素1、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素、E-选择蛋白、EST易位变体4(EST 4)、细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)、铁蛋白H、铁蛋白L、成纤维细胞生长因子2、纤维连接蛋白、Fit- 3 配体、具有CA125的氟代脱氧葡萄糖-PET(FDG-PET)、Fms-相关酪氨酸激酶1(VEGFR-1)、GADD45A、双能蛋白（Geminin）、草甘膦 N-乙酰基转移酶（Glyphosate N- acetyltransferase）、上皮素-颗粒素前体（Granulin-epithelin precursor）(GEP)、生长分化因子15、结合珠蛋白1、结合球蛋白-a-亚单位、HE4(人附睾蛋白（human epidiymis protein）)、Her2、HER2-neu、hK10、hK11、hK13、hk6、hk7、hK8、HLA II类 Doβ、hLMH1、hLMH2、HNF-1β、人绒毛膜促性腺激素-β亚单位、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、IGFBP-2、IL-2Rα(可溶性白细胞介素2受体α)、免疫球蛋白、免疫抑制酸性蛋白(lAP)、吲哚胺2,3-双加氧酶、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胰岛素样生长因子结合蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、整联蛋白α-V、整联蛋白αvβ6、细胞间粘附分子、干扰素α1、白细胞介素1α、白细胞介素1β、白细胞介素10、白细胞介素12A、白细胞介素16、Inter-α-胰蛋白酶抑制剂片段、激肽释放酶8、角蛋白、角蛋白18、角蛋白、I型细胞骨架19(细胞角蛋白19)、Kit配体、KRAS、乳运铁蛋白、层粘连蛋白-β3、瘦蛋白-选择蛋白(Leptil-selectin)、促黄体素释放激素受体、Mac-2结合蛋白 90k、巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞移动抑制因子、乳房血清抗原(Mammary serum antigen)、乳腺珠蛋白B(Mammoglobin B)、M-CAM、MIR21、间皮素(Mesothelin)、MMP3、黏液素型糖蛋白抗原、肌球蛋白X、神经生长因子β、神经生长因子-1(Netrin-1)、神经内分泌分泌蛋白-55(Neuroendocrine secretory protein-55)、中性粒细胞防卫素1、中性粒细胞防卫素3、Nm 23-H1、非金属细胞蛋白2（Nonmetallic cells protein 2）、非转移性细胞1蛋白(NM23A)、O-酰基转移酶结构域-含2（O-acyltransferase domain containing 2）、OVX1、OX40、P53、对氧磷酶2、Pcaf、p-糖蛋白、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶 （Phopshribosylaminoimidazole carboxylase）、血小板衍生的生长因子受体α、血小板衍生的生长因子受体β、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)、血小板因子4、妊娠相关血浆蛋白-A、妊娠区带蛋白、Procol-lys 1,2 oxoglute 5-digixyg 3、Procol-lys 1,2 oxoglute 5-digoxyg 1、孕酮受体(PR)、催乳素、前列腺分泌蛋白PSP94、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺蛋白(Prostatin)、蛋白激酶C结合蛋白1、p-选择蛋白、吡咯啉-5-羧酸还原酶1、G蛋白信号转导调节剂12 (Regulator of G protein signaling 12)、内质网钙结合蛋白 (Reticulocalbin)、S-100 α链、s-腺苷高半胱氨酸水解酶、血清淀粉样蛋白A蛋白(Serum amyloid A protein)、7个跨膜结构域蛋白(Seven transmembrance domain protein)、性别决定因子 Y-box-4、唾液酸化 SSEA-1（Sialyl SSEA-1）、小诱导细胞因子A18(CCL18, MlP-4)、小诱导细胞因子A2(CCL2)、小诱导细胞因子A3(CCL3)(巨噬细胞炎性蛋白1-α、小诱导细胞因子B5(CXCL5)、生长抑素、生长激素生长因子、生长因子、鳞状细胞癌抗原1、鳞状细胞癌抗原2、类固醇激素受体、存活素、多配体蛋白聚糖-1、核突触蛋白-γ（Synuclein gamma）、四连接素、四跨膜蛋白9（Tetraspanin 9）、TGF-α、胸苷磷酸化酶(TP)、甲状腺球蛋白(Tg)、组织金属蛋白酶2抑制剂、组织特异性移植抗原P35B、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、拓扑异构酶II、转铁蛋白受体p90 CD71（Transferring receptor p90 CD71）、转化生长因子α（Transforming growth factor alpha）、转化生长因子β1、外线粒体膜的易位酶、转甲状腺素蛋白（Transthyretin）、转甲状腺素蛋白(realbumin)片段、滋养层糖蛋白、原肌球蛋白1α链(α-原肌球蛋白)、胰蛋白酶、微管蛋白β2、微管蛋白β3、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员5(CD154)、肿瘤坏死因子(配体)超家族成员6(Fas配体)、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体p75/p55、肿瘤坏死因子受体超家族成员6(fas)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白1、肿瘤蛋白p53、泛素结合酶E2C(泛素cong enz)、尿血管抑素(uAS)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管平滑肌生长促进因子(VSGPIF-Spondin)、VEGF(165)b、V-erb-b2、维生素D结合蛋白、维生素K依赖蛋白C、玻连蛋白、血管假性血友病因子、Wilms 肿瘤1(WT-1)、WW结构域结合蛋白11、X box 结合蛋白-1和YKL-40。见Polanski等人，Biomark Insights,1:1(2006)；Cherneva等人，Biotechnol.& Biotechnol.EQ.21/2007/2：145(2007)；Alaoui-Jamali等人，J.Zhejiang Science B7：411(2006)；Basil等人，Cancer Res.66:2953(2006)；Suh等人，Expert Rev.Mol.Diagn.10:1069(2010)；和Diamandis，E.P.，Molecular and Cellular Proteomics 3:367(2004)。 [0206] 可以利用本发明的装置、系统和方法检测的其它分析物包括Tietz的教科书《Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics》,Burtis、Ashwood和Bruns，ISBN 0721601898，Elsevier，第4版(2006)中所提到的那些。 [0207] 本发明的方法、试剂盒、药筒和系统可被构建成用于检测预定的分析物组合名单，该名单可用于了解受试者的医学状况。例如，组合名单可包括：对病原体、用于治疗疑似病原体（诸病原体）的治疗剂和监测治疗药理过程(效力或者药代动力学)的潜在生物标记的检测，或者监测病原体或病原体副产物的存在。此外，可以设想如下的疾病治疗名单，其被构建成用于检测：疾病或疾病生物标记、用于治疗疑似疾病的治疗药物的水平或浓度、监测治疗药理过程(效力或者药代动力学)的潜在生物标记、以及疾病或者治疗效果的一般化学生物标记或其它生理学标记。因此，分析物检测的名单可以用于告知并形成合适的医学决策。 [0208] 例如，本发明的系统和方法可以用于监测在同种异体移植后的免疫妥协的受试者。在接受固体器官、骨髓、造血干细胞或其它同种异体捐赠的移植受试者中，需要监测免疫状态、器官功能，并且若有需要，需要快速并准确地确定机会感染。例如，需要从来自受试者的相同血样中监测肌酸酐和他克莫司水平，因为对药物浓度和肾功能的监测可以帮助并指导医生进行最佳移植后治疗。优化治疗是防止排斥反应但也确保免疫功能对抗机会感染并且总体导致受试者对免疫抑制治疗依从性增加的严密平衡。大部分的移植接受者死于移植排斥、移植物抗宿主病、或者机会感染。在前两种情况下，免疫抑制剂可以防止或抑制排斥反应。然而，如果受试者存在潜在感染，那么临床控制是挑战性的。作为一个具体例子，表现出未知起因发热的心、肺移植受试者进入卫生保健设施。给受试者开始使用广谱抗生素直到获知培养结果。如果病情恶化且培养显示有特定感染(例如念珠菌属)，则可以给已知受试者施用特定的抗真菌剂氟康唑。然而，此抗真菌药可改变给予几乎所有同种异体移植接受者的免疫抑制剂(他克莫司)的水平。在检测他克莫司和肌酸酐水平后，医生停止使用他克莫司，相信氟康唑将战胜感染并且是以快速的方式。在此方案下，如果该念珠菌属物种对氟康唑耐药则受试者病情会恶化，然后受试者开始使用适当的抗真菌剂。然而，因为他克莫司会被停用，所以未对免疫抑制治疗进行控制并且受试者会变得对任何其它治疗无反应并可继而死亡。因此，如果存在同时监测肌酸酐(肾功能)和他克莫司血液水平的检测并且准确地确认机会感染，那么可挽救上述受试者。 [0209] 本发明的系统和方法可以包括：多重无样品制备的单一检测方法；确定药物水平、毒性或不良反应决定因素的自动系统；并且病原体鉴别在免疫妥协的受试者设置中具有重要作用。例如，含有：(1)具有修饰在其表面上的肌酸酐特异性抗体的磁性粒子、(2)具有在其表面上的他克莫司特异性抗体的磁性粒子和(3)具有用于鉴别病原体种类的特定核酸探针的磁性粒子的具有入口或孔的药筒可以用于快速确定和提供给定移植受试者的临床控制值。可在这种受试者中以及有感染危险的任何其它患者群体中监测的机会感染包括但不限于：真菌；念珠菌属(耐药和非耐药株)；革兰氏阴性细菌感染(例如，大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯氏菌/奥克西托克雷白杆菌、或者绿脓杆菌)；以及革兰氏阳性细菌感染(例如，葡萄球菌属物种：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌)。可以监测的其它机会感染包括：凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌属物种、梭形杆菌属物种和摩氏摩根菌、以及病毒生物体，例如 CMV、BKV、EBC、HHV-6、HIV、HCV、HBV和HAV。 [0210] 本发明的系统和方法也可以作为多重诊断检测中的一部分而用于监测和诊断癌症患者。一个特定类型的癌症(结肠直肠癌)已显示在特定实体肿瘤的个体化医学治疗中的积极希望。遗传药理学标志可用于优化对结肠直肠癌和其它癌症的治疗。显著的个体遗传变异存在于5-FU、卡培他滨、伊立替康和奥沙利铂的药物代谢中，该遗传变异影响这些药物的毒性和效力。遗传标记的例子包括UGT1A1*28，其导致SN-38(伊立替康的活性代谢产物)的还原的缀合，从而导致不良反应（特别是中性粒细胞减少症）发生率增加。在较小的程度上，由DPYD*2A预测增加的5-FU毒性。胸苷酸合成酶增强子区域中的不定数串列重复区的多态性，连同单一核苷酸多态性C>G可以预期对5-FU的较差响应。奥沙利铂的效力受DNA修复系统的成分(例如ERCC1和XRCC1)的多态性的影响。内皮生长因子受体的多态性变化可能预测西妥昔单抗的效力。此外，免疫球蛋白G片段C受体中的多态性可减小西妥昔单抗的抗体依赖性细胞介导细胞毒作用。VEGF基因和缺氧诱导因子1α基因中的多态性变化也被认为导致治疗结果的差异。因此，对受试者中这种多态性的鉴别可用于帮助医生做出治疗决策。例如，已开发出基于PCR的遗传检测来协助医生对患有非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(CRC)和胃癌的受试者做出治疗性的治疗决策。ERCC1、TS、EGFR、RRM1、VEGFR2、HER2的表达以及对KRAS、EGFR和BRAF中的突变的检测可帮助医生确定最佳治疗选择。然而，这些PCR检测不能在现场进行，因此必须将样品递送到不在现场的实验室。经常对这些实体肿瘤进行活组织检查，并且制备FFPE(福尔马林固定的石蜡包埋的(组织))样品。本发明的系统和方法可以在无需5-7天周转时间的情况下使用，所述5-7天周转时间用以获得数据和信息以及使用现有方法所需的固定的样品。本发明的系统和方法可以提供用于在无需样品制备情况下分析样品的单一平台，其用于多种分析物类型，如在癌症的化学治疗药中，基因分型、毒性和效力标志可以彻底改变个体化医疗的实践并且提供快速、正确的诊断检测。 [0211] 本发明的系统和方法也可用于监测和诊断神经学疾病，例如痴呆(以前未受损的人中的认知能力丧失)以及其它形式的认知缺损。可以将痴呆概括地分类成两种类型：皮质性痴呆和皮质下痴呆。皮质性痴呆包括：阿尔茨海默氏病，血管性痴呆(也称为多发性梗塞性痴呆)，包括宾斯旺格病，具有路易小体的痴呆(DLB)，酒精引起的持久性痴呆，科尔萨科夫综合征，韦尼克脑病，额颞叶变性(FTLD)，包括皮克病，额颞叶性痴呆(或者额叶变异型额颞叶变性（frontal variant FTLD）)，词义性痴呆(或者临时变异型额颞叶变性（temporal variant FTLD）)，进行性非流畅性失语，克罗伊茨费尔特-雅各布病，拳击员痴呆，脑底异常血管网病，thebestia(经常被误认为癌症)，后皮质萎缩或者Benson氏综合征。皮质下痴呆包括由于亨廷顿病导致的痴呆、由于甲状腺机能减退导致的痴呆、由于帕金森病导致的痴呆、由于维生素B1缺乏导致的痴呆、由于维生素B12缺乏导致的痴呆、由于叶酸缺乏导致的痴呆、由于梅毒导致的痴呆、由于硬膜下血肿导致的痴呆、由于高血钙症导致的痴呆、由于低血糖症导致的痴呆、AIDS痴呆综合征、假性痴呆(具有明显认知症状的严重抑郁发作)、物质引起的持久性痴呆(与精神活性药使用和以前的苦艾酒中毒有关)、由于多发病因导致的痴呆、由于其它一般医学状况导致的痴呆(即，终末期肾功能衰竭、心血管疾病等)、或者未具体规定的痴呆(用于不符合特定标准的情况下)。阿尔茨海默氏病是痴呆的常见形式。因为痴呆根本地与许多神经变性疾病相关，所以在单一平台中检测作为疾病生物标记的这些蛋白质，连同药物或药物代谢产物水平的能力将协助医生调整剂量、改变方案、或者总体地监测疾病的发展。这些检测目前是在远离受试者和护理者的场所场外地进行。因此，为了具有在相同检测系统中监测药物水平和生物标记的能力，现场检测在缓解和治疗疾病方面将提供巨大的优点。本发明的方法可以是多重、无样品制备的单一检测方法、自动化系统，用于确定药物水平、毒性或不良反应决定因素以及疾病发展的潜在生物标记。例如，含有(1)具有修饰在其表面上的蛋白质痴呆特异性生物标记抗体的磁性粒子、(2)具有在其表面上的特异性抗体的磁性粒子以及(3)具有用于鉴别蛋白质表达水平的核酸特异性探针的磁性粒子的具有入口或孔的药筒可以用于快速地确定并提供给定的痴呆受试者的临床控制值。 [0212] 本发明的系统和方法也可以用于在多重、自动化无样品制备系统中监测和诊断传染病。可利用本发明的装置、系统和方法检测的病原体的例子包括例如：念珠菌属(耐药和非耐药株)，例如白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌；烟曲霉菌；大肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯氏菌/奥克西托克雷白杆菌、绿脓杆菌；葡萄球菌属物种(例如，金黄色葡萄球菌或者肺炎链球菌)；粪肠球菌、屎肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌物种、棒状杆菌属物种、梭形杆菌属物种、摩氏摩根菌、杰氏肺囊虫（以前称为卡氏肺囊虫）、F. hominis、化脓性链球菌、绿脓杆菌、多瘤病毒JC多瘤病毒(引起进行性多灶性脑白质病的病毒)、鲍氏不动杆菌、刚地弓形体、巨细胞病毒、曲霉属物种、卡波西氏肉瘤、隐孢子虫属、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌，以及其它细菌、酵母菌、真菌、病毒、蛋白酶传染性因子、霉菌、放线菌、原生动物、寄生虫、原生生物和蠕虫感染性生物体。 [0213] 本发明的系统和方法可以用于鉴别和监测受试者中疾病的发病机制，以便选择治疗干预、以及监测所选择治疗的有效性。例如，对于病毒感染或者处于病毒感染危险的患者，本发明的系统和方法可以用于确定感染性病毒、病毒载量，以及监测白细胞计数和/或指示感染状态的生物标记。病毒的鉴别可以用于选择合适的治疗。也可以通过监测治疗干预(例如，特定的抗病毒剂)来使治疗方案与抗病毒剂的循环浓度和病毒载量相关联，以确保患者对治疗有反应。 [0214] 本发明的系统和方法可以用于监测受试者的病毒感染，例如利用病毒名单，所述病毒名单被构建成用于检测巨细胞病毒(CMV)、EB病毒、BK病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、HSV1、HSV2、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒；流感病毒A、流感病毒A亚型H1、流感病毒A 亚型 H3、流感病毒B、人疱疹病毒6、人疱疹病毒8、人类偏肺病毒(hMPV)、鼻病毒、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3和腺病毒。本发明的方法可以用于监测病毒感染受试者的合适的治疗(例如，阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安泼那韦、安普利近、阿比朵尔（Arbidol）、阿扎那韦（Atazanavir）、Atripla、波西普韦(Boceprevir)、西多福韦、可比韦(Combivir)、地瑞拉韦（Darunavir）、地拉韦啶、二脱氧肌苷、二十二烷醇、依度尿苷(Edoxudine)、依非韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地（Enfuvirtide）、恩替卡韦、法昔洛韦、福米韦生、福沙那韦(Fosamprenavir)、膦甲酸、Fosfonet、更昔洛韦、伊巴他滨(Ibacitabine)、异丙肌苷(Imunovir)、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素α、干扰素β、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗（Maraviroc）、吗啉胍、美替沙腙、那非那韦、奈韦拉平、Nexavir、核苷类似物、奥塞米韦(达菲（Tamiflu）)、PEG干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦（Peramivir）、普来可那立(Pleconaril)、鬼臼毒素、雷特格韦(Raltegravir)、反转录酶抑制剂、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、Pyramidine、沙奎那韦、司他夫定、茶树油、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、替拉那韦(Tipranavir)、曲氟尿苷、三协唯(Trizivir)、曲金刚胺、特鲁瓦达(Truvada)、伐昔洛韦(Valtrex)、缬更昔洛韦、Vicriviroc、阿糖腺苷、盐酸塔利韦林(Viramidine)、扎西他滨、扎那米韦(Relenza)、或者齐多夫定)；以及监测给受试者施用的治疗剂的循环浓度。 [0215] 本发明的系统和方法也可以用于监测HIV/AIDS患者。当临床医生怀疑急性感染(例如，在报告有与急性反转录病毒综合症的症状和体征相关的最近危险行为的受试者中)时，通常进行HIV RNA的检测。通过使用敏感扩增检测(PCR、bDNA或者NASBA)在血浆中检测的高水平的HIV RNA，连同阴性或不确定的HIV抗体检测，支持急性HIV感染的诊断。在单一平台诊断方法中监测HIV/AIDS受试者的病毒载量、药物水平、CD4细胞计数和毒性类型将会为受试者提供显著的优点。本发明的系统和方法可以用于多重、无样品制备、单一检测方法和自动系统，用以确定药物水平、毒性或不良反应决定因素以及疾病发展的潜在生物标记。例如，含有(1)具有修饰在其表面上的CD4细胞特异性抗体的磁性粒子、(2)在其表面上具有毒性生物标记特异性抗体的磁性粒子、以及(3)具有用于鉴别病毒载量水平的核酸特异性探针的磁性粒子的具有入口或孔的药筒可以用于快速地确定并提供给定HIV/AIDS受试者的临床控制值。 [0216] 本发明的系统和方法也可以用于监测和诊断受试者中的免疫疾病(例如，克罗恩病、回肠炎、肠炎、炎性肠病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、以及非胃肠道免疫疾病)。相对近来的基因工程试剂的开发有可能根本地改变免疫疾病的治疗，并且英夫利昔单抗（Remicade）(也称为英夫利昔单抗（Infliximab），一种抗TNF抗体)被引入作为具有高效力、快速起效、长久疗效和提高的耐受性的新型治疗类型。然而，这些试剂是昂贵的，并且至少三分之一的适应症患者未能显示任何有用的反应。因此，显然重要的是发现预测将会有反应的患者以及预期复发的手段。TNF多态性也似乎会影响炎性肠病(IBD)的肠外表现的性质和频率。若干大型对照试验表明英夫利昔单抗在中等至严重克罗恩病患者以及造瘘克罗恩病的治疗中起作用。小型研究已显示对英夫利昔单抗的较差反应与增加的活化的NF-κB粘膜水平、TNFR2(基因型Arg196Arg)的外显子6的多态性的同合子性、核周抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的阳性、以及增加数量的产生干扰素-γ和TNF-α的活化固有层单核细胞的存在之间的可能的相关性。因此，在单一平台诊断方法中监测克罗恩病患者的TNF-α和毒性类型将会具有显著的优点。本发明的方法可以是多重、无样品制备、单一检测方法及自动系统，用以确定药物水平、毒性或不良反应决定因素、以及疾病发展的潜在生物标记。例如，含有(1)具有修饰在其表面上的抗-TNF-α特异性抗体的磁性粒子、(2)在其表面上具有毒性生物标记特异性抗体的磁性粒子、以及(3)具有用于鉴别疾病发展的标志的特异性探针的磁性粒子的具有入口或孔的药筒可用于快速地确定并提供给定克罗恩病或者IBD患者的临床控制值。 [0217] 本发明的系统和方法也可用于在多重自动无样品制备系统中监测和诊断传染病和炎症。这种系统和方法可以用于监测例如菌血症、脓毒症和/或系统性炎性反应综合征(SIRS)。早期诊断是临床重要的，因为此类型的感染如果未得到治疗则会导致器官功能障碍、灌注不足、低血压、难治性(脓毒性)休克/SIRS休克和/或多器官功能障碍综合征(MODS)。就典型的患者而言，许多细菌或真菌感染是进入医疗机构时培养的结果来并且被称为医院相关感染(HAI)，也称为医院的医院获得性感染或院内感染。感染免疫妥协患者的最常见细菌类型是革兰氏阳性细菌MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性细菌螺杆菌。虽然存在可以治疗由革兰氏阳性MRSA所引起疾病的抗菌药物，但目前存在较少的针对不动杆菌属的有效药物。血流感染中的常见病原体是：凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌。另外，白色念珠菌以及肺炎的病原体(例如绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌)导致许多感染。泌尿道感染的病原体包括：大肠杆菌、白色念珠菌和绿脓杆菌。此外，革兰氏阴性肠道生物体在泌尿道感染中常见。手术部位感染包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌。传染原可选自但不限于：与脓毒症相关的病原体，例如鲍氏不动杆菌、烟曲霉菌、脆弱拟杆菌、脆弱拟杆菌、blaSHV、洋葱博克霍尔德菌、空肠弯曲杆菌/结肠弯曲杆菌、吉利蒙念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、鲁希特念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠杆菌科、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、金氏金菌、奥克西托克雷白杆菌、肺炎克雷伯氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、Mec A基因(MRSA)、Morganella morgana、脑膜炎奈瑟菌、非脑膜炎奈瑟菌的奈瑟菌属物种、颊普雷沃菌、中间普氏菌、产黑色素普雷沃菌、痤疮丙酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、肠道沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单孢菌、腐生性葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、嗜麦芽窄食单孢菌、无乳链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、缓症链球菌、变形链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌和血链球菌；或者本文中所述的任何其它传染原。在某些情况下，该方法和系统将被设计成确定传染原是否携带是万古霉素耐药的特征的Van A基因或Van B基因；甲氧西林耐药的mecA、对β-内酰胺类抗生素更具一般耐药性的NDM-1和ESBL。 [0218] 脓毒症或者脓毒性休克是特征为全身炎症状态(全身炎症反应综合征或SIRS)并且存在已知的或者怀疑的感染的严重医学状况。脓毒症被定义为在感染存在下的SIRS，脓毒性休克被定义为具有难治性动脉压过压或灌注不足异常(虽然有足够的液体复苏)的脓毒症，严重脓毒症被定义为具有器官功能障碍、灌注不足或低血压的脓毒症。很多研究已检查了合并目前可用标志的价值，因此该平台被描述成能够独立地或同时测定多种因子的水平，所述因子例如：GRO-α、高迁移率族蛋白B1(HMBG-1)、IL-1受体、IL-1受体拮抗剂、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、骨桥蛋白、RANTES(受激活调节、正常T细胞表达和分泌；或者CCL5)、TNF-α、C-反应蛋白(CRP)、CD64和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。此外，该系统和方法可被设计成监测表征脓毒症的某些蛋白质，例如腺苷脱氨酶结合蛋白(ABP-26)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、脂多糖结合蛋白(LBP)和原降钙素(PCT)。因此，此平台减少经验方案、和/或可以或可以不靶向特定病原体和/或给定患者的潜在系统功能障碍的非特异性/一般抗菌剂的使用。此平台能够进行快速且正确的诊断，这意味着有效治疗，从而为医生决策提供关键信息并且降低发病率和死亡率。 [0219] 为了确定患者是否患有脓毒症，必须辨别病原体的存在。为了最有效地治疗患者，重要的是最早地开始合适的治疗。脓毒症的抗菌剂治疗和其它治疗依赖于在多个水平下对病原体的分类，包括将病原体鉴别为(1)细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它；(2)革兰氏阳性、革兰氏阴性、酵母菌或霉菌；(3)种；和(4)敏感性。 [0220] 这些特异性水平中的各水平缩短开始合适治疗的时间，该路线下面的各步骤将使治疗剂的范围缩小至最具特异性的组。在没有绝对敏感性数据的情况下，护理的经验方法依赖于关于病原体的可获得信息(在任何水平下)以及另一医疗保健单位的医院中的病原体频率和敏感性倾向的态样。因此，某些类型的病原体经常被认为是致病源，直到存在更多的数据来改进病原体与治疗的配对。具体而言，这些靶属于ESKAPE范畴(是一系列耐药病原体)和SPACE范畴(要求患者隔离的一组高毒力病原体)。 [0221] 除了鉴别这些多种样品类型(血液、组织、尿等)中的病原体以外，另一种将有症状患者(例如患有全身炎性综合症或SIRS的患者)与脓毒症患者加以区别的方法是通过使用单独地或者利用指数建立关联性的生物标记来鉴别感染患者。在由于抗菌治疗干扰诊断而感染未被检测的情况下，治疗的免疫系统控制，或者可以是多种类型分析物(细胞因子、代谢产物、DNA、RNA/基因表达等)的这些生物标记将指示感染并因此指示脓毒症。 [0222] 为了产生感染的存在和一些水平的种鉴别所需要的诊断信息，一个名单可以是：(i)革兰氏阳性聚簇(例如，金黄色葡萄球菌和CoNS(凝固酶阴性葡萄球菌))；(ii) 革兰氏阳性链/对(例如，链球菌属物种、缓症链球菌、肺炎属物种、无乳属（agalactie）物种、化脓属（pyogenes）物种、肠球菌属物种(屎肠球菌、粪肠球菌)；(iii)革兰氏阴性杆菌(例如，大肠杆菌、变形杆菌属物种、克雷伯菌属物种、沙雷氏菌属物种、不动杆菌属物种、寡养单胞菌属物种)；(iv)SPACE(例如，沙雷氏菌属物种、假单胞菌属物种、不动杆菌属物种、柠檬酸杆菌属物种、肠道细菌属物种)；(v)假单胞菌属(例如、假单胞菌属物种)；(vi)ESKAPE(屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、克雷伯菌属物种、不动杆菌属物种、假单胞菌属物种、肠道细菌属物种)；以及(vii)全细菌(所有的细菌物种)。 [0223] 此名单应当用于全范围的真菌检测。这些类型代表了用合适治疗药进行有效干预所需要的信息，考虑到各医疗保健单位将具有基于对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等的阳性反应的通过经验获得的方法。在各类型中所鉴别的种代表符合各标题但并非全面的那些。此外，包含全细菌标志来涵盖任何不被用于各种类型的诊断方法所涵盖的种。此外，尽管不完全，但如果如上所述地包含，各结果的组合也将给出这些种的指示。基于类型的交叉参考的阳性和阴性允许一种排除途径的方法，从而有概率地鉴别一些种。 [0224] 本发明的系统和方法也可以用于监测和诊断受试者的心脏病，例如心肌梗塞。心肌标志物或心肌酶是从受损心肌细胞中泄漏出的蛋白质，用于评估心肌损伤。心肌标志物包括但不限于：酶SGOT、LDH、肌酸激酶的MB亚型和心肌肌钙蛋白(T和I)。因此，在急性情况下，在单一平台诊断方法中除了药物治疗和毒性类型外，监测肌钙蛋白I和T以及心肌缺血的潜在的其它生物标记将会具有显著优点。本发明的系统和方法可用于提供多重、无样品制备、单一检测方法及自动系统，用于确定药物水平、毒性或不良反应决定因素、以及疾病发展的潜在生物标记。例如，含有(1)具有修饰在其表面上的抗-肌钙蛋白I或肌钙蛋白T特异性抗体的磁性粒子、(2)在其表面上具有毒性生物标记特异性抗体的磁性粒子和(3)具有用于鉴别疾病发展标志的特异性探针的磁性粒子的具有入口或孔的药筒可以用于快速地确定和提供给定心肌梗塞患者的临床控制值。 [0225] 一个或多个多孔药筒可以被构建成用于本发明的系统和方法；该药筒可以被制备成具有至少一个来自患者的全血样品；用于检测各待检测分析物(一种或多种小分子；一种或多种小分子的一种或多种代谢产物；代谢生物标记，例如肝功能名单中所描述的那些)的磁性粒子；以及稀释和洗涤缓冲液。肝功能检测是在患者的血清或血浆样品上进行，并且临床生化试验室血液分析提供有关患者肝脏状况的关键数据。“肝功能名单”是一种血液检测，其中低或高水平的一种或多种酶可表明有肝病或肝损伤。例如，肝功能名单可以包括以下的分析物检测测定中的一种或多种：一种或多种小分子；一种或多种小分子的一种或多种代谢产物；生物、代谢生物标记；基因分型\基因表达谱；和蛋白质组学分析。 [0226] 肝功能名单可以包括对患者或受试者生物样品中的一种或多种下列蛋白质的分析：(1)白蛋白(肝脏总蛋白的主要成分；而剩余部分被称为球蛋白；白蛋白必须以3.9至5.0 g/dL存在，低白蛋白血症表明营养不良、较低的蛋白质分解代谢、硬化或肾病综合症)；（2)天冬氨酸转氨酶(AST)(也称为血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶或者天冬氨酸氨基转移酶，是一种肝实质细胞中的酶并且通常为10至34 IU/L；升高的水平是急性肝损伤的指示物)；(3)丙氨酸转氨酶(ALT)(也称为谷氨酸丙酮酸转氨酶或者丙氨酸氨基转移酶，是一种以8至37 IU/L之间的水平存在于肝细胞中的酶；升高的水平是病毒性肝炎急性肝损伤或者对乙酰氨基酚超剂量的指示物；AST与ALT的比率用于区分肝损伤的各原因)；(4)碱性磷酸酶(ALP)(存在于给肝脏胆管作衬里的细胞中的酶；正常范围为44至147 IU/L并且在浸润型肝病、肝内胆汁淤积或大的胆管梗阻情况下水平升高)；(5)γ-谷氨酰转肽酶(GGT)(是比ALP更敏感的胆汁阻塞性损伤的标志，对肝脏是非常特异性的；标准范围为0至51 IU/L；急性和慢性酒精中毒均可升高GGT；可以利用GGT来检测孤立的ALP升高的原因)；(6)总胆红素(TBIL)(总胆红素的升高可以导致黄疸，并且可以归因于硬化、病毒性肝炎、溶血性贫血、或者内出血)；(7)直接胆红素；(8)凝血酶原时间(PTT)(肝细胞损伤和胆汁流梗阻可以导致凝血时间的变化)；(9)α-甲胎蛋白检测(水平升高表示患有肝炎或癌症)；(10)乳酸脱氢酶；以及(11)线粒体抗体(如果存在，则可表示有慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、或者其它自体免疫疾病)。可以利用本发明的系统和方法来分析肝功能名单中的上述蛋白质。 [0227] 另一个肝功能名单可包括：细胞色素P450酶的基因分型。细胞色素P450基因分型检测是用于确定患者或受试者代谢药物的状况如何。可利用细胞色素P450检测的结果将个体划分成四种主要类型： [0228] (i)弱代谢者。对某些药物的代谢比正常水平慢，药物将具有较长的半衰期并且可能增加引起不良反应的可能性。 [0229] (ii)正常代谢者。药物将以平均速率被代谢，因此是存在由治疗所带来益处以及与不代谢这些特定药物的其它个体相比有较少不良反应的指示。 [0230] (iii)中速代谢者。药物可以或可以不以平均速率被代谢。涉及药物代谢的至少一个基因被怀疑功能异常。然后存在不同地代谢某些药物的倾向。 [0231] (iv)超快速代谢者。药物比平均水平更快且更有效地代谢。因为代谢率高于平均值，一些药物比正常水平更快被活化且更快被排出，并且该药物可能不具有期望的效力。 [0232] 目前，对人群中负责这些酶的基因所进行的基因分型已经显示这些酶中的多态性差异可以导致一些药物的效力和毒性的变化。基因分型需要代表患者或受试者的基因组的细胞样品并且该分析的目的是在这些临床上重要的基因中确定遗传差异。 [0233] 可能的肝代谢酶可以是肝功能名单的一部分，包括但不限于：CYP2C19、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP1A2、NAT2、DPD、UGT1A1、5HTT。 [0234] 本发明的特征在于一种对来自患者的单一血样的多重分析(例如，单次血液抽取、或者本文中所述的任何其它类型的患者样品)，用以确定(a)肝酶状态以及(b)关键代谢酶的基因型，然后能够利用本发明的系统和方法来设计药物治疗方案以便获得最佳治疗护理。 [0235] 本发明的系统和方法可以包括一个或多个多孔试药筒,其被制备成具有至少一种来自患者的全血样品；用于检测各待检测的分析物的磁性粒子 ；分析物抗体；多价结合剂；和/或用于如上所述的多重检测的稀释和洗涤缓冲液。 [0236] 肾毒性 [0237] 肾毒性是使用外源化合物的常见不良反应，肾毒性早期阶段的早期快速检测可帮助做出医疗决策。对肾毒性检测的早期报道提示可以监测增加的某些基因的mRNA表达。然而，其它报道提示可在尿中检测肾毒性的标志。这些标志包括：kim-1、脂质运载蛋白-2、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、timp-1、丛生蛋白、骨桥蛋白、波形蛋白和血红素加氧酶1(HO-1)。更广泛地，对尿中DNA、重金属离子或BUN水平的检测可以是有用的临床信息。因此，本发明的方法和效用还包括检测这些肾毒性的标志的能力。任选地，肝功能名单也可包括一个或两个肾毒性的生物标记，反之亦然。 [0238] 从复杂样品中进行对核酸的扩增和检测 [0239] 本发明的系统和方法可以包括起始于复杂样品而进行的基于扩增的核酸检测测定(例如，用于诊断、法庭和环境分析)。 [0240] 样品制备也必须去除复杂样品(例如，体液、土壤、或者其它复杂环境)中发现的一般PCR抑制剂或提供对其的抗性。普通的抑制剂包括在Wilson,Appl.Environ.Microbiol.,63:3741(1997)等中所鉴别的那些。抑制剂通常是通过防止细胞裂解、降解或掩蔽靶核酸、和/或聚合酶活性的抑制而起作用。在反应中0.1%血液的存在抑制最常使用的聚合酶(Taq)。新近，已通过工程改造出对血液和土壤中发现的常见抑制剂(例如，血红蛋白和/或腐殖酸)具有抗性的突变型Taq聚合酶(Kermekchiev等人,Nucl.Acid.Res.,37(5)：e40,(2009))。制造商的介绍表明这些突变能够从高达20%的血液中直接扩增。虽然存在因突变所造成的抗性，但由于在血样存在下所观察的荧光猝灭的原因，准确的实时PCR检测是复杂的(Kermekchiev等人，Nucl.Acid.Res.,37：e40(2009))。 [0241] DNA或cDNA的聚合酶链反应扩增是一种经过考验且可信任的方法；然而，如上所述，聚合酶被粗样品中含有的试剂(包括但不限于常用的抗凝血剂和血红蛋白)所抑制。近来，已通过工程改造出对血液和土壤中发现的常见抑制剂具有抗性的突变型Taq聚合酶。目TM前市售的聚合酶，例如HemoKlenTaq (New England BioLabs, Inc.,Ipswich,MA)以及OmniTaqTM和OmniKlenTaqTM(DNA Polymerase Technology,Inc.,St.Louis,MO)是突变型(例如，N-末端截短和/或点突变)Taq聚合酶，取决于产物和反应条件，它们能够在高达10%、 20%或25%全血的存在下扩增DNA（见，例如，Kermekchiev等人 Nucl.Acid Res.31:6139(2003)；和Kermekchiev等人，Nucl.Acid.Res.,37:e40(2009)；并且见美国专利第7,462, 475号)。此外，Phusion®血液直接PCR试剂盒(Finnzymes Oy，Espoo,芬兰)，包括通过工程改造而包含双链DNA结合结构域的独特的融合DNA聚合酶，其允许在通常对常规聚合酶(例如Taq或Pfu)是抑制性的条件下进行扩增，并且允许在某些反应条件下在高达大约40%的全血存在下进行DNA扩增。见Wang等人,Nuc.Acids Res.32:1197(2004)；并且参见美国专利第 5,352,778号和5,500,363号。此外，Kapa Blood PCR Mixes(Kapa Biosystems,Woburn,MA)，提供基因工程改造的DNA聚合酶，该酶允许在某些反应条件下在高达大约20%的反应体积下进行对全血的直接扩增。尽管有这些突破，但对利用现有方法无法对所产生的扩增子进行直接光学检测，因为荧光、吸光度和其它基于光的方法产生被血液存在所淬灭的信号。 参见Kermekchiev等人，Nucl.Acid. Res.,37:e40(2009)。 [0242] 我们已发现可以在扩增反应中利用大约5%、大约10%、大约20%、大约 25%、大约30%、大约 25%、大约40%和大约45%或更多的全血来直接地扩增复杂样品(例如全血)，并且发现在添加结合到与靶核酸序列互补的寡核苷酸的缀合的磁性粒子后，可以利用磁共振(MR)弛豫测量从扩增反应中直接地检测所形成的扩增子。可替换地，可在扩增前把磁性粒子添加到样品中。因此，提供将核酸扩增用于复杂脏样品的方法，将所形成的扩增子杂交到顺磁性粒子，接着利用基于磁性粒子的检测系统对杂交的磁性粒子缀合物和靶扩增子进行直接检测。在具体实施方案中，通过MR弛豫测量(例如，T2、T1、T1/T2混合、T2*等)而对杂交的磁性粒子缀合物和扩增子进行直接检测。还提供是动态的方法，从而对样品内的初始核酸拷贝数进行定量(例如，以预定循环数进行采样和核酸检测，内源性内部对照核酸的比较，使用外源性掺料的同源竞争性对照核酸)。 [0243] 本文中所使用术语“扩增”或者其派生词表示在复制靶核酸或模板核酸由此增加所选择核酸序列的拷贝数的领域内为已知的一种或多种方法。扩增可以是指数的扩增或者线性的扩增。靶核酸或模板核酸可以是DNA或RNA。以此方式扩增的序列构成“扩增区”或“扩增子”。 本领域技术人员可以容易地设计引物探针从而靶向特定的模板核酸序列。在某些优选实施方案中，所形成扩增子较短从而允许快速的循环和生成拷贝。扩增子的大小可以根据需要而变化，以便提供将靶核酸与非靶核酸加以区别的能力。例如，扩增子的长度可以小于大约1,000个核苷酸。理想地，扩增子的长度为100至500个(例如，100至200、150至250、300至400、350至450、或者400至500个)核苷酸。 [0244] 虽然下文中所描述的示例性方法涉及利用聚合酶链反应(“PCR”)的扩增，但许多其它方法在核酸扩增的领域是已知的(例如，等温法、滚环法等)。本领域技术人员将理解的是，这些其它方法可用来代替PCR法，或者与PCR法一起使用。见例如Saiki“Amplification of Genomic DNA”in PCR Protocols，Innis等人编辑，Academic Press,San Diego, Calif.,第13-20页(1990年)；Wharam等人，Nucleic Acids Res.29：E54(2001)；Hafner等人, Biotechniques,30:852(2001)。适用于本发明方法的其它扩增方法包括例如：聚合酶链反应(PCR)法、逆转录PCR(RT-PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)法、链置换扩增(SDA)法、环介导等温扩增(LAMP)法、等温和嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)法，以及智能扩增系统(SMAP)方法。这些方法以及其它方法在本领域是众所周知的，并且可以适于与所提供的检测扩增核酸的方法结合使用。 [0245] PCR法是一种用于制造特定模板DNA序列的许多拷贝的技术。PCR法公开于美国专利第4,683,195、4,683,202和4,965,188，其各自以参考的方式并入本文中。设计出与模板DNA互补的一组引物，并且在包含多个扩增循环的反应中利用DNA聚合酶来扩增被引物侧接的区域。各扩增循环包括初始变性、以及高达50次的退火循环、链延长(或延伸)和链分离(变性)。在反应的各周期中，各引物之间的DNA序列被拷贝。引物可以结合到拷贝的DNA以及原来的模板序列，因此拷贝的总数随时间推移而指数地增加。PCR可根据Whelan等人(Journal of Clinical Microbiology,33:556(1995))所描述的方法进行。各种改进的PCR法是可用的并且是在本领域是众所周知的。各种改进例如：“RT-PCR”法(其中在执行PCR前利用逆转录酶由RNA合成DNA)和“TaqMan PCR”法(其中利用荧光标记的TaqMan探针和Taq DNA聚合酶仅扩增和检测特异性等位基因)对于本领域技术人员是已知的。RT-PCR及其变体已经描述于，例如，在美国专利第5,804,383、5,407,800、5,322,770和5,310,652号中，以及本文中所述的参考文献中，它们以参考的方式并入本文；并且例如美国专利第5,210,015、5,876,930、5,538,848、6,030,787和6,258,569中描述了用于该方法的TaqMan PCR和相关试剂，其内容以参考的方式并入本文中。 [0246] LCR是一种类似于PCR的DNA扩增法，但是其使用四个引物而不是两个引物以及使用连接酶来连接或联接DNA的两个片段。扩增可在热循环仪中进行(例如，Abbott Labs的LCx,North Chicago,IL)。可以例如根据Moore等人的Journal of Clinical Microbiology 36：1028(1998)的方法来执行LCR。LCR法及其变体描述于例如欧洲专利申请公开第 EP0320308号和美国专利第5,427,930号，其各自以参考的方式并入本文中。 [0247] TAS法是用于特异性地扩增靶RNA的方法，其中转录物利用cDNA合成步骤和RNA转录步骤由模板RNA获得。在cDNA合成步骤中，使用二结构域寡核苷酸引物将由DNA依赖性RNA聚合酶所识别的序列(即，聚合酶结合序列或PBS)插入待扩增的靶或标志序列的cDNA拷贝下游。在第二步骤中，RNA聚合酶用于从cDNA模板来合成RNA的多个拷贝。使用TAS的扩增仅需要少数循环，因为DNA依赖性RNA转录可以产生cDNA模板的各拷贝的10-1000个拷贝。可以根据Kwoh等人的PNAS 86:1173(1989)的方法执行TAS。TAS法已在例如国际专利申请公开WO 1988/010315中有描述，其内容以参考的方式并入本文中。 [0248] 转录介导的扩增(TMA)是基于转录的等温扩增反应；该等温扩增反应利用RNA聚合酶的RNA转录以及逆转录酶的DNA转录，以由靶核酸产生RNA扩增子。TMA法的优点是每次扩增循环可以产生100至1000拷贝的扩增子，这与每次循环产生仅2个拷贝的PCR或LCR法相对。TMA已描述于例如美国专利第5,399,491号，该专利的内容以参考的方式并入本文中。NASBA是由RNA或DNA模板特异性地扩增靶RNA的、基于转录的方法。NASBA是一种用于在一个温度下在单个混合物中对核酸进行连续扩增的方法。使用具有与靶RNA相同序列的正向引物并且在3’侧具有与靶RNA互补的序列的反向引物以及识别在5’侧的T7 RNA聚合酶的启动子序列，利用DNA依赖性RNA聚合酶从模板RNA中获得转录物。使用作为模板的所得转录物进一步合成转录物。可以根据Heim等人，Nucleic Acids Res.，26:2250(1998)的方式来执行该方法。NASBA方法已描述于美国专利第5,130,238号，其以参考的方式并入本文中。 [0249] SDA法是等温核酸扩增法，其中通过由限制性内切酶产生的单链缺口作为下一次复制的模板利用被由链取代型DNA聚合酶（缺乏5’->3’外切核酸酶活性）所合成的链取代的DNA链扩增靶DNA。将含有限制性内切酶切位点的引物退火至模板，然后将扩增引物退火至5′相邻序列(形成切口)。在固定温度下启动扩增。利用限制性内切酶来切割新合成的DNA链，并且再次开始聚合酶扩增，置换新合成的链。SDA可以根据 Walker等人，PNAS,89:392(1992)的方法进行。美国专利第5,455,166和5,457,027号中已经描述了SDA方法，其内容以参考的方式并入本文中。 [0250] LAMP法是等温扩增法，其中始终在合成的DNA的3′端形成环，在环内对引物进行退火，并且等温地进行靶DNA的特异性扩增。LAMP可以根据Nagamine等人，Clinical Chemistry.47:1742(2001)中的方法进行。LAMP方法已经描述于美国专利第6,410,278、6, 974,670和7,175,985号，其各自以参考的方式并入本文中。 [0251] ICAN法是一种非等温（anisothermal）扩增方法，其中利用包含RNA-DNA的嵌合引物和具有链取代活性的DNA聚合酶和核糖核酸酶H，通过链取代反应、模板交换反应和缺口引入反应，等温地进行靶DNA的特异性扩增。可根据 Mukai等人,J.Biochem.142：273(2007)进行ICAN。美国专利第6,951,722号中已经描述了ICAN法，该专利以参考的方式并入本文中。 [0252] SMAP(MITANI)法是一种方法，其中利用包含两种类型的引物以及作为模板的DNA或RNA的引物组在等温条件下连续地合成靶核酸。引物组中所包含的第一引物包括，在其3′端区中，可与靶核酸序列的3′端区中的序列(A)杂交的序列(Ac′)，以及在上述序列(Ac′)的5′侧上，可与与存在于上述靶核酸序列中的上述序列(A)的5′侧上的序列(B)互补的序列(Bc)杂交的序列(B′)。第二引物在其3′端区包括可与与上述靶核酸序列互补的序列的3′端区中的序列(C)杂交的序列(Cc′)，以及包含在上述序列(Cc′)的5′侧的相同链上可与彼此杂交的两个核酸序列的环回序列（loopback sequence）(D-Dc′)。SMAP可以是根据 Mitani等人,Nat.Methods,4(3):257(2007)的方法而进行。SMAP法已描述于美国专利申请公开第 2006/0160084、2007/0190531和2009/0042197号，各公开的内容以参考的方式并入本文中。 [0253] 扩增反应可以被设计成产生特定类型的扩增产物，例如是双链；单链；具有3’或5’悬突的双链；或者具有在5’和3’端的化学配体的双链的核酸。扩增的PCR产物可以通过如下方法进行检测：(i)将扩增产物杂交到磁性粒子结合的互补寡核苷酸，其中使用两种不同的寡核苷酸来杂交到扩增产物，使得核酸起促进粒子团聚的粒子间连接区（interparticle tether）的作用；(ii)杂交介导的检测，其中扩增产物的DNA必须首先被变性；(iii)杂交介导的检测，其中将粒子杂交到扩增产物的5’和3’悬突；(iv)使粒子结合到扩增产物末端的化学或生物化学配体，例如结合到生物素官能化扩增产物的链霉亲和素官能化粒子。 [0254] 本发明的系统和方法可以用于执行实时PCR并且提供关于样品中所存在靶核酸的量的定量信息(见图25和实施例14)。文献(见例如：RT-PCR Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol.193.Joe O'Connell,ed. Totowa，NJ:Humana Press，2002,378页.ISBN 0-89603-875-0.)中提供了用于执行定量实时PCR的方法。实施例14描述了本发明方法在全血样品实时PCR分析中的用途。 [0255] 本发明的系统和方法可以用于利用用捕获探针修饰的纳米磁性粒子以及磁性分离在不透明样品(例如全血)中直接地执行实时PCR。采用实时PCR能够在PCR反应已经开始后不打开反应管的情况下进行靶核酸的定量分析。 [0256] 以前的工作显示在一些情况下PCR反应中粒子的存在可以抑制PCR。就这些抑制性粒子而言，设想了在PCR反应期间可以将这些粒子拉到到管的一侧(或者该容器内的其它位置)从而使其保持在溶液外。多种方法可用于使粒子释放回到悬浮液中从而允许它们杂交到PCR产物并且然后将它们从溶液中拉出。 [0257] 在某些实施方案中，本发明的特征在于与全血相容的酶，例如NEB Hemoklentaq、DNAP Omniklentaq、Kapa Biosystems全血酶、Thermo-Fisher Finnzymes Phusion 酶的使用。 [0258] 本发明的特征还在于定量不对称PCR。在本发明的任何实时PCR方法中，该方法可以包括以下步骤：(i)将全血标本抽样至制备的含有超顺磁性粒子的PCR反应混合液（PCR mastermix）；(ii)在第一次PCR循环之前，封闭管直到PCR循环完成；(iii)将该管加载到热循环仪上；(iv)执行“n”次循环的标准PCR热循环；(v)执行T2检测(确切持续时间和此变化的步骤取决于生物化学和下面所述的粒子设计方法)；以及(vi)重复步骤(iv)和(v)直到对于准确的定量分析初始靶浓度而言已经获得足够的T2读数。 [0259] 上述方法可用于任何以下类型的对本文中所述的聚集或解聚的检测，其包含： [0260] 。 [0261] 全血的多种杂质和成分可以是对聚合酶和引物退火为抑制性的。这些抑制剂可以导致假阳性和低灵敏度的产生。为降低假阳性和低灵敏度的产生，当在复杂样品中扩增和检测核酸时，理想的是使用不被全血样品抑制的热稳定聚合酶(见，例如美国专利第7,462,475号)和包括一个或多个内部PCR测定对照(见 Rosenstraus等人,J.Clin Microbiol.36: 191(1998)和Hoofar等人,J.Clin.Microbiol.42:1863(2004))。例如，为了确保对临床试样进行了成功的扩增和检测，测定可以包括含有与靶序列相同的引物结合区的内标核酸。如实施例中所示，选择靶核酸和内部对照，使得其各自具有将内标与靶核酸区分的独特探针结合区。 [0262] 反应动力学 [0263] 磁性粒子与特定分析物反应而形成聚集体可用于在本发明的测定中产生诊断信号。在许多情况下，将反应混合物温育一定时间是足以形成聚集体的。本发明的方法、试剂盒、药筒和装置可以被构建用于缩短捕获特定分析物、或者产生磁性粒子的聚集体所需的时间量。虽然改变磁性粒子的总浓度将似乎是提高聚集速率的简单且直接的方法，但此方法由于以下原因而变得复杂化：(i)可随着高磁性粒子浓度而增加的非特异性聚集，以及(ii)产生响应于在低浓度的分析物存在下的聚集的可观察的信号变化(即，弛豫信号的变化)的需要。反应动力学可被改进，例如通过以机械方式引起的聚集、通过以声学方式引起的聚集、通过超声引起的聚集、通过静电引起的聚集、或者通过将磁性粒子束缚(例如，使纳米粒子暴露在磁场中，使用多孔膜，使用可磁化金属泡沫、或者离心)在一部分液体样品中。 [0264] NMR单元 [0265] 用于实施本发明方法的系统可以包括一个或多个NMR单元。图1A是用于检测液体样品对合适RF脉冲序列的信号响应的NMR系统的示意图100。偏置磁体102建立经过样品106的偏置磁场Bb104。在导入样品孔108(本文中使用的术语“孔”包括任何缺口、导管、容器、或者支架)之前，直到将液体样品106导入孔108，磁性粒子是处于在药筒中的液体或冻干状态、或者可在将液体样品引导入孔108之前将磁性粒子添加到样品106中。射频线圈110和射频振荡器112在是偏置磁场Bb的线性函数的Larmor频率下提供RF激发。在一个实施方案中，将射频线圈110缠绕在样品孔108的周围。激发RF造成水质子(或者非水溶剂中的游离质子)的自旋的不平衡分布。当关闭RF激发时，质子“松弛”到它们的初始状态并且发出可用于提取关于分析物的存在和浓度的信息的RF信号。线圈110起RF天线的作用并且检测信号，其基于所施加的RF脉冲序列而探测材料的不同性质，例如T2弛豫。对于一些技术的情况，感兴趣的信号是自旋-自旋弛豫(通常为10-2000毫秒)并且被称为T2弛豫。来自线圈110的RF信号被放大114和处理，从而响应于偏置磁场Bb中的激发来确定T2(衰减时间)。孔108可以是含有数纳升至数微升样品的小毛细管或者其它管，包含分析物以及适当尺寸的缠绕在其周围的线圈(见图1B)。通常将该线圈缠绕在样品周围，并且根据样品体积设计尺寸。例如(但不限于)，对于具有大约10 ml体积的样品，可以使用长度约为50 mm且直径为10至20 mm的螺线管线圈；对于具有大约40 μl体积的样品，可以使用长度约为6至7 mm且直径为3.5至4 mm的螺线管线圈；对于具有约为0.1 nl体积的样品，可以使用长度约为20 μm且直径约为10 μm的螺线管线圈。可替换地，在孔周围或附近的该线圈可构建成如图2A-2E中任一幅所示。NMR系统也可含有用于多重目的检测的多个射频线圈。在某些实施方案中，射频线圈具有尺寸为6 mm×6 mm×2mm的圆锥形状。 [0266] 图2A-2E示出了示例性的微NMR线圈(射频线圈)设计。图2A示出了长度为约100 μm的缠绕螺线管微线圈200，然而可以设想具有200 μm、500 μm或者高达1000 μm长度的线圈。图2B示出了直径为约1000 μm的“平面型”线圈202(该线圈并非真正的平面型，因为该线圈具有有限的厚度)。图2C示出了限定大约0.02 μL体积的MEMS螺线管线圈204。图2D示出了MEMS Helmholz线圈206构造的示意图，图2E示出了鞍形线圈220构造的示意图。 [0267] 用于传统NMR检测的绕线螺线管微线圈200描述于Seeber等人，“Design and testing of high sensitivity micro-receiver coil apparatus for nuclear magnetic resonance and imaging,” Ohio State University, Columbus, Ohio。用于传统NMR检测的平面型微线圈202描述于Massin等人,“High Q factor RF planar microcoil for micro-scale NMR spectroscopy, Sensors and Actuators A97-98,280-288(2002)。 Helmholtz线圈构造206的特征在于用于容纳样品的孔208、顶部Si层210、底部Si层212和放置的金属线圈214。用于传统的NMR检测的Helmholtz线圈构造206的一个例子描述于 Syms等人，“MEMS Helmholz Coils for Magnetic Resonance Spectroscopy”, Journal of Micromechanics and Micromachining 15(2005)S1-S9。 [0268] NMR单元包括磁体(即，超导磁体、电磁体、或永久磁体)。该磁体的设计可以是开放的或者部分闭合的，范围从U形或C形磁体到具有三个或四个柱的磁体、到具有用于样品放置的小开口的完全封闭磁体。折衷是磁体和机械稳定性的“最有效点（sweet spot）”的可达性(机械稳定性可以是希望获得高的场均匀度情况下的问题)。例如，NMR单元可以包括圆柱形形状且由SmCo、NdFeB、或者其它低场永久磁体制成的一个或多个永久磁体，该磁体提供大约0.5至大约1.5 T范围内的磁场(即，合适的SmCo和NdFeB永久磁体可购自Neomax，Osaka, Japan)。以说明而非以限制为目的，这种永久磁体可以是偶极/盒永久磁体(PM)组件、或者Hallbach设计(见Demas等人，Concepts Magn Reson Part A34A：48(2009))。该NMR单元可以包括但不限于位于中心的具有大约 20-30 ppm的磁场均匀度和40 μL最有效点的大约0.5T强度的永久磁体。此磁场均匀度允许待使用的较廉价的磁体(较小细调组装/匀场)，在较不易发生波动(例如温度漂移、随时间推移的机械稳定性——实际上任何影响均太小以至于难以观察)的系统中，容许在不影响测定测量(弛豫测量和相互关系测量不要求高均匀度的场)的情况下在杂散场（stray field）中的铁磁性物体或者传导物体的运动(这些具有较小的影响，因此需要较小的屏蔽)。 [0269] 线圈构造可被选择或使其适合于微NMR-MRS技术的具体实施，因为不同的线圈构造提供不同的性能特性。例如，这些线圈中的各线圈的几何形状具有不同的性能和场定位。平面型线圈202具有垂直于线圈平面的RF场。螺线管线圈200具有沿线圈轴线向下的RF场，且Helmholtz线圈206具有横断两个矩形线圈214的RF场。Helmholtz 206和鞍形线圈220具有横向磁场，该磁场将会允许将永久磁体偏置磁场置于该孔的上和下。Helmholtz线圈206和鞍形线圈220对于芯片设计而言可能是最有效的，同时当把样品和MRS磁性粒子容纳在微管中时螺线管线圈200会是最有效的。 [0270] 该微 NMR装 置可通 过缠绕或 打印线 圈或者通 过微电 机械系统(microelectromechanical system, MEMS)半导体制造技术而制造。例如，缠绕或打印线圈/样品孔模块的直径可以是大约100 μm，或者1厘米或更大。例如，MEMS单元或者芯片(如此命名是因为它是在半导体工艺中作为晶片（wafer）上的模具(die)而制造)可具有特征尺寸为大约10 μm至大约1000 μm的线圈。缠绕或者打印线圈/样品孔构造在本文中被称为模块，并且MEMS版本在本文中被称为芯片。例如，可将液体样品108容纳在具有线圈缠绕在其上的管(例如，毛细管、吸液管、或者微管)中，或者可将其容纳在孔周围具有射频线圈的芯片上的孔中。可替换地，使样品定位成流经靠近射频线圈的管、毛细管、或者空腔。 [0272] 含有具有射频线圈和包含本文中所描述磁性粒子传感器的微孔的NMR单元的系统可被设计用于通过建立粒子聚集现象的模型以及建立RF-NMR信号链模型而对感性趣的特定分析物（诸特定分析物）进行检测和/或浓度测量。例如，可以通过表征粒子聚集的物理性质（包括，例如，亲和力、相关尺寸和浓度的影响）而对分析物/磁性粒子系统（感性趣的）进行实验。另外，可以执行实验来表征NMR信号（诸NMR信号）(T2、T1、T2*、T2rho、T1rho和/或其它信号特征，例如T1/T2 混合信号，并且还可包括但不限于扩散、敏感性、频率)，作为粒子聚集或者消耗和磁性粒子特征的函数。在给定系统中对于MRS(磁共振开关)现象为特异性的信号特征可以用于增加检测灵敏度和/或改善性能。 [0273] NMR系统可包括具有射频线圈（诸射频线圈）和微加工（micromachined）在其上的电子器件的芯片。例如，可对芯片进行表面微加工，以便将结构建造在基板（substrate）的顶部。在把所述结构建造在基板的顶部而不是内部的情况下，基板的性质不如在体微加工（bulk micromachining）中那样重要，且体微加工中所使用的昂贵的硅晶片可以用较廉价的材料(例如玻璃或塑料)代替。然而，替代的实施方案可包括体微加工的芯片。表面微细加工通常开始于晶片或者其它基板并且在顶部生长出多个层。利用光刻法以及涉及酸的湿法刻蚀或者涉及电离气体或等离子体的干法刻蚀，而对这些层进行选择性刻蚀。干法刻蚀可以将化学性蚀刻与物理性蚀刻或材料的离子轰击相结合。表面微细加工可按需要包括许多层。 [0274] 在一些情况下，可将廉价的射频线圈整合入一次性药筒并为一次性部件。可以以允许与在固定NMR设置上的电路电接触的方式放置线圈，或者可以以感应的方式耦合到电路。 [0275] 在弛豫测量是T2的情况下，准确度和可重复性(精密度)将是与以下相关的样品的温度稳定性的函数：校准、测定的稳定性、信-噪比(S/N)、用于回聚的脉冲序列(例如，CPMG、BIRD、Tango等)、以及信号处理因素，例如信号调理(例如，回波信号的放大、调整和/或数字化)、时间/频率域转化，以及所采用的信号处理算法。信-噪比是偏置磁场(Bb)、样品体积、填充因数、线圈几何形状、线圈Q-因子（Q-factor）、电子器件带宽、放大器噪声和温度的函数。 [0276] 为了理解所要求的T2测量的精密度，应当观察即将到来的（at hand）测定的响应曲线并且使确定分析物浓度的期望精密度与可测量值（例如在一些情况下是T2值）的精密度相关联。然后，可形成适当的误差估算（error budget）。 [0277] 例如，为了获得肌钙蛋白的0.02 ng/mL检测限的10倍改进(灵敏度增加10倍)，必须将小于大约5.6毫秒的δ-T2从大约100毫秒的传统(非MRS-测量的)T2值中加以辨别。最小信-噪比(S/N)需要为大约20以检测此差异。 [0278] 用于本发明系统和方法的NMR单元可以是美国专利第7,564,245号中所描述的NMR单元，该专利的内容以参考的方式并入本文中。 [0279] 本发明的NMR单元可以包括如PCT公开WO09/061481中所描述的用于便携式磁共振弛豫测量仪的小探头，所述文献以参考的方式并入本文中。 [0280] 本发明的系统可以是可植入于或者可部分地植入于受试者中的。例如，本发明的NMR单元可以包括可植入的射频线圈以及任选的可植入的磁体，其如PCT公开WO09/085214和WO08/057578中所描述，各公开以参考的方式并入本文中。 [0281] 本发明的系统可以包括聚合物样品容器，用于部分或完全地减小与样品容器相关的NMR信号对液体样品的核磁共振参数的影响，其如PCT公开WO09/045354中所描述，内容以参考的方式并入本文中。 [0282] 本发明的系统可以包括用于被构建成进行预定数量的测量(即，被设计成用于有限次数的使用)的MR读数器的一次性试样架。一次性试样架可以包括0个、部分或全部的RF检测线圈中的元件(即，使得MR读数器缺乏检测线圈)。例如，一次性试样架可以包括用于RF检测的“读数”线圈，该线圈感应地耦合到存在于MR读数器中的“拾波”线圈。当样品容器在MR读数器内时，其非常靠近拾波线圈并且可用于测量NMR信号。可替换地，一次性试样架包括用于RF检测的射频线圈，当插入样品容器后该射频线圈电性连接到MR读数器。因此，当把样品容器插入MR读数器时，建立合适的电连接以允许检测。可以通过中断包括在一次性试样架内的电路中或者在一次性试样架和MR读数器之间的可熔断的连接，而控制各一次性试样架的可使用的次数。在把一次性试样架用于检测样品中的NMR弛豫之后，该仪器可被构建成向可熔断连接施加过量的电流，从而导致该连接断开而使得该线圈无法运行。任选地，可使用多个并联工作的可熔断连接，其各自连接到系统上的拾波，并且各自在各次使用中单独地断开，直到全部断开并使得一次性试样架无法运行。 [0283] 药筒单元 [0284] 用于执行本发明方法的系统可以包括一个或多个药筒单元，以提供一种用于将所有测定试剂和消耗品放置在该系统上的方便方法。例如，系统可被定制为执行特定功能、或者适合于执行多于一个的功能（例如，通过含有具有包含于其中的定制的磁性粒子的微孔的阵列的可变药筒单元）。该系统可以包括包含预先加载磁性粒子的孔的阵列的可替换的和/或可互换的药筒，并且被设计用于特定分析物的检测和/或浓度测量。可替换地，该系统可用于不同的药筒，其各自被设计用于不同分析物的检测和/或浓度测量、或者被构建成具有用于给定的测定的试剂和检测的单独的药筒模块。可将该药筒的尺寸设计成便于插入用于液体样品制备的外壳和从所述外壳中弹出，所述液体样品被转移至该系统中其它单元(即，磁力辅助团聚单元、或者NMR单元)的。药筒单元自身可以潜在地与操作站及MR读数器（诸MR读数器）直接地相接。药筒单元可以是具有可以独立于试剂模块灭菌的入口模块的模块化药筒。 [0285] 对于生物样品(例如血样)的处理，存在许多在药筒设计方面相互矛盾的要求，包括对入口模块无菌以防止交叉污染和假阳性测试结果的需要，以及包括在不能利用标准终端灭菌技术(如辐射)容易地进行灭菌的包装中的试剂的需要。用于样品标本抽样的入口模块可被设计成与未加盖的一次性使用真空采血管（vacutainer tubes）相接，以及取样两倍的可用于进行例如念珠菌属测定的样品体积(见图6D-6F)。一次性使用真空采血管允许部分或完全填充。入口模块具有两个硬塑料部件，这两个部件被超声波焊接到一起和箔密封，以形成通道的网络，从而允许形成第一孔溢出到第二样品孔的流道。软的一次性使用真空采血管密封部件是用于一次性使用真空采血管的密封，并且包括样品流动的端口和排气口。为了克服一旦加载并倒置一次性使用真空采血管所产生的流阻，需要一些流体静压。每次从样品孔中取出样品时，所述孔将被来自一次性使用真空采血管的流出液补足。 [0286] 模块化药筒可以提供用于在某些测定(包括但不限于将PCR产物分配入诸检测等分试样中)期间控制交叉污染的简单手段。另外，模块化药筒可以与自动化液体分配相容，并且提供容纳非常小体积的试剂达长时间段(超过1年)的方法。最后，预先分配这些试剂允许由制造过程来设定浓度和体积准确度，并且提供更方便的仪器使用，因为它要求精确度低得多的移液。 [0287] 本发明的模块化药筒是一种药筒，该药筒被分离成可以被封装并且若需要可以单独灭菌的多个模块。它们也可以单独地处理和储存，如果例如试剂模块要求冷冻但检测模块不要求冷冻。图5示出了具有咬合在一起的入口模块、试剂模块和检测模块的代表性药筒。在此实施方案中，将入口模块单独地封装在无菌包装中，并且将试剂模块和检测模块预组装和封装在一起。 [0288] 在储存期间，可以将试剂模块储存在冰箱中，同时可以将入口模块储存在干燥的储存器中。这提供额外的优点：仅需要非常小量的冰箱或冷柜空间来储存许多测定物。在使用时，操作者将会取出检测模块并且打开包装，如果测定需要则可以利用无菌技术来防止被皮肤菌群污染。然后，除去一次性使用真空采血管的盖子，并将倒置的入口模块置于采血管上，如图6A中所示。此模块已被设计成可容易地利用单个牵引工具来塑形（如图6B和图6C中所示），并且药筒的顶部和底部用箔密封以防止污染以及关闭通道。一旦利用入口模块将管重新密封，使该组件的右侧向上并且咬合在药筒的剩余部分上。该入口部包括具有溢出的孔，该孔允许使用具有2至6ml之间的血液的样品管并且仍然为系统自动化提供等深度接口。这是通过溢出而完成，其中溢出采样孔的血液仅落入药筒体中，从而防止污染。 [0289] 可替换地，模块化药筒被设计成用于多重检测。多重检测中的挑战是在一个药筒上具有不相容测底要求(即，不同的温育时间和/或温度)的多种测定的组合。该药筒的特征可以是2个主要部件：(i)试剂模块，其含有全测定名单所需要的所有单独试剂，以及(ii)检测模块。该检测模块仅含有执行温育的药筒的部件，若需要可以执行一次测定或者数次测定。该检测模块可以包括用于一次测定的两个检测室，第一检测室作为对照，且第二检测室用于样品。此药筒形式可以是可扩大的，因为可以通过包含试剂和其它检测模块而加入其它测定物。 [0290] 当使用者将整个或一部分的药筒插入仪器时，模块的操作开始。所述仪器执行测定启动、将测定物抽样至单独的检测室。然后，使这些单独的检测室与试纸分离并且彼此分离，并且单独地经过该系统运行。因为试剂模块被分离和丢弃，所以有最小可能样品单元穿过该仪器，从而节省仪器内部空间。通过将各测定物分配入其各自的单元，不同的温育时间和温度成为了可能，因为将各多重测定彼此物理分离并且对各样品进行单独操作。 [0291] 本发明的药筒单元可以包括一个或多个群的磁性粒子，该磁性粒子是作为液体悬浮液或者是在使用前重构的干燥的磁性粒子。例如，本发明的药筒单元可以包括包含1×106至1×1013个(例如，1×106至1×108、1×107至1×109、1×108至1×1010、1×109至1× 1011、1×1010至1×1012、1×1011至1×1013、或者1×107至5×108个磁性粒子)的用于测定单个液体样品的磁性粒子的室。 [0292] 系统 [0293] 用于实施本发明方法的系统可以包括一个或多个NMR单元、试剂盒单元和搅拌单元(例如，分裂非特异性磁性粒子相互作用，并且使磁性粒子重新分配入液体样品中、或者简单地搅拌样品管以完全地混合测定试剂，例如声处理、涡旋、振摇、或者用于混合一种或多种液体样品的超声波站)。这种系统还可包括用于执行本发明自动化测定的其它部件，例如：用于寡核苷酸检测的PCR单元；离心机；用于在系统内各单元之间输送液体样品的机械臂；一个或多个温育单元；用于将测定试剂与生物样品混合以形成液体样品的流体转移单元(即，吸液装置)；具有可编程处理器的计算机，用于存储数据、处理数据，并且用于根据一个或多个预设方案来控制各种单元的启动和停用；以及用于将预填充的药筒传送至系统的药筒插入系统，任选地具有显示待结合药筒使用的试剂以及方案的计算机的指令。 [0294] 本发明的系统可以提供一种用于对存在于来自受试者的体液中的分析物进行高处理量和实时检测的有效手段。检测方法可用于种类广泛的情况，所述情况包括但不限于：与特定生物学过程、生理条件、病症或病症的阶段有关的分析物的鉴别和/或定量分析。因此，这些系统可广泛地应用于，例如，药物筛选、疾病诊断、系谱分类、亲代和法庭鉴别、疾病发病和复发、对治疗的个体反应(与群体基础的比较)和治疗的监测。所述装置和系统也尤其可用于加快治疗药物开发的临床前和临床阶段，提高患者依从性，监测与处方药有关的ADR、形成个体化医疗、从中心实验室到家的或者基于处方的外来设备（outsourcing）血液测试、以及依据管理部门许可监测治疗剂。这些装置和系统可以提供用于个体化医疗的灵活的系统。本发明的系统可以是随所述系统的可编程处理器的方案或指令而变化或者互换的，以执行如本文中描述的种类广泛的测定。本发明的系统提供台式或者较小尺寸自动化仪器中所包含的实验室设置的许多优点。 [0295] 本发明的系统可用于同时地测定存在于相同的液体样品中的在宽的浓度范围内的分析物，并且可用于监测在单个受试者中在一段时间内分析物浓度和/或PD或PK标志浓度的变化率、或者用于执行浓度或者PD或PK的标志的趋势分析（无论它们是药物还是其代谢产物的浓度）。例如，如果葡萄糖是感兴趣的分析物，那么在给定时间样品中的葡萄糖浓度以及在给定时间段内葡萄糖浓度的变化率可以高度地用于预测和避免例如低血糖事件。因此，使用所述流体装置和系统所生成的数据可用于执行对受试者中分析物浓度的趋势分析。例如，可为患者提供用于在预定时间检测多种分析物的多个药筒单元。受试者可以，例如，在不同的星期的天里使用不同的药筒单元。在一些实施方案中，系统中的软件被设计成识别试剂盒上的标识符，该标识符指示系统计算机运行特定方案以运行测定和/或处理数据。可以经由外部接口(例如USB驱动器或者以太网连接)更新系统中的方案，或者在一些实施方案中，可以将整个方案记录在连接到药筒的条形码中。可根据需要，通过提示使用者进行各种输入(即，用于改变样品的稀释、提供给液体样品的试剂的量、改变温育时间或者磁力辅助团聚时间、或者改变NMR弛豫采集参数)来优化该方案。在把多重阵列构建成用于检测靶核酸的情况下，测定可以包括多重PCR以产生不同的扩增子，然后系列地检测不同的反应。多重测定任选地包括逻辑阵列，其中靶由二分搜索来设置以减少所需测定的次数(例如，革兰氏阳性或阴性导致将仅为其中一组或其它组而进行的基于不同的物种的检测)。 [0296] 本发明的系统可以执行多种测定，无论来自体液样品的被检测分析物是何种分析物。依赖于被使用的药筒单元的识别的方案可储存在系统计算机中。在一些实施方案中，药筒单元具有随后提供分析信息(例如，校准曲线、方案、以前的分析物浓度或水平)所需要去追踪或访问的测定特异性或者患者或受试者特异性信息的被系统计算机检测或读取的标识符(ID)或者卡上的条形码(1D或2D)。如需要，利用该药筒单元标识符来选择储存于系统计算机中的方案、或者确认各种测定试剂在药筒单元中的位置。待在该系统上运行的方案可包括系统执行方案（包括但不限于待运行的特定测定和待执行的检测方法）的控制器的指令。一旦系统进行了测定，指示生物样品中分析物的数据就生成了，并将其传输至通信组件，在此其可以被传输至外部装置进行处理（包括但不限于，计算样品中分析物的浓度），或者由系统计算机进行处理并且将结果呈现在显示读出装置上。 [0297] 例如，该标识符可以是具有一系列黑线和白线的条形码标识符，当插入药筒单元后该条形码标识符可以由条形码读数器(或者另一类型的检测器)读出。可以使用其它标识符，例如一系列字母数字混合编制的数值（alphanumerical values）、颜色、隆起物、RFID、或者可位于药筒单元上并可由系统计算机检测或阅读的任何其它标识符。检测器也可以是发出光的LED，光可与反射光的标识符相互作用并且被系统计算机测量以确定特定药筒单元的识别。在一些实施方案中，该系统包括存储或记忆装置，其具有药筒单元或者用于将信息传输至系统计算机的检测器。 [0298] 因此，本发明的系统可以包括执行不同测定的操作程序、以及药筒，该药筒被编码从而：(i) 将采用哪个预先编程的测定报告给操作程序；(ii)向操作程序报告药筒的构造；(iii)告知操作系统用于执行测定的步骤的顺序；(iv)告知系统采用哪个预编程的例程； (v) 提示使用者输入某些测定变量；(vi)记录患者识别号(该患者识别号也可以包括在容纳血样的一次性使用真空采血管上)；(vii)记录某些药筒信息(即，lot#、校准数据、在药筒上的测定、分析数据范围、有效期、存储要求、可接受样品的特性)；或者(viii)向操作程序报告测定升级或修订(即，使得测定的更新版本将仅出现在药筒升级上而不是报告给更大、更高价的系统)。 [0299] 本发明的系统可以包括一个或多个被构建用于附接到机器臂的流体转移单元。流体转移单元可以是吸液管，例如空气置换、液体后退（liquid backed）、或者注射器吸液管。例如，流体转移单元还可以包括与系统计算机的可编程处理器相连的的马达，该马达可以基于来自可编程处理器的方案使多个头（heads）移动。因此，系统的可编程处理器可以包括指令或命令，并且可以根据指令操作流体转移单元以通过将活塞撤回(用于吸入液体)或伸出(用于排出液体)至封闭的气室而转移液体样品。例如，可利用可编程处理器精确地控制运动空气的体积和运动速度。将样品(或者试剂)与稀释剂(或其它试剂)混合可以通过将待混合的成分抽吸入常见的管中，然后将大部分的混合的液体体积反复地上下抽吸至顶端中来实现。可用类似的方式将干燥的试剂溶解于管中。 [0300] 系统可以包括一个或多个用于加热液体样品和/或用于控制测定温度的温育单元。可将热用于测定反应的温育步骤，以促进反应并且缩短温育步骤所需的持续时间。系统可以包括被构建成用于在预定温度下接收液体样品达预定时间的加热块。该加热块可被构建成用于接收多个样品。 [0301] 可以小心地调节系统温度。例如，该系统包括利用搅拌的温度控制的空气而保持在预定温度(即，37℃)下的外壳（casing）。来自每个单元的废热将超过可以通过对空气的传导和对流由简单的包绕被动散发的热。为了消除废热，该系统可以包括被绝缘底板分离的两个室。上室包括那些液体样品的操作和测量所需的组件（components）的部分，同时下室包括单独单元的发热元件(例如，用于离心的马达、用于搅拌单元的马达、用于每个独立单元的电子器件、以及用于温育单元的加热块)。然后下底板开口，并利用强制气冷从该系统中带走热。 [0302] MR单元可需要更严密控制的温度(例如，±0.1℃)，因此可以任选地包括单独的外壳，将在预定温度下加热的空气吹入该外壳。外壳可以包括开口，通过该开口将液体样品插入和取出，并且允许加热的空气从所述开口逸出。 [0303] 通过提供下面的实施例而为本领域普通技术人员提供如何实施本文中所述装置、系统和方法的完整的公开和描述；这些实施例的意图是纯粹地示例说明本发明，并非意图限制发明人认为是其发明的范围。 [0304] 实施例1.包覆粒子的制备 [0305] 简要地，将1 mg基本上为单分散的羧基化磁性粒子加以洗涤并且再悬浮于100 μl活化缓冲液、10mM MES。将30 μl的10mg/ml 10kDa氨基-葡聚糖(Invitrogen)添加到活化缓冲液中，并在室温下在旋转器上温育5分钟。为了将羧基缀合到葡聚糖上的胺，添加30 μl的10mg/ml 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)并在旋转器上于室温下温育2小时。利用磁性分离将粒子从游离葡聚糖洗脱（3×1 mL PBS），然后再悬浮于1 ml的PBS中。将100 μl磺基-NHS-生物素（Sulfo-NHS-biotin）(Invitrogen)的100 mM溶液用于以生物素修饰葡聚糖表面上的氨基。在温育30分钟后，将粒子用1 ml激活缓冲液洗涤3次。接着，加入100 μl的0.5 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的蛋白质封闭（protein block）和30 μl的10mg/ml EDC(Sigma)，并温育过夜。在1 ml PBS中将所制备粒子洗涤3次，并且再悬浮至期望的浓度。 [0306] 对于分析物的检测而言，利用此方案合成的制备的粒子已显示在的T2测定中得出类似结果，无论样品是否包括缓冲液或者20%裂解的血液(见图14)。制备的变体(其中在一个步骤中预生物素化氨基葡聚糖直接地缀合到粒子)也导致在血液和缓冲液样品中的T2检测的类似性能。 [0307] 实施例2.在执行和不执行蛋白质封闭情况下所制备粒子的评价 [0308] 简要地，在抗生物素滴定T2测定中，在PBS和20%裂解的血样中，对根据实施例1中所述方法制备的生物素修饰的氨基-葡聚糖磁性粒子进行测定。 [0309] 按照以下程序进行测定。将50 μL的基质(PBS或者20%裂解血样)、50 μL变化浓度的抗-生物素抗体、50 μL的1.0 μg/ml二级抗体（secondary antibody）添加到5 mm NMR管中。然后，将150 μL的0.02 mM Fe粒子添加到各管中(即，2.7×108个粒子/管)。然后，将这些样品涡旋4秒，在37℃的加热块中温育2分钟。然后，将各样品再次涡旋4秒，在37℃的加热块中再温育 1分钟。在温育后，将各样品置于Bruker Minispec中达10分钟（在磁场下）。10分钟后，从磁体中取出样品，涡旋4秒，在37℃的加热块中温育5分钟。5分钟后，将各样品再次涡旋并且在37℃加热块中再温育1分钟。使用Bruker Minispec程序和以下参数得出T2值：扫描:1；增益:75；Tau:0.25；回波链:3500；总回波链:4500；和假回波（Dummy Echos）：2。如下计算ΔT2值：T2-(T2)0 ，并且将这些结果示于图14。 [0310] 具有蛋白质封闭的合成的粒子AXN4在血液和缓冲液中获得几乎相同的性能(图14)。图15中所描绘的图对在有(空心圆)和无(实心圆)蛋白质封闭步骤的情况下所制备的粒子进行了比较。因此我们已发现在血液基质中可能需要蛋白质封闭来实现类似的功能。 [0311] 其它蛋白质封闭（包括但不限于鱼皮明胶）也是成功的。根据上述方法制备粒子，区别在于使用鱼皮明胶(FSG)代替BSA作为蛋白质封闭。图16中所示的图显示了T2测定(如上所述)的结果来所述测定使用用BSA封闭的粒子的抗体滴定并且与FSG进行比较。数据表明在这两种蛋白质封闭方法之间有很少差异或者无差异(见图16)。然而，BSA已被证明是更可靠的封闭。 [0312] 实施例3. 葡聚糖涂层的量的确定 [0313] 已发现，试图增加粒子上葡聚糖涂层密度降低血液中的制备粒子的功能性。上述实施例1所描述的粒子的制备（显示几乎相等的缓冲液/血液性能）使用10×过量的基于空间填充模型的葡聚糖，以确定在包覆实验中所包括的葡聚糖的量。在以较高保真度使粒子官能化的尝试中，在包覆实验中增加葡聚糖涂层至1000-10000×过量的葡聚糖产生具有较厚的葡聚糖涂层的粒子，这产生与缓冲液相比的血液中的减小的响应。我们得出结论，具有蛋白质封闭的中等密度的葡聚糖对于产生在血样存在下的T2测定中表现良好的粒子涂层而言可能是理想的(见图17A和图17B)。 [0314] 实施例4.对全血样品中小分子分析物的检测 [0315] 缓冲液/分析物制备：制备0.1 % BSA、0.1 % Tween®于1× PBS中的溶液：10重量% Tween®20溶液。简要地，制备Tween®于1X PBS中的溶液。通过将10 mL的10% Tween®添加到490 mL的1X PBS中，来制备500 mL的0.2% Tween®溶液。在1×PBS溶液中制备2重量%的BSA溶液。通过将50 mL溶解于PBS中的2% BSA添加到450 mL 1×PBS中，来制备BSA溶液的0.2%溶液。将各稀释液合并来制备为1 L的最终体积和0.1% BSA、0.1% Tween®于1×PBS中的溶液的最终缓冲液浓度。 [0316] PEG-FITC-生物素分析物：由1mM Tris HCl制备100 μl的0.5 mM 溶液。将40 μl PEG FITC生物素与40 μl 0.5 mM Tris HCl混合，在室温下温育15分钟。15分钟后，将70 μl溶解于0.5 mM Tris HCl的PEG-FITC-生物素添加到630 μl 0.1% Tween®中，以制备100 μM储备溶液。通过涡旋将储备溶液剧烈混合。将200 μl的100 μM溶液添加到900 μl的0.1% Tween®中，以制备20,000 nM分析物。制备10倍稀释溶液，低至0.02 nM。 [0317] 过程： [0318] 用吸液管将25 μl合适的分析物和50 μl 1:5 裂解的血液基质直接地转移入5 mmNMR管中。将样品涡旋4秒。添加25 μl一级抗生物素抗体(0.18 μg/ml，稀释在0.1% Tween 20中，0.1% BSA，1×PBS)，接着在37℃下温育15分钟。15分钟后，将50 μl的3.0 μg/ml二级抗小鼠抗体(稀释于0.1% Tween中，0.1% BSA，1×PBS)和150 μl的 0.02 mM Fe粒子(2.7× 108个粒子/管)添加到NMR管中。然后将该样品涡旋4秒，在37℃下温育5分钟。将该样品置于Bruker Minispec中达10分钟（在磁场下）。10分钟后，从磁体中取出样品，并且再温育l5分钟。将该样品再次涡旋4秒并再温育1分钟。利用Bruker Minispec程序和以下参数得出T2值：扫描:1；增益:75；Tau:0.25；回波链：3500；总回波链:4500；和假回波：2。 [0319] 实施例5：抗体修饰粒子的合成 [0320] 按照如实施例1中所述方式所制备的氨基葡聚糖包覆的磁性粒子可以经由SMCC-SATA连接键(SMCC=4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯；SATA= N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)用抗体进一步官能化。首先利用如上所述的EDC化学方法将羧基化的磁性粒子缀合到10kDa氨基葡聚糖。用过量的磺基-SMCC进一步修饰葡聚糖包覆粒子以提供马来酰亚胺官能团。用SATA连接基(主要结合到抗体上的胺)来修饰抗体。控制SATA连接键以使得抗体的过度官能化最小化，所述过度官能化可导致粒子的交联或者抗体的亲和力降低。在去乙酰化后，SATA连接基暴露出巯基官能团，其可用于直接地连接到马来酰亚胺官能化粒子（形成硫醚键）。可利用BCA蛋白质测定(Pierce)来测量缀合到各粒子的抗体数量。已成功使用提供与SATA类似功能的连接基，例如SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫基]丙酸酯)。 [0321] 抗体包覆磁性粒子也可利用上述的化学方法制备，但是采用直接共价键结合到基质羧基化粒子。在一些情况下，可能需要将另一涂层 (例如葡聚糖或者封闭剂)添加到粒子表面。类似的化学方法可与替代的涂层（例如PEG或者BSA）一起用于氨基葡聚糖。 [0322] 实施例6.肌酸酐测定 [0323] 简要地，该测定包括以下步骤：在已用连接到磁性粒子表面的肌酸酐修饰的磁性粒子存在下，对靶样品进行温育。肌酸酐修饰的磁性粒子被设计成在肌酸酐抗体的存在下发生聚集。将各肌酸酐修饰的磁性粒子和肌酸酐抗体添加到含有肌酸酐的液体样品中，肌酸酐与磁性粒子竞争肌酸酐抗体。因此，肌酸酐与抗体的结合阻碍磁性粒子的聚集，并且低水平的肌酸酐被聚集体的形成所标识。当暴露在磁场中时这些聚集体改变样品的自旋-自旋弛豫率并且T2弛豫时间的变化(从周围水分子测量磁共振信号的变化)可与靶样品中分析物的存在和/或浓度直接相关。 [0324] 肌酸酐抗体 [0325] 在创建肌酸酐的抗体生成程序中，设计出修饰的肌酸酐分子(COOH-肌酸酐)并且缀合到运铁蛋白，用于BALB-C和AJ小鼠的免疫接种。 [0326] [0327] 生成34个产生稳定的抗体的克隆。这些克隆来自于BALB-C(脾细胞)(n=17)或者AJ小鼠(n=17)。对这两种遗传学不同的小鼠品系进行选择，因为已知其免疫系统中的遗传差异。开发了用于筛选和鉴别用于该测定的最佳单克隆抗体的标准和选择方法。抗体选择方法包括筛选与BSA-肌酸酐的结合（通过ELISA）、抗体亲和力/灵敏度/特异性（通过利用游离肌酸酐和潜在干扰物的ELISA竞争性测定）、确定抗体缀合到磁性粒子的能力以及在T2磁弛豫开关测定中的功能。 [0328] 利用上面概述的建立的抗体选择标准，鉴别了七种单克隆抗体并且选择为测定中的潜在候选物。 [0329] 肌酸酐包覆的磁性粒子 [0330] 将基本上为单分散的羧基化磁性粒子洗涤并且再悬浮于100 μl的缀合缓冲液(50 mM MES，pH=4.75)中。添加磺基-NHS(55 μmol，于200 μl MES缓冲液中的溶液)，将混合物涡旋。向该混合物中添加EDC(33.5 μmol，于200 μl MES缓冲液中的溶液)。将该溶液简单地涡旋，在室温下置于直立圆筒混合机（end over end mixer）上达1小时，沉降，去除上清液。向所形成固体中添加1 mL溶解于PBS的1% BSA，再次将混合物涡旋，在室温下置于直立圆筒混合机上达15-18小时。让这些粒子沉降并去除上清液。 [0331] 将BSA包覆的粒子悬浮于0.5 mL PBS-0.01%T20(10 mM磷酸盐缓冲液，pH=7.4、150 mM NaCl，含有0.01% Tween®20)中。将未反应的羧基用作为封闭剂的甲基-PEG4-胺(20 μl的10% v/v 于DMSO中的溶液)进行处理。将该混合物涡旋并且在室温下置于直立圆筒混合机上达8小时。将所形成的BSA包覆的粒子用0.5 mL PBS-0.01% T20反复洗涤。 [0332] 将COOH-肌酸酐(66 μmol)、EDC(140 μmol)和NHS(260 μmol)与300 μl干燥DMSO混合以形成浆，在反应结束时变澄清。将BSA包覆的粒子悬浮于0.5 mL PBS-0.01%T20(pH=8)中，接着添加活化的COOH-肌酸酐溶液。将所形成的混合物涡旋，并且室温下置于直立圆筒混合机上达4小时。将所形成的粒子在声处理下使用1:15和1:30的DMSO：PBS-0.01%T20(体积/体积)分别洗涤3次。然后在声处理下使用PBS-0.01%T20将这些粒子分别洗涤3次。将这些粒子再悬浮于PBS-0.1%T20(pH=8)，添加2 mg NHS-PEG 2K于200 μl PBS-0.01%T20中的溶液。在室温下将该混合物置于直立圆筒混合机上达12-20小时。然后在声处理下使用PBS-0.01%T20对这些粒子分别洗涤3次，以生成具有相继的（sequential）BSA、肌酸酐涂层、PEG 冒（cap）和封闭的肌酸酐-缀合的磁性粒子。 [0333] 将这些肌酸酐包覆的粒子再悬浮于测定缓冲液(100 mM 甘氨酸(pH=9.0)、150 mM NaCl、1% BSA、0.05% ProClin®和0.05% Tween®)中。 [0334] 使用肌酸酐缀合的粒子和可溶性肌酸酐抗体来执行肌酸酐测定方案，且产生/完成了利用T2信号的检测。图7A中示出了肌酸酐竞争性测定的结构。 [0335] 在指明之处，用包含100mM Tris(pH=7.0)、800 mM NaCl、1% BSA、0.1% Tween®和0.05% ProClin®的测定缓冲液稀释磁性粒子、抗体和液体样品的溶液。 [0336] 将肌酸酐-包覆的磁性粒子在测定缓冲液中稀释到0.4 mM Fe(5.48×109个粒子/ml)，彻底地涡旋，在4-8℃下平衡24小时。 [0337] 将抗肌酸酐小鼠单克隆抗体(上述)用作肌酸酐-缀合的磁性粒子的多价结合剂。在测定缓冲液中将抗体稀释到0.8 μg/ml的浓度，并彻底地涡旋。 [0338] 如下将各样品和校准剂（calibrators）进行稀释：1份样品：3份测定缓冲液。测定上限为大约4 mg/dL 肌酸酐。对于预测肌酸酐水平>4 mg/dL的样品，进行额外的样品稀释（利用1份初始稀释的样品：4份测定缓冲液）。 [0339] 各自对预先稀释的样品、测定缓冲液、磁性粒子和抗体溶液进行 涡旋。将10 μL各溶液添加到管中，将该管涡旋5秒。 [0340] 然后，在梯度磁场中对该管进行12分钟的磁力辅助团聚，在37℃下温育5分钟，置于MR读数器中(T2 MR，所述读数器具有2200 Fluke温度控制器，具有NDxlient软件0.9.14.1/硬件版本0.4.13 Build 2，固件版本0.4.13 Build 0)以测量样品的T2弛豫率，并且将该样品的T2弛豫率与标准曲线(见图8A)进行比较以确定液体样品中的肌酸酐的浓度。 [0341] 修饰的肌酸酐抗体的性能 [0342] 在该测定中不同的肌酸酐抗体进行检测，以确定抗体对聚集的影响。我们观察到当与肌酸酐包覆的磁性粒子组合时肌酸酐抗体的性能在其性能特征方面有所变化(见图8B)。2种制剂的SDS-PAGE凝胶分析显示在制剂1中有显著增加的聚集，这被认为是由于对此抗体的肌酸酐结合价的增加而引起，该抗体由于其纯化过程而聚集。为了比较，我们通过使抗体生物素化在并且链霉亲和素存在下使抗体多聚化而使另一种肌酸酐单克隆抗体 (14HO3)多聚化。然后用肌酸酐包覆的磁性粒子对单体形式、生物素化的单体形式和多聚化的形式进行检测，以评估提高的价对T2时间的影响。这些结果显示于图8C中，其表明在比非多聚化抗体低得多的浓度下，多聚化的抗体形成团簇。利用IgM抗体也观察到粒子集聚的价增强。 [0343] 实施例7.肌酸酐抗体包覆的磁性粒子 [0344] 使用替代的测定结构，该测定包括以下步骤：将靶样品在(i)已经用肌酸酐抗体修饰的磁性粒子；以及(ii) 包含多个肌酸酐缀合物的多价结合剂的存在下进行温育。磁性粒子被设计成在多价结合剂的存在下发生聚集，但是聚集被与液体样品中的肌酸酐的竞争所抑制。因此，肌酸酐与抗体包覆的粒子的结合阻止磁性粒子在多价结合剂的存在下的聚集，并且低水平的肌酸酐是由聚集体的形成所标识。当暴露到磁场中时这些聚集体改变样品的自旋-自旋弛豫率，并且T2弛豫时间的变化(从周围水分子测量磁共振信号的变化)可与靶样品中分析物的存在和/或浓度直接地相关。 [0345] 将基本上为单分散的羧基化磁性粒子加以洗涤，再悬浮于300 μl 缀合缓冲液(50 mM MES，pH=4.75)中，并将磺基-NHS(46 μmol) EDC(25 μmol)添加到这些粒子中。将该溶液简单地涡旋，在室温下置于直立圆筒混合机上达1小时。将活化的粒子用mL PBS-0.01%T20洗涤，再悬浮于1 mL溶解于PBS-0.01%T20的10%(w/v)胺-PEG-胺的溶液中。将该混合物涡旋，并且在室温下置于直立圆筒混合机上达2小时，然后用PBS-0.01%T20洗涤3次。 [0346] 作为替代的化学方法，BSA可以代替胺-PEG-胺。按照实施例6中描述肌酸酐包覆的磁性粒子的部分中所描述的方式制备BSA包覆的磁性粒子。 [0347] 将这些粒子再悬浮于260 μl PBS-0.01%T20，与198 μl磺基SMCC(5 mg/mL于PBS-0.01%T20中的溶液)反应。简单地对该溶液进行涡旋，并室温下置于直立圆筒混合机上达1小时，然后用含有10 mM EDTA的PBS-0.01%T20洗涤3次，以制成SMCC包覆的粒子。 [0348] 通过将SATA(30 nmol于DMSO中的溶液)与抗体(2 nmol于PBS中的溶液，pH=7.4)混合来制备SATA标记的抗体。在室温下将该溶液置于直立圆筒混合机上达1小时。在使用前，如下将SATA标记的抗体上的封闭的巯基进行脱保护：用去乙酰化缓冲液(0.5M盐酸羟胺(pH=7.4)、10mM磷酸盐、150 mM氯化钠、10 mM EDTA)进行1小时处理，并且经过使用含10mM EDTA的PBS的脱盐柱进行纯化。 [0349] 作为SATA的替代，可使用SPDP标记的抗体。通过添加SPDP(10mmol于DMSO中的溶液)与抗体(2nmol于PBS中的溶液，pH=7.4)来制备SPDP标记的抗体。将该溶液在室温下温育1小时，经过脱盐柱进行纯化。在反应中使用5mM 巯基乙胺使SPDP标记的抗体上的SPDP的二硫键裂解，并且在环境温度下温育10分钟。在使用前，使二硫键断裂的SPDP标记的抗体经过脱盐柱进行纯化。 [0350] 将具有PEG-或BSA-涂层的SMCC-官能化粒子与去乙酰化SATA-修饰的抗体混合，在室温下置于直立圆筒混合机上过夜，用PBS-0.05% Tween®80洗涤3次，再悬浮于含有10 mM EDTA的PBS-0.01%T20中。添加封闭剂(m-PEG-SH 2K)，将该溶液置于直立圆筒混合机上达2小时，用PBS-0.05% Tween®80洗涤2次，再悬浮于PBS-0.05% Tween®80、1% BSA和0.05% ProClin®中以制成抗体包覆的磁性粒子。 [0351] 将SMCC-官能化的BSA包覆的粒子与二硫键裂解的SPDP标记的抗体混合，并且在室温下置于直立圆筒混合机上达2小时，用PBS-0.01% Tween®20、10 mM EDTA洗涤2次，再悬浮于PBS、0.01% T20和10mM EDTA中。添加封闭剂 m-PEG-SH 2K(1微摩尔)，将该溶液置于直立圆筒混合机上达2小时。添加第二封闭剂N-乙基马来酰亚胺(5微摩尔)。将这些粒子混合15分钟，用PBS-0.01% Tween®20洗涤两次，再悬浮于pH=9的100mM Tris、0.05% Tween® 80、1% BSA和0.05% ProClin®中，以制成抗体包覆的磁性粒子。 [0352] 上面概述的程序可用于肌酸酐抗体、或者可利用EDC缀合将肌酸酐抗体直接缀合到羧基化磁性粒子的表面。 [0353] 肌酸酐多价结合剂 [0354] 通过EDC缀合，将COOH-肌酸酐缀合到3种氨基-葡聚糖化合物(Invitrogen公司；分子量为10k、40k和70k，分别具有6.5、12和24个氨基/每个分子的葡聚糖)和BSA。所形成的BSA-肌酸酐和氨基-葡聚糖-肌酸酐多价结合剂可用于上述竞争性抑制测定。实现了每个葡聚糖部分2-30个肌酸酐的取代度。图10中示出了肌酸酐抑制曲线的一个例子。所使用的结合剂是具有大约10个肌酸酐/每个葡聚糖分子的40kDa葡聚糖。 [0355] 实施例8. 他克莫司多价结合剂的制备 [0356] 使用葡聚糖和BSA来制备他克莫司缀合物。使用Grubbs第二代催化剂在4-乙烯基苯甲酸存在下对FK-506进行烯烃交互置换反应（olefin metathesis reaction），如下面的路线图1中所示。利用正相硅胶色谱法纯化该粗产物混合物。 [0357] [0358] 葡聚糖缀合物 [0359] 使用三种不同分子量的各自具有不同氨基取代的氨基-葡聚糖来制备葡聚糖-他克莫司缀合物。 [0360] 在搅拌下将2.78 mL的EDC溶液(40 mg/mL EDC 盐酸盐)与2.78 mL的磺基-NHS溶液(64 mg/mL 磺基-NHS)混合。向此混合物中添加0.96 mL的他克莫司-酸衍生物(C21)溶液(28.8 mg/mL于DMSO中的溶液)，将内容物在室温下搅拌30分钟以形成活化的他克莫司-酸衍生物(活化的 Tac溶液 4.6 mM)。活化的他克莫司被立即使用。 [0361] 将各种氨基-葡聚糖聚合物溶解于100 mM磷酸钠缓冲液(pH=8.0)，以制备9.5 mg/mL 储备溶液。 [0362] 在室温搅拌下以下表中所列出的比率将活化的Tac溶液逐滴添加到氨基-葡聚糖的储备溶液中。将各反应物剧烈搅拌至少2小时。 [0363] 表4 反应 氨基葡聚糖分子量 胺:Tac的比率 氨基葡聚糖(μL) Tac的体积(μL) 估计的Tac:葡聚糖摩尔比 1 70K 1:0.2 1000 70.8 未检测 2 70K 1:0.4 1000 141.6 未检测 3 70K 1:0.8 1000 283.2 4.1 4 70K 1:1.6 1000 566.4 未检测 5 70K 1:3.2 1000 1132.8 未检测 6 70K 1:5 1000 1770 15.8 7 10K 1:0.8 1000 283 1.0 8 10K 1:5 1000 1766 2.2 9 40K 1:0.8 1000 287 2.0 10 40K 1:5 1000 1793 8.2 [0364] 利用各反应产物的5步骤系列透析对所形成的Tac-葡聚糖缀合物进行纯化(第1次，15%(v/v)DMSO水溶液；第2次，10%(v/v)甲醇水溶液；第3次至第5次，高纯水；各步骤至少2小时；10K分子量氨基-葡聚糖使用3,500 MWCO 渗析膜，且40K和70K氨基-葡聚糖使用7K MWCO渗析膜)。 [0365] 在纯化后，对各样品进行冻干并确定干燥重量。在使用前重构多价结合剂。 [0366] 在重构后，基于254 nm处吸光度来估计他克莫司取代比。 [0367] 通过进行实验来确定何种尺寸的葡聚糖提供最佳团聚性能。简要地，将10 μL10% MeOH、溶解于PBS(pH=6.3)缓冲液中的1% BSA、20 μL葡聚糖Tac团聚体、10K、40K、70K（以不同的浓度）和10 μL抗他克莫司包覆的磁性粒子(0.2 mM Fe)添加到200 μL PCR管(2.7×109个粒子/管)中。利用平板混合器以2000 rpm对该样品进行2分钟涡旋，于37℃下在温育站预加热15分钟，暴露到侧部和底部磁体中各1分钟，重复6个循环，以2000 rpm再次涡旋2分钟，在含有PCR管设计的加热块的37℃培养箱中温育5分钟，并且在MR读数器中读出T2。数据表明葡聚糖Tac的分子量增加/取代比的变化可以导致改进的T2信号(见图11)。另外，较高的取代也导致改进的响应(见图12)。 [0368] BSA缀合物 [0369] 以不同的他克莫司取代度制备BSA-他克莫司缀合物。 [0370] 在搅拌下将34.5 μL NHS溶液(66.664 mg/mL于乙腈中的溶液)与552 μL EDC(6.481 mg/mL于50 mM MES（pH=4.7）中的溶液)加以混合。将515.2 μL此EDC NHS混合物逐滴添加到220.8 μL他克莫司-酸衍生物(C21)溶液(33.33 mg/mL于乙腈中的溶液)中，将内容物于室温下搅拌1小时，以形成活化的他克莫司-酸衍生物。该活化的他克莫司被立即使用。 [0371] 将BSA溶解于磷酸盐缓冲盐水和乙腈，形成含有5mg/mL BSA于40%乙腈中的溶液。 [0372] 在室温搅拌下以下表中所列出的比率将活化的Tac溶液逐滴添加到BSA溶液中。将各反应物剧烈搅拌至少2小时。 [0373] 表5 反应 Tac:BSA的比率 BSA(μL) Tac的体积(μL) 1 5:1 1000 35 2 10:1 1000 70 3 20:1 1000 140 4 30:1 1000 210 5 50:1 1000 350 [0374] 利用用40%乙腈预平衡的PD10尺寸排阻色谱柱纯化所形成的Tac-BSA缀合物。将洗脱液收集于1 mL级分中并且监测在280 nm处的吸光度，以鉴别含有BSA的级分。 [0375] 将含BSA的级分合并，并在真空下除去乙腈。 [0376] 通过以类似于葡聚糖-他克莫司缀合物所使用的方式执行滴定，来评价Tac-BSA缀合物的集聚能力。正如所观察的，集聚性能随Tac取代比的不同而不同(见图13)。 [0377] 实施例9. 他克莫司竞争性测定方案(抗体在粒子上的结构)。 [0378] 开发了使用抗他克莫司抗体缀合的粒子和BSA-他克莫司多价结合剂的他克莫司测定，并且利用MR读数器进行检测(见实施例6)。此测定被设计成用于检测全血样品，该全血样品已被提取从而从红血细胞和结合蛋白质中释放出他克莫司(从样品中提取疏水性分析物可以例如利用美国专利第5,135,875中所描述的方法来实现)。图7B中描绘了他克莫司竞争性测定结构。 [0379] 在指明的情况下，用含有100 mM 甘氨酸(pH=9)、0.05% Tween®80、1%BSA、150 mM NaCl、0.1%CHAPS的测定缓冲液来稀释磁性粒子和多价结合剂的溶液。 [0380] 利用相继的胺化涂层(PEG或BSA)、抗体共价连接、PEG冒和PEG/蛋白质封闭(如上述实施例中所述)来修饰具有COOH官能团的基础粒子。将抗体包覆的磁性粒子在测定缓冲液中稀释至0.4 mM Fe(5.48×109 个粒子/ml)，并彻底地涡旋。 [0381] 由共价缀合到BSA的COOH-修饰的他克莫司形成多价结合剂(如实施例8中所描述)。将该多价结合剂在测定缓冲液中稀释至0.02 μg/ml，并彻底地涡旋。 [0382] 将提取的样品溶液(10 μL)与磁性粒子溶液(10 μL)混合，涡旋5秒，并在37℃温育15分钟。向此混合物中添加20 μL多价结合剂，将所形成的混合物涡旋5秒并且在37℃下温育5分钟。 [0383] 按如上所述方式制备若干样品。在梯度磁场中对全部样品实行1分钟磁力辅助团聚。然后将所有样品放置入从磁场中取出的盘。对各样品实行至少5秒的涡旋并返回至盘中。再次对全部样品实行1分钟的磁力辅助团聚，接着进行涡旋。对于各样品重复此过程12次。 [0384] 将该样品在37℃下温育5分钟，置于MR读数器中(见实施例6)以测量样品的T2弛豫率，并将该样品的T2弛豫率与标准曲线(见图9)进行比较以确定液体样品中的他克莫司浓度。 [0385] 实施例10. 念珠菌属测定 [0386] 在用于念珠菌属的测定中，将两个库（pools）的磁性粒子用于各念珠菌属物种的检测。在第一库中，将物种特异性捕获寡核苷酸探针缀合到磁性粒子。在第二库中，将另一种物种特异性捕获寡核苷酸探针缀合到磁性粒子。在杂交后，这两种粒子将杂交到在靶核酸的有义链内的被大约10至100个核苷酸分开的两种不同的物种特异性序列。(可替换地，可以将两种捕获寡核苷酸缀合到单个库的粒子，从而形成具有针对第一区和第二区两者的特异性的单独的粒子)。该寡核苷酸修饰的磁性粒子被设计成在来自特定念珠菌属物种的核酸分子的存在下发生聚集。因此，与用于肌酸酐和他克莫司的抑制测定不同，念珠菌属测定的特征是在靶念珠菌属核酸分子存在下团聚的增加。图7C中示出了杂交介导的团聚测定的结构。 [0387] 将羧基化的磁性粒子用于念珠菌属测定。将磁性粒子缀合到寡核苷酸捕获探针以形成寡核苷酸-粒子缀合物。对于各靶扩增子，制备两个群的寡核苷酸-粒子缀合物。利用胺化的寡核苷酸和羧基化的粒子之间的标准EDC化学方法，或者任选地通过将生物素-TEG修饰的寡核苷酸缀合到链霉亲和素粒子来制备寡核苷酸-粒子缀合物。通常在1%固体的粒子浓度下进行缀合反应。 [0388] 缀合后，官能化寡核苷酸密度通过以下方法测量：将Cy5标记的补体杂交到这些粒子，洗涤这些粒子三次以除去非杂交的寡核苷酸；通过加热至95℃达5分钟来洗脱。利用荧光光谱法对Cy5标记的寡核苷酸的量进行定量分析。 [0389] 使用摇轴（rocker）或滚筒（roller），在连续混合条件下于37℃过夜进行缀合反应。将所形成的粒子缀合物：用1倍反应体积的Millipore水洗涤二次；用1倍反应体积的0.1M咪唑(pH6.0)洗涤二次（于37℃持续5分钟）；用1倍反应体积的0.1 M碳酸氢钠洗涤三次（于37℃持续5分钟）；然后，用1倍反应体积的0.1 M碳酸氢钠洗涤二次（于65℃持续30分钟）。将所形成的粒子缀合物以1%固体储存于TE(pH=8)，0.1%Tween®20中。 [0390] 被检测的念珠菌属物种的名单包括白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌。利用识别念珠菌属内高度保守的序列的通用引物来扩增序列。捕获寡核苷酸被设计成识别和杂交到扩增子内的物种特异性区。 [0391] 首先，按如下方式对一份血样的等分试样实行裂解： [0392] (i)将全血样品与过量(1.25×、1.5×、或2×)体积的氯化铵低渗裂解溶液混合。裂解溶液的添加破坏所有的RBC，但不破坏WBC、酵母菌或者细菌细胞。将细胞的物质以9000 rpm离心5分钟，并去除裂解物。用100 μl TE(tris EDTA，pH=8)使完整细胞重构至大约100 μl的最终体积；以及 [0393] (ii)向大约100 μl的样品中添加120 mg的0.5 mm的珠。将该样品以大约3K rpm搅拌3分钟，由此形成裂解物。 [0394] 然后，通过将裂解物添加到包含核苷酸；缓冲液(5 mM(NH4)SO4、3.5 mM MgCl2、6%甘油、60 mM两性离子缓冲剂(pH=8.7)（在25℃)）；引物(正向引物为4×过量(300 mM正向；0.75mM反向)以允许在最终产物中形成不对称单链)；和热稳定的聚合酶(HemoKlenTaq(New England Biolabs))的PCR反应混合液中，而对一份约为50 μl的裂解物的等分试样进行PCR扩增。在95℃下最初温育3分钟后，对该混合物实施PCR循环：62℃退火；68℃延伸；95℃-40次循环。注意：在退火和延伸温度中存在6℃的差异；可将退火和延伸并入单个步骤中以减少总扩增出报告时间。 [0395] 将现在即可用于检测的PCR扩增子与两个群的粒子在夹心测定中混合。 [0396] 在下表6中提供可用于念珠菌属测定的PCR引物和捕获探针。 [0397] 表6 PCR引物 Pan念珠菌属-PCR正向引物 GGC ATG CCT GTT TGA GCG TC(SEQ ID NO.1) Pan念珠菌属-PCR反向引物 GCT TAT TGA TAT GCT TAA GTT CAG CGG GT(SEQ ID NO.2)捕获探针 白色念珠菌探针#1 ACC CAG CGG TTT GAG GGA GAA AC(SEQ ID NO.3) 白色念珠菌探针#2 AAA GTT TGA AGA TAT ACG TGG TGG ACG TTA(SEQ ID NO. 4) 克柔念珠菌探针#1 CGC ACG CGC AAG ATG GAA ACG(SEQ ID NO.5) 克柔念珠菌探针#2 AAG TTC AGC GGG TAT TCC TAC CT(SEQ ID NO.6) 克柔念珠菌探针 AGC TTT TTG TTG TCT CGC AAC ACT CGC(SEQ ID NO.15) 光滑念珠菌探针#1 CTA CCA AAC ACA ATG TGT TTG AGA AG(SEQ ID NO.7) 光滑念珠菌探针#2 CCT GAT TTG AGG TCA AAC TTA AAG ACG TCT G(SEQ ID NO.8)近平滑念珠菌/热带念珠菌探针#1 AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC NitInd1AA(SEQ ID NO.9)近平滑念珠菌/热带念珠菌探针#2 CCG NitInd1GG GTT TGA GGG AGA AAT(SEQ ID NO.10)热带念珠菌 AAA GTT ATG AAATAA ATT GTG GTG GCC ACT AGC(SEQ ID NO.16) 热带念珠菌 ACC CGG GGGTTT GAG GGA GAA A(SEQ ID NO.17) 近平滑念珠菌 AGT CCT ACC TGA TTT GAG GTC GAA (SEQ ID NO.18) 近平滑念珠菌 CCG AGG GTT TGA GGG AGA AAT (SEQ ID NO.19) 抑制对照5' GG AAT AAT ACG CCG ACC AGC TTG CAC TA (SEQ ID NO. 20) 抑制对照3’ GGT TGT CGA AGG ATC TAT TTC AGT ATG ATG CAG(SEQ ID NO. 21) [0398] 1. NitInd是5',5-硝基吲哚，其为能够用4个DNA碱基中的任一碱基进行退火的碱基 [0399] 2. 应注意，寡核苷酸Ts作为间隔区而被添加。 [0400] 任选地，测定在对照序列以及用探针（用于确认对照序列的存在）修饰的磁性粒子的存在下进行。 [0401] 实施例11. 非团聚方法。 [0402] 此方法已经利用用抗肌酸酐抗体修饰的具有400 μm的孔的经氨基甲硅烷（aminosilane）处理的镍金属泡沫来演示，并且显示特异性地结合肌酸酐-衍生化的磁性粒 2 子。通过在室温下在2M HCL中温育1小时而洗涤1 cm的镍金属泡沫的块(Recemat RCM-Ni- 4753.016)，用去离子水彻底地洗涤，于100℃下干燥2小时。然后，于室温下将镍泡沫用2% 3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷在丙酮中的溶液处理过夜。然后，用去离子水充分地洗涤镍金属泡沫，并在100℃下干燥2小时。在室温下用2%戊二醛在水中的溶液对经氨基甲硅烷处理的镍金属泡沫进行2小时处理，并用去离子水充分洗涤。接着，使金属泡沫暴露于在PBS中的 100 μg/ml的抗肌酸酐抗体(14H03)(见实施例6)过夜，用PBS充分洗涤，再用Surmodics Stabilguard进行处理以稳定化和封闭非特异性结合。小心地在不损坏泡沫结构的情况下，利用新的剃刀切割2 mm2的衍生化的金属泡沫的块。将一块衍生化的金属泡沫放入PCR管的 20 μl 测定缓冲液(100 mM 甘氨酸(pH=9.0)、150 mM NaCl、1% BSA、0.05% ProClin®和 0.05% Tween®)中。将20微升对照粒子(0.2mM Fe)(不应结合到金属泡沫ABX1-11)添加到所述管中使最终体积达40 ul并且使最终粒子浓度达0.1 mM Fe(1×106至1×108个粒子/管)。也制备仅具有粒子和缓冲液但没有金属泡沫的单独的PCR管。在梯度磁场中对含有衍生化的金属泡沫和对照粒子的PCR管实行1分钟的磁力辅助团聚，然后用手持去磁器接触，进行另1分钟的磁力辅助团聚，去除与手持去磁体器的接触，进行另1分钟的磁力辅助团聚，并涡旋(三次1分钟的磁暴露)。从两个PCR管中取出30 μl样品，在grant块状加热器（grant block heater）中加热至37℃下保持5分钟并且利用MR读数器读出T2值(见实施例6)。来自样品（无泡沫）的T2读出为39.2，来自含有泡沫的PCR管的样品读出为45.1，显示由于NSB所导致的低水平的粒子消耗。将衍生化的金属泡沫去磁，涡旋，并在测定缓冲液中洗涤。以 0.1m MFe的最终粒子浓度。将其置于具有20 μl测定缓冲液和20 μl的用肌酸酐衍生化的AACr2-3-4粒子的新的PCR管（最终粒子浓度为0.1mMFe）中。在对照实验中也设置无衍生化的金属泡沫的成对的PCR管。通过磁力辅助团聚使具有金属泡沫的PCR管循环二次，其仅作为对照实验(三次1分钟暴露并在各次暴露后去磁，最终涡旋)。从两个管中取出30 μl的样品，加热至37℃保持5分钟，然后在MR读数器中读出。来自具有衍生化的金属泡沫的PCR管的样品读出为41.5，且来自具有用抗肌酸酐抗体进行衍生化的金属泡沫的PCR管的样品读出为324.2，因此显示来自由MR读数器读出的水体积的合适的肌酸酐衍生化的磁性粒子的特异性结合/消耗。 [0403] 实施例12. 单核苷酸多态性的检测 [0404] 存在许多借此T2测量可以检测单核苷酸多态性的方法。 [0405] 最简单的应用将会包括利用嗜热DNA连接酶(Tth 连接酶)对错配的辨别。此测定将需要对样品材料进行裂解接着进行DNA剪切。如果需要对基因组DNA的通用扩增，可以将衔接子连接到剪切的DNA。将利用工程改造的超顺磁性粒子结合的捕获探针对SNP进行检测，所述探针侧接SNP，使得 3’胺化的捕获探针的5’端将会与一种特定的SNP等位基因完全互补，并且随后的用Tth 连接酶的处理将会导致这两种粒子结合的捕获探针的连接。因此，连接将会把粒子锁定成团聚状态。在不希望基因组DNA扩增的情况（由于扩增偏倚(amplification bias)风险）下，反复的解链的（melt）杂交周期将导致信号放大。在所有情况下可以使用相同的5’胺化的捕获探针，同时可以形成3’胺化的探针从而在5’末端产生4种不同的库(A、G、C、或T)。检测将会要求将样品分入4个库中以确定哪个（哪些）核苷酸存在于特定个体内的多态位点。例如，G检测管中的强T2转换（switch）仅将会表明该个体在特定序列位置处对于G而言是纯合的，而在G和A处的转换将会表明该个体在该特定SNP部位处是G和A的杂合子。此方法的优点是Tth 聚合酶已显示具有优越的辨别能力，甚至是在辨别G-T错配方面(特定的允许的错配并且也是最常见的)（1:200倍（相对于正确补体））。虽然过去利用连接酶检测反应以及寡核苷酸连接酶测定来限定在已知多态位点的核苷酸序列，但都要求在连接反应前或者后进行扩增；在此特定的实施例中，可以通过连接反应引起的所形成的团聚粒子复合体尺寸的增加并且由此增加测量的弛豫时间(T2)来放大信号。 [0406] 此程序的修改可以包括粒子结合的捕获探针（其侧接生物素化探针的杂交）的杂交。当通过粒子结合的探针的杂交而形成完全互补的双链体时，连接酶将会使生物素探针共价结合到磁性粒子。再次重复热变性，以及随后的退火和连接的循环，应当在磁性粒子表面上产生高比例的长生物素化寡核苷酸。将执行洗涤以去除任何游离探针，随后添加第二链霉亲和素标记的超顺磁性粒子。只有将生物素化探针连接到第一粒子表面时，才发生团聚。 [0407] 也可以采用杂交辨别方法。在本实施例中，将产生与已知SNP相邻的胺化寡核苷酸补体。这些胺化寡核苷酸可以用于使96孔板的表面衍生化（在每孔中进行1个SNP检测反应）。然后使基因组DNA被剪切，连接到衔接子，并且不对称地扩增。然后将此扩增的基因组DNA应用于阵列以及短的生物素化SNP检测探针。该扩增的基因组DNA 将会杂交到孔结合的捕获探针，然后SNP检测探针将会结合到栓系的基因组DNA。执行洗涤以除去游离的SNP检测探针。然后将链霉亲和素(SA)磁性粒子添加到各孔中。为除去游离SA粒子，将需要再次洗涤。T2检测可以通过添加生物素化超顺磁性粒子以产生表面栓系的团聚的粒子而直接地在孔内进行，或者SA磁性粒子可以从阵列上的各孔中洗脱出，并且在使用生物素化磁性粒子的检测反应中温育。 [0408] 最后，可以将引物延伸反应偶联到T2检测，以辨别哪个核苷酸在多态位点处存在。在此测定中，将使用双脱氧核苷酸的库，其中一个核苷酸/具有生物素的库(即，ddA、ddT、dd生物素-C和/或ddG)。将使用携带在杂交后其最后碱基与SNP相邻的捕获探针的超顺磁性粒子。 [0409] 将剪切的基因组DNA分离并在四个单独的引物延伸反应中温育。然后，外切DNA聚合酶将会催化与存在于SNP中的核苷酸互补的双脱氧的加入。如果使用嗜热聚合酶以确保粒子上的大部分捕获探针都将被延伸，可以再次循环此反应。将进行磁性分离，随后对粒子进行洗涤，再与链霉亲和素超顺磁性粒子进行温育。接着将会发生集聚，其与第一粒子表面上的生物素化的捕获探针的范围成正比。如果两个双脱氧库产生T2中的增益(即，促进粒子团聚)，那么患者将会是杂合子。如果仅一个库产生增加的T2，那么患者将会是纯合子。 [0410] 用于检测SNP的最后一种方法采用等位基因-特异性PCR引物，其中引物的3’端包含SNP。因为采用严格的扩增条件，所以如果靶序列不与引物完全互补，那么PCR扩增将受影响，几乎不产生或者不产生产物。一般来说，将设计多种正向引物(一种与各等位基因完全互补)和单个反向引物。如下检测扩增子：利用两种或更多种捕获探针结合的超顺磁性粒子以引起基于杂交的团聚反应。此方法的一个优点是，它利用了针对在粗样品内的PCR上的T2所已经进行的部分工作，并且将会仅产生被设计成包括已知的SNP的引物。此方法的一个缺点是不能确定新生成的SNP位置。 [0411] 可采用的另一种方法是仅依赖于由于杂交到短的核酸靶所导致的粒子-粒子交联的辨别能力。寡核苷酸的碱基对中的错配已经显示显著地改变粒子的团聚状态和测量的T2信号（归因于单个碱基错配的存在所导致的杂交效率下降）。 [0412] 实施例13. 诊断念珠菌属名单 [0413] 在45天时程内执行检测。在研究的持续期间培养并维持了白色念珠菌和克柔念珠菌参照株以及白色念珠菌临床分离株。 [0414] 材料： [0415] 白色念珠菌和克柔念珠菌纳米粒子：对于各物种，产生两个粒子群，这些粒子共价缀合到与ITS2区内的物种特异性序列互补的寡聚核苷酸(见实施例10)。将这些粒子在4-8℃下在TE(pH=8)、0.1% Tween中储存，并且在即将使用前在DNA杂交缓冲液中稀释至0.097 mM Fe。 [0416] 念珠菌属株：名单是使用白色念珠菌参照株MYA 2876(GenBank FN652297.1)、克柔念珠菌参照株24210(GenBank AY939808.1)和白色念珠菌临床分离株而进行。将所使用的这五种白色念珠菌分离株在YPD中于室温下培养。选择出单个菌落，用PBS洗涤3次，然后利用血细胞计数器进行定量来制备全血掺料（whole blood spikes）。将这些样品以冷冻的甘油储备液的形式在-80℃下储存。 [0417] 人全血：从健康供体采集全血，用K2EDTA进行处理，并用洗涤过的系列地稀释的念珠菌属细胞（以在1E5至5个细胞/mL范围内的浓度）进行掺料。将在新鲜血液中制备的细胞掺料于-20℃下储存。 [0418] 红细胞裂解缓冲液：将含有10 mM碳酸氢钾、155 mM氯化铵和0.1 mM EDTA的低渗裂解缓冲液进行过滤灭菌并且在使用前于室温下储存。可替换地，可以使用红细胞裂解剂，例如非离子型去污剂(例如，Triton-X100与igepal的混合物，或Brij-58)。 [0419] PCR反应混合液：制备含有缓冲液、核苷酸、引物和酶的反应混合液(20 μL5×反应缓冲液、22 μL水、2 μL 10 mM dNTP、3 μL的10 μM 正向引物、3 μL的2.5 μM 反向引物、10 μL HemoKlenTaq和40 μL的珠击打裂解物（bead beaten lysate）)并且在室温下储存。 [0420] 粒子杂交反应混合液：在即将使用前制备由纳米粒子缀合物、盐、表面活性剂和甲酰胺组成的反应混合液(78 μL甲酰胺、78 μL 20×SSC、88.3 μL 1×TE + 0.1%Tween、7.5 μL CP1 -3'，和8.2 μL CP3 -5')。 [0421] 将在念珠菌属的机械裂解中使用的玻璃珠(0.5 mm)在酸中洗涤并高压灭菌，在使用前于室温下储存。 [0422] PCR方案： [0423] 图20中示出了用于检测全血样品中的病原体(例如，念珠菌属)的工作流的一般方案。该方案如下：(i)使掺料了人全血的样品升温至室温(大约30分钟)；(ii)将1 mL红细胞裂解缓冲液等分地取样至各管仲；(iii)将各管以9000 g离心5分钟，并将裂解的血液丢弃；(iv)将100 μL的0.2微米过滤的TE等分地取样至各管中；(v)将120 mg酸洗涤的玻璃珠添加到各管中；(vi) 以最大速度(大约3000 rpm)将各管涡旋3分钟；(vii)将50 μL裂解的样品等分地取样至含有PCR反应混合液的管中；(viii)按如下方式循环PCR反应：(最初的变性： 95℃，3分钟；在95℃下30–40次循环，20秒；在62℃下30-40次循环，30秒；在68℃下30-40次循环，20秒；最后的延伸：68℃、10分钟；最后的浸泡：4℃)；(ix)在热循环后对各样品进行简单的离心以形成沉淀物衃；(x)将5 μL的粒子反应混合液等分地取样至管中（对于每10 μL扩增的样品而言）；(xi)将所形成的混合物充分混合并且将该样品于95℃下变性3 分钟； (xii)在温和搅拌下于60℃对该样品实行1小时的杂交；(xiii)然后用粒子稀释缓冲液将该样品稀释到150 uL，在加热块中平衡至37℃达1分钟；以及(xiv)利用T2 MR读数器测量该样品的T2。 [0424] 检测结果 [0425] 在人全血中的白色念珠菌检测的可重复性：为了确定对白色念珠菌感染的人全血的T2测量的可重复性，我们进行了八天研究，其中每天将相同供体掺料并扩增的样品杂交到超顺磁性粒子(n=3)，并记录所产生的T2值。 [0426] 批内分析精度示于图19A，并且一般来说是紧密的:所有测量的CV小于12%。在8天期间内观察的可重复性示于图19B，在念珠菌属浓度范围内CV小于10%，阴性对照的CV小于6%。应用两个群的双尾Student氏T检验来确定模拟念珠菌属感染血液(10个细胞/mL)与健康供体血液的平均值之间的差异是否显著。所形成的P值小于0.0001，从而确认这些差异是统计学上显著的。 [0427] 样品基质对白色念珠菌和克柔念珠菌检测和可重复性的影响：向来自6个供体的健康血液中掺料进一定范围的白色念珠菌或克柔念珠菌细胞(1E5个细胞/mL至0个细胞/mL)。从白色念珠菌掺料的血液中执行16个独立的实验。各实验由1E5至0个细胞/mL掺料的血液的PCR扩增构成，各扩增反应进行三次重复的T2检测实验；因此对于白色念珠菌，在各检测浓度下记录总共48个T2值(见图21A)。在最低测试浓度(10个细胞/mL)下，我们在37%的时间内(16个实验中的6个)未能检测出白色念珠菌；然而在100个细胞/mL下在100%的时间内检测到白色念珠菌。这表明白色念珠菌的LOD高于10个细胞/mL但低于100个细胞/mL。将在10 CFU至100个细胞/mL之间检测更多的浓度，以更好地定义LOD；然而我们未预料观察到对测定性能的任何重要的基质效应。这是由如下的T2测量的CV而得到证实：在6个供体血液中在1E5个细胞/mL下为12.6%、在1E4个细胞/mL下为13.7%、在1E3个细胞/mL下为15%、在1E2个细胞/mL下为18%和在0个细胞/mL下为6%。这表明该测定可以在白色念珠菌浓度大于或等于至100个细胞/mL下可靠地检测，并且供体血样对性能无重要影响。 [0428] 使用克柔念珠菌的参照株执行相同的实验。在此情况下，进行7次独立实验，因为剩余的掺料的血液加以保存，用于血液培养分析。在任何实验批次中我们都没有在10个细胞/mL下检测到，但是在所有实验批次中在100个细胞/mL下检测到。这提示LOD 在10个细胞/mL至100个细胞/mL之间。再次，将需要在100个细胞/mL至10个细胞/mL之间的细胞浓度的滴定以便更好地定义LOD。在整个浓度范围的测量的CV为：在1E5个细胞/mL下为10.5%、在1E4个细胞/mL下为9%、在1E3个细胞/mL下为12%、在1E2个细胞/mL下为20%、在10个细胞/mL下为6.4%，在0个细胞/mL下为5.2%。图21B中示出了这些结果。 [0429] 检测限的初步确定：在1E4、1E3、5E2、1E2、50、10、5和0个细胞/mL的浓度下，将五种白色念珠菌临床分离株掺料进6个不同的供体血样。将各分离株掺料进最小量的两个不同的供体血样。通过T2测量对扩增反应进行检测，将结果绘制于图22中。重要的是,应注意没有数据因在此研究内的原因而被去除。在5个细胞/mL或者10个细胞/mL下在50%的时间内我们检测不到白色念珠菌；然而在50个细胞/mL下白色念珠菌在95%的时间内检测出。利用不同的临床分离株产生这些数据；各分离株含有不同数量的rDNA重复，并且在菌株之间这些重复的次数可以变化多达4倍(即，大约50个基因（units）至200个基因)。因为输入靶拷贝数将在各菌株之间以及无疑地在各物种之间略有变化，所以在非常低的细胞数量(即10个细胞/mL)下所观察的绝对T2值之间将存在微小的差异。基于我们非常初步的研究，数据提示界限（cut-off）为10个细胞/mL；然而此确定不能在试剂的最终制剂以及仪器/药筒不存在下完成。这提示，限定C5-C95区间将是困难的，因为在10个细胞/mL下各反应仅含有4个细胞。对于此输入体积的血液，在低于此的细胞数下的滴定变得困难。利用泊松分布来计算在10个细胞/mL下将会含有0个细胞的反应数，表明仅2%的反应将不含有细胞；然而在5个细胞/mL下，13%的反应将不含有念珠菌属细胞，并且在2个细胞/mL下，大约37%的反应将会不含有念珠菌属细胞。为了将在10个细胞/mL下的检测灵敏度提高到95%，我们可以把添加到PCR反应中的裂解物的量从40 μL增加至50 μL并且把患者血液的量从400 μL/反应增加至 800 μL/反应。 [0430] 灵敏度/特异性的初步测定：最初，利用血细胞计数器对输入念珠菌属菌落形成单位进行定量分析；然而在此情况下操作者将出芽的子细胞作为单独细胞进行计数。因为我们的数据是以菌落形成单位/mL而不是以细胞/mL来报道，所以不应对出芽进行定量。由于此误差，在各种掺料浓度下存在较少的念珠菌属的细胞/mL，并且我们的灵敏度(在10个细胞/mL下)仅为90%，同时我们的特异性为100%。在25个细胞/mL或更高的情况下，我们观察到100%的灵敏度和100%的特异性。在所有情况下，到第8天用念珠菌属细胞接种的血液培养小瓶为血液培养阳性。应当注意，对血液培养的默认设置为进行5天的温育；然而我们需要延长此温育时间，因为我们的接种物中的许多需要>5天的温育。作为一例，表7示出了为四种不同的接种入血液培养的白色念珠菌临床分离株所记录的从接种到培养阳性的时间。 [0431] 将在来自这些掺料的全血样品的800 μL等分试样上所进行的T2测量结果示于表8。在所有情况下，我们能够在25个细胞/mL或者更高时检测到，然而我们不能够在12个细胞/mL下检测到临床分离株C3。重要的是，注意到在此特定方法比较实验中，利用血细胞计数器而不是库尔特粒度仪对CFU进行定量。总共51个血液培养瓶用血细胞计数器定量的白色念珠菌临床分离株进行接种，且35个阴性血液培养瓶被包括在该实验中。在表8的列联表中示出了大于25个细胞/mL的接种物的结果。 [0432] 表7. 4种不同的白色念珠菌临床分离株的到达血液培养阳性结果的时间 白色念珠菌分离株 100 CFU/mL 25 CFU/mL 12 CFU/mL 0.0 0.0 C1 1161小时+/-12 161小时+/-12 161小时+/-12 192小时 192小时 C2 40小时+/-12 65小时+/-12 47.5小时 192小时 192小时 C3 69.5小时 161小时+/-12 161小时+/-12 192小时 192小时 C4 40小时+/-12 43小时 47.5小时 192小时 192小时 [0433] 注释：所有血液培养阴性小瓶为阴性并在第8天丢弃。 [0434] 表8. 在上面示出的预培养体外掺料的血样上进行PCR扩增和T2检测后获得的T2值(测定时间为大约3小时) 白色念珠菌分离株 100 CFU/mL 25 CFU/mL 12 CFU/mL 0.0 0.0 C1 739.0 409.0 632.5 112.7 112.8 C2 983.2 1014.5 977.6 117.4 114.8 C3 912.7 510.5 113.3 116.2 112.0 C4 807.6 741.2 665.2 119.1 115.9 [0435] T2值(以毫秒表示)是平均值（n=3），并且对于重复测量，CV小于10%。 [0436] 表9. 用于计算在>25个细胞/mL白色念珠菌时的灵敏度/特异性的列联表 阳性 51(真阳性) 0(假阳性) 51(真阳性+假阳性) 阴性 0(假阴性) 35(真阴性) 35(假阴性+真阴性) 总计 51(真阳性+假阴性) 35(假阳性+真阴性) 86(阴性) [0437] 估计的灵敏度=100×[真阳性/(真阳性+假阴性)]=100%(95%置信区间=93%至100%) [0438] 估计的特异性=100×[真阴性/(假阳性+真阴性]=100%(95%置信区间=90%至100%)。 [0439] CFU定量分析的标准化提高了我们测定的灵敏度和可重复性。表10中示出了来自27个血液培养瓶的初步结果。这些初步结果表明在10个细胞/mL或更高我们具有100%灵敏度和特异性。此外我们已开始进行使用柔念珠菌的方法比较。表11中示出了初步结果(来自 36个小瓶)。这些结果表明，对于克柔念珠菌，在10个细胞/mL或更高时我们具有88%/100%的灵敏度/特异性，且在33个细胞/mL或更高时具有100%灵敏度/100%特异性。另一重要变化（在新的血液培养一致比较（blood culture agreement comparisons）之前制定）是多探针粒子的使用。在此情况下，白色念珠菌检测的T2集聚反应使用白色念珠菌（albicans）/近平滑念珠菌（parapsilosis）/热带念珠菌（tropicalis）多功能粒子来进行，而克柔念珠菌使用光滑念珠菌（glabrata）/克柔念珠菌（krusei）多功能粒子进行检测。 [0440] 表10. 用于计算在>10个细胞/mL白色念珠菌时的灵敏度/特异性的列联表 阳性 18(真阳性) 0(假阳性) 18(真阳性+假阳性) 阴性 0(假阴性) 6(真阴性) 6(假阴性+真阴性) 总计 18(真阳性+假阴性) 6(假阳性+真阴性) 24(阴性) [0441] 估计的灵敏度=100×[真阳性/(真阳性+假阴性)]=100%(95%置信区间=81.4%至100%) [0442] 估计的特异性=100×[真阴性/(假阳性+真阴性]=100%(95%置信区间=54%至100%)。 [0443] 表11.用于计算在>10个细胞/mL克柔念珠菌时的灵敏度/特异性的列联表 阳性 24(真阳性) 0(假阳性) 24(真阳性+假阳性) 阴性 3(假阴性) 9(真阴性) 12(假阴性+真阴性) 总计 27(真阳性+假阴性) 9(假阳性+真阴性) 36(阴性) [0444] 估计的灵敏度=100×[真阳性/(真阳性+假阴性)]=89%(95%置信区间=71至98%)[0445] 估计的特异性=100×[真阴性/(假阳性+真阴性]=100%(95%置信区间=66至100%)。 [0446] 临床准确度的初步评估：临床准确度被定位为在两种或更多种临床状态之间（例如念珠菌血症相对于无念珠菌血症）进行辨别的能力。接收者操作特征(ROC)图描述了检测的性能，其以图形方式说明灵敏度(真阳性分数)与特异性(真阴性分数)之间的关系。显示了整个范围的决策水平的临床准确度(灵敏度/特异性对)。利用由10个细胞/mL和50个细胞/mL临床分离株掺料的全血样品所产生的数据，产生两个ROC图并且示于图23A和图23B。曲线下面积经常被用于对诊断准确度进行定量；在此情况下我们具有在10个细胞/mL或50细胞/mL的感染的念珠菌血症患者与无念珠菌血症的患者之间进行辨别的能力。在10个细胞/mL下，曲线下面积为0.72，这意味着如果在随机选择的具有念珠菌血症的人（在10个细胞/mL的感染水平下）中进行T2测定，则有72%的几率他们的T2值将会高于无念珠菌血症的人。该检测的临床准确度远高于50个细胞/mL，并且曲线下面积为0.98。再次表明在念珠菌血症的人（在此感染水平下）中，T2测定将在98%的时间内给出高于来自无念珠菌血症的患者的样品的值。对于50个细胞/mL的感染水平而言，这是极好的临床准确度。对于100个细胞/mL或更高的样品不制备ROC图，因为该面积将被转换成100%的临床诊断准确度。从临床平台上的实际患者样品确定最终临床准确度。 [0447] 检测出报告时间：具有估计的时间的初步测定步骤为：(i)低渗裂解/离心/珠击打(8分钟)；(ii)PCR(120分钟)；(iii)将扩增子杂交到粒子上(30分钟)；(iv)在均匀磁场中进行磁力辅助团聚(10分钟)；以及(v)转移并读数(10秒)。测定的处理时间估计为大约178分钟(大约3小时)，排除了试剂和设备准备的时间。这是用于定量的工作流；然而我们已显示下述具有较短的PCR和杂交步骤的改进的工作流并不获得相同的检测灵敏度(见图24)(虽然对于一些念珠菌属物种(即，光滑念珠菌)而言产生的扩增子的量的减小，因此在患病和正常之间具有较小的δ T2)：(i)低渗裂解/离心/珠击打(8分钟)；(ii)PCR(70分钟)；(iii)将扩增子杂交到粒子上(30分钟)；(iv)在均匀磁场中进行磁力辅助团聚(10分钟)；以及(v)转移和读数(10秒)。改进的工作流产生133分钟或者2小时13分钟的TAT(并且这无需转换到更快的热循环仪)。 [0448] 结论 [0449] 此检测显示了本发明的用于念珠菌血症的基于T2的分子诊断测定，具有下述基质：(i)检测在5至1E5个细胞/mL(5-log)范围内的全血中的白色念珠菌；(ii)检测在10个细胞/mL至1E5个细胞/mL范围内的全血中的克柔念珠菌；(iii)灵敏度/特异性为100%/100%，在>25个细胞/mL时；(iv)浓度>50个细胞/mL时诊断准确度大于98%；(v)与全血的测定相容性(使用12个不同供体血样，未观察到重要的基质效应)；(vi)T2测量的可重复性(在同一天内小于12%，在8天内小于13%)；以及(vii)将总测定出报告时间减小到2小时3分钟。 [0450] 我们已检测了较高的输入体积的人血液并且发现利用这些较大的血液体积可实现高效的低渗裂解；另外在10个细胞/mL下有检测的可重复性的增加。 [0451] 在50个滴定的2样品中观察到污染。为了减小污染问题，可将PCR步骤从检测步骤中分离。此外，可利用化学/生物化学方法使得扩增子无法扩增。例如，可使尿嘧啶结合入PCR产物，并且可使用尿嘧啶N转葡糖基酶执行预PCR温育。 [0452] 本发明的系统和方法的优点包括在无需从样品中分离出蛋白质和非靶核酸的情况下测定全血样品的能力。因为经过DNA纯化不引起靶核酸的损失(例如，在裂解后和扩增前运行Qiagen柱，导致灵敏度的>10×损失；并且在高于1%的浓度下使用全血干扰光学检测法)，样品间差异和偏倚(可以由DNA纯化所引起)被最小化，并且灵敏度被最大化。 [0453] 超过10%的脓毒性休克患者是念珠菌属载体；念珠菌属是继金黄色葡萄球菌和大肠杆菌之后的第三种最普遍的病原体，并且在念珠菌属感染的脓毒性休克患者中存在大约50%的死亡率。念珠菌属是医院获得性感染的第四大主要原因。对这些患者的快速鉴别对于选择适当的治疗方案而言是关键的。 [0454] 实施例14. 病毒测定 [0455] 将CMV基因组DNA掺料到无CMV的健康供体血样中，将40 μL该掺料的血液等分地取样至100 μL总体积的PCR反应。使用与全血相容的嗜热DNA聚合酶(T2 Biosystems，Lexington，MA)和示例性的通用引物执行扩增，所述通用引物设计如下：24 mer端—C6 连接基—CMV特定序列，该精确的序列如下： [0456] 5’-CAT GAT CTG CTG GAG TCT GAC GTT A-3'(SEQ ID NO.11，通用的尾部探针#1) [0457] 5’-GCA GAT CTC CTC AAT GCG GCG-3’(SEQ ID NO.12，通用的尾部探针 #2)[0458] 5'-CGT GCC ACC GCA GAT AGT AAG-3'(SEQ ID NO.13、CMV US8 正向引物) [0459] 5'-GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG-3'(SEQ ID NO.14、CMV US8反向引物)[0460] 引物被设计成使得捕获探针(即，修饰磁性粒子的核酸)将会退火至10mer区(10 mer在5’或3’端是不同的)。反应管中的最终引物浓度为300 nM，且PCR反应混合液包括5mM(NH4)2SO4、3.5 mM MgCl2、6%甘油、60 mM两性离子缓冲剂(pH=8.7)。设置5个单独的样品反应管。循环PCR反应遵照以下进行：95℃下最初变性3分钟，各循环由以下构成：95℃20秒；55℃30秒；和68℃20秒。在30、33、36、39和42次循环时，取出反应管并维持在4℃。一旦准备好全部样品，则对于每10 μL的扩增样品，将5 μL粒子反应混合液(6×SSC，30%甲酰胺，0.1% Tween)等分地取样至管中；将所形成的混合物充分混合，于95℃对该样品实行3分钟的变性；在温和搅拌下于45℃对该样品实行1小时的杂交；然后用粒子稀释缓冲液(PBS、0.1% Tween、0.1% BSA)将样品稀释至150 μL，在均匀磁场中执行10分钟的磁力辅助团聚，并且在加热块中平衡至37℃保持1分钟；利用T2 MR读数器测量5个单独样品的各样品的T2弛豫时间(见图25)。 [0461] 这些引物被设计成允许用捕获探针修饰的磁性粒子退火至10mer区(10mer在5’或3’端是不同的)，从而提供具有通用结构（用于与特定扩增引物聚集）的粒子。 [0462] 图25中所提供结果表明本发明的方法和系统可以用于进行实时PCR并且提供关于全血样品中所存在的靶核酸的量的定量信息。 [0463] 实施例15.实时PCR [0464] 前面的结果表明当PCR反应中存在粒子时，抑制扩增子的产生。我们假设在热循环中使粒子移动至反应管的侧面将会允许产生扩增子。简单的磁分离器/PCR块插入物(图26)被设计成在PCR反应期间将纳米粒子保持在侧壁上，因此使干扰以及对PCR反应成分的粒子暴露最小化。在除去磁场后，可将粒子完全地再悬浮于反应混合物中。 [0465] 在一个实验中，我们测试了可以将粒子束缚于管的侧面并返回至溶液中的速率。在此实验中，将100 μL的白色念珠菌(3′和5′)粒子在1xTE中的混合液(大约150毫秒未集聚的T2基线)于95℃下经历三次集聚/去集聚步骤。接着执行以下方案：(i)涡旋、在37℃下温育1分钟，测量T2；(ii)在磁性PCR插入物上于95℃下加热5分钟；(iii)在37℃下温育1分钟，测量T2；(iv) 涡旋15秒，在37℃下温育1分钟，测量T2；以及(v)转向步骤(ii)。将此实验的结果示于下面的表12中。 [0466] 表12 [0467] 。 [0468] 如表12中示，当使用检测的磁分离器时，于95℃显示完全可逆的纳米粒子集聚。粒子在95℃下稳定达至少3个集聚/去集聚循环。 [0469] 我们接着在反应溶液中纳米粒子存在的情况下检测了PCR效率。在2种条件下执行PCR：(1)使纳米粒子完全分散于溶液中；以及(2) 利用磁性插入物使纳米粒子集中于PCR检测管侧壁。 [0470] 使用白色念珠菌基因组DNA作为起始物，建立三个PCR反应(其中纳米粒子浓缩在检测管壁上；完全分散于溶液中；并且无纳米粒子)。利用凝胶电泳确认成功的靶DNA扩增。使用捕获-探针修饰的Seramag粒子。 [0471] 利用预先制备的PCR混合液和100拷贝的基因组白色念珠菌DNA作为起始物来建立不对称(4:1)PCR反应。将溶解于1xTE的白色念珠菌捕获粒子混合液(3′和5′)添加到反应(1)以及(3)中(基线为大约150毫秒)。对照反应(2)不具有添加的纳米粒子(图27)。 [0472] 在PCR期间，当纳米粒子存在于溶液中(分散于溶液中或者利用磁场集中在检测管侧壁)时未观察到PCR产物形成有差异。因此，用捕获探针修饰的纳米粒子不干扰PCR。如由凝胶电泳所证实的那样，在有和没有存在于溶液中的纳米粒子的情况下，在反应中产生相当量的产物。另外，在PCR过程期间检测管侧壁上的磁性纳米粒子的浓度对PCR不产生影响。 [0473] 实施例16.念珠菌属测定和临床数据 [0474] 开发了用于直接地在人全血内对5种念珠菌属物种进行检测的快速、准确且可重现的分子诊断检测，所述检测具有10个细胞/mL的检测限(LOD)和小于2小时的出结果时间。使用32个盲化临床试样来确定该测定的临床性能，且在此研究中我们观察到与血液培养的 100%阳性和100%阴性一致，同时在100%的念珠菌血症患者样品内准确地鉴别致病的念珠菌属物种。我们将该测定进一步应用于从念珠菌属阳性患者中抽出的血液试样，并且观察到与抗真菌治疗的时间进程一致的念珠菌属检测的下降。此诊断方法是快速的，适应于自动化的，并为临床医生提供检测复杂生物试样内的多种人病原体的机会。 [0475] 磁共振弛豫测量仪（Magnetic Resonance Relaxometer） [0476] 紧凑的磁共振(MR)系统被设计和制造成用于精确的T2弛豫测量，以便在所述条件下进行预定的测定。通过温度控制将此系统保持在37℃，并且此系统含有大约0.5 T（对应于22-24 MHz的操作的质子频率）的钐钴永久磁体。将所有标准MR部件：射频探针、低噪音前置放大器和发射器电子器件、分光光度计板、以及温度控制硬件封装在该系统中。该系统使用标准AC 电源输入并且经由以太网连接到外部计算机。用户友好型图形用户界面允许用户设定实验参数。 [0477] 该系统已被设计成接收在标准0.2 ml PCR管中的样品。通过优化电子器件和线圈来提高适用的样品体积的测量精密度，从而允许我们实现单扫描运行，以运行小于0.1%的T2中的CV。仪器间变异性小于2%：对系统部件具有最小的耐受性要求，并且无需校准。 [0478] 纳米粒子传感器缀合和表征 [0479] 利用标准碳二亚胺化学方法，将800 nm的羧基化氧化铁超顺磁性粒子（所述粒子由许多埋入包含800 nm的总粒径的聚合物基质的氧化铁纳米晶体组成）(见Demas等人,New J.Phys.13:1(2011))缀合到胺化的DNA寡核苷酸。将DNA-衍生化的纳米粒子于4℃下储存在1×Tris-EDTA(pH8)、0.1% Tween-20中。通过用6M HCl溶解粒子，接着添加盐酸羟胺和1,10 O-邻菲咯啉，随后进行分光光度法检测来测量纳米粒子缀合物的铁浓度，如Owen等人,J Immunol Methods,73:41(1984)中所描述。然后，对寡核苷酸衍生化的粒子进行功能性能检测，所述检测通过如下手段进行：在磷酸钠杂交缓冲液4×SSPE(600 mM NaCl、40 mM磷酸钠、4mM EDTA)内进行杂交引起的团聚反应，所述反应使用在序列上与来自这5种不同的念珠菌属物种的真菌ITS2序列相同的经稀释的合成寡核苷酸靶。通过将团聚的反应物经受95℃的热变性步骤、执行T2 测量、在60℃下重复杂交、接着执行第二次T2测量，来确认团聚反应的可逆性。 [0480] PCR引物和纳米粒子捕获探针设计 [0481] 通用的Pan念珠菌属PCR引物被设计成与5.8S和26S rRNA序列互补，该序列扩增念珠菌属基因组的间插转录间隔区2(intervening transcribed spacer 2，ITS2)的区域。一对寡核苷酸捕获探针被设计成分别与在不对称扩增的PCR产物的5’和3’端的嵌套序列互补。杂交到扩增子的5’端的捕获探针被3’胺化，同时使杂交到扩增子的3’端的捕获探针5’胺化。在氨基与捕获探针序列的第一核苷酸碱基之间加入多-T连接基（poly-T linker）(n=9至24)。HPLC纯化的PCR引物和捕获探针获自IDT Technologies (Coralville，IA)。 [0482] 抑制对照设计 [0483] PCR抑制对照被设计成与念珠菌属物种共同扩增，并且监测在全血试样内抑制PCR扩增的因子。合成模板被设计成含有在序列上与念珠菌属rRNA操纵子的5.8S和26S区相同的30个核苷酸侧翼序列。在此模板内的内部序列是由随机的乱序的白色念珠菌扩增子所组成。捕获探针被设计成与在不对称念珠菌属PCR反应内的过量扩增的链互补。合成的寡核苷酸ultramer获自IDT(Coralville，IA)，其在序列上与抑制对照相同。利用标准方法以5 μM的浓度在2×SSC中使寡核苷酸退火并且将其克隆到HindII/EcoRV消化的pBR322(NEB，Ipswich，MA)中。通过1 μL的连接反应物的电穿孔将转化进行在电个感应的（electrocompetant）大肠杆菌 K12细胞中，将转化体置于含有100 μg/mL氨苄青霉素的Luria Bertani(LB)琼脂平板上。选择两种耐氨苄青霉素菌落并且在2 mL LB氨苄青霉素培养基中培养。执行质粒的小量制备（mini-prep），接着进行限制性内切酶基因定位，以确认克隆中含有正确的插入物。然后执行桑格双脱氧测序法(SeqWright，休斯敦，TX)以确认成功的对照的克隆，并且在携带正确的插入物的克隆上进行DNA的大量制备（maxi-preps）。在增加浓度的全部5种念珠菌属物种的存在下，进行抑制对照的滴定，以确定可被可重现地检测的抑制对照的最低浓度。通过在已知的PCR干扰物(SDS、肝素、乙醇)的滴定的存在下执行PCR反应来证实抑制对照的功能的确认，并且显示对照的扩增被抑制。 [0484] 念珠菌属培养和体外掺料的样品制备 [0485] MYA-2876、ATCC 2001、ATCC 24210、ATCC 66029和ATCC 22019是用于制备体外掺料的全血试样的白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌实验室参照株(ATCC，Manassas，VA)。将酵母菌在酵母菌蛋白胨葡萄糖琼脂平板(YPD)上培养，并于25℃温育。选择单个菌落并将其悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中。通过在Accugenix(Newark，Delaware)进行ITS2序列测定而验证各物种。然后对细胞进行低速离心(3000 g，2分钟)，用新鲜PBS洗涤三次。然后将一份PBS洗涤的细胞的等分试样稀释于在20 mL Accuvette内的ISOTON II稀释剂(Beckman Coulter，Brea，CA)中，并依照制造商的说明书在Multisizer 4库尔特粒度仪(Beckman Coulter,Brea,CA)上对细胞进行定量。然后将细胞系列地稀释到在500至5个细胞/100 μL PBS缓冲液范围内的浓度。从ProMedX获得通过在K2EDTA一次性使用真空采血管(BD Diagnostics，Franklin Lakes，NJ)中进行无菌采集所抽取的新鲜人健康供体血液。通常向5毫升人血中掺料100 μL的定量的念珠菌属细胞。然后，将全血掺料的样品立即用于测定。 [0486] 全血PCR [0487] 利用先前描述的方法(见Bramley等人，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes，241:752(1971)和Wessels JM，Biochim Biophys Acta.,2:178(1973))在1 mL全血样品中执行红细胞裂解，然后执行低速离心，去除并丢弃上清液。然后将100 uL 含有1500拷贝的抑制对照的Tris EDTA(TE)缓冲液(pH=8.0)添加到收获的沉淀物中，对悬浮液执行机械裂解(见Garver等人,Appl.Microbiol.,1959.7：318(1959)；Hamilton等人,Appl.Microbiol.,10:577(1962);和Ranhand,J.M.,Appl.Microbiol.,28:66(1974))。然后将50 μL裂解物添加到50 μL含有脱氧核苷酸、PCR引物和与全血相容的嗜热DNA聚合酶(T2 Biosystems，Lexington，MA)的不对称PCR反应混合液中。使用下列循环参数执行热循环：95℃下热变性5分钟，40次由30秒的95℃热变性步骤组成的循环、20秒的62℃退火步骤、30秒的68℃延伸步骤、以及10分钟的在68℃下的最终延伸。 [0488] 杂交引起的团聚测定 [0489] 将15微升所形成的扩增反应液等分地取样至0.2 mL薄壁PCR管中，并在磷酸钠杂交缓冲液(4×SSPE)（含有成对的寡核苷酸衍生化的纳米粒子，以0.2 mM 铁/每反应的最终铁浓度）中温育。将杂交反应物在设定在1000 rpm的搅拌速度的振摇培养箱(Vortemp，LabNet International)中在95℃下温育3分钟，接着在60℃下温育30分钟。然后，将杂交的样品置于37℃加热块中，以历时3分钟平衡温度至MR读数器的温度。然后对各样品执行5次第二次涡旋步骤(3000 rpm)并且插入MR读数器中进行T2测量。 [0490] 念珠菌属患者样品采集方案 [0491] 从马萨诸塞州综合医院(MGH)或休斯敦大学医院的临床血液学实验室获得在与抽取用于血液培养(T=0)的试样同一天在K2EDTA一次性使用真空采血管(BD)中抽取的血液试样丢弃物（Blood specimen discards）。采集各试样并且将各试样根据具有血液培养阳性结果的患者按目录分类。将样品于-80℃储存在原始的一次性使用真空采血管内，并且将盲化的试样采集物在干冰上运送过夜至T2 Biosystems。临床样品采集方案由合适的人类研究委员会审查。 [0492] 统计分析 [0493] 对于各物种，通过使用概率单位模型来确定检测限。对于各物种，计算90%水平的检测和95%置信区间。在整个测定背景中，将各原始T2 信号转换成T2(毫秒)。将SAS v.9.1.3(Cary，NC)用于检测限分析、掺料的试样与培养物的一致性、临床试样中的灵敏度和特异性，和测量念珠菌属清除率的系列测定的统计计算。 [0494] 念珠菌属的T2MR检测与血液培养的一致性 [0495] 目前的用于念珠菌属诊断的金标准是血液培养。使用在0、33和100个细胞/mL的浓度下的白色念珠菌和克柔念珠菌的实验室参照株以及白色念珠菌的临床分离株，制备体外掺料的健康供体全血试样。将儿科的BACTEC血液培养小瓶(BACTEC Peds Plus/F小瓶，Beckton Dickenson)用一份由T2MR评价的体外掺料的试样的等分试样接种。在所有情况下，在第8天用念珠菌属细胞接种的血液培养小瓶均为血液培养阳性。总计，133个血液培养瓶接种了90个念珠菌属掺料的血样(33个细胞/mL的接种物)或者43个阴性血样。在T2MR与血液培养之间观察到98%阳性一致性和100%阴性一致性。 [0496] 临床试样数据 [0497] 获得K2 EDTA全血患者试样，以检测T2MR念珠菌属测定的临床性能。这些患者表现出败血病的症状，并且抽出血液进行培养。血样在血液学实验室中在4℃下储存，并且被选择以进行T2MR（如果结果是念珠菌属血液培养阳性，菌血症的血液培养阳性、或者血液培养阴性），从而更好地代表将会在平台上进行检测的样品的范围。14个样品是来自念珠菌血症患者，8个样品是来自菌血症患者，10个样品是来自血液培养阴性患者。图29示出了全部32个患者样品的测量的T2值。使用1 mL的各试样执行单次PCR反应。将750拷贝的内部抑制对照添加到各PCR反应中。在念珠菌属阴性样品中，平均内部对照(IC)信号为279 ms并且在18个念珠菌属阴性试样中的CV为25%。在所有情况下IC信号均不低于决策阈值(128 ms，将5倍标准差加到念珠菌属阴性检测反应中测量的平均T2值)，表明所有的阴性均为真阴性并且全血样品中没有抑制性物质的存在。检测反应是多重的、基于IDSA指南，从而按照如下方式报道三种结果：白色念珠菌或热带念珠菌阳性；克柔念珠菌或光滑念珠菌阳性；以及近平滑念珠菌阳性。念珠菌属阴性试样中测量的平均T2为114 ms，这些测量值的CV为2.4%，决策阈值(通过将5倍念珠菌属阴性检测反应中测量的标准差加上念珠菌属阴性试样中测量的平均T2值来计算)为128 ms。在念珠菌属阳性的试样中，由于扩增试剂的竞争因而IC信号被抑制。在高白色念珠菌的情况下，在用近平滑念珠菌粒子(例如 3号患者样品)检测时观察到一些交叉反应性，然而此信号不显著高于界限(20 ms)并且不导致抗真菌治疗中的差异，因为白色念珠菌和近平滑念珠菌两者均对氟康唑敏感。 [0498] T2MR成功地鉴别了白色念珠菌、近平滑念珠菌或克柔念珠菌的14种样品，所述样品通过血液培养以及随后的Vitek 2生物化学卡确认为阳性。此外，该检测对念珠菌属物种是特异性的，因为具有大肠杆菌、肠球菌属物种、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、凝固酶阴性葡萄球菌、或者α-溶血性链球菌的菌血症患者样品仍然为阴性。 [0499] 对来自2名显示念珠菌血症症状(例如接受抗生素后持续发热)的患者的系列抽取的样品进行检测，以显示该测定在监测念珠菌属清除率中有用性。在抽取血液进行血液培养的同一天，抽取血液用于T2MR。然后在9天的期间内抽取患者A的监测培养并且在5天的期间内抽取患者B的监测培养。图3示出了利用T2MR方法获得的两位患者的结果。对患者A进行用于培养的血液抽取(t=0)，所述患者被诊断具有念珠菌血症并且在血液培养的那天之后(t=1)静脉施用米卡芬净(光滑念珠菌)。在t=0天、t=3天、t=7天、t=8天、t=9天利用T2MR对全血试样进行检测。获得的T2MR值为320 ms（t=0）、467 ms（t=3）、284 ms（t=7）、245 ms（t=8）和17 ms(低于界限)（t=9）。在第3天和第8天抽取的随后的血液培养用24和48小时来达到培养阳性。从患者B中获得一系列的系列抽取的试样。在第0天用T2MR正确地检测到白色念珠菌(T2=426 ms)。血液培养在第2天变为阳性（利用随后的白色念珠菌鉴别）。在给患者施用米卡芬净1天后，在白色念珠菌T2MR中发现陡然的下降(T2=169 ms)并且在开始抗真菌治疗3天或更多天之后观察不到可监测的白色念珠菌。利用快速块状PCR热循环仪（block PCR thermocycler）和不对速度进行优化的三步骤热循环程序，在2小时的总处理时间内完成所有的检测。 [0500] 结论 [0501] 我们已开发并验证了能够检测5种临床上重要的念珠菌属物种的全血T2MR念珠菌属测定，该测定利用非光学检测的优点以剔出分析物纯化，因此能够实现更快速的出报告时间和可重现性更高的结果。不对称PCR是用于直接地在全血中特异性地扩增念珠菌属基因组的ITS2区以获得临床上相关的检测灵敏度。开发了T2检测方法，其中将两个库的寡核苷酸衍生化的纳米粒子杂交到单链扩增子的各端。因此，这些扩增子起粒子间栓系物的作用并且引起纳米粒子团聚，所述团聚导致水分子中质子的自旋-自旋弛豫(T2)的可测量且可重现的变化。我们进一步构建和实施了内部抑制对照，以监测可能存在于患者样品中的PCR抑制剂。 [0502] 使用由库尔特粒度仪所定量且掺料进健康供体全血中的参照株和临床分离株对测定进行评价。利用白色念珠菌掺料的血液(相同样品，相同操作者，相同仪器)在10天的期间内测量测定可重复性，我们观察到在整个动态响应范围内(0至1E5个细胞/mL) CV小于12.8%(n=30)。在白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌中测量出≤10个细胞/mL的分析灵敏度和检测限，在光滑念珠菌中检测出>10个细胞/mL的分析灵敏度和检测限(92.5%在10个细胞/mL下检测出)。尽管未经证明，在光滑念珠菌中观察的较高LoD的一个可能原因可能是与其它怀疑的念珠菌属物种相比光滑念珠菌中rDNA操纵子拷贝数减小，因为已知光滑念珠菌以单倍体形式存在于自然界而其它念珠菌属物种则以二倍体的形式存在。与念珠菌属诊断的金标准的一致性高：对于133个体外掺料的白色念珠菌和克柔念珠菌样品观察到98%的阳性一致性和100%的阴性一致性。应当注意的是T2念珠菌属检测的得出结果的时间为2小时，而白色念珠菌的达到血液培养阳性的时间通常为2天，克柔念珠菌的达到血液培养阳性的时间通常为大约1天(18-24小时)。 [0503] 32个临床试样类似于血液培养结果。测量的T2高于基于在念珠菌属阴性试样中测量的T2值的五倍标准差加上其平均值所确立的界限。在此情况下，阈值为128 ms(n=54)。在所有情况下我们均未观察到对PCR反应的抑制，因为在全部32个反应中检测到内部对照，并且在念珠菌属阳性患者中所观察到的IC信号减小，并且在念珠菌属阴性试样(n=18)中CV为25%(279 ms的平均T2值)。该测定对念珠菌属检测是高度特异性的，因为在任何菌血症试样(n=8)中未观察到交叉反应性。念珠菌属阳性试样被准确地鉴别，致病性念珠菌属物种被准确地鉴别，并均在2小时的达到应答所需时间内。 [0504] 此测定提供对施用抗真菌治疗后念珠菌属清除率的快速检测的潜力也得到了证实。抽取了2组患者样品并进行T2MR(图3)。在第1天施用抗真菌剂的情况下，在患者A中在第0天和第3天观察到光滑念珠菌的中等至高的T2信号。在随后的几天内，观察到光滑念珠菌信号的降低，在抗真菌治疗8天后无可检测到的光滑念珠菌。患者B在第0天测量到强的白色念珠菌信号，在抗真菌剂施用1天后观察到T2信号的陡然下降(306 ms的δT2)，并且在抗真菌治疗2天后检测不到。尽管是初步的，此数据表明该检测可以用于以实时方式监测治疗效果和念珠菌清除率。 [0505] 综上所述，我们已开发出了一种敏感且特异性的检测，其用于诊断由五种最常遇到的念珠菌属物种所导致的念珠菌血症。早期的临床结果是令人鼓舞的，并且显示快速诊断和物种鉴别是可实现的，这不仅促进了使用的合适抗真菌剂的早期治疗，而且还提供了一种监测念珠菌属清除率的手段。我们预计该基于纳米粒子的T2MR方法可广泛地应用于多种试样类型和病原体中的传染病诊断。 [0506] 实施例17. 应用Fab的他克莫司测定 [0507] 他克莫司测定是均相竞争性免疫测定，其利用被提取以从红血细胞和结合蛋白中释放他克莫司的EDTA全血样品来进行。该测定的关键要件是高亲和力他克莫司抗体、可靠的提取方法和被选择以促进特异性聚集并且使非特异性聚集最小化的缓冲系统的改进。此版本的测定使用对他克莫司具有高亲和力的重组一价Fab。 [0508] 使用全血校准剂、市售的全血对照、掺料的样品和患者样品，来评估他克莫司测定。 [0509] 测定试剂包括：(a)244 nm 粒子，其与相继的BSA以及一价Fab抗体缀合，并且用mPEG-巯基+NEM进行封闭(在测定缓冲液中将粒子稀释到0.2 mM Fe)；(b)以10:1的他克莫司与BSA的输入比与BSA缀合的C22修饰的他克莫司(在测定缓冲液中稀释到600 ng/ml)；(c)100 mM 甘氨酸(pH=9.0)、1% BSA、0.05% Tween 80、150 mM NaCl和0.05% Proclin的测定缓冲液；以及(d)70% MeOH、60 mM溶解于dH20的ZnSO4的提取试剂。 [0510] 使用1 mg/ml的Sigma FK506储备液(于100% MeOH中)制备全血 校准剂。在不同的水平下向EDTA全血中掺料进他克莫司溶液。在温柔地混合下将掺料的血液于37℃下温育，然后在标本抽样和冻结之前于4℃下储存过夜。靶水平为0、1、2、5、10、20、50、100和250 ng/ml的他克莫司。将校准剂提供给外部实验室，用于利用Architect他克莫司测定进行赋值。利用质谱对这些样品进行测定。结果显示理论值与实际赋值的0.9998的相关性。 [0511] 质量控制是由3个水平的UTAK免疫抑制剂基质对照（UTAK Immunosuppressant Matrix Controls）所组成。从接受他克莫司治疗的移植患者中获得患者样品。 [0512] 检测方案如下： [0513] (i)让所有的样品、校准剂、QC和试剂平衡至室温，通过温和的倒置进行混合。 [0514] (ii)用吸液管将200 μL的样品、校准剂或者QC材料转移入1.5 mL 微量离心管（microfuge tube）。添加200 uL提取试剂，涡旋30秒。将该样品在室温下温育2分钟，以10,000 rpm离心5分钟。将洁净的上清液转移到洁净的管中并且使用测定缓冲液制备2.5×稀释液。 [0515] (iii)用吸液管将10 μL稀释的提取液和10 μL稀释的粒子转移入反应管，涡旋混合，于37℃温育15分钟。用吸液管将20 μL BSA-tac缀合物转移入反应管，涡旋混合，于37℃温育15分钟。在梯度磁场中对样品执行6个循环(12分钟)的磁力辅助团聚。涡旋混合，在37℃下温育5分钟并且在37℃下在T2读数器中读数。 [0516] 对于各测试运行，对校准剂进行一式三份的测试(总共6次运行)。利用用于Windows的GraphPad Prism 5(5.02版本，GraphPad Software，San Diego California USA)将各运行数据用5PL模型拟合。将0校准剂作为0.01 ng/ml输入并且用于曲线模型。将所得的校准曲线(运行校准)用于反算运行中所包括的所有校准剂、全血掺料、QC和患者样品的他克莫司浓度。 [0517] 此外，在各校准剂的整个3天研究(n=18)中利用拟合数据获得Master校准曲线。利用Master曲线对全部样品进行反算，并且将所得他克莫司水平与利用运行校准所获得的那些进行比较。 [0518] 对由13个成员组成的可重复性名单(9个校准剂、3个对照和1个掺料的全血样品)进行一式三份的检测，共达3天，每天运行2次，总共18次重复检测。在研究的持续时间期间内，将校准剂于-80℃下储存，同时将对照和全血掺料于4-8℃下储存。 [0519] 利用运行校准曲线、以及GraphPrism中的master曲线来预测样品浓度。批内（Within-run）精密度、日内精密度、日间精密度和总精密度由ANOVA利用MiniTab 15计算。 [0520] 利用运行校准方法所预测的数据在大约3-210 ng/ml的他克莫司浓度范围内显示< 25%CV的总不精密度（imprecision）。 [0521] 利用2SD方法计算分析灵敏度。确定0校准剂的18次重复检测的标准差。然后计算在最大T2(曲线拟合的上渐近线)-2SD处的他克莫司水平，并且利用Master校准曲线来预测浓度。分析灵敏度为0.8 ng/ml。 [0522] 在他克莫司抗体形成和筛选期间，针对5种他克莫司代谢产物对抗体特异性进行评价。使用5种代谢产物中的每种进行5个亲和力成熟的克隆和7个通过交叉克隆而具有额外的亲和力成熟的克隆的ELISA抑制并且与游离他克莫司进行比较。下面示出了交叉克隆中的两种以及本领域状态的鼠类单克隆RUO抗体的数据。仅观察到的交叉反应性是对15-O-脱甲基代谢产物的轻微反应性。 [0523] 将对他克莫司测定性能的总结列于下表。 [0524] 表13. [0525] 。 [0526] 实施例18. 用于核酸分析物检测的纳米粒子的制备。 [0527] 单一探针粒子的制备：在使用前，利用磁道，对800 nm的羧基化氧化铁超顺磁性粒子（所述粒子由许多埋入包含800 nm的总粒径的聚合物基质的氧化铁纳米晶体组成）(见Demas等人，New J.Phys.13:1(2011))进行洗涤。以1 mM浓度/mg待制备的粒子，使磁性粒子再悬浮于66 μL无核酸酶的水、20 μL的250 mM MES缓冲液(pH=6)和4 μL胺化探针(从IDT获得)。制备A3’胺化的探针粒子和5’胺化的探针粒子(例如，用于近平滑念珠菌的探针)。将探针添加到粒子中，利用装备有把持管的泡沫支架的涡旋器对该悬浮液进行涡旋。将涡旋器设定在使粒子保持充分悬浮而无任何溅出的速度。然后将N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于水，并立即添加到涡旋的粒子-探针混合物中。然后将管封闭，在37℃培养箱中在转动情况下温育2小时。然后将管置于磁道中并且除去反应液。用如下的一系列洗涤剂洗涤这些粒子(125 μL/mg 粒子)：水；水；0.1 M咪唑(pH=6.0)，于37℃旋转下5温育分钟；水；0.1M碳酸氢钠(pH=8.0)，于37℃旋转下温育5分钟；水。然后，在旋转下于60- 65℃在0.1 M碳酸氢钠(pH=8.0)中对这些粒子实施1小时热应激。在热应激后，通过将管放置在磁道中，而除去碳酸氢盐。然后，将这些粒子再悬浮于储存缓冲液(Tris-EDTA，0.1% Tween 20)中，并涡旋。除去储存缓冲液，将最终的100 μl储存缓冲液添加到粒子制备物中。 将这些粒子于2-8℃下储存，利用铁检测进行验证，以确定这些粒子的铁浓度，并且针对靶核酸进行检测(例如，近平滑念珠菌（C. paraplsilosis）ITS2寡核苷酸滴定)。在念珠菌属测定中，将这些粒子稀释于补充0.09%叠氮化钠(作为防腐剂)的8×SSPE中。 [0528] 双重探针粒子的制备：对于双重探针粒子的制备，所述程序与上述相同，除了在添加至磁性粒子中之前将相同体积的第二探针(例如，3’胺化白色念珠菌)和第一探针(例如，3’胺化热带念珠菌)混合之外。类似地，在添加至磁性粒子中之前，混合相同体积的5’胺化探针。 [0529] 实施例19.念珠菌属测定改进 [0530] 通过洗涤沉淀物来改进实施例16的念珠菌属测定的检测限。将2.0 mL全血与100 μL的TRAX红细胞裂解缓冲液(即，壬基苯氧基-聚乙氧基乙醇(NP-40)与聚氧乙烯4-辛基苯酚醚(Triton-X100)的混合物)混合，并温育大约5分钟。将样品以6000 g离心5分钟，将所形成的上清液取出并丢弃。为了洗涤沉淀物，将沉淀物与200 μL Tris EDTA(TE)缓冲液（pH=8.0）混合，并进行涡旋。将样品再次以6000 g离心5分钟，将所形成的上清液取出并丢弃。在洗涤步骤后，将沉淀物与100 μL TE缓冲液混合，并且在剧烈搅拌下进行珠击打(例如，例如利用0.5 mm玻璃珠、0.1 mm硅珠、0.7 mm硅珠、或者不同尺寸的珠的混合物)。对样品进行再次离心。然后将50 μL所形成的裂解物添加到50 μL含有脱氧核苷酸、PCR引物和与全血相容性的嗜热DNA聚合酶(T2 Biosystems，Lexington，MA)的不对称 PCR反应混合液中。以如实施例16中所述方式执行热循环和杂交引起的团聚测定，以产生是血样中存在念珠菌属的特征的T2值。该测定可以产生(i)在念珠菌属阳性样品中小于20%的T2值的变异系数；(ii) 在掺料进50个单独的健康患者血样的样品中在小于或等于5个细胞/mL下至少95%的正确检测；(iii)在掺料进50个单独的不健康患者血样的样品中在小于或等于5个细胞/mL下至少 95%的正确检测；和/或(iv)在以2 mL血液为起始的临床阳性患者样品(即，利用其它技术(例如细胞培养)确定念珠菌属阳性)中大于或等于80%的正确检测。 [0531] 本申请要求2010年10月22日提交的美国申请序列号12/910，594的优选权，并且要求2010年11月16日提交的美国临时专利申请第61/414,141号、2010年12月1日提交的美国临时专利申请第61/418,465号和2011年6月15日提交的美国临时专利申请第61/497,374号的权益，其各自内容以参考的方式并入本文中。 [0532] 其它实施方案 [0533] 本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请以参考的方式并入本文中，使得意图将各独立的公开或专利申请以参考的方式具体地且单独地并入本文中。 [0534] 虽然已结合其具体实施方案描述了本发明，但应理解的是可以进一步修改，并且本申请意图涵盖通常根据本发明原理而作出的本发明的任何变型、用途或者调整，并且包括这样的与本公开内容的偏离：其属于本发明所属领域内的已知或常规实践，并可应用于上文列举的关键特征，并落入于权利要求书的范围之内。 [0535] 其它实施方案是在权利要求的范围内。 [0536] 所要求保护的为权利要求书的内容。 |
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