包含具有非常规生物活性的天冬氨酰-tRNA合成酶的组合物和方法 |
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| 申请号 | CN201080023661.6 | 申请日 | 2010-03-31 | 公开(公告)号 | CN102449143B | 公开(公告)日 | 2017-11-14 |
| 申请人 | ATYR医药公司; | 发明人 | 赖安·A·亚当斯; 洪非; 赵基; 克瑞斯迪·佩耶尔; 伊娃·R·阿莫尔; 肯尼·达里格; 莱斯利·A·格林尼; 伊夫·马瑞曼; | ||||
| 摘要 | 提供了具有非常规 生物 活性的分离的天冬 氨 酰‑tRNA合成酶多肽和多核苷酸，以及与其相关的组合物和方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.分离的天冬氨酰-tRNA合成酶AspRS多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-154组成，或者通过发生在(a)SEQ ID NO：1的残基1-154的C-末端的1、2或3个氨基酸的添加、删除和/或(b)SEQ ID NO：1的残基1-154的两亲性螺旋区的1、2或3个氨基酸的保守取代和/或(c)SEQ ID NO：1的残基1-154的N-末端的1个氨基酸的删除而区别于SEQ ID NO：1的残基1- |
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| 说明书全文 | 包含具有非常规生物活性的天冬氨酰-tRNA合成酶的组合物和方法 [0001] 相关申请的交叉引用 [0004] 以文本格式代替纸制版提供本申请相关的序列表，并且在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称为120161_412PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为 13KB，创建于2010年3月31日，并通过EFS-Web以电子方式提交。 [0005] 发明背景发明领域 [0006] 本发明通常涉及天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)多肽的形式、包含该多肽的组合物和使用该多肽的方法。 [0007] 相关技术的描述 [0008] 在翻译过程中，催化tRNA分子氨酰化的氨酰-tRNA合成酶对于遗传信息的解码是必不可少的。在高等真核生物中，氨酰-tRNA合成酶与其他多肽结合以形成超分子多酶复合物。每个真核生物的tRNA合成酶都由核心酶和附加于该核心酶氨基末端或羧基末端的另外 的结构域组成，所述核心酶与原核生物的tRNA合成酶的对应部分密切相关。例如，人酪氨 酰-tRNA合成酶(TyrRS)具有的羧基末端结构域不是原核生物和低等真核生物TyrRS分子的 一部分。 [0009] 已经证实，数种氨酰-tRNA合成酶具有不同于其参与翻译的非常规功能。例如，小酪氨酰-tRNA合成酶(mini-tyrosyl tRNA)(小TyrRS)，即对应于氨基酸残基1-364并且被多 形核细胞弹性蛋白酶和纤维蛋白溶酶切割的TyrRS的N末端结构域，是氨酰tRNA合成酶 “AARS”多功能细胞因子样蛋白和肽的一员。在体外，小TyrRS表现出刺激嗜中性粒细胞激活和趋化作用、内皮细胞增殖和迁移，并且在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)和小鼠基质胶分析中促进血管生成。小TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序与诸如IL-8的CXC趋化因子相似，赋予其趋化因子或血管生成活性。与其它包含ELR的细胞因子相似，该基序的突变抑制小TyrRS结合并 刺激白细胞和血管生成。 [0010] 此外，已经证实，TrpRS的截短形式具有血管生成的特性。在正常的人细胞中，可以检测到两种形式的TrpRS：由全长分子(氨基酸残基1-471)构成的主要形式和次要的截短形式。通过前mRNA的选择性剪接使氨基末端结构域缺失而产生所述次要形式。已经确定，小 TrpRS的氨基末端是位于全长TrpRS分子的第48位的蛋氨酸残基。可选择地，可以通过蛋白 质水解产生截短的TrpRS。例如，牛TrpRS在胰腺中高表达并被分泌进胰液中，由此产生截短的TrpRS分子。其他研究表明，小TrpRS抑制VEGF诱导的细胞增殖和迁移(Wakasugi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.99:173-177(2002))。尤其是，鸡CAM分析表明，小TrpRS阻断VEGF的血管生成活性。相比之下，全长TrpRS不抑制血管生成。因此，移除前48个氨基酸残基可以暴露TrpRS的抗血管生成的活性。因此，与TyrRS一样，某些形式的TrpRS具有除tRNA的氨酰化之外的活性。 [0011] 鉴于对于其他形式的TyrRS和TrpRS相关的非常规活性和治疗相关活性的这些发现，有必要鉴定其他氨酰-tRNA合成酶蛋白的生物学相关的形式和/或活性，从而开发出该 蛋白家族的全部治疗潜能。因此，本发明满足这些需要并且提供其他相关的优势。 [0012] 发明概述 [0013] 本发明源于下述发现：某些天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)多肽具有治疗相关的非常规生物活性。因此，一方面，本发明提供具有至少一种非常规生物活性的分离的AspRS多肽，以及基本上保留所述非常规活性的所述AspRS多肽的活性片段和变体。本文使用的“非常规活性”通常是指本发明的AspRS多肽所具有的、除了氨酰化，且更具体地，除了将天冬氨酸添加至tRNAAsp分子以外的活性。如本文详述，在某些实施方案中，本发明的AspRS多肽表现出的非常规生物活性可以包括但不限于：细胞增殖的调节、凋亡的调节、炎症的调节、细胞分化的调节、血管生成的调节、细胞结合的调节、Akt介导的细胞信号转导的调节、细胞代谢的调节、细胞因子产生或活性的调节和toll样受体信号转导的调节等。 [0014] 在某些实施方案中，本发明的AspRS多肽是全长哺乳动物AspRS蛋白的连续片段。在更具体的实施方案中，所述AspRS多肽是SEQ ID NO:1所示的人AspRS蛋白序列的连续片 段。作为说明，所述片段基本上可以为任何长度，只要它们不是全长，并且进一步地，只要其保留至少一种目的非常规生物活性。在某些示例性实施方案中，本发明的AspRS多肽的大小在长度上为约20-50、20-100、20-200、20-300、20-400或20-500个氨基酸。在其他实施方案中，本发明的AspRS多肽的大小在长度上为约50-100、50-200、50-300、50-400或50-500个氨基酸。在其他实施方案中，本发明的AspRS多肽的大小在长度上为约100-200、100-300、100- 400或100-500个氨基酸。在其他示例性实施方案中，本发明的AspRS多肽的大小在长度上为约200-300、200-400或200-500个氨基酸。 [0015] 在本发明的其他实施方案中，AspRS多肽包含AspRS蛋白序列的片段的活性变体(即，保留至少一种目的非常规生物活性)，所述AspRS蛋白序列例如SEQ ID NO:1所示的人 AspRS蛋白序列。在更具体的实施方案中，所述活性变体是这样的多肽，该多肽沿其长度与SEQ ID NO:1所示的人天冬氨酰-tRNA合成酶序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％的同一性。 [0016] 本发明的其他实施方案提供了天然存在的或非天然存在的、具有一种或多种非常规活性的AspRS剪接变体和点突变体。在某些实施方案中，所述AspRS包含两亲性螺旋结构 域。 [0017] 在本发明更具体的实施方案中，AspRS多肽包含SEQ ID NO:1所示的人AspRS序列的片段，所述片段基本上由氨基酸残基1-154、1-171、1-174、1-31、399-425、413-476或397- 425、或以上的活性片段或变体组成，所述活性片段或变体基本上保留至少一种目的非常规生物活性。 [0018] 在其他具体实施方案中，所述AspRS多肽不是NCBI登录号NP001340所示的多肽。 [0019] 按照本发明的另一方面，提供了包含至少一种如本文所述的AspRS多肽和异源融合伴侣的融合蛋白。 [0020] 按照本发明的另一方面，提供了编码本文所述的多肽和融合蛋白的分离的多核苷酸、以及包含这些多核苷酸的表达载体和包含这些表达载体的宿主细胞。还包括与AspRS多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸是引物、探针或反义寡核苷酸。其他实施方案涉及靶向AspRS多核苷酸的RNAi试剂。 [0021] 按照本发明的另一方面，提供了结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)，其对于本发明的AspRS多肽或其细胞结合伴侣之一具有结合特异性。在某些实施方案中，所述结合剂是抗体、其抗原结合片段、肽、肽模拟物、小分子或适体。在某些实施方案中，所述结合剂拮抗所述AspRS多肽的非常规活性。在其他实施方案中，所述结合剂激动所述AspRS多肽的非常规活性。 [0022] 按照本发明的另一方面，提供了组合物，例如药物组合物，其包含生理可接受的载体和至少一种本文所述的本发明的分离的多肽、融合蛋白、诸如抗体的结合剂、分离的多核苷酸、表达载体、宿主细胞等。 [0023] 某些实施方案涉及测定样品中AspRS多肽的存在或水平的方法，包括使所述样品与一种或多种结合剂接触、检测是否存在所述结合剂、从而测定所述AspRS多肽的存在或水平，所述结合剂与本文所述的AspRS多肽特异性结合。某些实施方案包括测定样品中AspRS 多肽的存在或水平的方法，包括将所述样品导入到可以特异性地鉴定本文所述的AspRS多 肽的分子检测器中，从而测定所述AspRS多肽的存在或水平。在具体实施方案中，所述分子检测器是质谱仪(MS)。某些实施方案包括将AspRS蛋白片段的存在或水平与对照样品或预 定值比较。某些实施方案包括表征样品的状态以将其与对照区分。在具体实施方案中，所述样品与对照包括细胞或组织，并且所述方法包括区分不同物种的细胞或组织、不同组织或 器官的细胞、不同细胞发育状态的细胞、不同细胞分化状态的细胞或健康与患病的细胞。 [0024] 还包括鉴定与AspRS多肽或一种或多种其细胞结合伴侣特异性结合的化合物的方法，包括：a)在合适的条件下使所述AspRS多肽或其细胞结合伴侣或以上二者与至少一种受试化合物组合，和b)检测所述AspRS多肽或其细胞结合伴侣或以上二者与所述受试化合物 的结合，从而鉴定与所述AspRS多肽或其细胞结合伴侣或以上二者特异性结合的化合物。在某些实施方案中，所述受试化合物是多肽或肽、抗体或其抗原结合片段、肽模拟物或小分 子。在某些实施方案中，所述受试化合物激动所述AspRS多肽或其细胞结合伴侣的非常规生物活性。在其他实施方案中，所述受试化合物拮抗所述AspRS多肽或其细胞结合伴侣的非常规生物活性。还包括通过本文提供的任何方法所鉴定的化合物。 [0025] 在其它方面，本发明还提供了通过将细胞或组织与本文所述的本发明的组合物接触而调节细胞活性的方法，其中所述待调节的细胞活性选自细胞迁移、细胞增殖、凋亡、炎症、细胞分化、血管生成、细胞结合的调节、Akt介导的细胞信号转导、细胞代谢、细胞因子产生和toll样受体信号转导等。在某些实施方案中，所述细胞活性是细胞因子产生。在具体实施方案中，所述细胞因子是IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1或IL-1ra中的任意一种或多种。在某些实施方案中，所述细胞活性是toll样受体 (TLR)信号转导。在具体实施方案中，所述TLR是TLR2、TLR4或以上二者。某些实施方案包括激发天然免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述细胞在个体中。 [0026] 其他方面，本发明提供了通过给予本发明的组合物来治疗需要治疗的个体的疾病、病症或其他疾病状态的方法。举例来说，这类疾病、病症或疾病状态可以包括但不限于，炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤疾病(例如，癌症)、代谢疾病、神经疾病、感染、心血管疾病和异常血管生成相关的疾病。 [0027] 序列表简要说明 [0028] SEQ ID NO:1是人天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)的全长氨基酸序列。 [0029] SEQ ID NO:2是编码SEQ ID NO:1的AspRS多肽的核酸序列。 [0030] SEQ ID NO:3是人AspRS多肽的32个氨基酸的氨基酸序列。 [0031] SEQ ID NO:4是大鼠AspRS多肽的32个氨基酸的氨基酸序列。 [0032] SEQ ID NO:5是AspRS两亲性螺旋的带正电荷的残基的一致序列。 [0033] SEQ ID NO:6是疟蚊(anopheles mosquito)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0034] SEQ ID NO:7是鹿蜱(deer tick)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0035] SEQ ID NO:8是霸王莲花青螺(owl limpet)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0036] SEQ ID NO:9是水蛭AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0037] SEQ ID NO:10是爪蟾(Xenopus)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0038] SEQ ID NO:11是日本河豚(Japanese puffer fish)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0039] SEQ ID NO:12是绿河豚(green spotted puffer)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0040] SEQ ID NO:13是棘鱼(stickleback)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0041] SEQ ID NO:14是鸡(chicken)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0042] SEQ ID NO:15是牛(bovine)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0043] SEQ ID NO:16是大鼠AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0044] SEQ ID NO:17是小鼠AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0045] SEQ ID NO:18是岩蹄兔(rock hyrax)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0046] SEQ ID NO:19是负鼠(opossum)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0047] SEQ ID NO:20是跗猴(tarsier)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0048] SEQ ID NO:21是猩猩(orangutan)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0049] SEQ ID NO:22是黑猩猩(chimpanzee)AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0050] SEQ ID NO:23是人AspRS N末端螺旋的一部分的氨基酸序列。 [0052] 图1A-1D显示AspRS(SEQ ID NO:1)的(A)结构域结构和(B)氨基酸序列，并且(C和D)展示了通过使用人嗜中性弹性蛋白酶进行全长AspRS蛋白的受控水解而产生的AspRS片 段的SDS-PAGE分离。图1C是SDS-PAGE凝胶，4-12％MOPS，显示全长AspRS和用PMN弹性蛋白酶的消化。图1D是SDS-PAGE凝胶，12％MES，显示全长AspRS和用PMN弹性蛋白酶的消化。 [0053] 图2A-2B表明用本发明AspRS(也被称为DRS)片段处理的内皮细胞(bAEC)中Akt的激活。图2A显示通过用弹性蛋白酶产生的AspRS片段库处理所诱导的Akt的磷酸化，图2B显 示利用AspRS切割库的Akt磷酸化的时间过程。 [0054] 图3显示与由用全长AspRS(DRS)或阳性对照—内皮单核细胞激活多肽II(EMAP)处理的外周血单核细胞(PBMC)的TNF-α分泌相比，用本发明AspRS片段(D1)处理的PBMC的TNF-α分泌增加。用D1、DRS或EMAP II蛋白处理PBMC 24小时并测定TNF-α的分泌。 [0055] 图4显示用AspRS片段D1处理PBMC后所分泌的示例性的细胞因子。处理PBMC 24小时，测定27种不同的细胞因子的分泌，并且发现IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra的分泌增加。 [0056] 图5示出AspRS片段D1以细胞类型特异的方式激活单核细胞。用作为阴性对照的PBS，作为阳性对照的PHA和AspRS片段D1处理PBMC24小时，并进行测定以检测单核细胞和淋巴细胞上激活的细胞表面标志物。 [0057] 图6示出AspRS片段D1诱导单核细胞(例如，THP-1)和巨噬细胞(例如，RAW 267.7)细胞系分泌TNF-α。 [0058] 图7示出AspRS片段D1诱导巨噬细胞细胞系的趋化性。图7A示出使用布丹室(boudin chamber)测定细胞迁移的实验装置，且图7B示出RAW 264.7巨噬细胞以剂量依赖 的方式向D1片段迁移。 [0059] 图8示出THP-1单核细胞中由AspRS片段D1所介导的TNF-α分泌被MEK抑制剂(UO126)抑制，但不被PI3激酶信号转导抑制剂(LY294022)抑制，所述MEK抑制剂是MAP激酶 信号转导途径中的关键组分。LPS用作阳性对照，并且其活性被两种抑制剂抑制。 [0060] 图9示出AspRS片段D1抑制VEGF诱导的血管生成。将包含PBS、舒尼替尼(sutent)或D1片段以及VEGF的基质胶溶液注入小鼠并分析基质胶栓中新的血管浸润。 [0061] 图10示出表明AspRS片段D1的N末端区域负责其细胞因子活性的实验结果。相对于存在6X组氨酸亲和标签的D1的C末端，存在6X组氨酸亲和标签的D1的N末端导致该片段的 TNF-α分泌活性的降低。 [0062] 图11示出AspRS片段D1在其N末端包含哺乳动物特异的32个氨基酸序列。SEQ ID NO:3是人AspRS的32个氨基酸的肽，SEQ ID NO:4是大鼠AspRS的32个氨基酸的肽。仅在哺乳动物AspRS的N末端发现而未在酵母AspRS中发现的32个氨基酸的肽，对于常规tRNA合成酶 活性是不必要的，并且经预测含有推定的螺旋(参见，Jacobo-Molina and Yang(1989)；以及Escalante and Yang,JBC(1992))。 [0063] 图12示出人AspRS片段D1的鉴定、进化和结晶。图12A示出用RAW264.7小鼠巨噬细胞进行SDS-PAGE分析的步骤；切下蛋白条带并用LC MS、MS进行分析，AspRS的N末端片段被鉴定为D1。图12B示出AspRS的附加的N末端是进化出的结构域。图12C示出解决到 分辨 率的全长二聚体人AspRS的晶体结构；指出了N末端tRNA反密码子结合结构域，氨酰化结构 域和连接D1片段与氨酰化结构域的30个氨基酸的连接物。 [0064] 图13示出D1在体内和体外诱导促炎性和抗炎性细胞因子的分泌。图13A示出来自静脉注射10mg/kg D1的小鼠的体内TNF-α和IL-10血清水平。2小时后小鼠显示出TNF-α的增加，6小时后TNF-α被快速清除，而IL-10的水平持续增高。图13B示出分别在4小时和24小时之后，从PBMC体外释放的TNF-α和IL-10。使用D1(250nM)处理的细胞表现出增加，而用全长AspRS(250nM)处理的细胞没有表现出增加；LPS(10EU)也表现出强烈的TNF-α应答。图13C中的流式细胞术分析揭示D1与83％的原代单核细胞和14％的总淋巴细胞群体结合。在原代淋 巴细胞中，D1与76％的CD19+B细胞结合。 [0065] 图14示出D1通过toll样受体2和toll样受体4(TLR2和TLR4)激活NF-kB。图14A示出D1激活RAW264.7小鼠巨噬细胞中的NF-kB；编码NF-κB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因的RAW-Blue细胞对于D1表现出剂量依赖的NF-κB激活，相比之下，缺乏通过AspRS的NF-κB激活。如图14B所示，D1(1μM)同时激活TLR2和TLR4超表达的HEK293细胞，而AspRS(1μM)没有表现出活性；用NF-κB诱导的报告分子稳定转染的表达TLR2或TLR4的HEK293细胞证明，D1可以诱导NF-κB激活。在图14C中，流式细胞术表明D1与超表达TLR2或TLR4的HEK细胞结合，而不与对照细胞结合。 [0066] 图15示出D1活性的表征，部分地与N末端两亲性螺旋有关。图15A中的螺旋轮描绘了人AspRS的N末端，并展现两亲性螺旋。图15B中的比对(从上至下，SEQ ID NO:6-23)说明针对N末端螺旋而设计的两个D1突变体；用于中和带负电的残基的三丙氨酸(AAA)突变，和 代表酵母序列的部分带电的回复突变体(SKK)。图15C示出用D1(50nM)处理24以后从PBMC释 放的体外TNF-α和IL-10增加，而用全长AspRS(50nM)或Δ22突变体(50nM)处理后不增加；带电的突变体(AAA和SKK)还表现出降低的活性。图15D说明D1如何从巨噬细胞中释放并通过 TLR2和TLR4受体与单核细胞、T细胞和B细胞结合，从而激发TNF-α释放的早期促炎性应答，随后激发IL-10释放的抗炎性应答。 [0067] 图16示出D1活性不是因为内毒素污染。在图16A中，哺乳动物表达的D1诱导外周血单核细胞中细胞因子的分泌。在HEK293细胞中，D1与常规分泌序列一起表达。收集含有分泌的D1的条件培养基，浓缩并与PBMC一起孵育；含有D1的培养基诱导TNF-α释放，而这在模拟转染的培养基中未观察到。如图16B所示，D1活性不依赖内毒素污染；在内毒素灭活剂多粘菌素B的存在下，D1细胞因子的释放未改变，而脂多糖(LPS)被完全抑制。图16C示出用蛋白酶K消化D1破坏了PBMC的细胞因子刺激能力。通过用蛋白酶K过夜处理，D1被完全消化，将消化的D1加入PBMC中并用ELISA测定TNF-α分泌。 [0068] 发明详述 [0069] 除非文中有明确相反指示，本发明的实施可利用本技术领域内的常规分子生物学方法和重组DNA技术，为了说明的目的，其中很多方法和技术在下文进行了描述。这些技术在文献中有充分的讲解。参见，例如，Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)(第2版,1989)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach (DNA克隆：操作方法),vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸 合成)(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.Hames& S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(转录和翻译)(B.Hames& S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.Freshney,ed.,1986)；A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆操作指南)(B.Perbal,ed.,1984)。 [0070] 本文引用的所有出版物、专利、专利申请通过引用的方式将其全部内容并入本文。 [0071] 定义 [0072] 除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域所属技术人员所通常理解的含义相同的含义。尽管在实施或检验本发明时可以使用与本文所述的相似或等 同的任何方法和材料，但是本文描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，如下定义以下术语。 [0073] 在本说明书和附加的权利要求中所用的单数形式“a(一)”、“an(一个)”和“the(该)”包括复数形式，除非文中明确指示不包括复数。例如，“an element(一个元件)”表示一个元件或多个元件。 [0074] 所用“约”表示与参考的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度(dimension)、尺寸、数额、重量或长度相比，改变多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的量、水平、值、数、频率、百分比、尺度、尺寸、数额、重量或长度。 [0075] “激动剂”是指增强或模拟AspRS的非常规生物活性的分子。激动剂可以包括蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或组合物，这些激动剂通过与AspRS或其结合伴侣直接相互作用或通过对AspRS参与的生物途径中的组分起作用来调节AspRS的活性。包括部分和完全激动剂。 [0076] 术语“拮抗剂”是指抑制或减弱AspRS的非常规生物活性的分子。拮抗剂可以包括诸如抗体的蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或组合物，这些拮抗剂通过与AspRS或其结合伴侣直接相互作用或通过对AspRS参与的生物途径中的组分起作用来调 节AspRS或其结合伴侣的活性。包括部分和完全拮抗剂。 [0077] 利用“编码序列”来表示负责编码基因的多肽产物的任何核酸序列。与之相反，术语“非编码序列”是指并非负责编码基因的多肽产物的任何核酸序列。 [0078] 整个说明书中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括陈述的步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其他的步骤或元素或者步骤或元素的组。 [0079] 利用“由…组成(consisting of)”来表示包括且限于跟随在词组“由…组成”后的任何内容。因此，词组“由…组成”表明所列出的元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其他元素。利用“基本上由…组成(consisting essentially of)”来表示包括列在该词组后所列的任何元素，并限于不妨碍或不促进在所列元素的公开内容中指明的活性或作用的其他元素。因此，词组“基本上由…组成”表明所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是任选的，可以存在或可以不存在，这取决于它们本质上是否影响所列元素的活性或作用。 [0080] 如本文所使用的，“功能”和“功能的”等术语是指生物学功能、酶血功能或治疗功能。 [0081] 利用“基因”来表示占据染色体上的特定基因座的遗传单元，并且由转录调节序列和/或翻译调节序列、和/或编码区、和/或非翻译序列(即，内含子、5'和3'非翻译序列)组成。 [0082] “同源性”是指一致的或组成型保守取代的氨基酸的百分数。同源性可以利用诸如GAP(Deveraux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12,387-395)的序列比对程序来确定，其通过引用的方式并入本文。通过这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文中所引用的序列相似或基本上有不同的长度的序列，这种空位可以通过例如利用GAP的比 较算法来确定。 [0083] 术语“宿主细胞”包括个体细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致(在形态学上或在总DNA互补物中)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感 染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。 [0084] 利用“分离的”来表示基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的物质。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”包括已经从天然存在状态中位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如，从通常邻近DNA片段的序列中移出所述片段。可选地，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等包括从其天然的细胞环境中以及从与细胞的其他组分的结合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即，它明显不与体内物质结合。 [0085] 如本文所使用的术语“mRNA”或有时称为“mRNA转录本”，包括但不限于：前mRNA转录本、转录加工中间体、准备用于翻译的成熟mRNA以及一个或多个基因的转录本，或来源于mRNA转录本的核酸。转录本加工可以包括剪接、编辑和降解。如本文所使用的，来源于mRNA转录本的核酸是指所述mRNA转录本或其子序列被最终用作模板所合成的核酸。从mRNA逆转录的cDNA，从该cDNA转录的RNA，从该cDNA扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等都是来源于该mRNA的转录本，并且多这种来源的产物的检测能指示样品中原始转录本的存在和/或丰 度。因此，mRNA来源的样品包括但不限于，一个或多个基因的mRNA转录本、从该mRNA逆转录的cDNA、从该cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA，从扩增的DNA转录的RNA等。 [0086] 本文使用的“非常规的”活性通常是指本发明的AspRS多肽所具有的，除了氨酰化，且更具体地，除了将其同源氨基酸添加至其同源tRNA分子以外的活性。非常规活性的非限制性实例包括RNA结合、氨基酸结合、细胞增殖的调节、细胞迁移的调节、细胞分化的调节(例如造血作用)、细胞凋亡或其它形式的细胞死亡的调节、细胞信号转导的调节、血管生成的调节、细胞结合的调节、细胞代谢的调节、细胞因子产生或活性的调节、细胞因子受体活性的调节、炎症的调节等。 [0087] 术语“调节”包括与对照相比，通常以统计学上显著或生理上显著的量“增加”或“刺激”，以及“减少”或“降低”。“增加的”或“提高的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括没有组合物(缺乏试剂或化合物)或有对照组合物时所产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更大倍数(例如，500、1000倍)(包括两者之间大于1的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“减少的”或降低的量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括没有组合物(缺乏试剂或化合物)或有对照组合物时所产生的量的1％、 2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、 19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％或100％的降低，包括两者之间的所有整数。“统计学上显著的”量的其他实例在下文描述。 [0088] 术语“从…获得”是指诸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的样品从个体的特定来源分离，或来自个体的特定来源。例如，提取物可以从直接分离自个体的组织或生物流体获得。“来源于”或“从…获得”还可以指多肽或多核苷酸序列的来源。例如，本发明的AspRS序列可以“来源于”AspRS蛋白水解片段或AspRS剪接变体或以上的一部分的序列信息，不管它们是天然存在的或人工产生的，并因此可以包括该序列，基本上由该序列组成或由该序列组成。 [0089] 本文所用的表述“序列同一性”或者例如包含“与…50％一致的序列”指序列在比较窗中基于一个一个核苷酸或基于一个一个氨基酸一致的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗中比较两个最优比对的序列，确定两条序列中出现的相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、GIy、VaI、Leu、He、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、GIu、Asn、GIn、Cys和Met)的位置数量以得到配对位置数，将该配对位置数除以比较窗(即，窗大小)中的位置总数，并将得到的结果乘以100以得到序列同一性百分比。 [0090] 本文所使用的“剪接点”包括成熟mRNA转录本或所编码的多肽中第一个外显子的3’端与第二个外显子的5’端连接的区域。该区域的大小可以变化，并在一个外显子的3’端与另一个外显子的5’端连接处的确定残基的任一端可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个(包括两者之间的所有整数)核苷酸或氨基酸残基。“外显子”是指已经通过顺式剪接移除前体RNA的一部分(内含子)或已经通过反式剪接将两个或更多个前体RNA分子连接在一 起后，在成熟形式的RNA分子中呈现的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或诸如rRNA或tRNA的非编码RNA的功能形式。取决于上下文，外显子可以指DNA或其RNA转录本中的序列。 “内含子”是指基因中不翻译成蛋白的非编码核酸区域。非编码的内含子节段被转录到前体mRNA(前mRNA)和某些其他RNA(例如长非编码RNA)中，并随后在加工成成熟RNA时通过剪接 去除。 [0091] “剪接变体”是指通过选择性剪接产生的成熟mRNA或其编码的蛋白，所述选择性剪接是指在RNA剪接期间，RNA(初级基因转录本或前mRNA)的外显子以多种途径重新连接的过程。所得的不同mRNA可以翻译成不同的蛋白异构体，从而允许单一基因编码多种蛋白。 [0092] 本文所用的“个体”包括呈现能够用本发明的AspRS多核苷酸或多肽治疗或诊断的症状或处于呈现该症状风险中的任何动物。合适的个体(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物、和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。非人灵长类，以及优选的人类患者包括在内。 [0093] 如本文所用的，“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”包括对能够被本文所述的AspRS多核苷酸或多肽的非常规活性影响的疾病或疾病状态的症状或病理产生的任何期望的效应，并且可以包括被治疗的疾病或疾病状态的一个或多个可测量的标志物的即便极 小的变化或改善。还包括与非Asp疗法相关的治疗，其中本文所述的AspRS序列提供治疗的 临床标志物。“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”并不必然表示疾病或疾病状态或其相关症状的彻底根除或治愈。接受该治疗的个体是有需要的任何个体。临床改善的示例性 标志物对本领域技术人员是显而易见的。 [0094] 利用“载体”或“核酸构建体”来表示在其中可以插入或克隆多核苷酸的多核苷酸分子，优选DNA分子，例如来自质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子。载体优选包含一个或多个独特的限制性位点，并能够在包括靶细胞或组织或者祖细胞或其组织在内的限定的宿主细胞中自主复制，或者能与限定的宿主的基因组整合使得克隆的序列可复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例 如，载体可以是线性或闭环质粒、染色体外元件、小型染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何元件。可选择地，载体可以是当导入宿主细胞时，能被整合进基因组并与它被整合进的染色体一起复制的载体。 [0095] 术语“野生型”和“天然存在的”可交替使用，指具有从天然存在的来源分离的基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最常见的，并因此可被任意地指定为基因的“正常”或“野生型”形式。 [0096] 天冬氨酰-tRNA合成酶多肽 [0097] 本发明通常涉及分离的AspRS多肽、编码该多肽的多核苷酸、与该多肽结合的结合剂、该多肽的类似物、变体和片段等，以及使用上述任何物质的组合物和方法。因此，按照本发明的一方面，提供了具有治疗相关的非常规活性的AspRS多肽，以及包含所述AspRS多肽 的组合物。 [0098] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可交替使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(诸如相应天然存在氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在 的氨基酸聚合物。 [0099] 多肽不被限制为特定的长度，但是，在本发明的背景下，其通常代表全长蛋白的片段，并且可以包括诸如糖基化、乙酰化、磷酸化等的翻译后修饰以及本领域内已知的其他修饰，并且包括天然存在的或非天然存在的修饰。可以使用多种公知的重组技术和/或合成技术来制备本发明的多肽和蛋白，这些技术的示例性实例将在下文进一步讨论。 [0100] 表述“多肽变体”指通过至少一个氨基酸残基的添加、删除或取代而区别于参照AspRS多肽(例如，SEQ ID NO:1或其任意片段，例如D1，包括由SEQ ID NO:1的1-154、1-171、 1-174、1-177、1-31、399-425、413-476或397-425位氨基酸残基组成的片段)，并通常保留至少一种本文所述的非常规活性的多肽。在某些实施方案中，多肽变体通过一个或多个取代 而区别于参照多肽，所述取代可以是本文所述的并且是本领域内已知的保守型或非保守型 取代。在某些实施方案中，多肽变体包含保守型取代，在这方面，本领域熟知一些氨基酸可以改变为具有广泛相似特性的其他氨基酸，而不会改变多肽活性的性质。 [0101] 本发明包括的多肽变体沿其长度通常表现出与野生型哺乳动物AspRS蛋白的相应区域至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同一性(通过下文所述来确定)，所述野生型哺乳动物AspRS蛋白例如SEQ ID NO:1或 其任意片段，例如D1，包括由SEQ ID NO:1的1-154、1-171、1-174、1-177、1-31、399-425、 413-476或397-425位氨基酸残基组成的片段。还包括通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或更多个氨基酸的添加、删除或取代而区别于参照AspRS序列，但保留参照AspRS多肽性质(例如非常规活性)的序列。在某些实施方案中，氨基酸添加或删除发生在SEQ ID NO:1或其片段的C末端和/或N末端，所述片段由SEQ ID NO:1的1-154、1-171、1-174、1-177、1-31、399-425、413- 476或397-425位氨基酸残基组成。在某些实施方案中，氨基酸添加包括邻近这些AspRS片段的C末端和/或N末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、 50或更多个野生型残基(即，来自相应的全长AARS多肽)。 [0102] 在其他实施方案中，变体多肽与相应的AspRS参照序列在至少1％但少于20％、15％、10％或5％的残基上不同。(如果这种比较需要比对，则序列应该进行最大相似性的比对。从删除或插入或错配“环”出的序列被认为是不同的)。适宜地，不同是在非必需残基或保守型取代处的不同或变化。 [0103] 还包括AspRS参照多肽的生物活性“片段”。代表性的生物活性片段通常参与相互作用，例如分子内的或分子间的相互作用。分子间的相互作用可以是特异性结合相互作用 或酶促相互作用。分子间相互作用可以在AspRS多肽与细胞结合伴侣之间发生，所述细胞结合伴侣例如参与AspRS多肽的非常规活性的细胞受体或其他宿主分子。 [0104] 通常，生物活性片段包含具有AspRS参照多肽的至少一种活性的结构域或基序，并且可以包括不同活性结构域中的一个或多个(在一些情况下，是全部)，以及包括具有非常 规活性的片段。在一些情况下，AspRS多肽的生物活性片段具有对于特定的截短的片段独特的生物活性，这样使得全长AspRS多肽可能没有该活性。在一些情况下，生物活性可以通过将生物活性AspRS多肽片段与其他的全长AspRS多肽序列分离，或者通过改变全长AspRS野 生型多肽序列的某些残基以暴露生物活性结构域而被揭示。例如，在某些示例性的实施方 案中，AspRS多肽可以包含本文所示的两亲性螺旋的全部或一部分(参见，例如SEQ ID NO： 3)和/或带正电残基区域(参见，例如SEQ ID NO：5)。在某些实施方案中，两亲性螺旋是本文所述的22个氨基酸的区域。 [0105] AspRS参照多肽的生物活性片段可以是这样的多肽片段，该多肽片段例如是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190、200、220、240、250、260、280、300个或更多个连续或非连续的氨基酸，包括两者之间的所有整数。在其他示例性实施方案中，SEQ ID NO：1的AspRS片段大小的长度范围为约20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、20-80、20-90、20-100、20-125、20-150或20- 175个氨基酸。在其他实施方案中，该片段大小的长度范围为约30-40、30-50、30-60、30-70、 30-80、30-90、30-100、30-125、30-150或30-175个氨基酸。在其他实施方案中，该片段大小的长度范围为约40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、40-100、40-125、40-150或40-175个氨基酸。在其他示例性实施方案中，该片段大小的长度范围为约50-60、50-70、50-80、50-90、 50-100、50-125、50-150或50-175个氨基酸。 [0106] 在某些实施方案中，AspRS多肽是截短的AspRS多肽。本文所用的“截短的”AspRS是指短于其对应的全长AspRS蛋白的天冬氨酰-tRNA合成酶蛋白，例如，由于从所述全长AspRS蛋白N末端和/或C末端移除氨基酸。截短的程度，即从全长AspRS蛋白移除的N末端和/或C末端氨基酸残基的数量，可以明显不同，但是如本文所述，当给予细胞、组织或个体时，仍然提供所需的细胞效应。在某些实施方案中，从全长哺乳动物AspRS蛋白的N末端和/或C末端截去至少约5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350个氨基酸或更多，包括所有中间的长度。中间长度意图包括它们之间的所有整数，例如6、7、8等，51、52、53等，201、202、 203等。合适地，生物活性片段的活性不少于AspRS参照多肽的非常规生物活性的约1％、 10％、25％或50％。 [0107] 还包括AspRS多肽的蛋白水解片段，其可根据多种技术表征、鉴定或衍生。例如，蛋白水解片段可以在体外鉴定，例如通过将全长或其他AspRS多肽与选择的蛋白酶一起孵育，或它们可以被内源性地(即，体内)鉴定。在某些实施方案中，诸如内源蛋白水解片段的蛋白片段可以通过以下方法产生或鉴定，例如，通过在选择的微生物或真核细胞中重组表达全长或其他AspRS多肽，并分离和表征来自其中的内源产生的蛋白片段，所述微生物或真核细胞已被修饰使之包含一种或多种选择的蛋白酶或天然地包含一种或多种可以对选择的 AspRS多肽起作用的蛋白酶。 [0108] 在某些实施方案中，诸如内源(例如，天然存在的)蛋白水解片段的蛋白片段可以从以下部分产生或鉴定，例如多种细胞部分(例如，胞浆、膜、核)和/或多种细胞类型的生长培养基，所述细胞类型包括例如，诸如RAW巨噬细胞(例如，RAW264.7巨噬细胞)的巨噬细胞、T细胞、包括原代T细胞和诸如Jurkat的T细胞系，以及自然杀伤(NK)细胞等。在某些实施方案中，因而产生的诸如内源蛋白水解片段的蛋白片段可以通过诸如质谱的技术或等效技术 来鉴定。一旦体外或内源鉴定的蛋白片段已经产生或被鉴定，它就可以被定位或测序，并且例如，被克隆进表达载体用于重组产生，或合成产生。 [0109] 大量的蛋白酶可以用于产生、鉴定、衍生或表征AspRS蛋白水解片段的序列。一般地，通常根据三个主要标准将蛋白酶分类：(i)所催化的反应，(ii)催化位点的化学性质和(iii)由结构揭示的进化关系。通过催化机理分类的蛋白酶或蛋白水解酶的一般实例包括 天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。 [0110] 大多数天冬氨酸蛋白酶属于胃蛋白酶家族。该家族包括消化酶，例如胃蛋白酶和凝乳酶，以及溶酶体组织蛋白酶D和诸如肾素的加工酶，和某些真菌蛋白酶(例如，青霉蛋白酶(penicillopepsin)、根霉菌蛋白酶(rhizopuspepsin)、壳室囊菌蛋白酶 (endothiapepsin))。天冬氨酸蛋白酶的第二家族包括病毒蛋白水解酶，例如来自AIDS病毒(HIV)的蛋白酶，还被称为逆转录病毒蛋白酶(retropepsin)。 [0111] 丝氨酸蛋白酶包括两个不同的家族。第一，胰凝乳蛋白酶家族，包括哺乳动物酶，例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶和激肽释放酶，第二，枯草杆菌蛋白酶家族，包括诸如枯草杆菌蛋白酶的细菌酶。这两个家族之间的通用3D结构不同，但它们具有相同的活性位点几何构型，并且通过相同的机理进行催化。丝氨酸蛋白酶表现出不同的底物特异性、差异性，这主要与多种酶亚位点(底物残基作用位点)中的氨基酸取代有关。某些丝氨酸蛋 白酶具有扩展的与底物的作用位点，而其他丝氨酸蛋白酶具有限于P1底物残基的特异性。 [0112] 半胱氨酸蛋白酶家族包括诸如木瓜蛋白酶、猕猴桃蛋白酶和菠萝蛋白酶的植物蛋白酶，数种哺乳动物溶酶体组织蛋白酶，胞浆钙蛋白酶(钙激活的)以及数种寄生虫蛋白酶 (例如，锥虫(Trypanosoma)、血吸虫(Schistosoma))。木瓜蛋白酶是原型，并且是该家族中研究最多的成员。对白介素-1-β转化酶的X射线结构的新的解释已经揭示半胱氨酸蛋白水 解酶的一种新的折叠类型。 [0113] 金属蛋白酶是较老的蛋白酶种类中的一种，在细菌、真菌和高等有机体中发现。它们在序列和3D结构上差异显著，但大多数酶都含有具有催化活性的锌原子。在某些情况下，锌可以被诸如钴或镍的另一金属替换而不丧失蛋白水解活性。细菌嗜热菌蛋白酶已被良好表征并且其结晶结构显示锌由两个组氨酸和一个谷氨酸结合。许多金属蛋白酶含有序列基 序HEXXH，其为锌提供两个组氨酸配体。第三配体是谷氨酸(嗜热菌蛋白酶、脑啡肽酶、丙氨酰氨肽酶)或组氨酸(虾红素、粘质沙雷氏菌酶(serralysin))。 [0114] 在某些示例性的实施方案中，可以使用本领域内已知的和可得到的技术、使用多种蛋白水解酶中的任何一种来产生截短的AspRS多肽。示例性的蛋白酶包括，例如，无色肽酶、氨肽酶、安克洛酶、血管紧张素转化酶、菠罗蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、胃促胰酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺)、内蛋白酶Arg-C、内蛋白酶Asp-N、内蛋白酶Glu-C、内蛋白酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、粒酶A、粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、组织激肽释放酶、亮氨酸氨基肽酶(总的)、亮氨酸氨基肽酶(细胞溶质的)、亮氨酸氨基肽酶(微粒体的)、基质金属蛋白酶、蛋氨酸氨基肽酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶、氨酰基脯氨酸二肽酶、链酶蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的碱性蛋白酶、来自曲霉属 (Aspergillus)的蛋白酶、来自佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉 (Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))(碱性的或碱 性蛋白酶)、来自多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的蛋白酶、来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的蛋白酶、来自根霉菌(Rhizopus sp.)的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉 (Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨基肽酶、凝乳酶、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和尿激酶。 [0115] 某些实施方案涉及分离的AspRS多肽，及包含该多肽的药物组合物，和使用它们的方法，所述分离的AspRS多肽包含来源于内源天然存在的AspRS多肽片段的氨基酸序列，或 基本上由这些氨基酸序列组成或由这些氨基酸序列组成，以。在某些实施方案中，如上文所示，诸如内源蛋白水解片段的AspRS蛋白片段的序列可以从以下部分产生或鉴定，例如多种细胞部分(例如，胞浆、膜、核)和/或多种细胞类型的条件培养基，包括原代细胞和细胞系。 这类细胞类型的实例包括但不限于，免疫细胞，例如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞(例如，RAW264.7巨噬细胞，参见实施例5)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞，所述淋巴细胞例如B细胞和T细胞(例如，CD4+辅助细胞和CD8+杀伤细胞)(包括原代T 细胞和诸如Jurkat T细胞的T细胞系)以及自然杀伤(NK)细胞。 [0116] 在某些实施方案中，可以通过诸如质谱的技术或等效技术来鉴定AspRS蛋白片段。仅通过示例的方式而非限制，在某些实施方案中，来自多种生理状态(例如，缺氧、限定饮食、年老、患病)的多种细胞类型、组织或体液的蛋白质组或其部分可以通过1D SDS-PAGE进行分离并按固定间隔将凝胶泳道切成条带，然后该条带可以任选地用诸如胰蛋白酶的合适 的蛋白酶进行消化以释放肽，该肽随后可以通过1D反相LC-MS/MS来分析。所得的蛋白质组 数据可被整合成所谓的肽图(peptograph)，其中在左图中，相对于垂直维度中的SDS-PAGE 迁移(从上到下是分子量从高到低)，以水平维度绘出指定蛋白的序列范围(从左到右是N末 端到C末端)。然后可以对具体肽片段进行测序或定位。在某些实施方案中，AspRS参照片段可以通过其例如与相应的全长AspRS的分子量相比的独特的分子量来表征。 [0117] 如上文所述，多肽变体可以通过一个或多个取代、缺失、添加和/或插入区别于本发明的AspRS多肽。这些变体可以是天然存在的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个本发明的上述多肽序列并按照本文所述用本领域内公知的多种技术中的任何一种 评估其生物活性。 [0118] 在其他的示例性实施方案中，所述变体可以是天然存在的或非天然存在的剪接变体，其中所述多肽具有至少一种非常规活性，例如本文所述的非常规活性。在其他的示例性实施方案中，相对于野生型AspRS多肽序列，所述变体包含一个或多个天然存在的或非天然存在的点突变，其中所述多肽具有至少一种非常规活性，例如本文所述的非常规活性。 [0119] 在某些实施方案中，变体包含保守型取代。“保守型取代”是指氨基酸被具有相似性质的另一个氨基酸所取代，这样肽化学领域技术人员会预测到基本上未改变的多肽的二级结构和亲水性。可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构内进行修饰，并且仍可获得编码 具有所需特性的变体或衍生多肽的功能分子。当希望改变多肽的氨基酸序列来产生等同的 甚至改进的本发明的AspRS多肽的变体时，例如，本领域技术人员可以根据表1改变编码DNA序列的一个或多个密码子。 [0120] 例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不会造成与诸如抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点的结构的相互作用结合能力的明显损失。因为通常是蛋白的相互作用能力和性质限定该蛋白的生物功能活性，所以可以在蛋白序列中进行某 些氨基酸序列取代，也当然可以在其基本的DNA编码序列中进行取代，而仍然获得具有相似性质的蛋白。因此，已考虑到可以在所公开的组合物的多肽序列或编码所述多肽的相应DNA序列中进行各种改变，而不会造成所需的功效或活性的明显损失。 [0121] 表1 [0122] [0123] [0124] 在进行这些改变时，还应当考虑氨基酸的亲水指数。本领域内普遍理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物学功能中的重要性(Kyte and Doolittle,1982，通过引 用并入本文)。例如，已知氨基酸的相对亲水特性与得到的蛋白的二级结构有关，而该二级结构随之限定了该蛋白与诸如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等其他分子的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸具有指定的亲水指数(Kyte and Doolittle, 1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(- 3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。 [0125] 本领域内已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，而仍产生具有相似生物活性的蛋白，即仍获得生物学功能等同的蛋白。在进行这些改变时，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代， 并且更特别优选的是在±0.5以内的那些氨基酸的取代。 [0126] 本领域内还应当理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。如美国专利第4,554,101号详述，已将下述亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+ 3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+ 0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸取代，且仍获得生物学上等同的蛋白。在这类改变中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代 是优选的，特别优选的是在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选的是在±0.5以内的 那些氨基酸的取代。 [0127] 如上文所述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对的相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。综合考虑了上述各种特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的，并且包括：精氨酸与赖氨酸、谷氨酸与天冬氨酸、丝氨酸与苏氨酸、谷氨酰胺与天冬酰胺、以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。 [0128] 此外，任何多核苷酸可以被进一步修饰以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于，在5’和/或3’端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶连接；和/或包含非传统碱基，例如次黄嘌呤核苷、Q核苷(queosine)和怀丁苷，以及乙酰基-、甲基-、硫代-和其他修饰形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。 [0129] 还可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，以及带有具有相似亲水性值的不带电荷极性头部基团的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守型改变的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以含有非保守型改变或可选择地含有非保守型改变。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列的区别在于5个或更少的氨基酸的取代、缺失或添 加。还可以(或可选择地)通过例如对多肽的二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸的 缺失或添加来修饰变体。 [0130] 多肽在蛋白的N末端可以包含信号(或前导)序列，其在翻译的同时或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以与连接物或其他序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如，多聚组氨酸)，或用于增强多肽与固相载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。 [0131] 当比较多肽序列时，如果两个序列中的氨基酸序列在如下文所述进行最大对应比对时是相同的，则可以认为所述两个序列是“同一的”。通常通过在比较窗中比较序列来进行两个序列间的比较，从而鉴定和比较序列相似性的局部区域。本文所用的“比较窗”是指至少约20个连续位置、通常30-约75个、40-约50个连续位置的节段，其中在将序列与具有相同数量连续位置的参照序列最佳比对后，可以将所述序列与参照序列进行比较。 [0132] 例如，可以使用Lasergene生物信息学软件套装中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用默认参数，进行用于比较的序列的最佳比对。该程序包括以下参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in Proteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白质的进化改变模型-用 于检验远距离关系的矩阵)；In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图谱),National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes(比对和系统发生的标准方法)pp.626-645Methods in Enzymology(酶学方法)vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.and Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17； Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4: 406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy(数值分类法-数值分类法的原理和实践),Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Proc.Nat'l Acad., Sci.USA 80:726-730。 [0133] 可选择地，可以通过以下来进行用于比较的序列的最佳比对：Smith and Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法、Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法搜索、这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件 包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)、或检查。 [0134] 适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。例如，可以按照本文所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，从而确定本发明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)可以公开获得进行BLAST分析的 软件。对于氨基酸序列而言，可以将评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时停止每个方向的字符命中延伸：当累积比对评分从其最大达到的值下降量X时；由于一个或多个负评分残基比对的累积而使累积评分达到0或低于0时；或达到任一序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定了所述比对的灵敏度和速度。 [0135] 在一个示例性方法中，通过在至少20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中，与用于两个序列最佳比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的多肽序列的一部分可以包含20％或更少的、通常为5％-15％、或 10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通过以下来计算百分比：确定两个序列中都存在的相同氨基酸残基的位置数量来产生配对位置数，将配对位置数除以参照序列中(即窗的大小) 的位置总数，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。 [0136] 在本发明的某些实施方案中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽是指直接地或间接地通过氨基酸连接物共价连接于一个或多个异源多肽序列(融合伴 侣)的本发明的AspRS多肽。形成融合蛋白的多肽通常是将C末端连接至N末端，但是它们也 可以是C末端连接至C末端、N末端连接至N末端、或N末端连接至C末端。融合蛋白的多肽可以为任何顺序。 [0137] 可以为了几乎任何所需目的设计并包括融合伴侣，只要它们对多肽所需的活性没有不利影响。例如，在一个实施方案中，融合伴侣包含有助于以高于天然重组蛋白的产量表达蛋白的序列(表达增强子)。可以选择另外的融合伴侣以增加蛋白的溶解性或使蛋白被靶 向所需的细胞内区室。其他融合伴侣包括促进蛋白纯化的亲和性标签。 [0138] 更一般地，可以利用与诸如Fc片段的异源序列的融合来去除AspRS多肽的不需要的特性或改善AspRS多肽所需的特性(例如，药物动力学特性)。例如，与异源序列的融合可以增加AspRS多肽的化学稳定性、降低免疫原性、改善体内靶向和/或增加循环半衰期。 [0139] 与异源序列的融合还可以用于产生双功能融合蛋白，例如不仅通过AspRS多肽具有选择的非常规活性，而且还能够通过异源多肽修饰(即，刺激或抑制)其他途径的双功能 蛋白。这些途径的实例包括，但不限于，多种免疫系统相关的途径，诸如先天或获得性免疫激活途径，或者细胞生长调节途径，诸如血管生成作用。在某些方面，异源多肽可以与AspRS多肽协同作用以调节个体中的细胞途径。可以用于生成双功能融合蛋白的异源多肽的实例 包括，但不限于，促血小板生成素、细胞因子(例如，IL-11)、趋化因子和多种造血生长因子，以及以上的生物活性片段和/或变体。 [0140] 通常可以用标准技术制备融合蛋白。例如，可以分别组装编码所需融合的多肽组分的DNA序列，并将其连入合适的表达载体中。使用或不使用肽连接物将编码一种多肽组分的DNA序列的3'端与编码第二多肽组分的DNA序列的5'端连接，使得序列的读码框是同相 的。这允许翻译为同时保留两个组分多肽的生物活性的单一融合蛋白。 [0141] 如果需要，可以用肽连接物序列将第一和第二多肽组分隔开足以确保每种多肽能折叠成其二级和三级结构的距离。用本领域内公知的标准技术将这类肽连接物序列并入融 合蛋白。可以基于下述因素选择某些肽连接物连接物序列：(1)它们采取柔韧的、伸展的构型的能力；(2)它们不会采取与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构的能力； 和(3)可以与所述多肽功能表位反应的疏水或带电残基的缺乏。优选的肽连接物序列包含 Gly、Asn和Ser残基。诸如Thr和Ala的其他接近中性的氨基酸也可以用于连接物序列中。可以有效地用作连接物的氨基酸序列包括公开于Maratea et al.,Gene 40:39 46(1985)； Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号 和第4,751,180号中的那些氨基酸序列。通常，连接物序列的长度可以为1-约50个氨基酸。 当第一和第二多肽具有可以用来隔开功能结构域和防止空间干扰的非必需N末端氨基酸区 时，不需要连接物序列。 [0142] 将连接的DNA序列可操作地连接于合适的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5'。类似地，需要结束翻译和转录终止信号的终止密码子仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3'。 [0143] 通常，多肽和融合多肽(以及它们的编码多核苷酸)是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是从其原始环境中移出的多肽或多核苷酸。例如，如果将天然存在的蛋白与天然系统中的部分或所有的共存物质分开，则该天然存在的蛋白是分离的。优选地，这类多肽是至少约90％纯的，更优选为至少约95％纯的和最优选为至少约99％纯的。例如，如果多核苷酸被克隆入不是天然环境的一部分的载体中，则认为所述多核苷酸是分离的。 [0144] 在其他的实施方案中，本发明的AspRS多肽可以是二聚体的一部分。二聚体可以包括，例如，两个相同AspRS多肽之间的同二聚体、两个不同AspRS多肽(例如，全长AspRS多肽和截短的AspRS多肽或两个不同的截短的AspRS多肽)之间的异二聚体、和/或AspRS多肽和 异源多肽之间的异二聚体。单体和/或二聚体可以是可溶的，并且可以被分离为或纯化为同质性。诸如AspRS多肽和异源多肽之间的异二聚体的某些异二聚体可以是双功能的。 [0145] 还包括AspRS多肽的单体，包括分离的AspRS单体，所述分离的AspRS单体无论是否由于一个或多个取代、截短、缺失、添加、或化学修饰或这些改变的组合，都基本上不与它们自己二聚化(同源二聚化)或与第二种AspRS多肽二聚化(异源二聚化)。在某些实施方案中，单体AspRS多肽具有生物活性，包括二聚体或多聚体AspRS多肽复合物不具有的非常规活 性。 [0146] 在其他的实施方案中，本发明的AspRS多肽可以是多单元复合物的一部分。本发明的多单元复合物可以包括，例如，至少2、3、4、或5或更多的单体。本发明的单体和/或多单元复合物可以是可溶的，并且可以被分离为或纯化为同质性。多单元复合物的单体单元彼此 之间可以是不同的、同源的、基本上同源的或相同的。然而，本发明的多单元复合物包括至少1个单体，所述单体包含如本发明所述的一种AspRS多肽或在其他的实施方案中，包含至 少两种或更多种如本文所述的AspRS多肽。 [0147] 共价连接的单体可以是直接(通过键)连接的或间接(例如，通过连接物)连接的。为了直接连接本文的多肽单体，修饰本文的多肽以增强二聚化可能是有益的。例如，可以通过一个或多个半胱氨酸的添加或取代来修饰AspRS多肽的一个或多个氨基酸残基。产生诸 如半胱氨酸取代的氨基酸取代或其他修饰来促进连接的方法是本领域技术人员所公知的。 [0148] 如本文所述，本发明的某些实施方案还考虑修饰的AspRS多肽的用途，包括改善AspRS多肽所需特性的修饰。本发明AspRS多肽的示例性修饰包括，但不限于，一个或多个组成氨基酸的化学和/或酶促衍生作用，包括侧链修饰、主链修饰和N末端与C末端修饰，这些修饰包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化；和碳水化合物或脂质部分、辅因子等的连接。示例性修饰还包括AspRS多肽的聚乙二醇化(参见，例如，Veronese and Harris,Advanced Drug Delivery Reviews(药物递送发展综述)54:453-456,2002，其通过引用的方式并入本 文)。 [0149] 在某些方面，可以利用化学选择性连接技术来修饰本发明截短的AspRS多肽，诸如通过以位点特异性和受控的方式连接聚合物。这种技术通常依赖于通过化学的或重组方式 将化学选择性锚定物并入蛋白骨架，以及用携带互补连接物的聚合物进行随后的修饰。因 此，可以控制组装过程和产生的蛋白-聚合物缀合物的共价结构，这使得诸如功效和药物代谢动力学特性的药物性质的合理优化成为可能(参见，例如，Kochendoerfer,Current Opinion in Chemical Biology 9:555-560,2005)。 [0150] 本文所述的AspRS多肽可以通过本领域人员已知的任何合适的方法制备，例如通过重组技术。例如，AspRS多肽可以通过包括下述步骤的方法来制备：(a)制备包含多核苷酸序列的构建体，该多核苷酸序列编码AspRS多肽并被可操作地连接到调节元件；(b)将构建 体导入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达AspRS多肽；以及(d)从宿主细胞分离AspRS多肽。 利用以下所述的标准方案方便地制备重组AspRS多肽：例如Sambrook,et al.,(1989,同 上)，特别是16和17节；Ausubel et al.,(1994,同上)，特别是10和16章；以及Coligan et al.,Current Protocols in Protein Science(John Wiley&Sons,Inc.1995-1997)，特别 是第1、5和6章。 [0151] 除了重组产生方法，还可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生本发明的多肽及其片段(Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以用手动技术或通过自 动化来进行蛋白合成。例如，可以用Applied Biosystems的431A肽合成仪(Perkin Elmer) 实现自动化合成。可选择地，不同的片度可以分别通过化学方式合成并利用化学方法进行 组合以制备所需的分子。 [0152] 多核苷酸组合物 [0153] 本发明还提供了编码本发明AspRS多肽的分离的多核苷酸，以及包含这些多核苷酸的组合物。如本文所述，本发明的AspRS多核苷酸还包括引物、探针、反义寡核苷酸和RNA干扰剂，所述引物、探针、反义寡核苷酸和RNA干扰剂包含AspRS参照多核苷酸的全部或一部分、它们与这些参照多核苷酸的全部或一部分互补或者与这些参照多核苷酸特异性杂交。 [0154] 如本文所用的术语“DNA”和“多核苷酸”和“核酸”是指从具体物种的总基因组DNA分离出来的DNA分子。因此，编码多肽的DNA节段是指这样的DNA节段，其含有一种或多种编码序列，而基本上从获得所述DNA节段的物种的总基因组DNA分离出来或纯化出来。术语“DNA节段”和“多核苷酸”包括DNA节段和这些节段的较小片段，并且还包括重组载体，包括例如，质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。 [0155] 如本领域技术人员所理解的，本发明的多核苷酸序列可以包括基因组序列、基因组外序列和质粒编码的序列以及表达或被改造来表达蛋白、多肽、肽等的较小的工程基因 节段。这类节段可以是天然分离的，或人工合成修饰的。 [0156] 如本领域技术人员所认识的，多核苷酸可以是单链(编码的或反义的)或双链的，以及可以是DNA(基因组的、cDNA或合成的)或RNA分子。其他编码或非编码序列可以，但不需要，存在于本发明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不需要，与其他的分子和/或支持物质连接。 [0157] 多核苷酸可以包含天然序列(即，编码AspRS或其部分的内源序列)，或可以包含变体，或该序列的生物学功能等同物。如下面进一步论述，多核苷酸变体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选使得所编码的多肽的所需活性相对于未修饰的多肽没有显著减弱。通常，可以按本文所述来评价对于所编码的多肽的活性的影响。 [0158] 在其他的实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含与天冬氨酰-tRNA合成酶相同或互补的序列的不同长度的连续区段，其中所述分离的多核苷酸编码本文所述的 AspRS。例如，本发明提供的多核苷酸编码至少约100、150、200、250、300、350、400、450或500或更多个本发明AspRS多肽的连续氨基酸残基，以及所有的中间长度。应当容易理解，此处的“中间长度”表示所提到的值之间的任何长度，例如101、102、103等；151、152、153等；201、 202、203等。 [0159] 本发明的多核苷酸，不管其编码序列自身的长度，可以与其他DNA序列组合，所述其他DNA序列例如启动子、聚腺苷化信号、其他限制性酶切位点、多克隆位点、其他编码节段等，使得它们的总长度可以显著不同。因此可以考虑，可以利用几乎任意长度的多核苷酸片段，总长度优选地受在计划的重组DNA流程中制备和使用的便利性的限制。此外，本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，有很多核苷酸序列编码本文所述的多肽。这些多核苷酸中的某些与任何天然基因的核苷酸序列具有低的同源性。虽然如此，本发明特别考 虑到由于密码子使用中的差异而不同的多核苷酸，例如，为人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因包括在本发明 范围内。等位基因是由于一个或多个诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的突变而改变的内源基因。所得到的mRNA和蛋白可以，但不需要，具有改变的结构或功能。可以用标准技术鉴定等位基因(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)。 [0160] 可以利用本领域内已知的和可获得的多种公认的技术中的任何一种来制备、操控和/或表达多核苷酸及其融合物。例如，编码本发明的多肽的多核苷酸序列或其融合蛋白或功能等同物可以用于重组DNA分子中以指导AspRS多肽在适当的宿主细胞中表达。由于遗传 密码子固有的简并性，可以产生编码基本上相同或在功能上等同的氨基酸序列的其他DNA 序列，并且这些序列可以用于克隆和表达给定的多肽。 [0161] 如本领域技术人员所理解地，在一些情况下，产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列是有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主优选的密码子以增加 蛋白表达速率或以产生具有所需特性的重组RNA转录本，所述所需特性例如半衰期长于从 天然存在序列产生的转录本的半衰期。 [0162] 此外，可以使用本领域内公知的方法改造本发明的多核苷酸序列，从而为了多种原因改变多肽编码序列的多核苷酸，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变。 [0163] 为了表达所需的多肽，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体中，即包含插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。可以用本领域技术 人员公知的方法构建含有编码目的多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。 这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、以及体内遗传重组。这些技术描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆，实验手册)(1989)和 Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术) (1989)中。 [0164] 多种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以用来包含和表达多核苷酸序列。这些表达载体/宿主系统包括但不限于，诸如用重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌的微生物；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，例如基于病毒的表达系统。 [0165] 表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是与宿主细胞蛋白相互作用来进行转录和翻译的载体的那些非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)。这些元件在它们的强度和特异性上可以不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型启动子和诱导型启动子。例如，当在细菌系统克隆时，可以使用诱导型启动子，例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,La Jolla,Calif.)或SPORTl质粒 (Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)的杂合lacZ启动子等。在哺乳动物细胞系统中，通常优选 来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果生成包含编码多肽的序列的多个拷 贝的细胞系是必需的，则基于SV40或EBV的载体可以有利地与适当的选择标志物一起使用。 [0166] 也可以使用特定的起始信号来实现编码目的多肽的序列的更高效的翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。如果将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中，则可以不需要其他的转录或翻译控制信号。然而，如果仅将编码序列或其一部分插入，则应该提供包括ATG起始密码子在内的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应该在正确的读码框中以确保全部插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是 不同来源的，可以是天然的或合成的。可以通过包含适于所用的特定细胞系统的增强子来 增强表达效率，诸如文献中描述的那些增强子(Scharf et al.,Results Probl.Cell Differ.20:125-162(1994))。 [0167] 此外，可以基于宿主细胞株调节插入的序列的表达或以所需的方式加工所表达的蛋白的能力来选择宿主细胞株。多肽的这些修饰包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。切割蛋白的“前原(prepro)”形式的翻译后加工也可以用来促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择诸如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138的、对于这类翻译后活性具有特异性的细胞体系和特征机制的不同宿主细胞，以确保外源蛋白的正确修饰和 加工。 [0168] 为了长期、高产量地产生重组蛋白，通常优选稳定的表达。例如，可以用表达载体转化稳定表达目的多核苷酸的细胞系，所述表达载体可以在同一载体或分别的载体上含有病毒复制起点和/或内源表达元件以及选择标记基因。引入载体后，在将细胞转至选择培养基之前，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择标记的目的是赋予对于选择的抗 性，并且选择标记的存在允许成功表达引入的序列的细胞的生长和恢复。可以用适合细胞 类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性克隆。 [0169] 可以用任何数量的选择系统来恢复转化的细胞系。这些选择系统包括，但不限于，可以分别用于tk-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell 11:223-232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817-823(1990))基因。另外，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性可以作为选择的基础；例如，提供甲氨蝶呤抗性的dhfr (Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567-70(1980))；提供对氨基糖苷类、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin et al.,J.MoI.Biol.50:1-14(1981))；以及分 别提供对氯磺隆和草丁膦(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性的als或pat(Murry,同 上)。 [0170] 用于检测和测量多核苷酸编码的产物的表达的多种方法是本领域已知的，所述方法利用本领域已知的对所述产物特异的多克隆或单克隆抗体。实例包括酶联免疫吸附测定 (ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。在Hampton et al., Serological Methods,a Laboratory Manual(1990)和Maddox et al.,J.Exp.Med.158: 1211-1216(1983)中以及其他地方描述了这些和其他测定。 [0171] 广泛多种的标记和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可以用于各种核酸和氨基酸测定中。制备用于检测多核苷酸相关序列的标记的杂交或PCR探针的方法包括寡核 苷酸标记、缺口平移、末端标记或利用标记的核苷酸的PCR扩增。可选择地，可以将序列或其任何一部分克隆入载体中，用于产生mRNA探针。这种载体在本领域是已知的，并且可以商 购，并且可以通过添加诸如T7、T3或SP6的合适的RNA聚合酶和标记的核苷酸来体外合成RNA探针。可以使用多种可商业购得的试剂盒进行这些步骤。可以使用的合适的报告分子或标 记物包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或产色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。 [0172] 可以在适合蛋白从细胞培养物中表达和回收的条件下，培养用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。根据所用的序列和/或载体，重组细胞产生的蛋白可以是分泌的或包含在细胞内。如本领域技术人员所理解的，可以将包含本发明多核苷酸的表达载体设计为包含 指导编码的多肽通过原核生物或真核生物细胞膜分泌的信号序列。可以用其他的重组构造 将编码目的多肽的序列连接至编码促进可溶蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列。 [0173] 按照本发明的另一方面，可以例如使用基因治疗技术将编码本发明多肽的多核苷酸体内递送至个体。基因治疗通常是指将异源核酸转移至患有该治疗所针对的病症或疾病 状态的哺乳动物，尤其是人的某些细胞、靶细胞。以下述方式将核酸引入选择的靶细胞，使得异源DNA表达并从而产生所编码的治疗产物。 [0174] 如本文所教导的能用于基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、腺相关病毒(AAV)，或优选地诸如逆转录病毒的RNA病毒。优选地，所述逆转录病毒载体是鼠或鸟逆转录病毒的衍生物或是慢病毒载体。优选的逆转录病毒载体是慢病毒载体。可 以插入单一外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、SIV、BIV、HIV和劳氏肉瘤病毒(RSV)。多种其他的逆转录病毒载体可以并入多个基因。所有的这些载体能转移或并入选择性标志物基因，以便鉴定和产生转染的细胞。例如，通过将来源于锌指的DNA结合目的多肽序列以及编码对于特异性靶细胞上的受体的配体的另一基因插入病毒载体，可以使所述 载体成为靶标特异性的。例如，通过插入编码蛋白(二聚体)的多核苷酸，可以使逆转录病毒载体成为靶标特异性的。通过使用抗体来靶向于逆转录病毒载体可以实现示例性的靶向。 本领域技术人员应当知道或利用有限的实验就能容易确定具体的多核苷酸序列，所述具体 的多核苷酸序列能被插入逆转录病毒基因组中，从而允许含有锌指-核苷酸结合蛋白多核 苷酸的逆转录病毒载体的靶标特异性递送。 [0175] 由于重组逆转录病毒是缺陷型的，所以它们需要辅助以产生感染性载体颗粒。例如，可以通过使用辅助细胞系来提供该辅助，所述辅助细胞系含有编码在LTR中的调节序列控制下的所有逆转录病毒结构基因的质粒。这些质粒缺少能使包装机制识别用于封装的 RNA转录本的核苷酸序列。缺失包装信号的辅助细胞系包括但不限于，例如PSI.2、PA317和PA12。由于未包装基因组，所以这些细胞系产生空的病毒体。如果将逆转录病毒载体导入包装信号完整的这类细胞中，而用其他目的基因替代结构基因，则所述载体可以被包装并可 以产生载体病毒体。通过该方法产生的载体病毒体随后可以用来感染诸如NIH 3T3细胞的 组织细胞系，以产生大量嵌合逆转录病毒体。 [0176] 也能使用用于基因治疗的“非病毒”递送技术，包括，例如，DNA-配体复合物、腺病毒-配体-DNA复合物、DNA的直接注射、CaPO4沉淀、基因枪技术、电穿孔、脂质体、脂转染等。这些方法中的任何一种对于本领域技术人员而言是可广泛获得的，并适于用在本发明中。 其他合适的方法对于本领域技术人员而言是可获得的，并且应当理解，可以使用可获得的 任何转染方法来实现本发明。通过将分离的DNA分子封装于脂质体颗粒中并将该脂质体颗 粒与靶细胞的细胞膜接触，能实现脂转染。脂质体是自我组装的胶体颗粒，其中由诸如磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱的两性分子组成的脂质双分子层封装了周围介质的一部分，这样所 述脂质双分子层包围了亲水内部。可以这样构建单层或多层脂质体，使得内部含有所需的 化学品、药物或本发明中的分离的DNA分子。 [0177] 某些实施方案包括在下文所述的严紧条件下能与参照AspRS多核苷酸序列或它们的互补物杂交的多核苷酸互补物。如本文使用的，术语“低严紧、中等严紧、高严紧或极高严紧条件下的杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以见于Ausubel et al.,(1998,同上)，第6.3.1-6.3.6节。在该参考文献中描述了水性和非水性方法，可以使用任一种。 [0178] 本文参考的低严紧条件包括以及涵盖用至少约1％v/v-至少约15％v/v的甲酰胺，和至少约1M-至少约2M盐在42℃杂交；以及用至少约1M-至少约2M盐在42℃洗涤。低严紧条 件还可以包括用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS在65℃杂交，以及用(i)2×SSC、0.1％SDS，或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS在室温洗涤。低严紧条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中杂交，随后至少在50℃(对于低严紧条件，洗涤的温度可以提高到55℃)下，在0.2×SSC、 0.1％SDS中洗涤两次。 [0179] 中等严紧条件包括和涵盖用至少约16％v/v-至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M-至少约0.9M的盐在42℃杂交，以及用至少约0.1M-至少约0.2M盐在55℃洗涤。中等严 紧条件还可以包括用1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS在 65℃杂交，以及用(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS在60-65℃洗涤。中等严紧条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×SSC中杂 交，随后在60℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。高严紧条件包括和涵盖用至少约31％v/v-至少约50％v/v的甲酰胺和至少约0.01M-至少约0.15M的盐在42℃杂交，以及 用约0.01M-约0.02M的盐在55℃洗涤。 [0180] 高严紧条件还可以包括用1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS在65℃杂交，以及用(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS在超过65℃的温度下洗涤。高严紧条件的一个实施方案包括在约45℃下在6× SSC中杂交，随后在65℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极高严紧条件的一个实施方案包括用0.5M磷酸钠、7％SDS在65℃杂交，随后在在65℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。 [0181] 本领域熟知其他严紧条件，并且本领域技术人员会认识到能够操纵多种因素来优化杂交的特异性。最后洗涤的严紧性优化可以确保高度的杂交。对于具体的实例，参见 Ausubel et al,同上，在第2.10.1至2.10.16页以及Sambrook et al.(1989,同上)的第 1.101至1.104节。 [0182] 尽管严紧洗涤通常在约42℃至68℃的温度下进行，但是本领域技术人员应当理解，其他温度可以适用于严紧条件。最大杂交速率通常发生在低于Tm约20℃至25℃下以形 成DNA-DNA杂合体。本领域公知，Tm是解链温度，或者是两条互补的多核苷酸序列分离的温度。用于估算Tm的方法是本领域熟知的(参见Ausubel et al.,同上在第2.10.8页)。 [0183] 通常，完美匹配的DNA双螺旋的Tm可以根据以下公式近似预测：Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)，其中：M是Na+的浓度，范围优选为 0.01摩尔至0.4摩尔；％G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基之和占碱基总数的百分比，在30％至 75％G+C的范围内；％甲酰胺是甲酰胺浓度的体积百分比；长度是DNA双螺旋中碱基对的数 目。随机错配的碱基对的数目每增加1％，双股DNA的Tm降低约1℃。对于高严紧条件，一般在Tm-15℃下进行洗涤，或对于中等严紧条件，在Tm-30℃下进行洗涤。 [0184] 在杂交方案的一个实例中，将包含固定的DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记的探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt's溶液(0.1％ 聚蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL变性的鲑鱼精子DNA)中于42℃下过夜杂交。然后将膜进行两次相继的中等严紧洗涤(即，用2×SSC、0.1％SDS，在45℃下进行15分钟；随后是用2×SSC、0.1％SDS，在50℃下进行15分钟)，随后是两次相继的更高的严紧洗涤(即，用0.2×SSC、0.1％SDS，在55℃下进行12分钟；随后是用0.2× SSC和0.1％SDS溶液，在65-68℃下进行12分钟)。 [0185] 本发明的实施方案还包括无论是用于检测、扩增、反义治疗还是其他目的的寡核苷酸。为了这些和相关的目的，术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”或“寡核苷酸(oligo)”或“寡聚体”意图包括单数形式的“寡核苷酸”以及复数形式的“寡核苷酸”，并且是指能在本发明的扩增方法中以及随后的检测方法中用作试剂的两个或更多个核苷酸、核苷、核碱基 或相关化合物的任何聚合物。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA和/或它们的类似物。 [0186] 术语寡核苷酸并不用必须指出该试剂的任何特定功能，而是仅一般地用于覆盖本文所述的所有这类试剂。寡核苷酸可以具有多种不同的功能，例如如果寡核苷酸能够与互 补链杂交并在核酸聚合酶的存在下能被进一步延伸，则它可以起引物的作用，如果寡核苷 酸包含能被RNA聚合酶识别的序列并允许转录，则它起启动子的作用，如果适当放置和/或 修饰，它可以起防止杂交或妨碍引物延伸的作用。寡核苷酸可以起探针或反义试剂的作用。 寡核苷酸实际上可以是任何长度的，该长度仅受其具体的作用所限，例如在扩增反应中、在检测扩增反应的扩增产物中或在反义或RNA干扰应用中的作用。本文所述的任何寡核苷酸 可以用作引物、探针、反义寡聚体或RNA干扰剂。 [0187] 本文所用的术语“引物”是指在由诸如缓冲液和温度所限定的合适的条件下，在四种不同的核苷三磷酸和诸如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶的聚合试剂的存在下，能够作为模板指导的DNA合成的起始位点的单链寡核苷酸。在任何给定的情况下，引物的长度取决于例如引物的预期用途，并且范围通常为约15-30个核苷酸，但是可以使用更短和更长的引物。 短引物分子通常需要更低的温度以便与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映 模板的确切序列，但必须足够互补以便与该模板杂交。引物位点是模板上与引物杂交的区 域。引物对是一组引物，包括与待扩增的序列的5’端杂交的5’上游引物和与待扩增的序列的3’端的互补物互补物杂交的3’下游引物。 [0188] 本文所用的术语“探针”是指可以被特定靶标识别的表面固定的分子。参见，例如，以美国专利第6,582,908号为例展示具有10、12和更多碱基的探针的所有可能组合。本文所用的探针和引物通常包含已知序列的至少12-15个连续核苷酸。为了增强特异性，还可以使用更长的探针和引物，例如包含AspRS参照序列或其互补物的至少20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或至少150个核苷酸的探针和引物。探针和引物可以显著长于这些实例，并且应当理解可以使用由本领域知识以及本说明书，包括表格、图和序列表支持的任何长度。 [0189] 制备和使用探针和引物的方法描述于参考文献中，例如Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),2.sup.nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Press,Plainview N.Y.；Ausubel,F.M.et al.(1987) Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),Greene Publ.Assoc.&Wiley-lntersciences,New York N.Y.；Innis,M.et al.(1990)PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(PCR实验技术，方法和应用指南), Academic Press,San Diego Calif。PCR引物对可以来源于已知序列，例如通过使用用于该目的的计算机程序，例如Primer(0.5版,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge Mass)。 [0190] 可以使用领域内已知的软件选择用作引物或探针的寡核苷酸。例如，OLIGO 4.06软件用于选择每条高达100个核苷酸的PCR引物对，和用于分析寡核苷酸和来自高达32kb的 输入多核苷酸序列的高达5,000个核苷酸的更大的多核苷酸。Primer3引物选择程序(可从 Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research,Cambridge Mass公开获得)允 许使用者输入“引物错配库(mispriming library)”，其中避免作为引物结合位点的序列由使用者指定。通过上述任何选择方法鉴定的寡核苷酸和多核苷酸片段可用于杂交技术中， 例如，用作PCR或测序引物、微阵列元件或特异性探针以鉴定核酸样品中完全或部分互补的多核苷酸。寡核苷酸选择的方法不限于本文所述的那些方法。 [0191] 术语“反义寡聚体”或“反义化合物”或“反义寡核苷酸”可交换地使用，并且是指每个均携带碱基配对部分的环状亚单元序列，其通过亚单元间的键而连接，所述亚单元间的键允许碱基配对部分通过Watson-Crick碱基配对与核酸(通常是RNA)中靶序列杂交，从而 在靶序列中形成核酸：寡聚体异源双螺旋，并通常以此防止该RNA的翻译。还包括使用它来调节选择的AspRS转录本和/或其相应的多肽的表达的方法，所述选择的AspRS转录本例如 剪接变体或蛋白水解片段。 [0192] 反义寡核苷酸可以包含约8-40个亚单元，通常约8-25个亚单元，并优选约12-25个亚单元。在某些实施方案中，寡核苷酸可以具有与靶序列精确互补的序列或如下文所定义 的接近互补的序列。在某些实施方案中，靶标和反义靶向序列之间互补的程度足以形成稳 定的双螺旋。反义寡聚体与靶RNA序列之间互补的区域可以短至8-11个碱基，但优选12-15 个碱基或更多，例如12-20个碱基，或12-25个碱基，包括这些范围之间的所有整数。约14-15个碱基的反义寡聚体通常是足够长的，从而使之在靶向于选择的AspRS转录本时具有唯一 的互补序列。 [0193] 在某些实施方案中，长达40个碱基的反义寡聚体可以是合适的，其中至少有例如10-12个碱基的最少碱基数与靶序列互补。然而，通常小于约30的寡聚体长度被优化为易于向细胞内摄取或主动向细胞内摄取。对于下文进一步描述的某些寡聚体，结合稳定性和摄 取的最佳平衡通常发生在18-25个碱基的长度。包括由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基组成的反义寡聚体(例如PNA、LNA、2’-OMe、MOE、吗啉代)，其中至少约6、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或 40个连续或非连续碱基与它们的AspRS靶序列或其变体互补。 [0194] 在某些实施方案中，反义寡聚体可以与AspRS核酸靶序列100％互补，或其可以包含错配，例如，以适应变体，只要在寡聚体和AspRS核酸靶序列之间形成的异源双螺旋能足以稳定地耐受细胞核酸酶的作用和体内可能发生的其它降解模式。下文讨论了不易受核酸 酶切割的寡聚体主链。如果存在错配，相对于杂合体双螺旋的中间区域，其对末端区域产生的不稳定影响较小。根据双螺旋稳定性的公知原则，允许错配的数目将取决于寡聚体的长 度，双螺旋中G：C碱基对的百分比，和双螺旋中错配的位置。尽管这样的反义寡聚体没有必要与AspRS核酸靶序列100％互补，但是其对于与靶序列稳定且特异性地结合，从而调节核 酸靶标的生物活性，例如AspRS蛋白的表达是有效的。 [0195] 寡聚体和靶序列之间形成的双螺旋的稳定性是结合Tm和双螺旋对细胞酶促切割的敏感性的函数。反义寡核苷酸与互补序列RNA的Tm可以通过常规方法测量，例如描述于 Hames et al.,Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交),IRL Press,1985,pp.107-108或 描述于Miyada C.G.and Wallace R.B.,1987,Oligonucleotide hybridization techniques(寡核苷酸杂交技术),Methods Enzymol.Vol.154pp.94-107.中的那些方法。在 某些实施方案中，反义寡聚体与互补序列RNA之间的结合Tm可以高于体温并优选高于50℃。 60-80℃范围内或更高的Tm是优选的。根据公知原则，可以通过增加双螺旋中C：G配对碱基的比例和/或通过增加异源双螺旋的(碱基对)长度来增加寡聚体化合物与互补碱基的RNA 杂合体之间的Tm。 [0196] 可以设计反义寡聚体用于阻断或抑制mRNA的翻译或用于抑制天然前mRNA剪接加工或诱导靶mRNA的降解，并可以称该反义寡聚体“针对”或“靶向”其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列可以包含AspRS mRNA转录本的任何编码或非编码序列，并因而可以在 外显子中或在内含子中。在某些实施方案中，靶序列在AspRS中是相对独特或异常的，并被选择用于降低选择的AspRS蛋白水解片段或剪接变体的表达。在某些实施方案中，靶位点包含加工前mRNA的3’或5’剪接位点或分支点。剪接位点的靶序列可以包含这样的mRNA序列，该mRNA序列在其5’端具有加工前mRNA中剪接受体点下游或剪接供体点上游的1-约25-约50 个碱基对。当寡聚体以本文所述的方式靶向靶标核酸时，该寡聚体更常被称为“靶向”生物学相关的靶标，例如参照AspRS多核苷酸。 [0197] 寡核苷酸的“亚单元”是指一个核苷酸(或核苷酸类似物)单元。该术语可以指具有或不具有连接的亚单元间的键的核苷酸，但是当涉及“带电的亚单元”时，电荷通常位于亚单元间的键(例如，磷酸酯或硫代磷酸酯键或阳离子键)当中。 [0198] 寡核苷酸的环状亚单元可以基于核糖或另一戊糖，或在某些实施方案中，基于改变的或修饰的基团。修饰的寡核苷酸主链的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯，包括3’亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯，包括3’氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯，它们的2’-5’连接的类似物和具有反向极性的那些，其中邻近的核苷酸单元对以3’-5’与 5’-3’连接或以2’-5’与5’-2’连接。还考虑肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基寡核苷酸(2’-Ome)、2’-甲氧基乙氧基寡核苷酸(MOE)、吗啉代、以及领域内已知的其他寡核苷酸。 [0199] 嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或次黄嘌呤。还包括以下碱基，例如吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲115氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5’烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴代尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷、2-硫脲核苷、4-硫脲核苷、怀丁苷、wybutoxosine、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5’-羧基甲基氨基甲基-2-硫脲核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌酐、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲核苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫脲核苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖Q核苷、尿苷-5-羟丙酸、2-巯基胞苷、苏氨酸衍生物等(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090；Uhlman&Peyman,同上)。在这方面， “修饰的碱基”是指上文所列举的除了腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)之外的核苷酸碱基，这类碱基可以在反义分子中的任何位置使用。本领域技术人员应当理解，根据寡聚体的用途，T和U是可交换的。例如，与更像RNA的诸如2’-O-甲基反义寡核苷酸的其他反义化学基相比，T碱基可以显示为U。 [0200] 寡核苷酸通常与诸如靶DNA或RNA的靶序列互补。术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对原则而相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分地”，其中只有部分核酸碱基根据碱基配对原则匹配。或者，核酸之间可以是“完全”或“全部”的互补性(100％)。核酸链间的互补性程度对核酸链间的杂交的效率和强度具有重要的影响。尽管通常期望完美的互补性，但是某些实施方案可以包括与靶序列的一个或多个，但优选20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个错配。包括寡聚体中任意位置处的变异。在某些实施方案中，相对于内部的变异，序列中接近寡聚体末端的变异通常是更优选的，并且如果存在，通常在5’和/或3’末端的约10、9、 8、7、6、5、4、3、2、或1个核苷酸内。 [0201] 术语“靶序列”是指寡核苷酸所针对的靶RNA的一部分，即通过互补序列的Watson-Crick碱基配对与寡核苷酸杂交的序列。在某些实施方案中，靶序列可以是AspRS mRNA的连续区域(例如，AspRS mRNA的独特剪接点)，或可以由该mRNA的非连续区域组成。 [0202] 术语“靶向序列”或某些实施方案中的“反义靶向序列”是指寡核苷酸中与DNA或RNA靶分子中的靶序列互补(还表示基本上互补)的序列。反义化合物的全部序列或只有一 部分可以与靶序列互补。例如，在具有20-30个碱基的寡核苷酸中，约6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个可以是与靶区域互补的靶向序列。通常，靶向序列由连续碱基形成，但是可选地，靶向序列可以由非连续序列形成，当将所述非连续序列例如从寡核苷酸的相反末端放置在一起时构成跨越靶序列的序列。 [0203] 当以反向平行构型发生杂交时，靶序列和靶向序列被描述为彼此“互补”。靶向序列可以具有与靶序列“近似的”或“大体的”互补性，并仍为了本发明的目的起作用，即其仍可以是功能“互补的”。 [0204] 如果寡聚体在生理条件下(Tm基本上高于45℃，优选至少50℃或通常为60℃-80℃或更高)与靶标(例如，AspRS参照多核苷酸或其互补物)杂交，，则寡核苷酸与靶多核苷酸序列“特异性杂交”。这类杂交优选符合严紧杂交条件。在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交时的温度。此外，在反义寡聚体与靶序列具有“近似的”或“大体的”互补性，以及具有精确的互补性的条件下，可以发生这类杂交。 [0205] 术语特异性结合或特异性杂交通常是指在选择的杂交条件下寡核苷酸探针或寡核苷酸序列不仅与其预期的靶基因序列结合，并且不与样品中其他靶序列显著结合，从而 在靶标池中区分其预期的靶标和所有其他靶标。如本文所述，与其预期靶序列特异性杂交 的探针还可以在选择的杂交条件下检测浓度差异。 [0206] 如上文所述，本文提供的某些寡核苷酸包含肽核酸(PNA)。还包括“锁核酸”亚单元(LNA)。LNA的结构在领域内是已知的，例如，Wengel,et al.,Chemical Communications(1998)455；Tetrahedron(1998)54,3607,以及Accounts of Chem.Research(1999)32, 301)；Obika,et al.,Tetrahedron Letters(1997)38,8735；(1998)39,5401,以及 Bioorganic Medicinal Chemistry(2008)16,9230。某些寡核苷酸可以包含通过不带电的 或基本上不带电的键连接的具有碱基配对部分的基于吗啉代的亚单元。术语“吗啉代寡聚 体”或“PMO”(氨基磷酸酯或磷酸二胺吗啉代寡聚体)是指由吗啉代亚单元结构组成的寡核苷酸类似物，其中(i)该结构通过含有磷的键连接在一起，所述含有磷的键为1-3个原子长，优选2个原子长，并且优选是不带电的或是阳离子，将一个亚单元的吗啉代氮与邻近亚单元的5’环外碳连接，并且(ii)每个吗啉代环具有通过碱基特异氢键而与多核苷酸中的碱基有效结合的嘌呤或嘧啶或等效的碱基配对部分。 [0207] 在某些实施方案中，可以通过逐步固相合成，利用上述参考文献中详述的方法以及下文关于具有混合的或不带电的和阳离子的主链键的寡核苷酸的合成的方法制备寡核 苷酸。在某些情况下，可取的是，将其他化学部分添加到寡核苷酸上，例如，用以增强药代动力学或促进化合物的俘获或检测。这些部分通常可以根据标准合成方法共价连接到寡聚体 的末端。例如，聚乙二醇部分或其他亲水性聚合物(例如具有10-100个单体亚单元的一种) 的添加，可以用于提高溶解度。一种或多种带电基团，例如带负电荷的基团，例如有机酸，可以增强细胞摄入。 [0208] 多种可检测分子可以用于致使寡核苷酸可被检测，例如可以直接(例如通过光发射)或间接(例如通过与荧光标记的抗体结合)检测的放射性同位素、荧光色素、染料、酶、纳米粒子、化学发光标志物、生物素或本领域内已知的其他单体。 [0209] 某些实施方案涉及RNA干扰(RNAi)剂，所述RNA干扰剂靶向AspRS参照多核苷酸的一种或多种mRNA转录本，包括mRNA转录本的片段或变体。还包括使用该试剂调节选择的 AspRS转录本的水平的方法，所述AspRS转录本例如AspRS剪接变体或蛋白水解片段。 [0210] 术语“双链的”是指包含这种区域的两个单独的核酸链，其中所述区域中链的至少一部分足以互补成氢键并形成双螺旋结构。术语“双螺旋”或“双螺旋结构”是指双链分子的区域，其中两个单独的链基本上互补并因此彼此杂交。“dsRNA”是指具有双螺旋结构的核糖核酸分子，所述双螺旋结构包含两条互补的和反向平行的核酸链(即有义链和反义链)。不是所有的dsRNA的核苷酸必须展现Watson-Crick碱基对，两条RNA链可以是基本上互补的。 RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。 [0211] dsRNA的链足够互补以杂交形成双螺旋结构。在某些实施方案中，互补的RNA链可以小于30个核苷酸，长度小于25个核苷酸，或甚至长度为19-24个核苷酸。在某些方面，互补的核苷酸序列的长度可以为20-23个核苷酸或长度为22个核苷酸。 [0212] 在某些实施方案中，RNA链的至少一条包含长度为1-4个核苷酸的核苷酸突出。在其他实施方案中，一条或两条链是钝末端。在某些实施方案中，dsRNA还可以包含至少一个化学修饰的核苷酸。 [0213] 本发明的某些实施方案可以包含微RNA。微RNA代表有机体中天然产生的一大类小RNA，其中某些能调节靶基因的表达。通过Dicer从约70个核苷酸的单链发夹前体转录本形 成微RNA。(V.Ambros et al.Current Biology 13:807,2003)。 [0214] 某些实施方案还可以利用短干扰RNA(siRNA)。siRNA试剂的每条链的长度可以等于或少于35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个核苷酸。该链的长度优选为至少 19个核苷酸。例如，每条链可以长度为21-25个核苷酸。优选的siRNA试剂具有17、18、19、29、 21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋区，和一个或多个突出，优选2-3个核苷酸的一侧或两侧3’突出。 [0215] 如本文所用的“单链RNAi试剂”是由单分子制成的RNAi试剂。RNAi试剂可以包含通过链内配对形成的双螺旋区，例如其可以是或可以包含发夹或盘-柄结构。单链RNAi试剂的长度为至少14个核苷酸，并且更优选至少15、20、25、29、35、40或50个核苷酸。其长度优选小于200、100或60个核苷酸。 [0216] 发夹RNAi调节剂可以具有等于或至少12、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋区。双螺旋区的长度可以优选等于或小于200、100或50。双螺旋区的长度的某些范围为15-30、17-23、19-23和19-21个核苷酸。发夹可以具有单链突出，或末端非配对区，优选在3’端，并优选在发夹的反义侧。在某些实施方案中，突出的长度可以为2-3个核苷酸。 [0217] 本发明还包括利用核酶的寡核苷酸。还包括可以表达本文所述的靶向AspRS的序列的载体递送系统。包括表达siRNA或其他形成双螺旋的RNA干扰分子的载体。示例性的递 送系统可以包括病毒载体系统(即病毒介导的转导)，包括，但不限于，逆转录病毒(例如，慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和疱疹病毒载体以及本领域内已知的其他病毒载体。 [0218] 靶向AspRS多核苷酸参照序列或其互补物的一部分或多部分的寡核苷酸和RNAi试剂可以用在本文所述的任何治疗、诊断或药物筛选方法中，并对本领域技术人员而言是显 而易见的。 [0219] 抗体组合物、其片段和其他结合剂 [0220] 按照另一方面，本发明还提供了对于本文所公开的多肽、或其一部分、变体或衍生物表现出结合特异性的结合剂以及使用所述结合剂的方法，所述结合剂例如抗体、抗体的抗原结合片段、可溶性受体、小分子、适体等。优选地，这些结合剂能有效地调节本发明的AspRS多肽所介导的一种或多种非常规活性。例如，在一些实施方案中，所述结合剂是与本发明的AspRS多肽结合并抑制所述AspRS多肽与一种或多种其细胞结合伴侣结合的能力的 结合剂。因此，这些结合剂通过拮抗本发明的AspRS多肽的活性可以用来治疗或预防所述 AspRS多肽介导的疾病、病症或其他疾病状态。 [0221] 如果抗体或其抗原结合片段与多肽以可检测的水平(例如，在ELISA测定中)发生反应，并且在相似条件下不与无关的多肽发生可检测地反应，则认为所述抗体或其抗原结 合片段与本发明多肽“特异性结合”、“免疫结合”和/或是“免疫反应性的”。 [0222] 在本文背景下所用的免疫结合通常是指免疫球蛋白分子和该免疫球蛋白特异性针对的抗原之间发生的非共价型相互作用。可以用相互作用的解离常数(Kd)来表示免疫结 合相互作用的强度或亲和力，其中Kd越小表示亲和力越高。可以用本领域内公知的方法对 所选多肽的免疫结合特性进行定量。一种这类方法需要检测抗原结合位点/抗原复合物形 成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力和等同影响 双向速率的几何参数。因此，可以通过计算浓度和结合与解离的实际速率来确定“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(kOff)。kOff/kon的比值可以消去与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。参见例如，Davies et al.(1990)Annual Rev.Biochem.59:439- 473。 [0223] 抗体的“抗原-结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链N-末端可变区(“V”)的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区中的三个高度不同的区段被称为“高变区”，其插在称为“框架区”或“FR”的较保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然见于免疫球蛋白中高变区之间并邻近高变区的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间彼此相对 排列，形成抗原结合表面。该抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且每条重和轻链的三个高变区被称作“互补决定区”或“CDR”。 [0224] 结合剂可以是例如带有或不带有肽组分的核糖体、RNA分子或多肽。在优选的实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的 任何一种制备抗体。参见，例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗 体：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory,1988。对感兴趣的多肽特异的单克隆 抗体可以使用例如Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技术以及对 其改进的技术来制备。本发明的多肽可以用于例如亲和层析步骤的纯化过程中。 [0225] 通过优先蛋白水解切割IgM可以产生“Fv”片段，但是蛋白水解切割IgG或IgA免疫球蛋白分子很少产生“Fv”片段。然而，更通常使用本领域内已知的重组技术衍生出Fv片段。 Fv片段包括非共价VH::VL异二聚体，该异二聚体包括保留了天然抗体分子的大部分抗原识 别和结合能力的抗原结合位点。Inbar et al.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 69:2659- 2662；Hochman et al.(1976)Biochem 15:2706-2710；和Ehrlich et al.(1980)Biochem 19:4091-4096。 [0226] 单链Fv(“sFv”)多肽是从融合基因表达的共价连接的VH::VL异二聚体，所述融合基因包括通过肽编码连接物连接的VH和VL编码基因。Huston et al.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85(16):5879-5883。已有多种方法描述了分辨化学结构，用于将 来自抗体V区的天然聚集的但化学分离的轻多肽链和重多肽链转换成sFv分子，所述sFv分 子会折叠成基本上相似于抗原结合位点的结构的三维结构。参见，例如，Huston等的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；和Ladner等的美国专利第4,946,778号。 [0227] 每个上述分子包括分别插在重链和轻链FR组之间的重链和轻链CDR组，所述FR组为CDR提供支持并且限定了CDR相对于彼此的空间关系。如本文所用的术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N末端开始，将这些区分别表示为“CDR1”、 “CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括6个CDR，包含来自每条重链和轻链V区的CDR组。 在本文中，包含单一CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽被称为“分子识别单元”。多个抗原抗体复合物的晶体分析已经证实，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，所述分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。 [0228] 如本文所用的术语“FR组”是指为重链或轻链V区的CDR组的CDR提供框架的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠为抗原结合位点，尤其是直接邻近CDR的FR残基。在FR中，某些氨基酸残基和某些结构特征是高度保守的。在这点上，所有的V区序列包含约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠成结合位点时，CDR表现为突出的环状基序，该环状基序形成抗原结合表面。普遍公认的是，FR的保守结构区影响CDR环到某些“常规”结构的折叠形状，与具体的CDR氨基酸序列无关。而且，已知某些FR残基参与非共价的结构域间接触，该结构域间接触使抗体重链和轻链的相互作用稳 定。 [0229] 很多包含来自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子已有描述，包括以下嵌合抗体：具有与人恒定结构域融合的啮齿动物V区及其相关CDR(Winter et al.(1991)Nature 349:293-299；Lobuglio et al.(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:4220- 4224；Shaw et al.(1987)J Immunol.138:4534-4538；和Brown et al.(1987)Cancer Res.47:3577-3583)，在与合适的人抗体恒定结构域融合之前移植进人支持FR中的啮齿动 物CDR(Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534-1536；和Jones et al.(1986)Nature 321:522-525)，以及由重组相嵌的 (veneered)啮齿动物FR支持的啮齿动物CDR(欧洲专利公开第519,596号，于1992年12月23 日公布)。这些“人源化”分子被设计为将对于啮齿动物抗人抗体分子的不希望的免疫应答降至最低，该免疫应答限制了那些部分在人接受体中的治疗应用的持续时间和功效。 [0230] 如上文所述，结合剂包括“肽”。术语肽通常是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。在某些实施方案中，术语“肽”是指相对短的多肽，包括由约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个(包括两者之间的所有整数和范围(例如，5-10、8-12、10-15))氨基酸组成并且与AspRS多肽、其细胞结合伴侣或二者相互作用的肽。如本文所述，肽可以由天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸组成。 [0231] 结合剂可以包含肽模拟物或其他小分子。“小分子”是指合成来源或生物来源(生物分子)的有机化合物，但通常不是聚合物。有机化合物是指其分子包含碳的一大类化合 物，通常排除仅含有碳酸盐、碳的单纯氧化物或氰化物的那些化合物。“生物分子”通常是指由活的有机体产生的有机分子，包括大的聚合分子(生物聚合物)，例如肽、多糖和核酸以及小分子，例如初级代谢产物、次级代谢产物、类脂、磷脂、糖脂、甾醇类、甘油脂类、维生素类和激素类。“聚合物”通常是指由重复结构单元组成的大分子或高分子，所述重复结构单元通常由共价化学键连接。 [0232] 在某些实施方案中，小分子具有小于1000道尔顿的分子量，通常为约300-700道尔顿，并包括约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、500、650、600、750、700、 850、800、950或1000道尔顿。 [0233] 结合剂还包括适体。适体的实例包括核酸适体(例如，DNA适体、RNA适体)和肽适体。核酸适体通常是指已经通过例如SELEX(通过指数富集的配体的系统性进化)的体外选 择或等效方法的重复轮次被工程化改造，从而与多种分子靶标结合的核酸种类，所述分子 靶标例如小分子、蛋白、核酸并且甚至是细胞、组织和有机体。因此，包括与本文所述的 AspRS多肽和/或它们的细胞结合伴侣结合的核酸适体。 [0234] 肽适体通常包括两端连接到蛋白支架(即，通常将肽适体的结合亲和力增强到与抗体的结合亲和力相当的水平(例如，在纳摩尔范围内)的双结构约束)的可变的肽环。在某些实施方案中，可变环长度可以由约10-20个(包括二者之间的所有整数)氨基酸组成，并且该支架可以包括具有良好溶解度和容纳性质的任何蛋白。某些示例性的实施方案可以使用 细菌蛋白硫氧还蛋白A作为支架蛋白，待插入还原活性位点的可变环(野生型蛋白中的- Cys-Gly-Pro-Cys-环)具有可以形成二硫键的两个半胱氨酸侧链。因此，包括与本文所述的AspRS多肽和/或它们的细胞结合伴侣结合的肽适体。可以利用本领域内已知的不同系统， 包括酵母双杂交系统，进行肽适体选择。 [0235] 如上文所述，本发明的AspRS多肽和结合剂可以用于本文所述的任何诊断、药物开发或治疗方法中。 [0236] 在本发明的另一个实施方案中，可以将本发明的诸如单克隆抗体的结合剂与一种或多种目的试剂结合。例如，可以将治疗剂直接地或间接地(例如，通过连接物基团)与合适的单克隆抗体结合(例如，共价键合)。当试剂和抗体中的每一个都具有能与另一个反应的 取代基时，试剂和抗体之间的直接反应是可能的。例如，一个上的诸如氨基或巯基的亲核基团能与另一个上的诸如酸酐或酸卤化物的含有羧基的基团反应或与含有良好离去基团(例 如，卤化物)的烃基反应。 [0237] 可选择地，通过连接物基团将治疗剂和抗体结合是可取的。连接物基团的功能可以是间隔物来使抗体与试剂保持距离，从而避免结合能力的干扰。连接物基团也可以增加 试剂或抗体上的取代基的化学反应性，并因此增强结合效率。化学反应性的增强也可以促 进试剂、或试剂上的官能团的效用，否则将无法实现这点。 [0238] 对本领域技术人员显而易见的是，包括同功能的和异功能的在内的多种双功能或多功能试剂(例如描述于Pierce Chemical Co.,Rockford,IL目录中的那些)可以用作连接 物基团。例如，可以通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基而实现结合。有多个参考文献描述了这类方法，例如，Rodwell等的美国专利第4,671,958号。 [0239] 如果当治疗剂脱离本发明免疫缀合物的抗体部分时，其更有效，则可能需要使用在细胞内化过程中或细胞内化时可切割的连接物基团。多种不同的可切割的连接物基团已 有描述。试剂从这些连接物基团的细胞内释放机制包括通过以下的切割：二硫键的还原(例如，Spitler的美国专利第4,489,710号)、光不稳定的键的照射(例如，Senter等的美国专利第4,625,014号)、衍生氨基酸侧链的水解(例如，Kohn等的美国专利第4,638,045号)、血清补体介导的水解(例如，Rodwell等的美国专利第4,671,958号)、和酸催化的水解(例如， Blattler等的美国专利第4,569,789号)。 [0240] 将多于一种的试剂与抗体结合是可取的。在一个实施方案中，多个试剂分子与一个抗体分子结合。在另一个实施方案中，可以将多于一种的试剂与一个抗体结合。不考虑特定实施方案，可以用很多方法制备具有多于一种的试剂的免疫缀合物。例如，可以将多于一种的试剂直接与抗体分子结合，或可以使用提供多个连接位点的连接物。 [0241] 制剂和给药 [0242] 通常将本发明的组合物(例如，多肽、多核苷酸、抗体等)配制于药学可接受的或生理可接受的溶液中，用于单独给予细胞、组织或动物或与一种或多种其他治疗形式联合给予细胞、组织或动物。还应当理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其他试剂联合给药，例如，其他的蛋白或多肽或各种药物活性剂。对所述组合物中还包括的其他组分几乎没有 限制，只要其他试剂对本发明的AspRS多肽的预期达到的所需效果没有不利影响。 [0243] 在本发明的药物组合物中，药学可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员所公知的，在多个治疗方案中使用本文所描述的具体组合物的合适的剂量和治疗方案 的开发也是本领域技术人员所公知的，包括例如，口服、胃肠外、静脉内、鼻内、颅内以及肌肉内给药和制剂。 [0244] 在某些应用中，可以将本文所公开的药物组合物通过口服给药递送至个体。因此，可以将这些组合物与惰性稀释液或与可吸收可食用的载体一起配制、或可以将它们封装于硬壳或软壳的明胶胶囊中、或可以将它们压成片剂、或可以将它们直接合并到饮食食物中。 [0245] 在某些情况下，将本文所公开的药物组合物经胃肠外、静脉内、肌肉内甚或腹膜内递送是理想的，如例如在美国专利第5,543,158号、美国专利第5,641,515号和美国专利第5,399,363号(其每一篇通过引用的方式以其整体并入本文)中所描述的。可以在适当混合 了诸如羟丙纤维素的表面活性剂水中制备作为游离碱或药学可接受的盐的活性化合物的 溶液。也可以在甘油、液态聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散液。在常规的保存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。 [0246] 适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，通过引用将其全部特别并入本 文)。在任何情况下，所述形式应该是无菌的，并且流动性应达到易于注射的程度。在制备和保存的条件下，它应该是稳定的，并且应该针对诸如细菌和真菌的微生物的污染作用而进 行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)、以上合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。通过以下可以保持合适的流动性： 例如，使用诸如卵磷脂的包被、对于分散液保持所需的颗粒大小和使用表面活性剂。各种抗细菌剂和抗真菌剂可以促进预防微生物作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等。在多数情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。通过在组合物中使用诸如单硬脂酸铝和明胶的延迟吸收的试剂可以实现注射组合物的延长吸收。 [0247] 对于水性溶液的胃肠外给药，例如，如果需要，应当使溶液适当缓冲，并且首先用足够的盐溶液或葡萄糖使液体稀释剂成为等渗的。这些特定的水性溶液尤其适于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药和腹膜内给药。在该方面，根据本公开，可以利用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可将1个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并且或者加至 1000ml的皮下注射液或者在计划的输注部位进行注射(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学),第15版,pp.1035-1038和1570-1580)。根据 待治疗个体的疾病状态，剂量必然会发生某些变化。在任何情况下，负责给药的人应当确定对于单独个体的合适剂量。而且，对于人类给药，制剂应该满足FDA生物制剂办公室标准所要求的无菌、致热原性、以及一般的安全和纯度标准。 [0248] 可以通过以下制备无菌的可注射溶液：将合适的溶剂中的所需量的活性化合物与上面列举的各种其他成分合并，如果需要，随后进行过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分合并入无菌媒介中来制备分散液，所述无菌媒介含有基本的分散介质和来自那些上 文列举的所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方 法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术可以从事先的无菌过滤溶液产生活性成分外加任 何其他所需成分的粉末。 [0249] 可以将本文所公开的组合物配制为中性形式或盐形式。药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的自由氨基基团形成的)，并且所述酸加成盐可以与诸如盐酸或磷酸的无机酸 形成或与诸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。与自由羧基基团形成的盐也可以来源于诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱和诸如异丙 胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。通过配制后，按照与剂型相容的方式和治疗有效量给予溶液。可以以多种剂型容易地给予制剂，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。 [0250] 如本文所用的“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒介、包被、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这样的介质和试剂作为药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑在治疗组合物中使用它。补充的活性成分也能合并入组合物中。 [0251] 短语“药学可接受的”是指这样的分子实体和组合物，当将其给予人时，不会产生过敏性或相似的不良反应。包含作为活性成分的蛋白的水性组合物的制备是本领域公知的。通常，将这类组合物制备成或为液体溶液或为悬浮液的注射液；还可以制备成在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式。也可以将制剂乳化。 [0252] 在某些实施方案中，可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶递送媒介递送药物组合物。通过鼻内气溶胶喷雾将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺的方法已有描述，例如，美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号(通过引用将每一篇的全部特别 并入本文)。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga et al.,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物 (美国专利第5,725,871号，通过引用将其全部特别并入本文)的药物递送在制药行业内也 是公知的。同样，聚四氟乙烯支持基质的形式的跨粘膜的药物递送描述于美国专利第5, 780,045号(通过引用将其全部特别并入本文)。 [0253] 在某些实施方案中，可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等进行递送，用于将本发明组合物引入合适的宿主细胞中。特别是，可以配制本发明组合物用于封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中的递送。可以用已知的和常规的技术进行这类递送媒介的配制和使用。 [0254] 包含本发明组合物的试剂盒 [0255] 在其他方面，本发明提供了包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器填充了如本文所述的本发明的一种或多种多肽、多核苷酸、抗体、多单元复合物、以上的组合物等。所述试剂盒包括如何使用这些组合物的书面说明书(例如，调节细胞信号转导、血管生成、癌症、炎性条件等)。 [0256] 本文的试剂盒还可以包含一种或多种其他的治疗剂或待治疗的适应症所适用的或所需要的其他组分。如果需要，其他的治疗剂可以容纳在第二容器中。其他治疗剂的实例包括，但不限于，抗肿瘤剂、抗炎剂、抗细菌剂、抗病毒剂、血管生成剂等。 [0257] 本文的试剂盒还可以包含一种或多种注射器或实施计划递送方式所必需或所需要的其他组分(例如，支架、可植入的贮库等)。 [0258] 使用方法 [0259] 本发明的实施方案还包括使用本文所述的AspRS组合物或“试剂”用于诊断、药物开发和/或治疗目的的方法。术语AspRS“试剂”通常是指AspRS多核苷酸、AspRS多肽、结合剂和本文所述的其他化合物。对于诊断目的而言，AspRS试剂可以以多种不限制的方法使用，从而区分不同的细胞类型或不同的细胞状态，或用于鉴定具有相关疾病或疾病状态的个 体。对于药物开发目的而言，AspRS试剂可以用于鉴定AspRS多肽的一种或多种细胞“结合伴侣”，表征AspRS多肽的一种或多种“非常规”活性，鉴定选择性地或非选择性地激动或拮抗AspRS多肽与其结合伴侣的相互作用的试剂，和/或鉴定选择性或非选择性地激动或拮抗 AspRS多肽的一种或多种“非常规”活性的试剂。对于治疗目的而言，本文所提供的AspRS试剂或组合物可以用于治疗下文所述的多种疾病或疾病状态。 [0260] A.诊断 [0261] 如上文所述，本文所述的AspRS试剂可以用于诊断测定中。这些实施方案包括检测一种或多种新鉴定的AspRS蛋白片段的AspRS多核苷酸序列或相应的多肽序列或其一部分。 在某些实施方案中，一种或多种新鉴定的AspRS序列的存在或水平与一种或多种细胞类型 或细胞状态有联系或相关。因此，如上文所述，AspRS序列的存在或水平可以用于区分不同的细胞类型或不同的细胞状态。可以根据基于多核苷酸和/或多肽的诊断技术来检测AspRS 序列的存在或水平。 [0262] 本文提供的某些方法依赖于AspRS序列的差异表达，来表征细胞、组织或个体的疾病状态或状态并且将其与另一细胞、组织或个体区分。非限制性的实例包括，检测生物样品中AspRS序列的存在或水平以区分不同种类的细胞或组织，不同组织或器官的细胞，诸如新生的或成体的细胞发育状态，细胞分化状态，诸如健康、患病和受治疗的状况，细胞内和细胞外部分，以及原代细胞培养物和其他细胞培养物，例如永生化细胞培养物。 [0263] 差异表达通常是指相对于合适的对照中AspRS多核苷酸或多肽序列的表达水平，相同序列的一种或多种基因表达水平在统计学上的显著性差异。统计学上的显著性差异可 以指所测量的表达水平的增加或降低，所述测量是通过RNA水平、蛋白水平、蛋白功能或诸如本文所述的那些基因表达的任何其他相关测量进行的。 [0264] 如果结果不可能是偶然发生的，则结果通常被称为统计学上显著的。测试或结果的显著性水平通常涉及概率统计假定检验概念。在简单情况下，统计学上的显著性可以被 定义为当零假设事实上为真时做出否决该零假设的判定的概率(被称为I型错误或“假阳性 确定”的判定)。该判定通常用p值进行：如果p值小于显著性水平，则否决零假设。p值越小，结果越显著。贝叶斯因子也可用于确定统计学上的显著性(参见，例如，Goodman S.,Ann Intern Med 130:1005-13,1999)。 [0265] 在更复杂的但实际上重要的情况下，测试或结果的显著性水平可以反映在这样的分析中，其中当零假设事实上为真的时做出否决该零假设的判定的概率不超过规定的概 率。该类分析允许那些应用，其中决定否决的概率可以远小于零假设中所包含的某些假定 集合的显著性水平。 [0266] 在某些示例性的实施方案中，统计学上显著的差异表达可以包括这样的情况，其中相对于合适的对照，可疑的生物样品中给定的AspRS序列的表达水平提供表达上至少约 1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.9X、2.0X、2.2X、2.4X、2.6X、2,8X、3.0X、4.0X、 5.0X、6.0X、7.0X、8.0X、9.0X、10.0X、15.0X、20.0X、50.0X、100.0X或更大的差异(即，可以更高或更低表达的差异表达)，包括二者之间的所有整数和小数(例如，1.24X、1.25X、2.1X、 2.5X、60.0X、75.0X等)。在某些实施方案中，统计学上显著的差异表达可以包括这样的情况，其中相对于合适的对照，可疑的生物样品中给定的AspRS序列的表达水平提供表达上至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、 90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000百分比(％)或更大的差异(即，可以更高或更低的差异表达)，包括二者之间的所有整数和小数。 [0267] 作为额外的实例，还可以通过进行本文所述及领域内已知的Z检验确定差异表达，即计算绝对Z评分(参见实施例1)。Z检验通常用于鉴定样品平均值和群体平均值之间的显 著性差异。例如，相对于95％置信区间(即5％的显著性水平)的标准正常表(例如，对照组 织)，绝对值大于1.96的Z评分指示非随机性。对于99％的置信区间，如果绝对Z大于2.58，意味着p<.01，并且差异更加显著——可以更高置信地否决零假设。在这些和相关实施方案 中，1.96、2、2.58、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更高的绝对Z评分，包括两者之间的所有小数(例如，10.1、10.6、11.2等)，可以为统计学上的显著性提供有力标准。在某些实施方案中，大于6的绝对Z评分提供特别高的统计学上的显著性。 [0268] 基本上相似地通常是指生物样品与参考对照之间的表达水平缺乏统计学上的显著性差异。基本上相似的表达水平的实例可以包括这样的情况，其中相对于参照样品，可疑的生物样品中给定的SSCIGS的表达水平提供表达上少于.05X、0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、 0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X.、1.1X、1.2X、1.3X或1.4X的差异(即，可以更高或更低表达的差异表达)，包括二者之间的所有小数(例如，.15X、0.25X、0.35X等)。在某些实施方案中，差异表达可以包括这样的情况，其中相对于参照样品，可疑的生物样品中给定的AspRS序列的表达水平提供表达上少于0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、30、40、50百分比(％)的差异(即，可以更高或更低的差异表达)。 [0269] 在某些实施方案中，例如当使用Affymethx Microarray检测AspRS多核苷酸或多肽序列的表达水平时，还可以通过平均表达值确定差异表达，所述平均表达值由Affymethx Microarray Suite 5软件(Affymetrix,Santa Clara,CA)或其他相似软件所概括，通常折 合成1000的平均表达值。 [0270] 本发明的实施方案包括检测AspRS多核苷酸或多肽参照序列或其部分的存在或水平以区分不同有机体或物种的细胞、组织或其他生物样品的方法，其中该序列的存在或水 平与选择的有机体或种类相关。通常的实例包括在人与细菌、真菌、植物和其他非人动物的任意组合之间进行区分的方法。动物中包括在人与脊椎动物和无脊椎动物的任意组合之间 进行区分的方法，包括诸如鱼、两栖动物、爬行类、鸟和非人哺乳动物的脊椎动物以及诸如昆虫、软体动物、甲壳类和珊瑚虫等无脊椎动物。非人哺乳动物中包括在人与非人哺乳动物的任意组合之间进行区分的方法，所述非人哺乳动物来自非洲猥目、象鼩目、管齿目、蹄兔目、长鼻目、海牛目、带甲目、披毛目、树鼩目、皮翼目、灵长目、啮齿目、兔形目、猬形目、鼩形目、翼手目、鳞甲目、鲸目、食肉目、奇蹄目或偶蹄目。灵长目包括猴子、猿、大猩猩和黑猩猩以及领域内已知的其他种类。因此，本文所述的AspRS多核苷酸或多肽参照序列或变体的存在或水平可以用于鉴定诸如细胞、组织或器官的给定的生物样品的来源，所述鉴定通过区 分这些有机体的任意组合，或通过区分人与这些有机体的任意一种或多种(例如有机体组) 来进行。在某些实施方案中，还可以通过将AspRS序列或其部分的存在或水平与预定值比较来确定给定的生物样品的来源。 [0271] 本发明的实施方案包括检测AspRS多核苷酸或多肽参照序列或其部分的存在或水平，以区分来自不同组织或器官的细胞或其他生物样品的方法。非限制性的实例包括区分 来自以下的任意组合的细胞或其他生物样品的方法：皮肤(例如，真皮、表皮、皮下组织层)、毛囊、神经系统(例如，脑、脊髓、外周神经)、听觉系统或平衡器官(如，内耳，中耳，外耳)、呼吸系统(例如，鼻、气管、肺)、胃食管组织、胃肠道系统(例如，口腔、食道、胃、小肠、大肠、直肠)、血管系统(例如，心脏、血管和动脉)、肝脏、胆囊、淋巴/免疫系统(例如，淋巴结、淋巴滤泡、脾脏、胸腺、骨髓)、泌尿生殖系统(如，肾、输尿管、膀胱、尿道、子宫颈、输卵管、卵巢、子宫、外阴、前列腺、尿道球腺体、附睾、前列腺、精囊、睾丸)、肌肉骨骼系统(例如，骨骼肌、平滑肌、骨、软骨、肌腱、韧带)、脂肪组织、乳房以及内分泌系统(例如，下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺、肾上腺)。因此，根据本文所述的AspRS多核苷酸或多肽序列的联合，这些方法可以用于鉴定或表征细胞或其他生物样品所来源的组织或器官。 [0272] 本发明的实施方案包括检测AspRS多核苷酸或多肽参照序列或其部分的存在或水平，以区分或表征细胞的发育或分化状态的方法。还包括区分生殖细胞、干细胞和体细胞的方法。发育状态的实例包括新生的和成体的。细胞分化状态的实例包括全能细胞、多能细 胞、多能祖干细胞和成熟的、完全分化的细胞之间的所有精细且可确认的阶段。 [0273] 全能细胞具有全部潜能，通常在有性和无性繁殖时出现，并包括孢子与合子，尽管在某些情况下细胞可以去分化并恢复全能性。多能细胞包括具有分化为三种胚层中任何一种的潜能的干细胞，所述胚层包括内胚层(内胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖系统)和外胚层(表皮组织和神经系统)。多潜能祖细胞通常可以分化为有限数目 的组织类型。多潜能细胞的实例包括，但不限于，来自骨髓的产生诸如红细胞、白细胞和血小板的免疫细胞的造血干细胞(成体干细胞)，来自骨髓的产生基质细胞、脂肪细胞和各种 类型的骨细胞的间质干细胞(成体干细胞)，产生各种类型的皮肤细胞的上皮干细胞(祖细 胞)和产生分化的肌肉组织的肌卫星细胞(祖细胞)。因此，与对照或预定水平相比，特定 AspRS多核苷酸或多肽序列的存在或水平可用于区分或表征上述细胞分化状态。 [0274] 本发明的实施方案包括检测AspRS多核苷酸或多肽参照序列的存在或水平以表征或诊断细胞、组织、器官或个体的状况的方法，其中该状况可以表征为健康的、患病的、有患病风险的或受治疗的。为了该诊断目的，术语“诊断的(diagnostic)”或“诊断的 (diagnosed)”包括鉴定病理状态的存在或性质，表征发展为这种状态的风险和/或检测该 病理状态响应于治疗的改变(或未改变)。诊断方法在其灵敏度和特异性上有差异。在某些 实施方案，诊断测定的“灵敏度”是指测试为阳性的患病细胞、组织或个体的百分比(“真阳性”的百分比)。未被该测定检测到的患病细胞、组织或个体通常被称为“假阴性”。未患病且在测定中测试为阴性的细胞、组织或个体可以称为“真阴性”。在某些实施方案中，诊断测定的“特异性”可以定义为1(1)减假阳性比例，其中“假阳性”比例被定义为没有疾病且测试为阳性的那些样品或个体的比例。虽然特定诊断方法可能不能提供状态的最终诊断，但是如 果该方法能提供辅助诊断的阳性指示，它就足够了。 [0275] 在某些实例中，可以通过将与病理状态相关的一种或多种选择的AspRS多核苷酸或多肽参照序列或其部分的存在或水平与合适的对照相比(无论水平是增加的还是降低) 来诊断病理状态的存在或发展为病理状态的风险。“合适的对照”或“适当的对照”包括组织或有机体的细胞或其他生物样品中确定的值、水平、特征、特性或性质，例如，表现出诸如不存在所述状态的正常性状的对照或正常细胞、组织或有机体。在某些实施方案中，“合适的对照”或“适当的对照”是预先确定的值、水平、特征、特性或性质。其他合适的对照对本领域技术人员是显而易见的。疾病或疾病状态的实例在本文他处描述。 [0276] 本发明的实施方案包括基于AspRS多核苷酸或核酸的检测技术，该技术由于检测的灵敏度而提供某些优势。因此，某些实施方案涉及作为诊断方法或测定的一部分的AspRS多核苷酸的使用或检测。AspRS多核苷酸的存在和/或水平可以通过本领域已知的任何方法 测量，包括诸如Northern印迹的杂交测定、定量或定性聚合酶链式反应(PCR)、定量或定性逆转录酶PCR(RT-PCR)、微阵列、点印迹或槽印迹、或诸如荧光原位杂交(FISH)的原位杂交以及其他。这些方法中的某些在下文更详细描述。 [0277] 可以通过本领域内已知的方法从血液、生物流体、组织、器官、细胞系或其他相关样品中收集和/或产生诸如DNA和RNA的AspRS多核苷酸，例如描述于以下的那些方法：Kingston.(2002 Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技 术),Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY(参见，例如，描述于Nelson et al.Proc Natl Acad Sci U S A,99:11890-11895,2002)等。 [0278] 可以使用本领域内已知的方法产生互补DNA(cDNA)文库，例如描述于以下的那些方法：Ausubel et al.(2001Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学 实验技术),Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Sambrook et al. (1989Molecular Cloning(分子克隆),Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,NY)；Maniatis et al.(1982Molecular Cloning(分子克隆),Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)等。 [0279] 某些实施方案可以利用用于检测AspRS多核苷酸序列的杂交方法。用于进行多核苷酸杂交测定的方法在领域内发展良好。杂交测定步骤和条件根据应用而变化，并且根据 已知的通用结合方法进行选择，包括描述于以下的那些方法：Maniatis et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(2nd Ed.Cold Spring Harbor, N.Y.,1989)；Berger and Kimmel Methods in Enzymology(酶学方法),Vol.152,Guide to Molecular Cloning Techniques(分子克隆技术指导)(Academic Press,Inc.,San Diego, Calif.,1987)；Young and Davism,P.N.A.S,80:1194(1983)。进行重复和受控的杂交反应 的方法和装置已经描述于美国专利第5,871,928号、第5,874,219号、第6,045,996号和第6, 386,749号、第6,391,623号，通过引用将每篇并入本文。 [0280] 某些实施方案可以利用用于检测AspRS多核苷酸序列的核酸扩增方法。术语“扩增”或“核酸扩增”是指包含预期的特异性靶核酸序列的至少一部分的靶核酸的多个拷贝的产生。多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物。在某些实施方案中，扩增的靶标所包含的序列小于完整的靶基因序列(内含子和外显子)或表达的靶基因序列(外显子和位于侧翼的非 翻译序列的剪接的转录本)。例如，可以利用与靶多核苷酸的内部位置杂交并从该位置启动聚合的扩增引物通过扩增该靶多核苷酸的一部分来产生特异的扩增子。优选地，扩增出的 部分包含可以利用多种公知方法的任一种进行检测的可检测的靶序列。 [0281] 本文所使用的“选择性扩增”或“特异性扩增”是指扩增本发明的靶核酸序列，其中靶序列的可检测的扩增基本上限制在从待测试的目的核酸样品扩增靶序列而不是从来自某些其他样品来源的靶核酸序列扩增，所述其他样品来源例如在扩增反应期间使用的试剂 中或进行扩增反应的环境中存在的污染。 [0282] 利用“扩增条件”来表示允许按照本发明进行核酸扩增的条件。在某些实施方案中，扩增条件可以不如本文所述的“严紧杂交条件”严紧。在扩增条件下，本发明的扩增反应中使用的寡核苷酸与它们的预期靶标杂交，但在严紧杂交条件下可能杂交也可能不杂交。 另一方面，本发明的检测探针通常在严紧杂交条件下杂交。本领域技术人员根据所利用的 特定扩增方法可易于确定按照本发明实施核酸扩增的可接受的条件。 [0283] 许多公知的核酸扩增方法需要热循环以交替地使双链核酸变性并使其与引物杂交；然而，其他公知的核酸扩增方法是等温的。通常被称为PCR的聚合酶链式反应(美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号)使用变性，引物对与互补链的退火和引物延伸的多个循环以指数方式增加靶序列的拷贝数。在被称作RT-PCR的变形 中，使用逆转录酶(RT)从mRNA产生互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。 [0284] 如上所述，术语“PCR”是指选择性地扩增靶核酸种类的多个扩增循环。包括定量PCR(qPCR)、实时(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)，并且定量逆转录PCR(qRT-PCR)在领域内有良好的描述。术语“pPCR”是指定量聚合酶链式反应，术语“qRT-PCR”是指定量逆转录聚合酶链式反应。qPCR和qRT-PCR可以用于扩增靶向的cDNA分子并同时对其进行定量。它使得可以对cDNA库中的特定序列，例如选择的AspRS基因或转录本，同时进行检测和定量。 [0285] 术语“实时PCR”可以使用DNA结合染料，与PCR中所有双链(ds)DNA结合，引起染料发出荧光。因此，PCR期间DNA产物的增加导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许对DNA浓度进行定量。然而，诸如SYBR Green的dsDNA染料将与所有dsDNA PCR产物结合。在实时PCR热循环仪中检测并测量荧光，并且与产物的指数增加相对应的荧光的几何级数增加用来确定每个反应中的阈值循环(“CT”)。 [0286] 术语“CT评分”是指阈值循环数，这是PCR扩增已超过阈值水平时的循环。如果样品中特定基因的mRNA的量较高，则其将比低表达的基因更早跨越阀值，因为有更多的起始RNA用于扩增。因此，CT评分低表示样品中的基因表达高，CT评分高表示基因表达低。 [0287] 某些实施方案可以采用通常被称为LCR的连接酶链式反应(Weiss,R.1991,Science 254:1292)，其使用与靶核酸的邻近区域杂交的两套互补的DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸可以在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接，从而产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。 [0288] 在某些实施方案中，其他技术可用于评估来自特定cDNA文库转录本的RNA转录本，包括微阵列分析(Han,M.,et al.,Nat Biotechnol,19:631-635,2001；Bao,P.,et al., Anal Chem,74:1792-1797,2002；Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10614-19, 1996；以及Heller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2150-55,1997)和SAGE(基因表达 系列分析)。与MPSS相似，SAGE是数字化的并可以产生大量的信号序列(参见，例如， Velculescu,V.E.,et al.,Trends Genet,16:423-425.,2000；Tuteja R.and Tuteja N.Bioessays.2004 Aug；26(8):916-22)，但是数量级小于可从诸如MPSS的技术获得的信号序列。 [0289] 在某些实施方案中，术语“微阵列”包括具有与基底结合的多个核酸的“核酸微阵列”，与所述多个结合的核酸中的每个的杂交可被分别检测。基底可以是实心的或多孔的，平面的或非平面的，整体的或分布式的。核酸微阵列包括在Schena(ed.)中所述的所有装置：DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series)(DNA微阵列： 实用方法(实用方法系列)),Oxford University Press(1999)；Nature Genet.21(1) (suppl.):1-60(1999)；Schena(ed.),Microarray Biochip:Tools and Technology(微阵 列生物芯片：工具与技术),Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000)。核酸微阵列可以包含与基底结合的多个核酸，其中所述多个核酸位于多个珠子上 而不是整体的平面基底上，例如如在Brenner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4): 1665-1670(2000)所描述的。核酸微阵列的实例可以见于美国专利第6,391,623号、第6, 383,754号、第6,383,749号、第6,380,377号、第6,379,897号、第6,376,191号、第6,372,431号、第6,351,712号、第6,344,316号、第6,316,193号、第6,312,906号、第6,309,828号、第6, 309,824号、第6,306,643号、第6,300,063号、第6,287,850号、第6,284,497号、第6,284,465号、第6,280,954号、第6,262,216号、第6,251,601号、第6,245,518号、第6,263,287号、第6, 251,601号、第6,238,866号、第6,228,575号、第6,214,587号、第6,203,989号、第6,171,797号、第6,103,474号、第6,083,726号、第6,054,274号、第6,040,138号、第6,083,726号、第6, 004,755号、第6,001,309号、第5,958,342号、第5,952,180号、第5,936,731号、第5,843,655号、第5,814,454号、第5,837,196号、第5,436,327号、第5,412,087号和第5,405,783号，通过引用将这些专利的公开内容并入本文。 [0290] 其他实例包括可从Affymetrix(Santa Clara,Calif.)以商标名GeneChipTM商购的核酸阵列。制备和使用阵列的其他示例性的方法提供于，例如美国专利第7,028,629号、第 7,011,949号、第7,011,945号、第6,936,419号、第6,927,032号、第6,924,103号、第6,921, 642号和第6,818,394号中。 [0291] 涉及阵列和微阵列的本发明还考虑连接到固体基底的聚合物的多种用途。这些用途包括基因表达监测、谱型分析、文库筛选、基因分型和诊断。基因表达监测和谱型分析方法以及用于基因表达监测和谱型分析的方法描述于美国专利第5,800,992号、第6,013,449 号、第6,020,135号、第6,033,860号、第6,040,138号、第6,177,248号和第6,309,822号中。 基因分型及其用途描述于美国申请系列第10/442,021号、第10/013,598号(美国申请第 2003/0036069号)以及美国专利第5,925,525号、第6,268,141号、第5,856,092号、第6,267, 152号、第6,300,063号、第6,525,185号、第6,632,611号、第5,858,659号、第6,284,460号、第6,361,947号、第6,368,799号、第6,673,579和第6,333,179号中。可以与本文所公开的方法联合使用的核酸扩增、标记和分析的其他方法收录在美国专利第5,871,928号、第5,902, 723号、第6,045,996号、第5,541,061号和第6,197,506号中。 [0292] 如本文所述，某些实施方案可以利用诸如引物或探针的寡核苷酸用于扩增或检测，这对本领域技术人员是显而易见的。如本文所述，尽管寡核苷酸的设计和序列取决于其功能，但是通常应考虑数个变量。最相关的变量包括：长度、解链温度(Tm)、特异性，与系统内其他寡核苷酸的互补性、G/C含量、多嘌呤(T、C)或多嘧啶(A、G)区段以及3’端序列。 [0293] 因此，某些实施方案包括检测样品中靶AspRS多核苷酸的方法，其中所述多核苷酸通常包含本文所述的参照AspRS多核苷酸的序列，所述方法包括a)将样品与探针杂交，所述探针包含与样品中靶多核苷酸互补的序列，并且所述探针能与所述靶多核苷酸特异性杂 交，在合适的条件下，在所述探针和所述靶多核苷酸或其片段之间能形成杂交复合物，和b)检测是否存在所述杂交复合物，并且任选地，如果存在，检测其含量。还包括检测样品中靶AspRS多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含本文所述的参照AspRS多核苷酸序列，所述方法 包括a)扩增所述靶多核苷酸或其片段，和b)检测是否存在所述扩增的靶多核苷酸或其片 段，并且任选地，如果存在，检测其含量。 [0294] 本发明的实施方案包括多种基于AspRS多肽的检测技术，包括基于抗体的检测技术。这些实施方案中包括用AspRS多肽来产生抗体或其他结合剂的用途，然后所述抗体或其他结合剂可以用于诊断方法和组合物中，从而检测通常来自个体的细胞或其他生物样品中 所选的AspRS多肽或对其进行定量。 [0295] 某些实施方案可以利用标准方法，例如免疫印迹和免疫沉淀反应，酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术和免疫荧光测定(IFA)。这些公知的方法通常利用本文所述的一 种或多种单克隆或多克隆抗体，所述抗体与本发明的选择的AspRS多肽或该AspRS多肽的独 特区域特异性结合，并通常不与诸如全长AspRS多肽的其他AspRS多肽显著结合。在某些实 施方案中，AspRS多肽的独特区域可以由诸如蛋白水解片段的新鉴定的选择性剪接变体或 蛋白片段的独特剪接点或特定三维结构编码。 [0296] 某些实施方案可以利用“阵列”，例如“微阵列”。在某些实施方案中，“微阵列”还可以指具有与基底结合的多肽集合或多个多肽的“肽微阵列”或“蛋白微阵列”，与所述多个结合的多肽的结合可以被单独地检测。可选地，肽微阵列可以具有多种结合剂，包括，但不限于，可以特异性检测本文所述的AspRS多肽的结合的单克隆抗体、多克隆抗体、噬菌体展示结合剂，酵母双杂交结合剂和适体。阵列可以基于这些AspRS多肽的自身抗体检测，例如，如在Robinson et al.,Nature Medicine 8(3):295-301(2002)中所描述。肽阵列的实例可见于WO 02/31463、WO 02/25288、WO 01/94946、WO 01/88162、WO 01/68671、WO 01/57259、WO 00/61806、WO 00/54046、WO 00/47774、WO 99/40434、WO 99/39210和WO 97/42507以及美国专利第6,268,210号、第5,766,960号和第5,143,854号，通过引用将每篇并入本文。 [0297] 某些实施方案可以利用MS或其他基于分子量的方法用于诊断性地检测AspRS多肽序列。质谱法(MS)通常是指用于确定样品或分子的元素组成的分析技术。MS还可用于确定 诸如肽和其他化合物的分子的化学结构。 [0298] 通常，MS原理包括将化合物电离以产生带电的分子或分子片段，然后测量它们的质荷比。在示例性的MS方案中：将样品加载到MS装置上，并经过汽化，通过多种方法中的一种将样品的组分电离例如，通过用电子束轰击它们)，这导致形成带正电的粒子，然后通过磁场加速阳离子，当所述离子穿过电磁场时根据它们的运动轨迹对粒子的质荷比(m/z)进 行计算，并且根据m/z对之前的步骤中检测的离子进行分类。 [0299] 示例性的MS装置具有三个模块：离子源，其将气相的样品分子转化成离子(或在电喷雾电离的情况下，将溶液中存在的离子移动到气相中)；质量分析器，其使用电磁场通过离子的质量将其分类；和检测器，其测量指示剂量的值，并因而提供数据用于计算存在的每种离子的丰度。 [0300] MS技术同时具有定性和定量用途，包括鉴定未知化合物，确定分子中元素的同位素组成，和通过观察化合物的断裂确定化合物的结构。其他用途包括对样品中化合物的量 进行定量或研究气相离子化学的原理(真空中离子和中性粒子化学)。因此，根据本文所提 供的任何方法可以将MS技术用于测定生物样品中本发明的AspRS多肽的存在或水平，并将 这些水平与对照样品或预定值进行比较。 [0301] B.化合物和治疗剂开发 [0302] 某些实施方案涉及AspRS多肽或AspRS多核苷酸参照序列在药物开发中的用途，通常涉及鉴定调节参照AspRS的一种或多种非常规活性的试剂。例如，某些实施方案包括鉴定AspRS参照多肽或包含AspRS参照序列的多肽的一种或多种“结合伴侣”的方法，所述结合伴侣例如与AspRS多肽相关，并参与其一种或多种非常规活性的细胞蛋白或其他宿主分子。还包括鉴定激动或拮抗AspRS参照多肽或其活性变体的非常规活性的化合物(例如，多肽)或 其他试剂的方法，例如通过使所述化合物或其他试剂与AspRS多肽和/或其一种或多种细胞 结合伴侣相互作用。 [0303] 因此，某些实施方案包括鉴定AspRS参照多肽的结合伴侣的方法，包括a)在合适的条件下使AspRS多肽与生物样品组合，和b)检测AspRS多肽与结合伴侣的特异性结合，从而 鉴定与AspRS参照多肽特异性结合的结合伴侣。还包括筛选与AspRS参照多肽或AspRS多肽 的结合伴侣特异性结合的化合物的方法，所述方法包括a)在合适的条件下使所述多肽或结 合伴侣与至少一种受试化合物组合，和b)检测所述多肽或结合伴侣与所述受试化合物的结 合，从而鉴定与所述多肽或其结合伴侣特异性结合的化合物。在某些实施方案中，所述化合物是多肽或肽。在某些实施方案中，所述化合物是小分子或其他(例如，非生物的)化合物。 在某些实施方案中，所述化合物是肽模拟物。 [0304] 可以利用适合检测蛋白-蛋白相互作用的任何方法来鉴定与AspRS参照多肽相互作用，与其一种或多种细胞结合伴侣相互作用，或与以上二者相互作用的细胞蛋白。可以利用的常规方法的实例包括对细胞裂解物或从细胞裂解物获得的蛋白进行免疫共沉淀反应， 交联和通过梯度或色谱柱共纯化，主要用于鉴定裂解物中与AspRS多肽相互作用的蛋白。 [0305] 在这些和相关实施方案中，使用本领域技术人员公知的技术，例如通过Edman降解技术，可以确定与AspRS多肽或其结合伴侣相互作用的蛋白的至少一部分氨基酸序列。参 见，例如Creighton Proteins:Structures and Molecular Principles(蛋白：结构与分子原理),W.H.Freeman&Co.,N.Y.,pp.3449,1983。获得的氨基酸序列可以用作产生寡核苷酸 混合物的引导，所述寡核苷酸混合物可以用于筛选编码这类蛋白的基因序列。例如，可以通过本文所述的和本领域内已知的标准杂交或PCR技术完成筛选。用于产生寡核苷酸混合物 和进行筛选的技术是公知的。参见，例如，Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.,1989；和lnnis et al.,eds.PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR实验技术：方法和应用指南)Academic Press,Inc.,New York,1990。 [0306] 此外，可以利用同时鉴定编码结合伴侣或其他多肽的基因的方法。这些方法包括，例如，以与λ-gt11文库抗体探测的公知技术相似的方式，利用标记的AspRS蛋白或另一多肽、肽或融合蛋白，例如变体AspRS多肽或与标志物(例如，酶、fluor、发光蛋白或染料)融合的AspRS结构域或Ig-Fc结构域，探测表达文库。 [0307] 检测体内蛋白相互作用的一个方法是双杂交系统。该系统的实例描述于(Chien et al.,PNAS USA 88:9578 9582,1991)中并且可从Clontech(Palo Alto,Calif.)商购。在 某些实例中，双杂交系统或其他这类方法可用于筛选与“诱饵”基因产物相互作用的蛋白激活结构域文库。通过示例而非限制的方式，AspRS参照多肽或变体可用作诱饵基因产物。 AspRS结合伴侣也可用作“诱饵”基因产物。总基因组或cDNA序列可被融合到编码激活结构域的DNA上。将该文库和编码诱饵AspRS基因产物与DNA结合结构域融合的杂合体的质粒共 转化进酵母报告菌株中，从所得的转化体筛选表达报告基因的那些菌株。 [0308] 还包括三杂交系统，其允许在酵母中检测RNA-蛋白相互作用。参见，例如Hook et al.,RNA.11:227-233,2005。因此，这些和相关方法可用于鉴定AspRS多肽的细胞结合伴侣。这些和相关方法也可用于鉴定与AspRS多肽、其细胞结合伴侣或以上二者相互作用的诸如 结合剂或核酸的其他化合物。 [0309] 如上所述，一旦分离，可以鉴定结合伴侣，然后相应地将该结合伴侣与标准技术联合使用以鉴定与其相互作用的蛋白或其他化合物。因此，某些实施方案涉及筛选与AspRS参照多肽的结合伴侣特异性结合的化合物的方法，所述方法包括a)在合适的条件下使所述结合伴侣与至少一种受试化合物组合，和b)检测所述结合伴侣与所述受试化合物的结合，从 而鉴定与结合伴侣特异性结合的化合物。在某些实施方案中，所述受试化合物是多肽。在某些实施方案中，所述受试化合物是化合物，例如小分子化合物或肽模拟物。 [0310] 某些实施方案包括筛选调节AspRS参照多肽的活性的化合物的方法，所述方法包括a)在容许所述多肽具有活性的条件下使所述多肽与至少一种受试化合物组合，b)评定存 在受试化合物时所述多肽的活性，和c)将存在受试化合物时所述多肽的活性与不存在受试 化合物时所述多肽的活性进行比较，其中存在所述受试化合物时多肽活性的改变表示化合 物调节所述多肽的活性。 [0311] 某些实施方案包括筛选调节AspRS参照多肽的结合伴侣的活性的化合物的方法，所述方法包括a)在容许所述结合伴侣具有活性的条件下使所述多肽与至少一种受试化合 物组合，b)评定存在受试化合物时所述结合伴侣的活性，和c)将存在受试化合物时所述结 合伴侣的活性与不存在受试化合物时所述结合伴侣的活性进行比较，其中存在所述受试化 合物时结合伴侣活性的改变表示化合物调节所述结合伴侣的活性。通常，这些和相关实施 方案包括评定与AspRS多肽或其结合伴侣相关的选择的非常规活性。包括体外和体内条件，例如细胞培养条件。 [0312] 某些实施方案包括筛选有效地作为AspRS参照多肽或其活性片段或变体的完全或部分激动剂的化合物的方法，所述方法包括a)将包含所述多肽的样品暴露于化合物，和b) 通常通过测定AspRS多肽的非常规活性的增加来检测所述样品中的激动剂活性。某些方法 包括a)将包含AspRS多肽的结合伴侣的样品暴露于化合物，和b)通常通过测定AspRS多肽的 选择的非常规活性的增加来检测所述样品中的激动剂活性。某些实施方案包括这样的组合 物，该组合物包含通过所述方法鉴定的激动剂化合物以及药物可接受的载体或赋形剂。 [0313] 还包括筛选有效地作为AspRS参照多肽的完全或部分拮抗剂的化合物的方法，所述方法包括a)将包含所述多肽的样品暴露于化合物，和b)通常通过测定AspRS多肽的非常 规活性的降低来检测所诉样品中的拮抗剂活性。某些方法包括a)将包含AspRS多肽的结合 伴侣的样品暴露于化合物，和b)通常通过测定AspRS多肽的选择的非常规活性的降低来检 测所述样品中的拮抗剂活性。某些实施方案包括这样的组合物，该组合物包含通过所述方 法鉴定的拮抗剂化合物以及药物可接受的载体或赋形剂。 [0314] 在某些实施方案中，可以设计体外系统以鉴定可以与AspRS参照序列或其结合伴侣相互作用或调节AspRS参照序列或其结合伴侣的化合物。通过这类系统所鉴定出的某些 化合物可用于，例如，调节途径的活性和加工所述途径的组分本身。它们还可在筛选中用于鉴定破坏所述途径的组分之间的相互作用，或可以直接破坏这类相互作用的化合物。一个 示例性的方法涉及在允许AspRS多肽和受试化合物相互作用和结合的条件和足够的时间下 制备它们的反应混合物，从而形成可以从反应混合物去除和/或检测的复合物。 [0315] 可以以多种方式进行体外筛选测定。例如，可以将AspRS多肽、细胞结合伴侣或受试化合物锚定在固相上。在这些和相关实施方案中，在反应结束时可以在固相上俘获和检 测所得的复合物。在这类方法的一个实例中，将AspRS多肽和/或其结合伴侣锚定在固相表 面上，而未锚定的受试化合物可被直接地或间接地标记，使得可以检测固相表面上的组分 对所述受试化合物的俘获。在其他实例中，将受试化合物锚定在固相表面上，而未锚定的 AspRS多肽和/或其结合伴侣是标记的或以某种方法可检测。在某些实施方案中，微滴定板 通常可用作固相。锚定的组分(或受试化合物)可以通过非共价或共价连接被固定。通过用 蛋白溶液简单包被固相表面并干燥可以实现非共价连接。可选择地，可以使用对待固定的 蛋白特异的固定的抗体，优选单克隆抗体，将所述蛋白锚定在固相表面上。所述表面可以预先制备并储存。 [0316] 为了进行示例性的测定，通常将未固定的组分添加到含有锚定的组分的包被表面。反应完成之后，在所形成的任何特异性复合物仍将固定在固相表面上的条件下去除(例如，通过冲洗)未反应的组分。可以以多种方式实现锚定在固相表面上的复合物的检测。例如，如果之前未固定的组分是预先标记的，则对固定在表面上的标记的检测表明形成了复 合物。如果之前未固定的组分是未预先标记的，则可以使用间接标记来检测锚定在表面上 的复合物，例如，使用对之前未固定的组分特异的标记抗体(随后可以用标记的抗lg抗体直接标记或间接标记所述抗体)。 [0317] 可选择地，例如，可以利用表面等离子共振技术(SPR)和作为标志(index)的共振角的改变来确定是否存在受试化合物的结合，其中根据常规方法将AspRS多肽或细胞结合 伴侣固定在可商购的传感器芯片(例如，由BiacoreTM制造)的表面上，将受试化合物与之接触，并且用特定波长的光从特定角度照射所述传感器芯片。还可以通过检测与受试化合物 相应的峰的出现来测定受试化合物的结合，所述检测通过这样的方法，其中将AspRS多肽或细胞结合伴侣固定在适用于质谱仪的蛋白芯片的表面上，将受试化合物与之接触，并且将 诸如MALDI-MS、ESI-MS、FAB-MS等的电离方法与质谱仪(例如，双聚焦质谱仪、四级杆质谱仪、飞行时间质谱仪、傅里叶变换质谱仪、离子回旋质谱仪等)结合。 [0318] 在某些实施方案中，基于细胞的测定，基于膜囊的测定，或基于膜部分的测定可用于鉴定调节选择的AspRS多肽在非常规途径中的相互作用的化合物。为此目的，可以使用表达AspRS多肽和/或结合伴侣的细胞系、或表达包含这类蛋白的结构域或片段(或其组合)的融合蛋白的细胞系、或已经基因工程改造以表达这类蛋白或融合蛋白的细胞系(例如，COS 细胞、CHO细胞、HEK293细胞、Hela细胞等)。通过相对于对照或预定量监测非常规活性的变化(例如，统计学上的显著性变化)可以鉴定影响该活性的受试化合物。 [0319] 对于涉及反义试剂和RNAi试剂的实施方案，例如，还包括筛选有效地改变AspRS参照多核苷酸的表达的化合物的方法，所述方法包括a)将包含AspRS参照多核苷酸的样品暴 露于诸如潜在的反义寡核苷酸的化合物，和b)检测AspRS多核苷酸表达的改变。在某些非限制性的实例中，根据本领域常规技术，这些和相关实施方案可以用于基于细胞的测定或用 于无细胞翻译的测定中。还包括通过这类方法所鉴定的反义试剂和RNAi试剂。 [0320] 还包括适用于高通量筛选(HTS)的任何上述方法，或本领域已知的其他筛选方法。HTS通常使用自动化以运行针对候选化合物文库的测定的筛选，例如，测量本文所述的非常规活性的增加或降低的测定。 [0321] C.治疗方法 [0322] 在另一方面，本发明涉及使用本发明的组合物方法，用于使用本文所述的组合物治疗细胞、组织或个体。本发明可以调节的细胞或组织优选为哺乳动物细胞，或更优选为人细胞。这些细胞可以是健康状态或患病状态的细胞。 [0323] 因此，本文所述的AspRS试剂，包括AspRS多肽、AspRS多核苷酸、基于AspRS多核苷酸的载体、反义寡核苷酸、RNAi试剂以及诸如肽、抗体和抗原结合片段、肽模拟物或其他小分子的结合剂，可用于治疗与参照AspRS的非常规活性相关的多种非限制性疾病或疾病状态。这类非常规活性的实例包括，细胞增殖的调节、细胞迁移的调节、细胞分化的调节(例如造血作用)、细胞凋亡或其它形式的细胞死亡的调节、细胞信号转导的调节、血管生成的调节、细胞结合的调节、细胞代谢的调节、细胞因子产生或活性的调节、细胞因子受体活性的调节、炎症的调节等。 [0324] 包括基于多核苷酸的疗法，例如反义疗法和RNAi干扰疗法，其通常涉及降低靶分子的表达，所述靶分子例如贡献其非常规活性的AspRS多肽的特定剪接变体或AspRS多肽的 细胞结合伴侣。反义或RNAi疗法通常拮抗所述非常规活性，例如通过降低AspRS参照多肽的表达。还包括激动或拮抗AspRS参照多肽的非常规活性的基于多肽、抗体、肽模拟物或其他小分子的疗法，例如通过与AspRS多肽、其细胞结合伴侣或以上二者直接相互作用。 [0325] 在某些实施方案中，例如，提供了用于调节治疗相关的细胞活性的方法，所述治疗相关的细胞活性包括，但不限于，细胞代谢、细胞分化、细胞增殖、细胞分化、细胞动员、细胞迁移、基因转录、mRNA翻译、细胞阻抗、细胞因子产生等，所述方法包括将细胞与本文所述的AspRS组合物接触。因此，AspRS组合物可以用来治疗基本上任何可以获益于一种或多种这些活性的调节的细胞或组织或个体。 [0326] AspRS组合物还可以用于多种治疗环境中的任何一种，包括例如，肿瘤疾病、免疫系统疾病(例如，自身免疫性疾病和炎症)、感染性疾病、代谢疾病、神经元/神经病学疾病、肌肉/心血管疾病、异常造血作用相关的疾病、异常血管生成相关的疾病、异常细胞存活相关的疾病等的治疗或预防相关的那些治疗环境。 [0327] 例如，在某些示例性实施方案中，本发明的AspRS组合物可以用于调节血管生成，例如，通过内皮细胞增殖和/或信号转导的调节。可以使用合适的细胞系(例如，人微脉管内皮肺细胞(HMVEC-L)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC))和使用合适的测定(例如，内皮细胞迁 移测定、内皮细胞增殖测定、成管测定、基质胶栓测定等)来监测内皮细胞的增殖和/或细胞信号转导，所述测定中的多数在本领域内是已知的并且是可以获得的。 [0328] 因此，在相关的实施方案中，本发明的组合物可以用来治疗基本上任何可以获益于血管生成调节的细胞或组织或个体。例如，在一些实施方案中，可以将经历或易感于血管生成的细胞或组织或个体(例如，血管生成疾病状态)与本发明合适的组合物接触，从而抑 制血管生成疾病状态。在其他的实施方案中，可以将经历或易感于不足的血管生成的细胞 或组织(例如，血管生成抑制的疾病状态)与本发明合适的组合物接触，从而干扰血管生成 抑制活性和/或促进血管生成。 [0329] 血管生成疾病状态的示例性实例包括，但不限于，年龄相关的黄斑部退变(AMD)、癌症(实体的和血液学的)、发育异常(器官发生)、糖尿病致盲、子宫内膜异位、眼部新血管生成、银屑病、风湿性关节炎(RA)和皮肤变色(例如，血管瘤、鲜红斑痣或单纯痣)。抗血管生成疾病状态的实例包括，但不限于，心血管疾病、再狭窄、缺血性组织或心力衰竭再灌注后的组织损伤、慢性炎症和伤口愈合。 [0330] 本发明的组合物还可以用作免疫调节剂，用于通过调节直接或间接介导自身免疫性和/或炎症疾病、疾病状态和病症的细胞来治疗抗炎症或促炎症的适应症。可以使用本领域内已知和可获得的任何技术来监测本发明组合物作为免疫调节剂的功效，所述技术包括 例如，迁移测定(例如，使用白细胞或淋巴细胞)，细胞因子产生测定或细胞活力测定(例如，使用B细胞、T细胞、单核细胞或NK细胞)。 [0331] “炎症”通常是指组织对诸如病原体、受损伤细胞(例如，创伤)和刺激物的有害刺激的生物应答。术语“炎症应答”是指获取和调节炎症的具体机理，包括，仅通过示例的方式，免疫细胞的激活或迁移，细胞因子的产生，血管扩张(包括激肽释放，纤溶和凝血方式)以及本文所述的和本领域内已知的其他方式。理想的情况下，炎症是身体的保护性尝试，从而既去除伤害性刺激又为受影响的一种或多种组织启动愈合过程。如果缺乏炎症，伤口和感染永远不会愈合，形成这样一种局面，组织的进行性破坏将威胁生存。另一方面，过度或慢性炎症可能与多种疾病有关联，如花粉热，动脉粥样硬化，类风湿关节炎以及本文所述的和本领域内已知的其他疾病。 [0332] 慢性炎症的临床体征取决于疾病的持续时间、炎性病变、原因和受影响的解剖学区域(参见，例如Kumar et al.,Robbins Basic Pathology-8th Ed.(罗宾斯基础病理学第 八版),2009Elsevier,London；Miller,LM,Pathology Lecture Notes(病理学讲义), Atlantic Veterinary College,Charlottetown,PEI,Canada)。慢性炎症与多种病理状态 或疾病相关，包括，例如，过敏症，阿尔茨海默氏病，贫血，主动脉瓣狭窄，诸如类风湿性关节炎和骨关节炎的关节炎，癌症，充血性心脏衰竭，纤维肌痛，纤维化，心脏病发作，肾功能衰竭，红斑狼疮，胰腺炎，中风，手术并发症，炎性肺部疾病，炎性肠道疾病，动脉粥样硬化，神经系统疾病，糖尿病，代谢紊乱，肥胖症和牛皮癣以及本文所述和本领域内已知的其他疾 病。因此，AspRS组合物可用于治疗或处理慢性炎症，调节任何一种或多种个体的慢性炎症应答，或治疗任何一种或多种与慢性炎症相关的疾病或疾病状态。 [0333] 某些具体炎症应答包括细胞因子产生和活性，以及相关的途径。例如，某些示例性的实施方案涉及经由核因子-κB(NF-κB)调节细胞信号转导，例如通过增加该转录因子的下游活性。在某些实例中，NF-κB活性的增加可以导致细胞因子信号转导或活性的增加，所述细胞因子例如促炎性细胞因子(例如，TNF-α)和抗炎性细胞因子(例如，IL-10)。 [0334] 评估炎症和其他疾病状态的体征和症状的标准对本领域技术人员是显而易见的，并由以下的教导例证，例如Berkow et al.,eds.,The Merck Manual(默克手册),16th edition,Merck and Co.,Rahway,N.J.,1992；Goodman et al.,eds.,Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(古德曼、吉尔曼治疗学的药理 学基础),10th edition,Pergamon Press,Inc.,Elmsford,N.Y.,(2001)；Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics (Avery的药物治疗：临床药理学和治疗学理论与实践),3rd edition,ADIS Press,Ltd., Williams and Wilkins,Baltimore,MD.(1987)；Ebadi,Pharmacology,Little,Brown and Co.,Boston,(1985)；Osolci al.,eds.,Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿 制药科学),18th edition,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)；Katzung,Basic and Clinical Pharmacology(基础及临床药理学),Appleton and Lange,Norwalk,CT(1992)， 所述标准包括用于做出鉴别诊断的目的以及用于监测治疗，例如通过根据已接受的临床标 准确定的改善来确定在治疗期间是否已经给予治疗有效剂量。 [0335] 还包括调节免疫应答，例如天然免疫应答的方法。如本文所用的术语“免疫应答”包括由免疫系统的一种或多种细胞所介导的对抗原、疫苗组合物或免疫调节分子发生的可测量的或可观察的反应。免疫应答通常从抗原或免疫调节分子与免疫系统细胞的结合启 动。对抗原或免疫调节分子的反应可以由多种细胞类型介导，所述细胞类型包括最初与抗 原或免疫调节分子结合的细胞和参与介导天然、体液、细胞介导的免疫应答的细胞。 [0336] 如本文所用的“天然免疫应答”可以涉及病原相关的分子模式(PAMP)或AspRS多肽与诸如toll样受体的细胞表面受体的结合。对PAMP或其他信号响应的toll样受体和Ipaf信 号转导途径的激活导致免疫调节分子的产生，例如细胞因子和共刺激分子，所述免疫调节 因子引发和/或增强免疫应答。参与天然免疫应答的细胞包括，例如，树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞等。 [0337] 某些实施方案涉及增强天然免疫应答。某些实施方案涉及降低天然免疫应答。在某些方面，天然免疫应答由一种或多种诸如TLR2和/或TLR4的toll样受体(TLR)介导。本发 明的某些AspRS多肽与诸如TLR2和/或TLR4的TLR结合。TLR识别区分感染物与自身的PAMP并 介导诸如细胞因子的免疫调节分子的产生，这对于有效的适应性免疫的发展是必要的 (Aderem,A and Ulevitch,R.J.Nature 406:782-787(2000)和Brightbill,H.D., Immunology 101:1-10(2000)，通过引用并入本文)。toll样受体家族的成员识别多种抗原 类型并可以区分病原体。例如，TLR2识别多种真菌，革兰氏阳性菌和分枝杆菌组分，TLR4识别革兰氏阴性菌产物脂多糖(LPS)，且TLR9识别诸如细菌DNA中CpG重复的核酸。 [0338] 刺激天然免疫(例如，经由TLR2和/或TLR4)的AspRS组合物单独或与其他疗法联合可用于治疗多种疾病状态。这类疾病状态的具体实例包括传染病，例如细菌、病毒和寄生虫传染病。无论是在活的、减毒的还是其他类型的疫苗中，刺激天然免疫的AspRS组合物还可用作疫苗佐剂，以增强个体对一级抗原的免疫应答。 [0339] 病毒传染病或媒介的实例(及它们相应的疫苗)包括，但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、杯状病毒相关性腹泻、轮状病毒腹泻、B型流感嗜血杆菌肺炎和侵入性疾病、流感、麻疹、腮腺炎、风疹、副流感相关性肺炎、呼吸道合胞病毒(RSV)肺炎、重度急性呼吸系统综合症(SARS)、人乳头瘤病毒，单纯疱疹病毒2型生殖器溃疡、HIV/AIDS、登革热、日本脑炎、蜱传脑炎、西尼罗河病毒相关的疾病、黄热病、爱泼斯坦-巴尔病毒、拉沙热、克里米亚-刚果出血热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、狂犬病、裂谷热、天花、麻风病、上呼吸道和下呼吸道感染，脊髓灰质炎以及本文他处所描述的。 [0340] 细菌传染病或媒介的实例包括，但不限于，炭疽杆菌(Bacillus antracis)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬种布鲁氏菌 (Brucella canu)、羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪种布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉衣原体(Chlamydia psitacci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)、难辨梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(即，白喉)、肠球菌 (Enterococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体(Leptospira)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、立式立克次体(Rickettsia recketisii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生葡萄球菌 (S.saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌 (S.pneumoniae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、百日咳博德特氏菌 (Bordatella pertussis)和中耳炎媒介(例如，常由肺炎链球菌、流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)引起)以及本文他处所 描述的。 [0341] 寄生虫传染病的实例包括，但不限于，阿米巴病(如溶组织内阿米巴)，钩虫病(如线虫寄生虫，如美洲半口线虫和十二指肠钩虫)，利什曼病，疟疾(4种原生动物寄生虫疟原虫，恶性疟原虫，间日疟原虫，卵形疟原虫和四日疟原虫)，血吸虫病(寄生血吸虫，曼氏血吸虫，裂体血吸虫和日本血吸虫)，盘尾丝虫(河盲症)，克氏锥虫(查加斯病/美国昏睡病)，和麦地那龙线虫，淋巴丝虫病。 [0342] 某些AspRS组合物可用于内毒素休克的治疗或缓解，所述内毒素休克通常由于暴露于诸如脂多糖(LPS)的外源抗原而导致。由于内毒素休克可以由TLR信号转导介导，并且 天然存在的内源AspRS片段可以刺激TLR，所以本文提供的某些结合剂、反义试剂或RNAi试 剂通过拮抗或以其他方式减少内源AspRS片段所介导的TLR2和/或TLR4的刺激可以致使个 体对内毒素休克具有更强的抵抗力。 [0343] 还包括治疗免疫疾病的方法。可以按照本发明治疗的示例性免疫系统疾病、病症或疾病状态包括，但不限于，原发性免疫缺陷、免疫介导的血小板减少症、川崎综合征、骨髓移植(例如，成年人或儿童的新近骨髓移植)、慢性B细胞淋巴细胞性白血病、HIV感染(例如，成年人或儿童的HIV感染)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、输血后紫癜等。 [0344] 此外，其他的疾病、病症和疾病状态包括格林巴利综合征、贫血症(例如，细小病毒B19相关的贫血症、具有高感染风险的患有稳定多发性骨髓瘤的患者(例如，复发性感染)、自身免疫性溶血性贫血(例如，温型自身免疫性溶血性贫血)、血小板减少症(例如，新生儿血小板减少症)和免疫介导的嗜中性白细胞减少症、移植(例如，巨细胞病毒(CMV)阳性器官的CMV阴性接受体)、低丙球蛋白血症(例如，具有感染或发病风险因素的低丙球蛋白血症新生儿)、癫痫(例如，难治性癫痫)、系统性血管炎综合征、重症肌无力(例如，重症肌无力的代偿失调)、皮肌炎和多肌炎。 [0345] 其他的自身免疫性疾病、病症和疾病状态包括，但不限于，自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性新生儿血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性血细胞减少、溶血性贫血、抗磷脂综合征、皮炎、变态反应性脑脊髓炎、心肌炎、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、肾小球性肾炎(例如，IgA肾病)、多发性硬化、神经炎、葡萄膜炎性眼炎、多内分泌腺病、紫癜(例如，过敏性紫癜(Henloch-Scoenlein purpura))、莱特尔氏病、僵人综合征、自身免疫性肺部炎症、吉兰-巴雷综合征、胰岛素依赖性糖尿病和自身免疫炎性眼病。 [0346] 其他的自身免疫性疾病、病症和疾病状态包括，但不限于，自身免疫性甲状腺炎；甲状腺机能减退，包括桥本氏甲状腺炎和特征例如为细胞介导和体液甲状腺细胞毒性的甲 状腺炎；SLE(其特征通常为例如循环和局部产生的免疫复合物)；库德帕斯彻氏综合征(其 特征通常为例如抗基底膜抗体)；天疱疮(其特征通常为例如表皮棘层松解抗体)；受体自身免疫，例如，葛瑞夫兹氏病(其特征通常为例如促甲状腺激素受体抗体)、重症肌无力(其特征通常为例如乙酰胆碱受体抗体)；胰岛素抗性(其特征通常为例如胰岛素受体抗体)；自身免疫性溶血性贫血(其特征通常为例如抗体致敏的红细胞的吞噬作用)；和自身免疫性血小 板减少性紫癜(其特征通常为例如抗体致敏的血小板的吞噬作用)。 [0347] 其他的自身免疫性疾病、病症和疾病状态包括，但不限于，风湿性关节炎(其特征通常为例如关节中的免疫复合物)；伴随抗胶原蛋白抗体的硬皮病(其特征通常为例如核仁 和其他的核抗体)；混合性结缔组织病(其特征通常为例如诸如核糖核蛋白的可提取性核抗 原的抗体)；多炎症/皮肌炎(其特征通常为例如非组蛋白抗核抗体)；恶性贫血(其特征通常为例如抗壁细胞、抗微粒体和抗内因子抗体)；特发性阿狄森病(其特征通常为例如体液和 细胞介导的肾上腺细胞毒性)；不育症(其特征通常为例如antispennatozoal抗体)；肾小球性肾炎(其特征通常为例如小球基底膜抗体或免疫复合物)；原发性肾小球性肾炎、IgA肾 病；大疱性类天疱疮(其特征通常为例如基底膜中的IgG和补体)；舍格伦综合征(其特征通 常为例如多组织抗体和/或特异性非组蛋白抗核抗体(SS-B))；糖尿病(其特征通常为例如 细胞介导的和体液胰岛细胞抗体)；和肾上腺素抗药性，包括伴有哮喘或囊性纤维化的肾上腺素抗药性(其特征通常为例如β肾上腺素受体抗体)。 [0348] 其他的自身免疫性疾病、病症和疾病状态包括，但不限于，慢性活动型肝炎(其特征通常为例如平滑肌抗体)；原发性胆汁性肝硬化(其特征通常为例如抗线粒体抗体)；其他的内分泌腺衰竭(其特征通常为例如部分病例中的特异性组织抗体)；白癜风(其特征通常 为例如抗黑色素细胞抗体)；脉管炎(其特征通常为例如血管壁中的免疫球蛋白和补体和/ 或低血清补体)；心肌梗塞后疾病状态(其特征通常为例如抗心肌抗体)；心切开术综合征 (其特征通常为例如抗心肌抗体)；风疹(其特征通常为例如对IgE的IgG和IgM抗体)；特应性皮炎(其特征通常为例如抗IgE的IgG和IgM抗体)；哮喘(其特征通常为例如对IgE的IgG和 IgM抗体)；炎性肌病；和其他炎性病症、肉芽肿性病症、退行性病症和萎缩性病症。 [0349] 还包括调节造血作用和相关病理状态的方法。本发明的AspRS多肽可以调节的造血过程的实例包括，但不限于，骨髓细胞(例如，红系细胞，肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞，髓样树突状细胞，诸如嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的粒细胞，巨核细胞，血小板)和淋巴细胞(例如，自然杀伤细胞、淋巴样树突状细胞、B细胞和T细胞)的形成。某些特定的造血过程包括红细胞生成、粒细胞生成、淋巴细胞生成、巨核细胞生成、血小板生成等。还包括调节造血细胞的转运或动员的方法，所述造血细胞包括造血干细胞、祖细胞、红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨核细胞和血小板。 [0350] 可以在体内、体外、离体或以上的任意组合进行调节造血作用的方法。这些方法可以在含有造血干细胞，造血祖细胞，或可以向造血谱系分化的其他干细胞或祖细胞(例如，脂肪组织来源的干细胞)的任何生物样品，细胞培养物或组织上进行。对于体外和离体方法，可以根据本文所述且本领域内已知的技术和特征分离和/或鉴定无论是造血来源还是 其他来源的干细胞和祖细胞。 [0351] 在其他的实施方案中，本发明的AspRS组合物可以用于调节细胞增殖和/或存活，并且因此，用于治疗或预防特征为细胞增殖和/或存活异常的疾病、病症或疾病状态。例如，在某些实施方案中，AspRS组合物可以用于调节凋亡和/或治疗异常凋亡相关的疾病或疾病 状态。凋亡是用于描述被称为程序性细胞死亡的细胞信号转导级联的术语。对于诱导凋亡 的分子(例如癌症)，以及抑制凋亡的分子(即，中风、心肌梗塞、脓毒症等)存在各种治疗指征。可以使用本领域内已知的和可获得的任何技术监测凋亡，包括例如，检测DNA断裂、膜不对称性改变、凋亡半胱天冬酶激活和/或细胞色素C和AIF释放的测定。 [0352] 增加的细胞存活或抑制凋亡相关的示例性疾病包括，但不限于，癌症(诸如滤泡性淋巴瘤、癌和激素依赖性肿瘤，包括，但不限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、成神经细胞瘤、黏液瘤、肌瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性病症(诸如，多发性硬化、舍格伦综合征、葛瑞夫兹氏病、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球性肾炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板减少性紫癜和风湿性 关节炎)和病毒感染(诸如疱疹病毒、痘病毒和腺病毒)、炎症、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、急性移植排斥和慢性移植排斥。 [0353] 增加的细胞存活相关的其他示例性疾病或疾病状态包括，但不限于，恶性肿瘤和相关病症的发展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病； 包括成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病在内的急性髓细胞性白血病)和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白 血病和慢性淋巴细胞性白血病))、骨髓增生异常综合征、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦氏巨球蛋白血症、重链病、和实体肿瘤，所述实体肿瘤包括，但不限于，肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威姆氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。 [0354] 增加的凋亡相关的示例性疾病包括，但不限于，AIDS(诸如HIV诱导的肾病和HIV脑炎)、神经退行性病症(诸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏症、肌萎缩性侧束硬化症、色素性视网膜炎、小脑退变和脑瘤或与之前相关疾病)，自身免疫性病症(例如多发性硬化、舍格伦综合征、葛瑞夫兹氏病、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬化、贝切特氏病、克罗恩氏病、多肌炎、系统性红斑狼疮、免疫相关的肾小球性肾炎、自身免疫性胃炎、血小板减少性紫癜和风湿性关节炎)、骨髓增生异常综合征(例如再生障碍性贫血)、移植物抗宿主病(急性和/或慢性)、缺血性损伤(诸如由心肌梗塞、中风和再灌注性损伤引起的损伤)、肝损伤或疾病(例如，肝炎相关的肝损伤、肝硬化、缺血/再灌注性损伤、胆汁淤积症(胆管损伤)和肝癌)、毒素诱导的肝疾病(诸如由酒精引起)、脓毒性休克、溃疡性结肠炎、恶病质和厌食症。 [0355] 在其他的实施方案中，本发明组合物可以用于神经元/神经病学疾病或病症的治疗中，其示例性实例包括，帕金森氏症、阿耳茨海默氏病、皮克氏病、克罗伊茨费尔特雅各布氏病、亨廷顿氏舞蹈病、交叉性肢体瘫痪、肌萎缩性侧束硬化症、共济失调、大脑性瘫痪、慢性疲劳综合症、慢性疼痛综合症、先天性神经异常、脑神经疾病、谵妄、痴呆、脱髓鞘病、家族性自主神经异常、癫痫、头痛、亨廷顿氏舞蹈病、脑积水、脑膜炎、运动障碍、肌病、神经系统瘤、神经皮肤综合征、神经退行性疾病、神经毒性综合症、眼球运动障碍、周围神经系统病症、垂体病症、脑穿通畸形、瑞特综合征、睡眠障碍、脊髓病症、中风、西登哈姆氏舞蹈病、图雷特综合症、神经系统创伤和损伤等。 [0356] 此外，其他的实施方案涉及使用本发明组合物治疗代谢性病症，所述代谢性病症例如肾上腺脑白质营养不良、克利伯病(球形细胞脑白质营养不良)、异染性脑白质营养不 良、亚历山大病、Canavan氏病(海绵样脑白质营养不良)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、科凯恩综合征、贺勒氏疾病、勒韦氏综合征、利氏病、威尔逊氏病、哈勒沃登-施帕茨病、泰-萨克斯病等。可以使用本领域内已知的和可获得的任何技术来监测本发明组合物在调节代谢过程 中的功效，包括例如，检测脂肪细胞脂肪生成或脂肪细胞脂解的测定。 [0357] 在本发明的更具体的实施方案中，本发明的AspRS组合物可用于调节细胞信号转导，例如通过细胞信号转导蛋白(例如，Akt)。可以用任何已知的测定监测细胞信号转导。例如，可以通过多种靶蛋白的改变的磷酸化模式来监测总体细胞信号转导事件的发生。因此，响应于细胞的AspRS多肽处理的细胞信号转导活性的检测可以作为不同生物效应的指示。 可以这样选择用于该测定的靶蛋白，使其包括主要细胞信号转导级联的关键组分，从而提 供细胞信号转导情况及其治疗相关性的广泛描述。通常，这类测定涉及用AspRS多肽处理细胞，随后是使用特异性检测靶蛋白的磷酸化(活化)形式的抗体的免疫检测。 [0358] 用来监测治疗相关性细胞信号转导事件的示例性靶蛋白可以包括，但不限于：p38MAPK(促分裂原活化蛋白激酶，其由细胞应激和炎性细胞因子激活，参与细胞分化和凋 亡)；SAPK/JNK(应激激活的蛋白激酶/Jun氨基末端激酶，其由细胞应激和炎性细胞因子激 活)；Erk1/2、p44/42MAPK(促分裂原活化蛋白激酶Erk1和Erk2，其由广泛的细胞外信号激 活，参与细胞生长和分化的调节)；和Akt(由胰岛素和各种生长或存活因子激活，参与凋亡的抑制、糖原合成调节、细胞周期调节和细胞生长)。也可以监测酪氨酸残基的总体磷酸化，作为磷酸化介导的细胞信号转导改变的一般指示。 [0359] 当然，应当理解，也可以分析诸如细胞粘附分子(例如，钙粘蛋白、整联蛋白、闭合蛋白、连环蛋白、选择蛋白等)和/或离子通道蛋白的其他蛋白种类，用于监测本发明组合物调节的细胞事件或活性。 [0360] 在本发明的其他具体实施方案中，本发明的AspRS组合物可用于调节细胞的细胞因子产生，例如，诸如单核细胞和/或淋巴细胞的免疫细胞。可以使用本领域内已知的任何测定(即，RT-PCR、ELISA、ELISpot、流式细胞术等)来监测细胞因子的产生。通常，这类测定涉及用AspRS多肽处理细胞，然后检测细胞因子mRNA或多肽以测量细胞因子产生的变化。因此，响应于细胞的AspRS多肽处理的细胞因子产生的增加和/或减少的检测可以作为不同生 物效应的指示。通过调节细胞因子产生，本发明的AspRS多肽可以引发、增强和/或抑制免疫应答或炎症应答。例如本发明的AspRS多肽和组合物可用于改变个体中的细胞因子谱(即，1型与2型)。用于监测AspRS组合物的生物效应，可以测量的示例性的细胞因子包括，但不限于，IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL- 12p40、IL-15、IL-18、IL-23、TGF-β、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、GRO-α、GM-CSF、G-CSF等。 [0361] 通过引用将本说明书所引用的所有出版物和专利申请并入本文，如同特别和单独指出通过引用并入每一个单独的出版物或专利申请。 [0362] 尽管出于清楚理解的目的，以说明和举例的方式详细地描述了上述发明，但是对于本领域技术人员是显而易见的是，根据本发明的教导，在不脱离附加的权利要求的实质 和范围的情况下可以进行某些改变和修改。提供下述实施例仅为说明而并非限制。本领域 技术人员会容易意识到，可以改变和修改多种非关键参数而产生本质上相似的结果。 实施例 [0363] 实施例1：人天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)片段的产生 [0364] 表达具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的全长重组人AspRS，并使用镍IMAC层析从大肠杆菌中纯化所述全长重组人AspRS。为了通过受控制的蛋白水解产生AspRS片段， 用42nM人嗜中性弹性蛋白酶处理所述全长蛋白30分钟，然后通过在4-12％MOPS或12％MES 缓冲液中运行SDS-PAGE(图1C和D)分离片段。在4-12％MOPS中的SDS-PAGE凝胶上运行的消 化物仅显示一个约19kDa的蛋白片段(图1C)，而在12％MES缓冲液中的SDS-PAGE凝胶上运行 的消化物显示至少三个额外的3-6kDa的较小的肽片段(图1D)。 [0365] 实施例2：AspRS片段激活内皮细胞中Akt [0366] 在37℃下，通过将42nM的嗜中性弹性蛋白酶添加到2μg全长重组AspRS中持续30分钟产生AspRS片段库。通过添加超过蛋白酶10倍的α1-抗胰蛋白酶(Serpin A1)来终止反应。 用50nM未切割的或用嗜中性弹性蛋白酶切割的全长AspRS蛋白的库来处理牛大动脉内皮细 胞(bAEC)。将细胞与AspRS片段孵育10和15分钟，收获细胞并用抗体进行免疫印迹，该抗体仅特异性识别信号分子Akt的磷酸化(活化)形式。该处理通过磷酸化作用导致Akt强的可重 复的活化(图2A和2B)。由于Akt在凋亡、糖原合成、细胞周期和细胞生长的调节中的作用，所以该效应是有意义的。 [0367] 实施例3：AspRS上嗜中性弹性蛋白酶切割位点的鉴定 [0368] 用LC/MS/MS分析通过嗜中性弹性蛋白酶切割所产生的片段(图1D)以确定每个片段的准确的量。此外，从在4-12％的MOPS或12％的MES缓冲液中运行的SDS-PAGE凝胶切下单独的片段并进行凝胶内胰蛋白酶消化，随后用LC/MS/MS分析，从而鉴定片段产生自全长蛋 白的哪个部分并鉴定归因于嗜中性弹性蛋白酶的非胰蛋白酶切割位点。这些肽边界的特征 在表2中简述。 [0369] 表2-AspRS肽边界 [0370] [0371] 实施例4：AspRS片段增加PBMC的TNF-α分泌 [0372] 用100mM剂量的全长AspRS蛋白和AspRS片段——D1(表2)处理来自健康的供体的外周血单核细胞(PBMC)24小时。将已知能增加PBMC的TNF-α分泌的EMAPII(内皮单核细胞激活多肽II)用作阳性对照。观察到对全长AspRS响应的TNF-α分泌的增加，并且这种增加与从EMAPII阳性对照观察到的增加在数量级上相似。然而，出人意料的是，AspRS的D1片段以比从全长AspRS或EMAPII阳性对照所观察到的水平高近6倍的水平诱导TNF-α分泌(图3)。因 此，AspRS的D1片段具有在全长蛋白中被极大掩盖的新功能。 [0373] 实施例5：AspRS片段D1诱导与全长AspRS不同的细胞因子体外分泌 [0374] 将全长AspRS(100nM)或AspRS片段D1(100nM)与1×106外周血单核细胞(PBMC)一起孵育24小时。24小时的孵育后，收获上清，在液氮中速冻然后分析多种细胞因子。检测上清的27种不同的细胞因子并与缓冲液处理的PBMC上清进行比较。误差棒代表2次生物学重 复。如图4所示，AspRS片段D1显示出对上文多种细胞因子的强刺激，并且超过用全长AspRS所观察到的刺激(例如，IL1-β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MIP1-α、MIP-1β、GRO-α、MCP-1和IL-1ra)。 [0375] 实施例6：AspRS片段诱导单核细胞中CD71标志物上调 [0376] 从正常血液供体分离外周血单核细胞(PBMC)。用200nM剂量的AspRS片段D1(由全长蛋白的前154个氨基酸组成)对1.5×106PBMC进行24小时的处理。用10μg/ml植物凝集 素——植物血细胞凝集素(PHA)处理的PBMC作为阳性对照。如图5所示，用抗CD71抗体 (Becton-Dickinson)染色并通过流式细胞仪分析样品后，在D1处理的门内单核细胞中可见 CD71增殖标志物的上调。在同一样品的门内的淋巴细胞群体中，未观察到CD71上调的显著 增加。因此，D1具有激活PBMC混合物中的单核细胞的细胞类型特异性能力。 [0377] 实施例7：AspRS片段单核细胞和巨噬细胞的TNF-α分泌 [0378] 单核细胞(THP-1)和巨噬细胞(RAW 264.7)细胞系均用100nM的C末端标记的D1(C-D1)或全长AspRS(C-DRS)处理。在第2、4、8和24小时收集上清，然后分析TNF-α分泌。如图6所示，用C-D1处理后TNF-α分泌的最大量见于第2-4小时，但是随后在第8和第24小时下降。用C-DRS处理后，在所有检测的时间点，TNF-α分泌都是非常少的。用C-D1处理后，TNF-α分泌的增加是剂量依赖的。此外，用100nM、50nM、25nM、12.5nM和6nM的C-D1、N-D1和C-DRS处理细胞 4小时表明仅C-D1处理增加TNF-α分泌。 [0379] 实施例8：DRS片段D1诱导巨噬细胞细胞系的趋化性 [0380] 为了评价体外细胞迁移，用含0.5mg/ml明胶的PBS包被具有聚碳酸酯膜(5μm孔径，Costar)的24孔Transwell小室并使其风干。用新鲜的DMEM将分离的RAW264.7细胞(小鼠单核细胞/巨噬细胞细胞系)洗涤1次并以2×107细胞/ml悬浮于0.1％BSA/DMEM中。用0.1％ 6 BAS/DMEM将全长AspRS(DRS)或D1稀释成不同浓度。将RAW264.7细胞以2×10细胞/100μl/ 孔的量添加到上室中。将含有DRS或D1的培养基以500μl/孔充满下室。处于37℃24小时后，将钙黄绿素AM(Invitrogen)以8μM的最终浓度添加到下室以对迁移的细胞进行染色。孵育 30分钟后，用棉签从Transwell膜的上表面移除仍未迁移的细胞。在荧光显微镜的高倍视野下，对膜的下表面上的迁移细胞进行计数。如图7所示，D1以剂量依赖的方式诱导迁移，而相同浓度的全长AspRS仅刺激很少的迁移或没有刺激迁移。 [0381] 实施例9：AspRS片段诱导的巨噬细胞TNF-α分泌可被U0126抑制 [0382] 用100mM的小分子抑制剂U0126或LY294022预处理巨噬细胞(RAW264.7)一小时，然后用50nM的D1或1ng/ml的LPS再处理4小时。收集上清并分析TNF-α分泌。如图8所示，在D1和LPS处理的细胞中，TNF-α的分泌被U0126抑制。然而，LY294022仅抑制LPS处理的细胞中的TNF-α分泌。 [0383] 实施例10：AspRS片段D1抑制VEGF诱导的血管生成 [0384] 本实验的目的是评价AspRS的D1片段的抗血管生成活性。在改良的 栓测定中，将D1蛋白直接并入 栓中以确定其抑制VEGF诱导的血管生成的能力。简 而言之，在实验的第一天获得重量为21-25g的雌性NCR Nude小鼠(8只小鼠/组)。在第1天、第4天和第6天时，利用27号针将1ml空气注射进肩胛骨之间的皮下空间，从而在受试动物中产生气囊。在第7天时，将0.5ml含有VEGF(Cell Sciences)+盐水、VEGF+舒尼替尼(Pfizer Pharmaceuticals)或VEGF+D1蛋白的 (VWR)注射进之前产生的气囊中。在第13天 (灌注后第6天)时，处死动物并切下 栓，对其进行照相和称重。用于评价活性的 主要终点是每mg 栓湿重中的血红蛋白含量。如图9所示，D1引起对VEGF诱导的 血管生成的抑制。 [0385] 实施例11：C末端标记的AspRS片段诱导单核细胞中的TNF-α分泌 [0386] 用100nM的C或N末端标记的D1或全长AspRS处理单核细胞(THP-1)4小时。然后，收集上清并分析TNF-α分泌。如图10所示，在用C末端标记的D1处理的细胞中对TNF-α分泌的诱导最显著。N末端标记的D1诱导相当小的应答，这表明D1片段的N末端区可能在其细胞因子 活性中起重要作用。所有其他处理组对TNF-α分泌的诱导明显更低。 [0387] 实施例12：AspRS片段D1含有人DRS的哺乳动物特异性结构域 [0388] 如图11所示，一段32个氨基酸的肽仅发现于哺乳动物DRS的N末端而在酵母DRS中未发现。蛋白的该区域对于常规tRNA合成酶氨酰化活性是不必要的，并经预测含有推定的 两亲性螺旋(报道于Jacobo-Molina and Yang(1989),Escalante and Yang,JBC(1992) 中)。基于所观察到的D1的N末端对于其细胞因子活性的重要性，该独特的区域可能是本文 所报道的D1的细胞因子活性的重要媒介。 [0389] 实施例13：对来自巨噬细胞的内源D1片段的鉴定 [0390] 如图12A所示，使用LC/MS/MS蛋白质组分析在小鼠巨噬细胞细胞系(RAW264.7)中检测AspRS片段。图12A示出用RAW264.7小鼠巨噬细胞进行SDS-PAGE分析的步骤；切下蛋白 条带并用LC MS、MS进行分析，AspRS的N末端片段被鉴定为D1。该质谱分析揭示D1片段含有AspRS同二聚体的501个残基单体单元的N末端部分(由全长AspRS的约第1-171个残基组 成)。D1片段包含人AspRS的反密码子结合结构域(参见，图12B)，并与包含高度类似的OB折叠结构域的EMAPII细胞因子具有相似的结构。发现EMAPII细胞因子为p43(结合于哺乳动物 细胞的多tRNA合成酶复合物中的蛋白)中独特的结构域，其中在凋亡条件下，该结构域被切除并分泌，从而充当免疫调节细胞因子。类似的EMAPII样结构域存在于人TyrRS的C末端区 域中。然而，与EMAP-II和发现于TyrRS和p43中的同源结构域不同，D1在其N末端具有独特的 22个氨基酸的延伸，这仅在高等真核细胞中发现并形成两亲性螺旋。 [0391] 实施例14：AspRS的结构分析 [0392] 为了更好地理解D1的结构和生理来源，对天然人AspRS进行结晶，并以 的分辨率确定其三维结构(参见，图12C)。相当于D1的结构部分形成单独的含有OB折叠的结构 域，而C末端催化结构域与酵母和细菌AspRS的C末端催化结构域十分相似。连接D1片段和催化结构域的包含残基154和182的连接物在结构上混乱，表明其高度的柔韧性。该连接物区 域的柔韧性及其对蛋白酶的明显可及性，表明用内源蛋白酶对其进行切割应该能从天然 AspRS释放D1。用PMN弹性蛋白酶对重组天然人AspRS的处理，通过切割和D1在第154位残基 处的完全释放证实了这种推测(参见实施例3)。 [0393] 实施例15 [0394] AspRS片段D1诱导细胞因子的体内和体外分泌以及该片段与免疫细胞的结合 [0395] 巨噬细胞是天然免疫的重要成员，并产生和分泌多种蛋白细胞因子，包括参与细胞代谢和炎症的那些细胞因子。为了探测AspRS的D1片段与炎症之间可能的联系，将D1蛋白(10mg/kg)静脉注射进健康小鼠，并相对于媒介对照测量分泌进血流中的炎性细胞因子(促 炎性和抗炎性)的变化。由于人和小鼠的AspRS与D1具有96.8％的序列同一性，所以将重组 人AspRS和D1用于所有研究。 [0396] 图13A示出来自静脉注射10mg/kg D1的小鼠的体内TNF-α和IL-10血清水平。2小时后小鼠显示出TNF-α的增加，6小时后TNF-α被快速清除，而IL-10的水平持续增高。 [0397] 为了证实这些体内结果，还将代表单核细胞和淋巴细胞的混合物并从人类供体中分离的PBMC在体外暴露于D1蛋白(以及全长AspRS蛋白)，并检测培养基中对该处理应答的 TNF-α或IL-10的分泌。与体内所观察到的效果类似，用D1处理导致该混合细胞群体分泌 TNF-α和IL-10(图13B)。该效果是D1所特有的，并且未见于天然的AspRS，这表明通过切割过程将该N末端结构域从亲本tRNA合成酶中分离的效果。 [0398] 为了研究D1靶向于PBMC混合物中的哪种细胞，使用流式细胞术分析D1与混合物中不同亚群的细胞的结合。如图13C所示，观察到D1与单核细胞的强烈结合，混合物中几乎 100％的单核细胞都被D1分子结合。相比之下，没有检测到天然AspRS与单核细胞的结合(数据未显示)。还观察到D1蛋白与淋巴细胞的子集(约14％)的结合。对结合的淋巴细胞群体的进一步分析揭示，D1结合发生在B细胞(总B细胞的约80％被结合)和T细胞(总T细胞的约 20％被结合)两者之上(参见，图13C，附加图)。对于单核细胞和淋巴细胞，该效果是D1所特有的，并且未见于天然的AspRS(数据未显示)。这些数据支持D1直接结合并可能调节参与免疫应答的细胞的作用。 [0399] 实施例16：D1经由核因子κB进行信号转导 [0400] 核因子κB(NF-κB)被认为是一种通过刺激促炎性细胞因子(如TNF-α)的转录而在炎症发作中起重要作用的转录因子，并且随后在炎症消退期间，刺激诸如IL-10的抗炎性细胞因子的表达。NF-κB还在引导对多种刺激的细胞应答中起重要作用，所述刺激包括氧化胁迫、病毒和细菌病原体和炎性细胞因子。因此，研究了D1对巨噬细胞中NF-κB的激活效应。 [0401] 对于本次实验，将编码NF-κB诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因的RAW-Blue细胞与PBS、D1或全长AspRS一起孵育。如图14A所示，用D1处理的细胞显示出强烈剂量依赖的NF-κB激活，相比之下，由全长AspRS或PBS处理的细胞缺乏激活。 [0402] 实施例17 [0403] D1与TLR2和TLR4结合并经由TLR2和TLR4进行信号转导 [0404] 可以通过包括模式识别toll样受体(TLR)在内的多种巨噬细胞表面受体触发NF-κB。为研究与TLR受体家族潜在的联系，用NF-κB诱导的报告基因(编码分泌型胚胎碱性磷酸酶)和编码不同的toll样受体组的基因(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9)对7种不同的HEK293细胞系进行稳定的共转染。如图14B所示，观察到D1诱导的NF-κB的激活仅经由TLR2或TLR4而不经由TLR3、5、7、8或9。 [0405] 利用流式细胞术实验来确定D2是否与TLR2和/或TLR4结合。在这些实验中，将V5标记的D1(100nM)或AspRS(100nM)与稳定表达TLR2或TLR4的HEK293细胞一起孵育。空载体转 染的HEK293细胞作为无结合对照。利用流式细胞仪通过FITC-V5检测评定结合。图14C示出 D1与超表达TLR2或TLR4的稳定转染的HEK细胞强烈结合，但与不表达TLR2或TLR4的仅转染 载体的HEK细胞发生非常少的结合。 [0406] 实施例18：D1活性中的两亲性螺旋 [0407] 现有工作证实LPS是TLR2和TLR4的配体。确实，TLR2和TLR4的类脂A激动剂(OM174)配体在体内显示与从D1观察到的效果相似的效果，即TNF-α的瞬时释放(1-2小时)和随后的IL-10分泌的增加。D1编码EMAP-II样OB折叠。如同D1，EMAP-II结构域，当通过蛋白水解切割从p43释放时，刺激单核细胞分泌TNF-α。EMAP-II结构域还对嗜中性粒细胞显示出其他活性(刺激迁移和髓过氧化物酶的分泌)。然而，D1对嗜中性粒细胞不起作用(数据未显示)。 EMAP-II与D1之间的一个区别是包含在D1的前22个氨基酸中的独特的两亲性螺旋。因此，研究了两亲性螺旋在D1活性中的作用。 [0408] 首先，从D1缺失22个氨基酸的整个两亲性螺旋区域以产生Δ22D1。还产生某些点突变。例如，作为两亲性螺旋，人D1的N末端螺旋在该螺旋的一侧包含带正电的残基而在另一侧包含带负电的残基。低等真核生物的D1具有在两侧均带正电的稍长的螺旋。该螺旋的 带正电的残基已被证明能增强tRNA结合，其中的一致序列LSKKXLKKXXK(SEQ ID NO:6)是特 别重要的。该螺旋从带正电向两亲性螺旋的进化(通过从低等到高等真核生物AspRS的发 展)这样发生，3个高度保守残基的一同转换(concerted switch)，在螺旋的一侧产生带负 电的集簇，该带负电的集簇在高等真核生物中是严格保守的。假设这些带负电的残基，特别是在EMAP-II样OB折叠的环境中时，可以促成附加到D1的新的22个氨基酸的螺旋的活性。为探索这种可能性，对高等真核生物集簇中带负电的3个保守残基(E12、E16、E19)进行取代 (参见，图15B)，将它们转换回带正电集簇的低等真核生物形式(E12S、E16K、D19K)(SKK D1)。 [0409] 然后用50nm的D1、全长AspRS、Δ22突变体和电荷突变体AAA与SKK处理PBMC。相对于完整的D1，Δ22D1诱导PBMC释放非常少的THF-α或IL-10(参见，图15C)。相对于D1，AAK和SKK D1突变体对于TNF-α和IL-10分泌也具有降低的活性(对于SKK约4倍)。这些观察结果表明N末端两亲性螺旋在受体结合中的作用。 [0410] 为进一步支持该结论，还构建了在N末端而不是C末端具有V5标签的N-V5-D1，并在TNF-α释放与结合测定中测试。N-V5-D1不能结合PBMC或诱导PBMC分泌TNF-α(数据未显示)。 因此，在N末端具有肽融合可以降低D1的活性，这进一步支持了N末端两亲性螺旋在D1活性 中的作用。 [0411] 实施例19：D1活性不是由于内毒素污染 [0412] 在这些研究中使用的重组D1是从大肠杆菌中纯化的，并显示出具有少于12EU/mg的含LPS的细菌内毒素水平。但是，LPS是TLR2和TLR4信号转导的强烈刺激物，进行实验以去除痕量内毒素对从D1可见的结果负责的任何可能性。为此目的，在转染的HEK293细胞中表 达具有分泌序列的编码D1的基因。将含有分泌的D1的条件培养基收集、浓缩并与PBMC一起 孵育。 [0413] 如图16A所示，这些培养基刺激TNF-α的分泌，而来自仅用载体转染的细胞的培养基不能刺激分泌。此外，D1刺激的TNF-α释放不受已知的内毒素灭活剂多粘菌素B的影响(参见图16B)。相比之下，仍然如图16B所示，LPS刺激的TNF-α分泌的激活被多粘菌素B完全阻断。如图16C所示，用完全消化蛋白但不消化内毒素的蛋白酶K处理D1导致PBMC中TNF-α活性的完全消除。因此，D1活性不是由于内毒素污染。 [0414] 实施例20：Δ22AspRS小鼠体内敲入实验 [0415] 如上所述，由于AspRS的Δ22变体不能经由TLR2和TLR4刺激TNF-α分泌，因此在不损害AspRS的常规且基本的氨酰化活性的条件下，Δ22AspRS敲入小鼠的产生允许检测 AspRS的N末端的生理作用。初期实验集中在检测移除Δ22区域的AspRS的潜在的保护作用，所述Δ22区域已被证明作为TLR2和TLR4的内源性配体负责AspRS的活性。 [0416] 进行内毒素休克实验以测试具有Δ22AspRS敲入的小鼠是否由于它们缺乏TLR2和TLR4的内源性配体而对内毒素休克具有更强的抗性。在该实验中，将200μl/剂量的含有LPS(1μg/小鼠)和D-GalN(20mg)的盐溶液静脉注射进野生型小鼠和Δ22AspRS敲入小鼠中。这 是用于内毒素休克或败血症的常用模型，其在野生型小鼠中几乎导致完全的致死性(参见，Car et al.,J Exp Med,179:1437-44,1994)。相信通过移除内源性促炎性toll样受体配体 (即，Δ22所代表的AspRS区域)，小鼠应该可以抵抗内毒素休克所诱导的致死性。 [0417] 进行LPS耐受实验以测试来自Δ22AspRS小鼠的巨噬细胞是否由于缺乏toll样受体信号转导的脱敏作用而对LPS刺激具有较弱的耐受性。来自这些敲入小鼠的巨噬细胞应 该仍未暴露于内源性TLR2和TLR4配体(即，Δ22所代表的AspRS区域)的促炎性作用。为了检验这种可能性，用LPS(100ng/ml)离体刺激野生型和Δ22AspRS敲入小鼠腹膜巨噬细胞24小 时，这导致可通过ELISA分析的细胞因子的激活和产生(参见，Sato et al.,J Immunol.165:7096-101,2000)。由于缺乏负责诱导耐受性的促炎性信号，来自Δ22AspRS小鼠的巨噬细胞应该显示出对LPS的更强的应答。 [0418] 应当注意到，上述公开是描述性的、说明性的和示例性的，不应理解为对附加权利要求限定范围的限制。 |
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