首页 / 国际专利分类库 / 化学;冶金 / 染料;涂料;抛光剂;天然树脂;粘合剂;其他类目不包含的组合物;其他类目不包含的材料的应用 / 有机染料或用于制造染料的有关化合物;媒染剂;色淀 / 不包含在本小类任一单独的组内的染料 / 荧光化合物

荧光化合物
申请号 CN200880126876.3 申请日 2008-12-12 公开(公告)号 CN101946171A 公开(公告)日 2011-01-12
申请人 拜奥蒂乌姆股份有限公司; 发明人 毛飞; 梁伟义; 张正英; 海·E·胡佛;
摘要 一般而言，本 发明 涉及涉及 荧光 染料。本发明提供了宽范围的 荧光染料 和含有所述荧光染料的 试剂 盒 ，它们适用于标记各种 生物 分子、细胞和 微生物 。本发明还提供了使用荧光染料用于研究和开发、法医鉴定、环境研究，以及对病症进行诊断、预测和/或 治疗 的各种方法。
权利要求

1.式I化合物：
其中F为荧光团；
T为由一个或多个化学键形成且连接三个或更多不同部分的结合部分，以及其中所述结合部分含有约1-100个原子；
m和n独立为0至20的整数；
R1、R2和R3各自独立为(R)p-(L)q-；
R1、R2和R3中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
R1、R2和R3中的每个p为1至20的整数；
R1、R2和R3中的每个q为0至20的整数；
R1、R2和R3中的每个R独立为：i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；
ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；以及其中
R1、R2和R3中的至少一个R为反应性基团且R1、R2和R3中的至少另一个R为水溶性聚合物基团。
2.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为占吨染料、香豆素染料、芘染料或花青染料。
3.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为香豆素染料。
4.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为芘染料。
5.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为若丹明染料。
6.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。
7.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。
8.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为碳水化合物。
9.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物为多肽。
10.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约300Da。
11.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约800Da。
12.权利要求1的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量为约800Da至约3000Da。
13.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团与氨基、巯基或羟基亲核基形成共价键。
14.权利要求1的化合物，其中所述反应性基团为异硫氰酸酯基团、异氰酸酯基团、一氯三嗪基团、二氯三嗪基团、卤素取代的吡啶基团、卤素取代的二嗪基团、亚磷酰胺基团、马来酰亚胺基团、氮丙啶基团、磺酰卤基团、酰卤基团、羟基琥珀酰亚胺基酯基团、羟基磺基琥珀酰亚胺基酯基团、四氟苯酚酯基团、亚胺酯基团、肼基团、叠氮基硝基苯基、叠氮基团、炔基团、3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酰胺基团、乙二醛基团或醛基团。
15.权利要求1的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约
1200nm。
16.权利要求1的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约360至
1250nm。
17.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为下式的香豆素：
其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf部分中的一个为将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述部分连接的键；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的各剩余部分具有式(R)p-(L)q-，其中
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个L为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个p独立为1至20的整数；以及
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个q独立为0至20的整数。
18.权利要求17的化合物，其中
具有式
19.权利要求17的化合物，其中所述荧光团被一个或多个磺酸根基团取代。
20.权利要求1的化合物，其中所述荧光团为下式的化合物：
其中 将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述 部分连接；
R4、R5和R6各自独立为(R)p-(L)q-；
R4、R5、R6中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
R4、R5、R6中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；R4、R5、R6中的每个p独立为1至20的整数；
R4、R5、R6中的每个q独立为0至20的整数；
a、b和c独立为0、1、2或3。
21.权利要求20的化合物，其中m为0且 具有式
22.权利要求21的化合物，其中R1包括水溶性聚合物基团且R2包括反应性基团。
23.权利要求22的化合物，其中R1包括聚乙二醇。
24.权利要求22的化合物，其中R2包括N-羟基琥珀酰亚胺基团。
25.具有最大荧光激发波长的化合物，其中所述化合物具有式II的结构：
其中F为具有以下结构的部分：
Z为抗衡离子；
Y为允许在F和Ψ之间发生电子离域作用的桥单元；
Ψ为具有以下结构之一的部分：
X1和X4独立为
X2和X3独立为
a和b独立为0、1、2或3；
b′为0、1或2；
其中当Ψ为式1，且所述化合物的最大荧光激发波长小于660nm时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，其中R5和R6不能组合起来形成取代的环；
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立为(R)p-(L)q-，
所述化合物的每个(R)P-(L)q的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
所述化合物的每个(R)p-(L)q-中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约
1-100个原子的连接部分；
每个(R)p-(L)q-中的每个p独立为约1至约20的整数；
R1或R2的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为0至约20的整数；
R3、R4、R5、R6或R7的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为1至约20的整数；
c为0或1；
d为0或1；
所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为反应性部分；以及
所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为水溶性聚合物。
26.权利要求25的化合物，其中当存在至少两个相邻的R1和/或两个相邻的R2时，所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2结合形成6元环，所述6元环是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
27.权利要求26的化合物，其中当所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2结合形成6元环时，如此形成的环为芳族的。
28.权利要求25的化合物，其中当Ψ为式1且所述化合物的最大荧光激发波长等于或大于660nm时，或当Ψ不是式1时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，或R5和R6可结合形成环状部分，所述环状部分是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
29.权利要求25的化合物，其中Y为：
其中当存在C时，其为5元或6元环状基团；
R7为(R)p-(L)q-；
(R)p-(L)q-的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；
ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
(R)p-(L)q-中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
p为约1至约20的整数；以及
q为1至约20的整数。
30.权利要求25的化合物，其中R1和R2中至少一个R为带电部分。
31.权利要求25的化合物，其中R1和R2中至少一个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。
32.权利要求25的化合物，其中R1和R2中每个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。
33.权利要求25的化合物，其中X2和X3独立为
34.权利要求25的化合物，其中X2和X3独立为
35.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。
36.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。
37.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约300。
38.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物的分子量大于约800。
39.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量为约800至约3000。
40.权利要求26的化合物，其中两个相邻的(R1)a与环A中它们所连接的原子结合形成碳环。
41.权利要求40的化合物，其中所述碳环为芳族的。
42.权利要求26的化合物，其中两个相邻的(R2)b与环B中它们所连接的原子结合形成碳环。
43.权利要求42的化合物，其中所述碳环为芳族的。
44.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
45.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
其中c为1；d为1；
R3和R4中的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3和R4中的至少一个R为水溶性聚合物基团。
46.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
其中c为1；d为1；
R3、R4和R5的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5的至少一个R为水溶性聚合物的基团。
47.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
其中c为1；d为1；
R3和R4中的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3和R4中的至少一个R为水溶性聚合物基团。
48.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
其中c为1；d为1；
R3、R4和R5的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5的至少一个R为水溶性聚合物的基团。
49.权利要求25的化合物，其中所述化合物具有式：
其中c为1；d为1；
R3、R4和R5的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5的至少一个R为水溶性聚合物的基团。
50.权利要求25的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约
1200nm。
51.权利要求25的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约360至约
1250nm。
52.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧烷。
53.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。
54.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为碳水化合物。
55.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物为多肽。
56.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量大于300。
57.权利要求25的化合物，其中所述水溶性聚合物分子量大于800。
58.权利要求25的化合物，其中所述化合物为
59.取代的花青染料，所述取代的花青染料含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长。
60.取代的花青染料，所述取代的花青染料含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。
61.权利要求59或60的取代的花青染料，其中所述染料被非螺环部分取代。
62.结合剂，所述结合剂用权利要求59或60的取代的花青染料标记，其中所述结合剂与靶标多肽选择性结合以形成复合物，以及其中复合物的形成产生了至少为100的荧光信噪比。
63.权利要求62的结合剂，其中所述取代的花青染料取代有非螺环取代基。
64.权利要求62的结合剂，其中所述结合剂为多肽。
65.权利要求63的结合剂，其中所述多肽为抗体。
66.式III化合物：
其中
Z为-H、烷基、-CF3、-CN或下式的基团：
+ +
X1为＝O、＝NH2 或＝NR6R7 ；
X2为-OH、NH2或-NR8R9；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为(R)p-(L)q-；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个p独立为1至20的整数；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个q独立为0至20的整数；
a、b、c、d和d独立为0、1、2、3或4；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中至少一个R为反应性部分；以及
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中至少一个R为水溶性聚合物基团。
67.权利要求66的化合物，其中R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2和所述邻近的R1或R2所连接的环中任何间插原子结合形成5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
68.权利要求67的化合物，其中当R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2结合形成5元或6元环时，所述环是不饱和的。
69.权利要求67的化合物，其中当R6、R7、R8或R9中的至少一个可与邻近的R1或R2结合形成5元或6元环时，所述环是饱和的。
+
70.权利要求66的化合物，其中X1为＝NH2。
71.权利要求66的化合物，其中X1为＝O。
72.权利要求66的化合物，其中X2为-OH。
73.权利要求66的化合物，其中X2为-NH2。
74.权利要求66的化合物，其中所述化合物的最大荧光激发波长范围为约450至
750nm。
75.权利要求66的化合物，其中所述化合物的最大荧光发射波长范围为约470至
800nm。
76.式V的化合物：
其中
R1、R2、R3和R4各自独立为(R)p-(L)q-，
R1、R2、R3和R4中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、膦酸根基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
R1、R2、R3和R4中每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分，
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中每个p独立为1至20的整数，
R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中每个q独立为0至20的整数，
a、b、c和d独立为0、1、2或3，
R1、R2、R3和R4中至少一个R为反应性部分，以及
R1、R2、R3和R4中至少一个R为水溶性聚合物基团。
77.试剂盒，其包括：
i)权利要求1、25、59、60、66或76的化合物；ii)缓冲剂；iii)用于纯化缀合产物的材料或装置；以及v)指示所述化合物用法的说明书。
78.生物分子，其包括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的标记物，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与生物分子连接的反应。
79.权利要求78的包括标记物的生物分子，其中所述生物分子包括多核苷酸。
80.权利要求78的包括标记物的生物分子，其中所述生物分子包括多肽。
81.权利要求80的生物分子，其中所述多肽还包括抗原结合位点。
82.权利要求80的生物分子，其中所述多肽为完整免疫球蛋白。
83.权利要求80的生物分子，其中所述多肽为Fab片段。
84.免疫球蛋白，其包括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的标记物，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与免疫球蛋白连接的反应，其中所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。
85.权利要求84的免疫球蛋白，其中所述抗体与erb2结合。
86.制备经标记的生物分子的方法，其包括使权利要求1、25、59、60、66或76的化合物与底物生物分子在足以实现所述化合物和底物生物分子之间发生交联的条件下反应。
87.权利要求86的方法，其中所述底物生物分子为多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质或它们的组合。
88.权利要求87的方法，其中所述底物生物分子为多核苷酸。
89.标记细胞群落中细胞，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求78的生物分子接触，其中所述生物分子包括靶标部分，所述靶标部分与作为细胞指示的结合配偶体结合，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记。
90.权利要求89的方法，所述方法还包括对细胞进行成像的步骤，所述成像步骤包括i)将激发波长导向所述细胞；以及
ii)检测从所述细胞发射的荧光。
91.权利要求89的方法，其中所述标记在体外发生。
92.权利要求89的方法，其中所述标记在体内发生。
93.用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长等于或大于685nm的荧光团。
94.用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长等于或大于750nm的荧光团。
95.权利要求93或94的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白当与荧光化合物缀合时保持了对靶标的结合特异性。
96.权利要求95的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。
97.权利要求96的免疫球蛋白，其中所述抗体与erb2结合。
98.权利要求93或94的免疫球蛋白，其中所述荧光化合物为权利要求1、25、59、60、66或76的化合物。
99.用荧光化合物标记的多肽，所述多肽呈现出的血清半衰期不短于缺少所述荧光化合物的相应多肽的血清半衰期，其中所述荧光化合物为权利要求1、25、59、60、66或76的化合物。
100.标记多肽的方法，其包括：形成包括多肽和结合剂的复合物，其中所述结合剂包括具有权利要求1、25、59、60、66或76的式的结构的荧光标记物，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与结合剂连接的反应。
101.权利要求100的方法，其中所述结合剂为抗体。
102.权利要求101的方法，其中所述复合物包括(a)与所述多肽结合的第一抗体，以及(b)结合剂，其起到第二抗体的作用，显示出与第一抗体结合的能力。
103.权利要求102的方法，其中所述标记发生在固体底物上。
104.权利要求102的方法，其对多肽进行细胞内标记。
105.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约100的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：
(来自复合物的荧光信号)/(来自多肽、同种型对照第一抗体和所述结合剂的荧光信号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合剂结合。
106.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约250的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：
(来自复合物的荧光信号)/(来自多肽、同种型对照第一抗体和所述结合剂的混合物的荧光信号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合剂结合。
107.权利要求102的方法，其中所述复合物产生大于约270的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：
(来自复合物的荧光信号)/(来自多肽、同种型对照第一抗体和结合剂的混合物的荧光信号)，其中所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与所述结合剂结合。
108.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相TM
同第二抗体形成的、用DyLight 680 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总荧光信号相比大至少5％。
109.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相同第二抗体形成的、用Cy5.5 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总荧光信号相比大至少5％。
110.权利要求102的方法，其中所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相同第二抗体形成的用Alexa Fluor 680 染料进行了可比程度的标记的复合物所产生的总荧光信号相比大至少5％。
111.权利要求108、109或110的方法，其中具有权利要求25的式的结构的标记物为具有下式的化合物：
112.权利要求111的方法，其中每种复合物在635nm或633nm激发。
113.权利要求111的方法，其中每种复合物以相同蛋白质浓度存在。
说明书全文

荧光化合物

[0001] 本申请要求于2007年12月14日提交的美国临时专利申请61/013,956的权益，在此将其全文引入作为参考。

背景技术

[0002] 荧光染料广泛用于生物学研究和医学诊断。荧光染料优于常规的放射性物质，因为荧光染料通常是足够灵敏的而被检测，且花费更少、毒性更低。具体地，具有可区别的色彩范围(color range)的不同荧光团(fluorophore)使得进行多种测定法(multiplexed assays)变得更实际可行，所述多种测定法能够平行检测多重生物学靶标。通常需要使多重靶标平行显现的能力，用来描绘体外和体内不同生物学靶标之间的空间和时间关系。此外，宽范围的荧光染料的产生开启了进行高通量和自动化测定的新途径，由此显著地降低了对每测定的单元花费。此外，荧光染料的低毒性提供了体外操作的容易性，并且也使得其进行体内生物活性成像(imaging biological activities)更安全。
[0003] 尽管荧光染料具有多种优点，但常规染料具有许多深切的限制。例如，常规荧光染料通常易于发生染料间淬灭(inter-dye quenching)，这是已知为减小染料的有效亮度的现象。常见的实践是，使给定的靶标与多种染料分子缀合，以便使得经标记的靶标(例如生物分子如蛋白质或DNA)的亮度最大化。对于许多常规荧光染料而言，经标记的靶标的荧光强度通常与所连接的染料分子的数目不成正比，而是比预测的强度低，这时由于例如与靶标连接的多种染料之间发生淬灭。所述淬灭效应可部分归因于所连接的染料分子之间的物理相互作用，这种物理相互作用可导致非荧光性染料二聚体的形成。二聚体形成可由疏水相互作用(hydrophobic interaction)驱使。因为许多传统的荧光染料如各种若丹明染料(rhodamine dye)和花青染料(cyanine dye)是高度疏水的芳族化合物，这些常用的染料特别易于在经标记的生物分子上形成二聚体。已显示将磺酸根基团(sulfonate group)加到染料中减少二聚体形成。参见，例如美国专利5,268,486和6,977,305、6,130,101和Panchuk-Voloshina等人，J.Histochem.Cytochem.47(9)，1179(1999)。然而，尽管磺化作用可减少二聚体形成，但也将负电荷引入到了生物分子中，由此可增加破坏经标记的生物分子的生物活性的危险。此外，仅取代有磺酸根基团的染料在受试者体内使用时可显示出较短的血清半衰期。
[0004] 常规荧光染料的另一种限制因素是个体荧光基团所固有的较低荧光亮度。这种特性通常由荧光基团的荧光量子产率(fluorescence quantum yield)决定。低的荧光量子产率通常是由于能量从分子的电子激发态(excited electronic state)转移到振动态和转动态(vibrational and rotational states)引起的，这是电子能量转换为热能而非光能的过程。改善荧光基团的荧光量子产率的一种途径是使染料结构刚性化(rigidify)，从而染料具有受限的振动和转动模式。参见例如美国专利5,981,747和5,986,093，这些专利描述了经两个碳的链刚性化的单次甲基花青染料(monomethine cyanine dye)，所述两个碳的链连接两个苯并噁唑鎓(benzazolium)氮原子。类似地，在美国专利6,133,445中，三次甲基花青染料通过将桥基引入到含有三个环的稠合环系中而刚性化。刚性化的花青染料与非刚性化的对应染料相比都具有显著改善的量子产率。然而，量子产率的改善是以损害了其它期望的特性为代价的。例如，由于这些刚性化染料的结构相对复杂，它们与常规花青染料相比通常花费若干更多的步骤来合成，这常常伴随着较低的收率。高度刚性化的染料也可能显示了在蛋白质上聚集的更高倾向。例如，已显示刚性化的花青染料即使当其在蛋白质上的标记程度大大低于非刚性化花青时也形成二聚体(Cooper，et al.Journal of Fluorescence 14，145(2004))。此外，已显示与常规非刚性化三次甲基花青染料相比，刚性化的三次甲基花青染料显著降低了耐光性(photostability)(参见例如美国专利6,133,445)。
发明内容
[0005] 因此，对允许在各种应用中便利和有效地标记宽范围的分子的改进组合物和方法仍然存在相当的需求。本发明满足了这种需求，并且提供了额外的优点。
[0006] 因此，本发明提供了可具有下列特征的任何一种或所有特征的荧光化合物。在一方面，使用本发明的荧光化合物制备的经标记的生物分子显示了显著降低的二聚体形成。在其它方面，本发明的化合物和经标记的生物分子显示了其它期望的特性，如更高的水溶性，改善的荧光量子产率，改善的耐光性、相对简单的合成、对标记的缀合物(conjugate)的改善的特异性，和/或改善的体内半衰期。
[0007] 本发明提供了式I化合物：
[0008]
[0009] 其中F为荧光团；
[0010] T为由一个或多个化学键形成且连接三个或更多不同部分的结合部分(joining moiety)，以及其中所述结合部分含有约1-100个原子；
[0011] m和n独立为0至20的整数；
[0012] R1、R2和R3各自独立为(R)p-(L)q-；
[0013] R1、R2和R3中的每个L独立为连接部分(linking moiety)，所述连接部分由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子，它们经选择以使所述部分为稳定部分；
[0014] R1、R2和R3中的每个p为1至20的整数；
[0015] R1、R2和R3中的每个q为0至20的整数；
[0016] R1、R2和R3中的每个R独立为：i)当与反应配偶体(reaction partner)反应时能够形成共价键的反应性基团(reactive group)；ii)水溶性聚合物的基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团(sulfonate group)、膦酸根基团(phosphonate group)或磺酰胺基(sulfoamido group)；或iv)-H；以及其中R1、R2和R3中的至少一个R为反应性基团且R1、R2和R3中的至少另一个R为水溶性聚合物的基团。
[0017] 在一些实施方案中，所述荧光团为占吨染料(xanthene dye)、香豆素染料(coumarin dye)、芘染料(pyrene dye)或花青染料(cyanine dye)。所述水溶性基团可以是例如聚环氧烷(polyalkylene oxide)如聚环氧乙烷。可供选择地，所述水溶性聚合物基团可以是碳水化合物或多肽。所述水溶性聚合物基团的分子量可大于约300Da，或可供选择地大于约800Da，或分子量为约800Da至约3000Da。所述反应性基团可与氨基、巯基或羟基亲核基形成共价键。例如，所述反应性基团可以是异硫氰酸酯基团、异氰酸酯基团、一氯三嗪基团、二氯三嗪基团、卤素取代的吡啶基团、卤素取代的二嗪基团、亚磷酰胺基团(phosphoramidite)、马来酰亚胺基团、氮丙啶基团、磺酰卤基团、酰卤基团、羟基琥珀酰亚胺基酯基团(hydroxysuccinimidyl ester)、羟基磺基琥珀酰亚胺基酯基团(hydroxysulfosuccinimidyl ester)、四氟苯酚酯基团、亚胺酯基团、肼基团、叠氮基硝基苯基、叠氮基团(azide)、炔基团、3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酰胺基团、乙二醛基团或醛基团。
[0018] 本发明化合物的荧光激发波长(fluorescence excitation wavelength)可为约350至约1200nm，而所述化合物的荧光发射波长(fluorescence emission wavelength)可为约360至1250nm。
[0019] 在一实施方案中，式I化合物包括荧光团，所述荧光团为下式的香豆素：
[0020]
[0021] 其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf部分中的一个为将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述 部分连接的键；并且Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的各剩余部分具有式(R)p-(L)q-，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的每个R独立为i)当与反应配偶体反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物的基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团、膦酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
[0022] Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个L为连接部分，所述连接部分由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子，它们经选择以使所述部分为稳定部分；Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个p独立为1至20的整数；Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf中的每个q独立为0至20的整数。
[0023] 在其它实施方案中，式I化合物包括荧光团，所述荧光团为下式的若丹明：
[0024]
[0025] 其中 将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述 部分连接；
[0026] R4、R5和R6各自独立为(R)p-(L)q-；R4、R5、R6中的每个R独立为i)当与反应配偶体反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；R4、R5、R6中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；R4、R5、R6中的每个p独立为1至20的整数；R4、R5、R6中的每个q独立为0至20的整数；以及a、b和c独立为0、1、2或3。
[0027] 在有关实施方案中， 具有式 在一些实施方案中，R1包括水溶性聚合物基团且R2包括反应性基团。例如，R1包括聚乙二醇基团。在其它实施方案中，R2包括N-羟基琥珀酰亚胺基团。
[0028] 在其它实施方案中所述荧光团被一个或多个磺酸根基团取代。
[0029] 在另一方面，本发明提供了具有最大荧光激发波长的化合物，其中所述化合物具有式II的结构：
[0030]
[0031] 其中F为具有以下结构的部分：
[0032]
[0033] Z为抗衡离子，Y为允许在F和Ψ之间发生电子离域作用(delocalization)的桥单元(bridge unit)；
[0034] Ψ为具有以下结构之一的部分：
[0035]
[0036] X1和X4独立为
[0037] X2和X3独立为
[0038] a和b独立为0、1、2或3；
[0039] b′为0、1或2；
[0040] 其中当Ψ为式1，且所述化合物的最大荧光激发波长小于660nm时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，其中R5和R6不能组合起来形成取代的环；
[0041] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立为(R)p-(L)q-，
[0042] 所述化合物的每个(R)P-(L)q的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
[0043] 所述化合物的每个(R)p-(L)q-中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
[0044] 每个(R)p-(L)q-中的每个p独立为约1至约20的整数；
[0045] R1或R2的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为0至约20的整数；
[0046] R3、R4、R5、R6或R7的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为1至约20的整数；
[0047] c为0或1；d为0或1；
[0048] 所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为反应性部分；以及
[0049] 所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为水溶性聚合物。
[0050] 在一些实施方案中，本发明提供了式II化合物，其中当存在至少两个相邻的R1和/或两个相邻的R2时，所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2可结合形成6元环，所述6元环是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。在一些实施方案中，本发明提供了式II化合物，其中当所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2可结合形成6元环时，如此形成的环为芳族的。
[0051] 在式II化合物的一些实施方案中，当Ψ为式1且所述化合物的最大荧光激发波长等于或大于660nm时，或当Ψ不是式1时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，或R5和R6可结合形成环状部分，所述环状部分是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
[0052] 在式II化合物的一些实施方案中，Y为：
[0053]
[0054] 其中当存在C时，其为5元或6元环状基团；R7为(R)p-(L)q-；(R)p-(L)q-的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；(R)p-(L)q-中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约
1-100个原子的连接部分；p为约1至约20的整数；以及q为1至约20的整数。
[0055] 在式II化合物的一些实施方案中，R1和R2中至少一个R为带电的部分。在其它实施方案中，R1和R2中至少一个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。在其它实施方案中，R1和R2中的每个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。
[0056] 在式II化合物的一些实施方案中，X2和X3独立为
[0057] 在其它实施方案中，X2和X3独立为
[0058] 在式II化合物的一些实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧烷。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。在一些实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于约300。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于约800。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物分子量范围为约800至约3000。
[0059] 在式II化合物的一些实施方案中，两个相邻的(R1)a与环A中它们所连接的原子结合形成碳环。在一些实施方案中，所述碳环为芳族的。在其它实施方案中，两个相邻的(R2)b与环B中它们所连接的原子结合形成碳环。在一些实施方案中，所述碳环为芳族的。
[0060] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0061]
[0062] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0063]
[0064] 其中c为1；d为1；R3和R4中至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3和R4中至少一个R为水溶性聚合物基团。
[0065] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0066]
[0067] 其中c为1；d为1；R3、R4和R5中至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5中至少一个R为水溶性聚合物的基团。
[0068] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0069]
[0070] 其中c为1；d为1；R3和R4中一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团以及R3和R4中一个R为水溶性聚合物基团。
[0071] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0072]
[0073] 其中c为1；d为1；R3、R4和R5中至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5中至少一个R为水溶性聚合物的基团。
[0074] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式：
[0075]
[0076] 其中c为1，d为1；R3、R4和R5中至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团，以及R3、R4和R5中至少一个R为水溶性聚合物的基团。
[0077] 在一些实施方案中，所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约1200nm。在其它实施方案中，所述化合物的最大荧光发射波长范围为约360至约1250nm。
[0078] 在一些实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧烷。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为碳水化合物。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为多肽。在一些实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于300。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于800。
[0079] 在式II化合物的一些实施方案中，所述化合物为
[0080]
[0081]
[0082] 在另一方面，本发明提供了含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长。在一些实施方案中，要求保护的取代的花青染料，所述染料被非螺环部分(non-spiro moiety)取代。
[0083] 在另一方面，本发明提供了含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。在一些实施方案中，要求保护的取代的花青染料，所述染料被非螺环部分取代。
[0084] 在另一方面，本发明提供了用本发明的取代的花青染料标记的结合剂(binding agent)，其中所述结合剂与靶标多肽选择性结合以形成复合物(complex)，以及其中复合物的形成产生了至少为100的荧光信噪比(signal to noise ratio)。在一些实施方案中，所述结合剂包括取代的花青染料，其取代有非螺环取代基。在一些实施方案中，所述结合剂为多肽。在其它实施方案中，所述多肽为抗体。
[0085] 在另一方面，本发明提供了式III化合物：
[0086]
[0087] 其中Z为-H、烷基、-CF3、-CN或下式的基团：
[0088]
[0089] X1为＝O、＝NH2+或NR6R7+；
[0090] X2为-OH、NH2或-NR8R9；
[0091] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为(R)p-(L)q-；
[0092] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；
[0093] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；
[0094] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个p独立为1至20的整数；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中每个q独立为0至20的整数；
[0095] a、b、c、d和d独立为0、1、2、3或4；
[0096] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中至少一个R为反应性部分；以及
[0097] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9中至少一个R为水溶性聚合物基团。
[0098] 在式III化合物的一些实施方案中，R6、R7、R8或R9中的至少一个与邻近的R1或R2和所述邻近的R1或R2所连接的环中任何间插原子(intervening atom)可结合形成5元或6元环，所述5元或6元环是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。在一些实施方案中，当R6、R7、R8或R9中的至少一个与邻近的R1或R2可结合形成5元或6元环时，如此形成的环是不饱和的。在其它实施方案中，当R6、R7、R8或R9中的至少一个与邻近的R1或R2可结合形成5元或6元环时，如此形成的环是饱和的。
[0099] 在式III化合物的一些实施方案中，X1为＝NH2+。在其它实施方案中，X1为＝O。在其它实施方案中，X2为-OH。在一些实施方案中X2为-NH2。
[0100] 在式III化合物的一些实施方案中，所述化合物的最大荧光激发波长范围为约450至750nm。在其它实施方案中，所述化合物的最大荧光发射波长范围为约470至800nm。
[0101] 在另一方面，本发明提供了式V化合物：
[0102]
[0103] 其中R1、R2、R3和R4各自独立为(R)p-(L)q-，
[0104] R1、R2、R3和R4中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、膦酸根基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H。
[0105] R1、R2、R3和R4中每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分，
[0106] R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中每个p独立为1至20的整数，
[0107] R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中每个q独立为0至20的整数，
[0108] a、b、c和d独立为0、1、2或3，
[0109] R1、R2、R3和R4中至少一个R为反应性部分，以及
[0110] R1、R2、R3和R4中至少一个R为水溶性聚合物基团。
[0111] 在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包括：i)权利要求1、25、59、60、66或76的化合物；ii)缓冲剂；iii)用于纯化缀合产物的材料或装置；以及v)指示所述化合物用法的说明书。
[0112] 在另一方面，本发明提供了生物分子，其包括：具有式I、II、III、IV、V结构的标记物(label)，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与生物分子连接的反应。在一些实施方案中，所述生物分子包括多核苷酸。在一些实施方案中，所述生物分子包括多肽。在一些实施方案中，所述多肽还包括抗原结合位点。在一些实施方案中，所述多肽为完整免疫球蛋白(whole immunoglobulin)。在一些实施方案中，所述多肽为Fab片段。
[0113] 在另一方面，本发明提供了免疫球蛋白，其包括具有式I、II、III、IV、V结构的标记物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与免疫球蛋白连接的反应，其中所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与erb2结合。
[0114] 在另一方面，本发明提供了制备经标记的生物分子的方法，其包括使以下化合物与底物生物分子在足以实现所述化合物和底物生物分子之间发生交联的条件下反应：具有式I、II、III、IV、V结构的化合物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。在一些实施方案中，所述底物生物分子为多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质或它们的组合。在其它实施方案中，所述底物生物分子为多核苷酸。
[0115] 在另一方面，本发明提供了标记细胞群落中的细胞，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明方法标记的生物分子接触，其中所述生物分子包括靶标部分，所述靶标部分与作为细胞指示的结合配偶体(binding partner)结合，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记。在一些实施方案中，所述方法还包括对细胞进行成像的步骤，所述成像步骤包括i)将激发波长导向(direct)所述细胞；以及ii)检测从所述细胞发射的荧光。在一些实施方案中，所述标记在体外发生。在其它实施方案中，所述标记在体内发生。
[0116] 在另一方面，本发明提供了用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长等于或大于685nm的荧光团。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白当与荧光化合物缀合时保持了对靶标的结合特异性。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与erb2结合。在一些实施方案中，所述荧光化合物为式I、II、III化合物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。
[0117] 在另一方面，本发明提供了用荧光化合物标记的免疫球蛋白，所述荧光化合物包括聚环氧烷和最大吸收波长等于或大于750nm的荧光团。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白当与荧光化合物缀合时保持了对靶标的结合特异性。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白为与癌细胞上的抗原特异性结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体与erb2结合。在一些实施方案中，所述荧光化合物为式I、II、III、V化合物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。
[0118] 在另一方面，本发明提供了用荧光化合物标记的多肽，所述多肽呈现出的血清半衰期不短于缺少荧光化合物的相应多肽的血清半衰期，其中所述荧光化合物为具有式I、II、III、V结构的化合物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。
[0119] 在另一方面，本发明提供了标记多肽的方法，其包括：形成包括所述多肽和结合剂的复合物，其中所述结合剂包括具有式I、II、III、V结构的荧光标记物，含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长，或含有反应性基团和一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长，其中对所述式的至少一个反应性部分已进行了将标记物与结合剂连接的反应。在一些实施方案中，所述结合剂为抗体。在一些实施方案中，所述复合物包括(a)与所述多肽结合的第一抗体，以及(b)结合剂，其起到第二抗体的作用，显示出与第一抗体结合的能力。在一些实施方案中，所述标记在固体底物上发生。在一些实施方案中，其在细胞内标记多肽。在一些实施方案中，所述复合物产生大于约100的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：(来自复合物的荧光信号(所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与结合剂结合))/(来自多肽、同种型对照第一抗体和结合剂的混合物的荧光信号)。在其它实施方案中，所述复合物产生大于约250的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：(来自复合物的荧光信号(所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与结合剂结合))/(来自多肽、同种型对照第一抗体和结合剂的混合物的荧光信号)。在其它实施方案中，所述复合物产生大于约
270的信噪比，其中所述信噪比由下式计算：(来自复合物的荧光信号(所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与结合剂结合))/(来自多肽、同种型对照第一抗体和结合剂的混合物的荧光信号)。
[0120] 在一些实施方案中，所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相同第二TM抗体形成的复合物(用DyLight 680 染料进行了可比程度的标记)所产生的总荧光信号相比大至少5％。在其它实施方案中，所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相同第二抗体形成的复合物(用Cy5.5 染料进行了可比程度的标记)所产生的总荧光信号相比大至少5％。在其它实施方案中，所述复合物产生的总荧光信号与由相同第一抗体和相同第二抗体形成的复合物(用Alexa Fluor 680 染料进行了可比程度的标记)所产生的总荧光信号相比大至少5％。在一些实施方案中，具有式II结构的标记物为具有下式的化合物：
[0121]
[0122] 在一些实施方案中，每种复合物在635nm或633nm被激发。在一些实施方案中，每种复合物以相同蛋白质浓度存在。
[0123] 引用参考
[0124] 将本说明书中提及的所有出版物和专利申请在此引入作为参考，所引用的程度就如同将每篇单独的出版物和专利申请明确和单独地指出，以引入作为参考。附图说明
[0125] 在所附的权利要求书中具体地阐明了本发明的新颖特征。通过参考以下的详细说明将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细说明列出了示例性实施方案和附图，在示例性实施方案中利用了本发明的原理，其中：
[0126] 图1为分别显示在含水缓冲液中Cy5 染料和化合物41(实施例41)以类似的标记程度(即约4)与山羊抗小鼠IgG缀合时的吸收光谱的图示。Cy5 染料的光谱显示出染料聚集的特征性双峰，而化合物41的光谱主要显示了单峰，这表明实质上不存在染料聚集。
[0127] 图2为显示当在630nm进行激发时，在类似的标记程度(即约5)和当量蛋白质浓度(equivalent protein concentration)下Cy5 染料与山羊抗兔IgG的缀合物和化合物41(实施例41)与山羊抗兔IgG的缀合物的荧光发射光谱的图示。所述数据证明了本发明的荧光基团的荧光性比Cy5 染料显著高。
[0128] 图3为当在630nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下Cy5 染料与山羊抗兔IgG的缀合物和化合物41(实施例41)与山羊抗兔IgG的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。所述数据显示，当抗体以较高程度标记时，本发明的荧光基团与Cy5 染料相比较少地发生荧光淬灭(参见实施例97)。
[0129] 图4为当在530nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下化合物5(实施例5)与抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)的缀合物、Cy3 染料与抗生物素蛋白链菌素的缀合物和Alexa Fluor 555 染料与抗生物素蛋白链菌素的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。本发明的荧光基团得到的较高斜率，这证明本发明的荧光基团本质上比Cy3 染料或Alexa Fluor 555 染料更具荧光性(参见实施例97)。
[0130] 图5为当在530nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下化合物5(实施例5)与山羊抗小鼠的缀合物、Cy3 染料与山羊抗小鼠的缀合物和Alexa Fluor 555染料与山羊抗小鼠的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。所有三种荧光基团具有类似的吸收最大值和发射最大值，但Cy3 染料和Alexa Fluor 555 染料不具有水溶性聚合物基团。所述数据显示，在宽范围的标记程度下本发明的荧光基团与Alexa Fluor555 染料亮度相同。然而，Cy3 染料的荧光在较高的标记程度下基本上被淬灭(参见实施例97)。
[0131] 图6为当在640nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下化合物67(实施例67)与山羊抗小鼠IgG的缀合物和不含水溶性聚合物基团的光谱学类似的荧光基团即Alexa Fluor 660 染料与山羊抗小鼠IgG的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。所述数据显示，与Alexa Fluor 660 染料相比，本发明的荧光基团在宽标记程度下下具有更高的荧光量子产率，并且当抗体处于较高标记程度时发生更少的荧光淬灭(参见实施例97)。
[0132] 图7为当在350nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下化合物92(实施例92)与山羊抗小鼠IgG的缀合物和不含水溶性聚合物基团的类似荧光基团即AMCA与山羊抗小鼠IgG的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。所述数据显示，与AMCA相比，本发明的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率，并且当抗体处于较高标记程度时发生更少的荧光淬灭(参见实施例97)。
[0133] 图8为当在488nm进行激发时，就在含水缓冲液中相同蛋白质浓度下化合物96(实施例96)与山羊抗小鼠IgG的缀合物和不含水溶性聚合物基团的类似荧光基团
即5(6)-羧基若丹明110(CR110)与山羊抗小鼠IgG的缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图。所述数据显示，与CR110相比，本发明的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率，并且当抗体处于较高标记程度时发生更少的荧光淬灭(参见实施例97)。
[0134] 图9为显示如流式细胞术测量的，用各种荧光标记的抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的图示。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用山羊抗小鼠IgG染色，所述山羊抗小鼠IgG用化合物41分别以2.7、3.9和5.8的标记程度进行标记，或所述细胞用标记有Cy5 染料的市售山羊抗小鼠IgG标记(深色柱)。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也用每种荧光第二抗体而不是第一抗体直接染色(空白柱)。结果显示，与用市售抗体缀合物染色的细胞相比，用本发明的抗体缀合物染色的细胞亮度高25-60％，并且信噪比极好(参见实施例104)。
[0135] 图10为流式细胞术直方图，其显示作为荧光强度的函数的免疫荧光染色的细胞的分布。将Jurkat细胞固定，透化(permeabilize)，然后用小鼠抗人CD3抗体孵育。CD3抗体随后与用AlexaFluor647 染料(DOL 3.1)(灰线条峰)或化合物41(DOL 3.9)(黑线条峰)标记的山羊抗小鼠IgG一起孵育。该图显示，与本发明的荧光基团标记的抗体相比，AlexaFluor647 染料标记的抗体得到染色较弱的细胞和更分散(scattered)的荧光染色(参见实施例105)。
[0136] 图11显示了本发明的荧光基团随时间推移的耐光性与荧光素(fluorescein)和Alexa Fluor 488 染料随时间推移的耐光性的比较。将肌丝(Actin filament)用鬼笔环肽(phalloidin)染色，所述鬼笔环肽用化合物96、Alexa Fluor 488 染料或荧光素标记，然后对每种样品的相对荧光相对时间进行绘图。图11显示，用化合物96标记的生物分子的耐光性优于用荧光素和Alexa Fluor 488 染料标记的生物分子的耐光性(参见实施例107)。
[0137] 图12A、B和C为显示山羊抗小鼠IgG缀合物的吸收光谱的图示，所述山羊抗小鼠IgG缀合物以不同标记程度(DOL)用三种近红外(near-IR)染料制备：图12A表示用Cy7染料以4种不同的DOL(每个抗体1.2至3.4个染料分子)标记山羊抗小鼠IgG所形成的缀合物的吸收光谱。图12B表示用Alexa Fluor 750 (AF750 )染料以4种不同的DOL(每个抗体2.2至5.9个染料分子)标记山羊抗小鼠IgG所形成的缀合物的吸收光谱。图12C表示用染料29(表3)以6种不同的DOL(每个抗体1.1至7.4个染料分子)标记山羊抗小
鼠IgG所形成的缀合物的吸收光谱。所有光谱在室温在PBS 7.4缓冲液中获得。Cy7 染料标记的缀合物和AF750 染料标记的缀合物(A和B)显示了染料聚集的特征性双峰，而化合物29标记的缀合物(C)主要显示了单峰，这表明实质上不存在染料聚集。
[0138] 图13为在pH 7.4PBS缓冲液中在相同蛋白质浓度下，就用本发明的近红外染料即染料29(表3)标记的山羊抗小鼠IgG缀合物和分别用两种其它不含水溶性聚合物基团的近红外荧光基团(即Alexa Fluor 750 (AF750 )染料和Cy7 染料)中的一种来标记的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，在735nm激发时，总荧光相对标记程度(DOL)的图示。所述数据显示，与AF750 染料和Cy7 染料相比，染料29的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率，并且当抗体处于较高标记程度时发生更少的荧光淬灭。
[0139] 图14为显示如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的图示，所述山羊抗小鼠IgG分别用本发明的近红外染料即染料29(表3)、Alexa Fluor 750 染料和Cy7 染料标记。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用三种经标记的第二抗体中一种来染色，所述三种经标记的第二抗体具有相似的标记程度。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也用同种型对照第一抗体和每种荧光第二抗体染色(深色柱)。结果显示，用本发明的抗体缀合物染色的细胞显著更亮，并且信噪比极好。
[0140] 图15比较了以下三种近红外染料的耐光性：表3的化合物29、Alexa Fluor 750(AF750 )染料和Cy7 染料。将染料浓度为5μM的三种染料溶液暴露于日光1/2小时。记录光解作用之前和之后各溶液的吸收光谱。结果显示，本发明的近红外染料比AF750染料和Cy7 染料都显著更稳定。
[0141] 图16A和B为用抗体进行细胞内染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的图示，所述抗体用Alexa Fluor 750 (AF750 )染料或染料29(表3)标记。图16A为显示如流式细胞术测量的，用指定量的山羊抗小鼠IgG(用化合物29标记(DOL＝3.5))或市售山羊抗小鼠IgG(用APC-AF750 串联染料(tandem dye)(Invitrogen)标记)染色的Jurkat细
胞的相对荧光水平的图示。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用两种经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也用同种型对照第一抗体和每种荧光第二抗体染色(深色柱)。图16B为显示图16A的染色的信噪比的图示。流式细胞术实验在配备633nm激光器和780/60nm PMT检测器的BD LSR II上进行。
结果显示，染料29得到了高的荧光信号，背景非常少，而APC-AF750 串联染料显示了显著的非特异性染色。结果显示，染料29在633nm具有非常小的吸收，而所述串联染料在所述激光波长由于供体染料APC具有几乎最大吸收。染料29、本申请披露的近红外染料等就使用633nm或更长波长的激发源进行流式细胞术分析而言是特别有利的。
[0142] 图17为就以下具有相似波长的三种近红外染料的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，总TM荧光相对标记程度(DOL)的图示：染料31(表3)、获自Thermo Fisher的Dylight 800染料和获自Li-Cor Biosciences的IRDye 800 CW染料。数据显示，染料31在宽范围的DOL下比其它两种染料显著更亮。
[0143] 图18为如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的图示，所述山羊抗小鼠IgG抗体分别用染料31(表3)、获自Thermo Fisher的TMDylight 800和获自Li-Cor Biosciences的IRDye 800 CW染料标记。为了评价三种近红外染料的荧光淬灭，将所述抗体以所指明的不同标记程度(DOL)用每种染料进行标记。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也用同种型对照第一抗体和每种荧光第二抗体染TM
色(同种型，深色柱)。结果显示，染料31在宽范围的DOL下比Dylight 800染料和IRDye
800 CW染料都显著更亮。还为重要的是，染料31比其它两种染料产生更好的信噪比。
[0144] 图19为就分别含有以下染料的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，总荧光强度相对标记程度(DOL)的绘图：本发明的近红外染料即染料32(表3)和三种光谱学相似的近红外荧光基团即获自GE Healthcare的Cy5.5 染料、获自Invitrogen的Alexa Fluor 680TM
(AF680)染料和获自Thermo Fisher的Dylight 680。荧光测量在pH 7.4PBS缓冲液中使TM
用660nm激发进行。所述数据显示，与Cy5.5 Alexa Fluor 680 和Dylight 680相
比，本发明的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率。
[0145] 图20A和B为关于用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的数据的图示，所述山羊抗小鼠IgG抗体各自用四种不同的近红外染料标记。图20A为显示如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的图示，所述山羊抗小鼠IgG抗体用染料32(表3)、获自GE Healthcare的Cy5.5 染料、获自Thermo TMFisher的Dylight 680染料或获自Invitrogen的Alexa Fluor 680 (AF680)染料标
记。为了评价三种近红外染料的荧光淬灭，山羊抗小鼠IgG抗体的各部分用一种染料以所指示的两种不同标记程度(DOL)中的一种来标记，以形成具有8个抗体的一组。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也用同种型对照第一抗体和每种荧光第二抗体染色(同种型，深色柱)。图20B为针对图20A中染色结果的信噪比(S/N)的绘图。数据显示，与从其它三种市售近红外染料制备的缀合物相比，用染料32标记的缀合物更亮并且在染色时更具有特异性。

具体实施方式

[0146] 尽管本申请已显示和描述了本发明的优选实施方案，然而对本领域技术人员显而易见的是，所述实施方案仅通过举例的方式来提供。本领域技术人员可想到多种变化形式、改变和替代(substitution)而不背离本发明。应该理解的是，本申请描述的本发明实施方案的多种可供选的方案可用于实践本发明。预期的是，随后的权利要求限定了本发明的范围，这些权利要求范围中的方法和结构以及它们的等价形式涵盖在所述权利要求的范围内。
[0147] 本发明披露了荧光化合物，其包括至少一种反应性基团和至少一种水溶性聚合物。所述化合物可具有期望的特性如分子内移动性(intramolecular mobility)受限、荧光量子产率增加、聚集减少、溶解性增加、淬灭减少和体内和体外稳定性增加。所述化合物可用于标记分子和生物分子如多肽和多核苷酸，并且适用于宽范围的应用，包括诊断和成像系统。
[0148] 本发明的荧光化合物和标记的分子可显示出聚集减少。染料聚集通常被认为是荧光淬灭的主要贡献因素(contributing factor)。在本发明中防止聚集不需要使用过量的带负电荷的磺酸根基团就可实现。这可辅助标记生物分子如蛋白质，因为经标记的蛋白质可具有与底物蛋白质可比的等电点，由此可更好的维持其生物学特异性。使用本发明的水溶性聚合物也可辅助掩蔽(camouflag)或屏蔽(shield)与其相连的荧光团。例如，这样的水溶性聚合物可为相对大的基团，如聚乙二醇部分。当荧光团与生物分子如多肽相连时，这可以是特别期望的。因此，与其它荧光标记的蛋白质相比，用本发明化合物标记的蛋白质更能抵抗蛋白酶催化的降解。因此，本发明的经标记的蛋白质如经标记的抗体当应用于动物体(如哺乳动物体)时在循环中可具有更长的半衰期，因此可适于体内成像。经标记的生物分子在体外系统中(例如在采用血清或其它生物提取物的测定中)也可显示出更长的半衰期。
[0149] 水溶性聚合物可限制或降低与其相连的荧光团的分子内移动性，如振动和转动。这可增加荧光基团的荧光量子产率。所述荧光增强效应对于具有相对柔性的核心结构的荧光基团而言可以是特别有效的。此外，本发明的经标记的分子与相应的底物生物分子相比在体内可具有较低的免疫原性和较低的抗原性。此外，本发明的化合物和经标记的分子可显示出更高的耐光性且对荧光基团的漂白(bleaching)更具有抵抗性。
[0150] 定义：
[0151] 本发明化合物可具有不对称中心、手性轴和手性平面(如E.L.Eliel andS.H.Wilen，Stereo-chemistry of Carbon Compounds，John Wiley & Sons，New York，
1994，1119-1190页中所述)，以及作为外消旋化合物、外消旋混合物和单独的非对映异构体存在，其所有可能的异构体和混合物包括光学异构体，都包括在本发明的范围内。此外，本申请披露的化合物可作为互变异构体形式存在，并且预期两种互变异构体形式都涵盖在本发明的范围内，即使仅描述了一种互变异构体结构。
[0152] 当任何变量(如R、L、(R1)a、(L)q)以任何构成成分出现不止一次时，它们在每次出现时的定义独立于其它每次出现时的定义。仅当取代基和变量的组合得到了稳定的化合物时，则这样的组合才是允许的。从取代基画入环系中的线表明所指明的键可与任何可取代的环碳原子连接。若所述环系是多环的，则预期所述键仅在最近的环(proximal ring)上与任何合适的碳原子连接。环被取代基取代，这通常允许所述取代基为与所述环稠合的环状结构。
[0153] 应该理解，本领域普通技术人员可对本发明化合物上的取代基和取代方式进行选择，从而提供这样的化合物，所述化合物是化学稳定的，且可通过本领域已知技术以及下面列出的方法从容易得到的起始原料来容易地合成。若取代基本身取代有不止一个基团，应该理解，这些多个基团可在同一碳或不同碳上取代，只要得到稳定的结构。短语“任选取代有一个或多个取代基”应该认为等价于短语“任选取代有至少一个取代基”，在这种情况优选的实施方案将具有0至3个取代基。
[0154] 本申请使用的“烷基”意在包括支链、直链和环状饱和的脂肪族烃基。烷基具体地包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等，以及环烷基如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、四氢萘基、亚甲基环己基等。“烷氧基”表示通过氧桥相连的烷基。
[0155] 术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的直链、支链或环状的非芳族烃基。烯基包括但不限于，乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。若指明取代的烯基时，烯基的直链、支链或环状部分可含有双键，以及可被取代。
[0156] 术语“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的直链、支链或环状的烃基。炔基包括但不限于，乙炔基、丙炔基和丁炔基。若指明取代的炔基时，炔基的直链、支链或环状部分可含有三键，以及可被取代。
[0157] 本申请使用的“芳基”意在表示每个环中具有至多7个原子的任何稳定的单环碳环或每个环中具有至多7个原子的任何稳定的多环碳环，其中至少一个环为芳族的。所述芳基部分的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基(indanyl)、联苯基(biphenyl)、菲基(phenanthryl)、蒽基(anthryl)或二氢苊基(acenaphthyl)。在芳基取代基为二环且一个环是非芳族的情形中，应该理解，通过芳族环进行连接。
[0158] 本申请使用的术语“杂芳基”表示每个环中具有至多7个原子的稳定的单环或每个环中具有至多7个原子的稳定的二环，其中至少一个环为芳族的且含有1至4个选自O、N和S的杂原子。本定义范围中的杂芳基包括但不限于，吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、四氢喹啉基、占吨基和香豆素基。在杂芳基取代基为二环且一个环是非芳族或不含杂原子的情形中，应该理解，分别通过芳族环或含有杂原子的环进行连接。
[0159] 本申请使用的术语“杂环”或“杂环基”意在表示含有至少一个杂原子的5元至10元芳族杂环或含有至少一个杂原子的5元至10元的非芳族杂环，所述杂原子为O、N或S。本定义包括二环基团。因此“杂环基”包括上文提及的杂芳基以及其二氢和四氢类似物。“杂环基”的进一步实例包括但不限于以下基团：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基(benzoxazolyl)、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲嗪基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、二氮杂萘基(naphthpyridinyl)、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉基、异噁唑啉基、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮丙啶基、1，4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂卓基(hexahydroazepinyl)、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡唑基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。
[0160] 除非另有具体定义，所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基取代基可以是未取代的或取代的。例如，烷基可被选自以下的一个或多个取代基取代：OH、氧代(oxo)、卤素、烷氧基、二烷基氨基或杂环基，如吗啉基或哌啶基。
[0161] 术语“卤代”或“卤素”意在包括氯、氟、溴和碘基团。
[0162] 术语“芳族的”以其通常意义使用，包括实质上在多个键之间(如在环中)离域的不饱和度。
[0163] 术语“取代基”是指在被取代的化学基团、基(radical)、分子、部分或化合物中代替氢的原子、基或化学基团。
[0164] 本申请使用的“螺环”是指这样的环状部分，这种环状部分与另一个基团连接，从而所述环状部分的一个环原子也是所述另一个基团的原子。非螺环取代基是环状或非环状部分，其经由非螺环部分的原子和所述另一个基团的原子之间的键连接而与所述另一个基团直接相连。螺环部分的一个实例是例如在环己酮环A上的取代基环B。
[0165]
[0166] 除非另有说明，术语“基(radical)”当应用至任何分子或化合物时，用来指所述分子或化合物的一个部分、片段或基团而不是指“自由基”。所述基可通过共价键与另一个部分相连。
[0167] 术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”、“探针”和“寡核苷酸”互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸)或它们的类似物的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可进行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的位点(locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体(vector)、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和甲基化核苷酸类似物。若存在对核苷酸结构的修饰，则这种修饰在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸的序列可由非核苷酸组分间断。多核苷酸还可在聚合之后进一步修饰，如通过与标记组分缀合来修饰。“多核苷酸”还可用来指核酸肽(peptide nucleic acid，PNA)、锁定核酸(locked nucleic acid，LNA)、苏型呋喃糖基核酸(threofuranosyl nucleic acid，TNA)和其它非天然核酸或核酸模拟物。本领域已知的其它碱基和骨架修饰也包括在本定义中。参见例如De Mesmaeker et al(1997)Pure & Appl.Chem.，69，3，pp 437-440。
[0168] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本申请中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性的、环状的或支化的，其可包括经修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸间断。所述术语还涵盖例如经由以下作用修饰的氨基酸聚合物：磺化、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白酶解加工(proteolytic processing)、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转移RNA介导的氨基酸与蛋白质的加成如精氨酰化(arginylation)、遍在蛋白化(ubiquitination)或任何其它处理，如与标记组分缀合。本申请使用的术语“氨基酸”是指天然氨基酸和/或非天然或合成性氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽物(peptidomimetic)。“
[0169] 本申请使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(“与之发生免疫反应”)的抗原结合位点的分子。结构上而言，最简单的天然存在的抗体(如IgG)含有四条多肽链，经由二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。免疫球蛋白表示一类大家族的分子，其包括几种类型的分子，如IgD、IgG、IgA、IgM和IgE。术语“免疫球蛋白分子”包括例如，杂交抗体或改变的抗体(altered antibody)和它们的片段。已显示，抗体的抗原结合功能可由天然存在的抗体的片段进行。这些片段统称为“抗原结合单元”。抗原结合单元可基于它们的分子结构概括地分为“单链″(“Sc”)和“非单链”(“Nsc”)类型。
[0170] 多种物种来源(包括无脊椎动物和脊椎动物)的免疫球蛋白分子也涵盖在术语“抗体”中。术语“人”当应用至抗体或抗原结合单元时，是指由人基因或其片段表达的免疫球蛋白分子。术语“人源化的(humanized)”当应用至非人类(如啮齿动物或灵长类动物)抗体时，是含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的杂交免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。大部分而言，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换，所述非人类物种如小鼠、大鼠、兔或具有期望特异性、亲和力和能力的灵长类动物。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基置换。此外，人源化抗体可包括未能在受体抗体或导入的CDR(imported CDR)或框架序列中发现的残基。进行这些修饰以进一步对抗体性能进行改进和优化以及使引入人体时的免疫原性最小化。一般而言，人源化抗体包括至少一种，通常两种可变域中的基本上所有种类，其中所有或基本上所有CDR域对应于非人免疫球蛋白的那些结构域，以及所有或基本上所有FR域为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。
[0171] 术语“稳定的”是指这样的组合物和化合物具有足够的化学稳定性，从而能经受从反应混合物中分离成有用的纯度，而用于期望的应用中。
[0172] 术语“荧光基团(fluorescent group)”、“荧光团(fluorophore)”、“染料”或“荧光基团”互换使用，是指为荧光性的分子、基团或基。术语“荧光性的”当应用至化合物的分子时，用来指化合物吸收能量(如UV、可见光或IR辐射)并将所述能量的至少一部分随时间再次发射为光的特性。荧光基团、荧光化合物或荧光团包括但不限于离散的化合物、分子、蛋白质和大分子复合物。荧光团还包括显示出长期荧光衰减(long-lived fluorescence decay)的化合物，如镧系元素离子和镧系元素与有机配体敏化剂(sensitizer)的络合物。
[0173] 本申请使用的“受试者(subject)”是指含有经表达的遗传物质的生物学实体。在多种实施方案中，所述生物学实体为脊椎动物。在一些实施方案中，所述生物学实体为哺乳动物。在其它实施方案中，所述受试者为包括人类在内的生物学实体。
[0174] “对照”是在实验中用于比较目的的可选受试者或样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，当实验的目的是检测受相关疾病影响的细胞或组织中差异表达的转录物或多肽时，通常优选的是使用阳性对照(受试者或来自受试者的样品，其显示出所述差异表达和所述疾病特征性症状)，和阴性对照(受试者或来自受试者的样品，其缺乏所述差异表达和所述疾病的临床症状)。
[0175] 术语“FRET”是指Foerster共振能量转移。在本发明中，FRET是指至少两种荧光化合物之间、荧光化合物和非荧光组分之间，或荧光组分和非荧光组分之间发生的能量转移过程。
[0176] “结合剂(binding agent)”是对其所结合的结合配偶体或靶标分子显示出结合选择性的分子。结合剂可以是生物分子如多肽如抗体或蛋白质、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、多核苷酸，包括DNA和RNA、脂质和碳水化合物或它们的组合。结合剂还可以是半抗原(hapten)、药物、离子络合剂(ion-complexing agent)如金属螯合剂、微粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒或其它荧光分子，包括本发明的染料分子。
[0177] “靶标部分”是结合剂中与结合配偶体结合的部分。靶标部分可以是而不限于，多核苷酸中与另一种多核苷酸或多肽选择性结合的核苷酸序列。靶标部分的另一非限制性实例可以是较大多肽序列中与多核苷酸序列或另一种多肽序列特异性结合的多肽序列。靶标部分可以是小分子或结构基序，所述小分子或结构基序与蛋白质受体、另一种小分子基序或络合剂(不限于这些列举)结合。所述选择性结合可以是特异性结合事件。
[0178] “结合配偶体”是由靶标部分结合的分子或粒子，其可以是细胞、病毒、细胞碎片、抗体、抗体片段、肽、蛋白质、多核苷酸、抗原、小分子或它们的组合。其可由结合剂选择性或特异性结合。
[0179] 在本申请的多肽-抗体复合物的上下文中所提及的术语荧光的“信噪比”是以下的比率：(来自复合物的荧光信号(所述复合物包括被第一抗体结合的多肽，所述第一抗体本身与用本发明化合物经标记的结合剂结合))/(来自多肽、同种型对照第一抗体和经标记的结合剂的混合物的荧光信号)。
[0180] 本申请使用的“标记程度”或“DOL”是指与每个靶标分子(包括但不限于多肽和多核苷酸)连接的染料分子的数目。例如，每个多肽如抗体连接单个染料分子表示1.0的标记程度(DOL)。若平均不止一个染料分子与多肽如抗体反应或交联，则所述标记程度大于1，并且还可为不是整数的数目。DOL的数目越高，标记程度越大。
[0181] 本申请使用的“细胞内”是指给定的分子存在于细胞内。细胞内分子可存在于细胞质中，与细胞膜相连，位于细胞器表面或在细胞的细胞器中。
[0182] “底物”或“固体底物”当在反应表面的上下文中使用时，是指测定某种相互作用的物质。例如，在该上下文中底物可以是阵列(array)的表面或微孔的表面。其还可为固体，如不形成特定形状但在其表面具有连接点的聚合物。
[0183] 术语“最大激发波长”和“最大荧光激发波长”在本申请中互换使用。这些术语是指荧光化合物吸收激发染料的光能从而发射最大荧光的最大波长。术语“最大吸收波长”当应用至染料时，是指所述染料最有效吸收激发能而发出荧光的光能的波长。染料具有“最大荧光发射波长”，即染料发出最强荧光的波长。当针对任何染料提及单一波长时，根据所述术语的上下文，其是指最大激发、吸收或发射波长，例如，吸收波长是指化合物具有最大吸收时的波长，而发射波长是指所述染料发出最强荧光的波长。
[0184] 本发明化合物：
[0185] 本发明提供了式I化合物：
[0186]
[0187] 在此，F表示荧光团或荧光基团。一般而言，适于本发明化合物的荧光团(式I中的“F”)衍生自具有下述取代位点的荧光化合物，所述取代位点允许与-(L)m-或T基团连接。多种荧光基团的核心结构(包括所述荧光基团的亚分类的核心结构)适于用作荧光团。荧光团通常可包括这样的结构，所述结构包括形成属于一类荧光基团的荧光基团所必要的最少数目的原子。作为实例，香豆素荧光基团包括下文列出的式A的核心结构：
[0188]
[0189] 作为另一个实例，荧光素荧光基团包括下文列出的式B的核心结构：
[0190]
[0191] 作为另一个实例，若丹明荧光基团具有下文列出的式C的核心结构：
[0192]
[0193] 作为另一个实例，吲哚碳菁(indocarbocyanine)荧光基团可具有下文列出的式D的核心结构：
[0194]
[0195] 其它种类的荧光性荧光基团的核心结构可容易地由本领域普通技术人员使用上述原则确定。本领域技术人员应该理解的是，荧光基团核心结构的确定可以是一定程度随意的，因为荧光基团的分类本身可以是随意的。一类荧光基团，例如，可进一步分类为不同的亚类，其中荧光基团的各亚类包括对荧光基团的具体亚类而言独特的一种或多种取代基。由此，就每种亚类的荧光基团而言可存在核心结构。例如，如下文式E所示的7-氨基香豆素，是所有7-氨基香豆素衍生物的核心结构，而其本身为属于更普遍的香豆素荧光基团(具有式A的核心结)的荧光基团的亚类。
[0196]
[0197] 下表显示了多种常见种类的荧光团和核心结构的典型激发和发射波长：
[0198]荧光基团 典型激发波长 典型发射波长
香豆素 300-500nm 350-550nm
荧光素 470-520nm 500-540nm
若丹明 480-640nm 510-660nm
花青 350-1200nm 360-1250nm
芘 350-490nm 400-510nm
[0199] 在一些实施方案中，F可衍生自花青荧光基团、Cy荧光基团、占吨荧光基团、Alexa Fluor荧光基团、香豆素荧光基团、芘荧光基团、Bodipy荧光基团、ATTO荧光基团或DY荧光基团。本领域公知的是，花青荧光基团可包括花青荧光基团的各种亚分类，包括但不限于吲哚碳菁荧光基团、氧杂碳菁(oxacarbocyanine)荧光基团、硫杂碳菁(thiacarbocyanine)荧光基团、氮杂碳菁(azacarbocyanine)荧光基团(氮杂花青荧光基团)、苯乙烯基花青荧光基团和部花青(merocyanine)荧光基团，以上基团仅用于举例。类似地，占吨荧光基团可包括但不限于荧光素及其衍生物和例如各种若丹明荧光基团。
[0200] 在本发明中用作荧光团的荧光化合物的其它非限制性实例包括吖啶橙(Acridine orange)、吖啶黄(Acridine yellow)、Alexa Fluor荧光基团、ATTO荧光基团、Bodipy荧光基团、金胺O(Auramine O)、苯并蒽酮(Benzanthrone)、9，10-双(苯基乙炔基)蒽、5，12-双(苯基乙炔基)并四苯、羧基荧光素二乙酸盐、钙黄绿素、羧基荧光素，1-氯-9，10-双(苯基乙炔基)蒽、2-氯-9，10-双(苯基乙炔基)蒽、香豆素、花青、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、DyLight Fluor荧光基团、荧光素、2’，7’-二氯二氢荧光素、Hilyte Fluor荧光基团、LDS 751、Oregon Green、芘、藻胆素(Phycobilin)、藻红蛋白(Phycoerythrin)、藻红素(Phycoerythrobilin)、芘、若丹明和三(4，7-二苯基-1，10-菲咯啉二磺酸)钌(II)(Ruthenium(II)tris(bathophenanthroline disulfonate))。这些化合物和这些化合物的衍生物或基可用作本发明的荧光团。
[0201] 在本发明中可使用的荧光基团的其它实例包括但不限于，4-乙酰胺基-4′-异硫氰酸根合均二苯乙烯-2，2′-二磺酸、吖啶和衍生物如吖啶和异硫氰酸吖啶(acridine isothiocyanate)、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3，5-二磺酸盐(荧光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰TM
亚胺、邻氨基苯甲酰胺(anthranilamide)、BODIPY 及其衍生物和类似物、亮黄(Brilliant Yellow)、花青荧光基团如Cy3和Cy5和其它衍生物、香豆素和衍生物如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素苷(Coumaran 151)、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、荧光素和衍生物如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)和QFITC(XRITC)；荧光胺；4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)、噁嗪荧光基团如尼罗蓝(Nile Blue)和其它类似物；芘和衍生物如芘、丁酸芘和琥珀酰亚胺基1-丁酸芘；rosamine荧光基团、四甲基rosamine和其它类似物、若丹明和衍生物如
6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)，若丹明B、若丹明123、异硫氰酸若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明；异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)和噻嗪荧光基团如亚甲蓝和类似物。适用于本发明的其它荧光团披露于美国专利申请2003/0165942、2003/0045717和2004/0260093以及美国专利5,866,366和WO 01/16375中，将这些专利引入本文作为参考。其它实例描述于美国专利6,399,335、公开的美国专利申请2003/0124576和The Handbook-‘A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，Tenth Edition’(2005)(得 自Invitrogen，Inc./Molecular Probes)中，将所有这些文献引入本文作为参考。
[0202] 本发明的荧光基团还可包括荧光蛋白质。本领域已知的荧光蛋白质包括GFP和其各种衍生物，描述于如美国专利5,625,048；5,777,079；6,066,475；6,319,669；6,046,925；6,124,128和6,077,707中。其它荧光蛋白质为Y66F、Y66H、EBFP、GFPuv、ECFP、AmCyan1、Y66W、S65A、S65C、S65L、S65T、EGFP、ZsGreen1、EYFP、ZsYellow1、DsRed、DsRed2、AsRed2、mRFP1和HcRed1。
[0203] 许多荧光基团是市售的，并且可用于合成本发明化合物。反应性荧光基团的商业来源包括Invitrogen(Molecular Probes)、AnaSpec、Amersham(AP Biotech)、Atto-Tec、Dyomics、Clontech和Sigma-Aldrich。
[0204] 荧光团可通过连接部分-(L)m-与结合部分T相连。一般而言，连接部分(通常由“L”表示)可为将两个部分(如荧光团、水溶性聚合物和反应性基团)彼此连接
或与本发明化合物中包括的其它任何基团连接的任何基团。合成可获得性(Synthetic accessibility)和便利性通常可决定每个连接部分的性质。在一些实施方案中，连接部分为含有约1-100个原子且由一个或多个化学键形成的基团，以使所述基团为稳定的部分。
在其它实施方案中，连接部分由一种或多种以下化学键形成：碳-氢键、碳-氮键、碳-氧键、碳-硫键、碳-磷键、氮-氢键、硫-氢键、磷-氢键、硫-氧键、硫-氮键、硫-磷键、磷-氧键、磷-氮键和氧-氮键，其中所述键可以是经选择的单键、双键、三键、芳族键和杂芳族键，从而所述连接部分是稳定的。连接部分可以是例如，二价烷基。可供选择的，连接部分可以是包括额外以下基团的烷基：醚基团、氨基、酰胺基、酯基、磺酰基、硫醚基团、甲酰氨基、氨磺酰基、酰肼基团或吗啉代、芳基和杂芳基。
[0205] 连接部分通常由约1-100个原子形成。在一些实施方案中，连接部分由1-50个非氢原子形成，其它的原子为氢原子。所述非氢原子可以是例如，C、N、O、P或S。在其它实施方案中，连接两个基团的连接部分包括基团间的1至50个相邻键(consecutive bond)。一些连接部分可具有1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、5至25或5至20个这样的相邻键。
[0206] 非限制性示例性连接部分示于下文：
[0207]
[0208] 在上述图像中，n表示重复亚甲基单元的数目，其是可变的，从而提供期望长度的连接体(linker)。典型地，n为1至约50。一些连接体中n为1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、5至30、5至20或5至15。
[0209] 类似地，结合部分(通常由“T”表示)可为将三个或多个不同的部分(如荧光团、水溶性聚合物和反应性基团)彼此连接或与本发明化合物中包括的其它任何基团如连接部分连接的任何基团。在一些实施方案中，结合部分为含有约1-100个原子且由一个或多个化学键形成的基团。可对所述键进行选择以使所述基团为稳定的部分。在其它实施方案中，连接部分由一种或多种以下化学键形成：碳-氢键、碳-氮键、碳-氧键、碳-硫键、碳-磷键、氮-氢键、硫-氢键、氧-氢键、磷-氢键、硫-氧键、硫-氮键、硫-磷键、磷-氧键、磷-氮和氧-氮键，其中所述键可以是经选择的单键、双键、三键、芳族键和杂芳族键，以使所述基团是稳定的部分。在一些实施方案中，T含有1至50个原子，或可供选择地1至40、1至30、1至20或1至10个原子。T可以是单个原子如N或C。T还可以是小环状基团如碳环基团、杂环基团或芳族基团。非限制性实例包括经取代的以下基团：苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基、二氢苊基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、吲嗪基、吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、二氮杂萘基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉基、异噁唑啉基、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮杂环丁烷基、氮丙啶基、1，4-二氧杂环己烷基、六氢氮杂卓基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡唑基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲二氧基苯甲酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基。结合部分可以是例如三价、四价、五价或六价的。结合部分的实例描述于下文：
[0210]
[0211] 式I下标m和n指示存在的连接体部分的数目，且独立为0至20的整数。当m为0时，所述连接体部分理解为不存在，且显示为与所述连接体部分连接的任何两个部分理解为经由键连接。当n为0时，由“n”限定的任何取代基理解为不存在。
[0212] 表示为式I的R1、R2和R3的基团是式(R)p-(L)q-的基团。当化合物中存在多个(R)p-(L)q-基团时，每个R、L、p或q独立于同一化合物中存在的任何其它R、L、p或q基团。每个p通常为1至20的整数。在一些实施方案中，p为1。在其它实施方案中，p可为1至
2、3、4、5、10或15。每个q通常为0至20的整数。在p为0的实施方案中，L理解为不存在，且显示与L连接的任何R基团理解为经由键直接相连。可供选择的，p可以是1。在其它情况中，q可为1至2、3、4、5、10或15。
[0213] “R”可以是赋予本发明化合物期望的功能特性的任何基团。R基团的更具体实施方案在下文讨论。
[0214] 本发明化合物包括至少一个为反应性基团的R。反应性基团为能够在底物或底物分子上与反应配偶体反应从而形成共价键的化学部分。本发明化合物可用于标记多种宽泛的分子或底物，所述分子或底物含有合适的反应配偶体或衍生为含有合适的反应配偶体。“反应性基团”和“反应配偶体”可指本发明化合物上的基团，或指要标记的分子上的基团。
在此，通过便利的方式而非限制，化合物上的成键基团通常指反应性基团，底物分子上的成键基团通常指反应配偶体。“反应底物”、“底物”和“反应配偶体”在本申请文件通篇互换使用。
[0215] 反应性基团及其反应配偶体可以分别是亲电体和亲核体，其能够与或不与偶联剂或催化剂形成共价键。根据一实施方案，所述反应性基团为当进行紫外光活化或光解时就与烃分子反应的光活化基团。根据另一实施方案，所述反应性基团为能够与共轭二烯经由第尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)进行反应的亲双烯体。根据另一实施方案，所述反应性基团为能够与亲双烯体反应的1，3-二烯。根据另一实施方案，所述反应性基团为能够与叠氮官能团反应形成1，2，3-三唑连接键(linkage)的炔。根据另一实施方案，所述反应性基团为能够与叠氮官能团经由所谓的Staudinger反应形成酰胺连接键的2-(二苯基膦基)苯甲酸甲酯。仅通过举例，根据本发明的有用的反应性基团、官能团和相应的连接键的实例列于表1中。
[0216] 表1：反应性基团、官能团和共价连接键的实例
[0217]反应性基团 反应配偶体/底物 生成的共价连接键
活化的酯* 胺/苯胺 羧酰胺
丙烯酰胺 硫醇 硫醚
酰叠氮** 胺/苯胺 羧酰胺
酰卤 胺/苯胺 羧酰胺
酰卤 醇/苯酚 酯
酰基腈 醇/苯酚 酯
酰基腈 胺/苯胺 羧酰胺
醛 胺/苯胺 亚胺
醛或酮 肼 腙
醛或酮 羟胺 肟
烷基卤 胺/苯胺 烷基胺
烷基卤 硫醇 硫醚
烷基卤 醇/苯酚 酯
烷基磺酸酯 硫醇 硫醚
烷基磺酸酯 羧酸 酯
烷基磺酸酯 醇/苯酚 酯
酸酐 醇/苯酚 酯
酸酐 胺/苯胺 羧酰胺
芳基卤 硫醇 苯硫酚
芳基卤 胺 芳基胺
氮丙啶 硫醇 硫醚
硼酸酯 二醇 硼酸酯
环氧化物 硫醇 硫醚
卤代乙酰胺 硫醇 硫醚
卤代三嗪 胺/苯胺 氨基三嗪
卤代三嗪 醇/苯酚 三嗪基醚
亚胺基酯 胺/苯胺 脒
异氰酸酯 胺/苯胺 脲
[0218] 表1：反应性基团、官能团和共价连接键的实例
[0219]反应性基团 反应配偶体/底物 生成的共价连接键
异氰酸酯 醇/苯酚 氨基甲酸酯
异硫氰酸酯 胺/苯胺 硫脲
马来酰亚胺 硫醇 硫醚
亚磷酰胺 醇 亚磷酸酯
甲硅烷基卤 醇 甲硅烷基醚
磺酸酯 胺/苯胺 烷基胺
磺酸酯 硫醇 硫醚
磺酸酯 醇 醚
磺酰卤 胺/苯胺 磺酰胺
磺酰卤 苯酚/醇 磺酸酯
叠氮 炔 1，2，3-三唑
顺铂 鸟苷 顺铂-鸟苷复合物
[0220] *本领域所理解的活化的酯通常具有式-COΩ，其中Ω为良好的离去基，如琥珀酰亚胺基氧基(-OC4H4O2)、磺基琥珀酰亚胺基氧基(-OC4H3O2-SO3H)或苯并三唑基-1-氧基-(-OC6H4N3)；或芳基氧基或经吸电子取代基(如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合)取代一次或多次的芳基氧基，用于形成活化的芳基酯；或由碳二亚胺活化的羧酸，从而形成a a b a b酸酐或混合酸酐-OCOR 或-OCNRNHR，其中R 和R，可以是相同的或不同的独立为C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或C1-C6烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。
[0221] **酰叠氮也可重排为异氰酸酯。
[0222] 反应性基团可以是与胺、硫醇、羟基或醛反应的基团。反应性基团可以是胺-反应性基团，如琥珀酰亚胺基酯(SE)，或硫醇-反应性基团，如马来酰亚胺、卤代乙酰胺或甲基硫代磺酸酯(methanethiosulfonate，MTS)，或醛-反应性基团，如胺、氨基氧基(aminooxy)或酰肼。
[0223] 本发明化合物还包括为水溶性聚合物基团的至少一个R。根据本发明，水溶性聚合物基团可显著降低荧光基团核心结构的分子内移动性，以及由此可改善荧光基团的荧光量子产率。所述基团也可赋予它们所连接的化合物其它特性，如荧光基团的耐光性改善，针对生物分子标记时荧光基团聚集减少，荧光标记的生物分子(如抗体)的染色特异性增加；和体内标记的生物分子(如抗体)的免疫原性和抗原性降低。
[0224] 各水溶性聚合物基团通常为足够大以改善化合物的荧光特性的基本上无反应性的、水溶性部分。在该上下文中使用的术语“聚合物”不要求存在严格重复单元。就本发明的目的而言，具有足够分子大小和溶解性但不具有重复单元的分子就视为“水溶性聚合物基团”。
[0225] 水溶性聚合物基团包括但不限于有机聚合物和生物分子如多肽和碳水化合物。水溶性聚合物可包括醚基、羟基、叔胺基团、季胺基团和/或胍基。各水溶性聚合物可以是线性的、支化的、环状的或它们的组合。本发明的水溶性聚合物可包括单链或可供选择地一条、两条、三条、四条或更多链。可以使用具有一条、两条、三条、四条或更多支链的水溶性聚合物。本发明化合物可包括任何数目的水溶性聚合物基团。一般而言，本发明化合物包括至少一个水溶性聚合物基团至多约8个水溶性聚合物基团。在一实施方案中，化合物包括至少2个水溶性聚合物基团至约8个水溶性聚合物基团。在另一实施方案中，化合物包括至少3个水溶性聚合物基团至多约8个水溶性基团。在一个化合物中各水溶性聚合物基团的合适分子量，或可供选择地，所有水溶性聚合物基团的合适分子量可为约100、200、300、400、
500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000、
20000Da或更大。在一实施方案中，本发明的水溶性聚合物基团分子量在450和5000Da之间。在另一实施方案中，本发明的水溶性聚合物基团分子量在约800和约3000Da之间。在另一实施方案中，化合物中所有水溶性聚合物基团的合计分子量为约450至约5,000Da。在另一实施方案中，化合物中所有水溶性聚合物基团的合计分子量为约1,000至约3,000Da。
[0226] 在一实施方案中，本发明的水溶性聚合物为聚环氧烷。合适的聚环氧烷包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚乙二醇-聚丙二醇(PEG-PPG)共聚物和含N上经取代的甲基丙烯酰胺的聚合物和共聚物。适于本发明的各种聚环氧烷以及制备和使用所述聚环氧烷的方法描述在下列文献中：US5,637,749；5,650,388；5,298,643；5,605,976；5,567,422；5,681,567；5,321,095；5,349,001；5,405,877；5,234,903；5,478,805；5,324,844；
5,612,460；5,756,593；5,686,110；5,880,131；6,824,782；5,808,096；6,013,283；
6,251,382。商业来源的聚环氧烷试剂包括Sigma-Aldrich、Nanocs、Creative Biochem、Pierce、Enzon、Nektar和Nippon Oils and Fats。聚环氧烷基团如下所示：
[0227]
[0228] 必要时聚环氧烷可经额外取代以赋予聚合物其它期望特性。所述修饰可包括例如，增加或降低聚合物的化学稳定性的化学连接键，这可允许调整聚合物的半衰期的化学或生物学稳定性。在一些情形中，聚环氧烷分子被各种基团端接或“封端(cap)”。所述基团的实例为羟基、烷基醚(如甲基醚、乙基醚、丙基醚)、羧基甲基醚、羧基乙基醚、苄基醚、二苄基亚甲基醚或二甲基胺。聚环氧烷可具有多个可能的端基中的一个，所述端基包括但不限于羟基、甲基醚、乙基醚、羧基甲基醚和羧基乙基醚。在一实施方案中，聚环氧烷为用甲基醚端接的聚乙二醇聚合物。这样的基团被称为mPEG。mPEG通常具有式-(CH2CH2O)nCH3，其中n为乙二醇单元的数目，并且由所述mPEG的大小决定。
[0229] 其它合适的聚合物包括以下物质的衍生物和缀合物：聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚(苯乙烯磺酸)、聚(乙烯醇)或聚(碘化2-乙烯基-N-甲基吡啶鎓)。
[0230] 在另一实施方案中，本发明的水溶性聚合物为碳水化合物。所述碳水化合物包括单糖或多糖，且可以是例如，可溶淀粉、糖原、葡聚糖、果胶、甘露聚糖、半乳聚糖、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和其它衍生化的纤维素。当水溶性聚合物是碳水化合物时，碳水化合物中存在的至少30％的羟基可被掩蔽为甲基醚、磺酸根合烷基醚(sulfonatoalkyl ether)和/或乙酸酯。
[0231] 在另一实施方案中，本发明的水溶性聚合物为多肽。合适的多肽可包括例如，丝氨酸、精氨酸、含有修饰的ε-氨基的多聚赖氨酸或半胱氨酸。所述多肽的其它实例披露于例如WO 2006/081249中。预期的是所述多肽可用作本发明的水溶性聚合物。
[0232] 本发明的水溶性聚合物还包括上述不同类型物质的组合。例如，这样的水溶性聚合物可以是与聚环氧烷部连接的多肽。
[0233] 水溶性聚合物通常不包括与本发明化合物中包括的一个或多个反应性基团的化学不相容的任何一种或多种基团。例如，若反应性基团为亲电体，则水溶性聚合物不应包括强亲核体。在更具体的实例中，若反应性基团为N-羟基琥珀酰亚胺基酯，则水溶性聚合物不应包括伯胺或仲胺基团。作为另一个具体实例，当反应性基团为马来酰亚胺时，水溶性聚合物不应包括巯基。同样地，若反应性基团为亲核体，则水溶性聚合物通常不应包括强亲电体。然而，水溶性聚合物可包括最小数目的弱亲核体或最小数目的弱亲电体，从而在储存或处理期间反应性基团的化学不受到显著影响，或本发明化合物的稳定性不受影响。弱亲核体的实例为羟基，其通常存在于碳水化合物分子中。由此，在一些实施方案中，当水溶性聚合物为碳水化合物分子时，至少30％的羟基优选被掩蔽为醚如甲基醚，和/或掩蔽为酯，如乙酸酯。在其它实施方案中，所有羟基都被掩蔽为醚和/或酯。
[0234] 一般而言，在一些情形中本发明化合物的额外取代基(“R”)可为基团如磺- 2- +酸根(-SO3)、膦酸根(-PO3 )和铵基。在此，术语“铵”表示NH4、三烷基铵或四烷基铵。本领域技术人员可以理解离子基团需要抗衡离子来平衡其电荷。例如，每个带负电- 2-
的-SO3 或-PO3 可需要一或两个阳离子来平衡负电荷。同样地，带正电的铵可需要阴离子来维持其中性。一般而言，只要抗衡离子不降低所述荧光基团的溶解性，抗衡离子的性质就- 2- + + +
不是关键的。在一些实施方案中，当取代基为-SO3 或-PO3 时，抗衡离子是H、Na、K 或铵。在其它实施方案中，当所述取代基为铵时，抗衡离子优选为氯离子、氟离子、溴离子、硫酸根、膦酸根、乙酸根等。一些荧光基团可固有地具有正电荷或负电荷。在这样的情形中，固有电荷可充当抗衡离子。可供选择的，固有电荷可需要抗衡离子来维持中性。就任何固有电荷而言，选择抗衡离子的规则如先前所述。在本发明的一些实施方案中，存在至少一个- + + +
磺酸根(-SO3)，任何必要的抗衡离子选自H、Na、K 和铵。为了简便起见，就本申请所述的大多数荧光基团结构而言可能未示出任何可离解的一个或多个抗衡离子。
[0235] 所述取代基可增加化合物的水溶性和/或其荧光量子产率。然而，相对高数目的带电基团通常不是期望的，因为其可导致高度带电的荧光团，这样的荧光团与蛋白质缀合时，例如可显著改变蛋白质的等电点，由此可能影响经标记的蛋白质的生物学特性。例如，用高度带电的荧光分子标记的抗体在染色时可显示高的背景。在一些实施方案中，所述带电水溶性R基团的数目为0-4或0-3。因为本发明的荧光基团具有至少一种水溶性聚合物基团，所述水溶性聚合物基团也能够增加荧光基团的水溶性和/或量子产率，带电R基团如磺酸根的数目可保持为最小，由此使经标记的蛋白质的生物学特异性的损失最小化。
[0236] 每个取代基R可以是相同的或不同的，且可选自卤素、-OH、-NH2、-SO2NH2和包含1至约15个碳原子和任选至少一个杂原子的任何含碳取代基。当存在杂原子时，所述至少一个杂原子优选选自卤素、N、O、S、P和Si。在一些情形中，R可以是二烷基胺取代基例如，二乙胺或二甲基胺。当R为含碳取代基，其可采取任何结构或构象，包括例如烷基、环烷基、烯基或炔基。
[0237] 本发明化合物可采取多种构型。具体构型的示例性构型示于下表2：
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245] 在上表中，“WSP”表示水溶性聚合物基团，而“RG”表示反应性基团。
[0246] 在一实施方案中，式I化合物包括荧光团，所述荧光团为占吨荧光基团、香豆素荧光基团、芘荧光基团或花青荧光基团。在一些实施方案中，所述荧光团为香豆素荧光基团。这样的荧光团可具有式
[0247]
[0248] 如在式I中那样，其中Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf部分中的一个为将荧光团与-(L)m-部分或 部分连接的键。其余部分Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf具有式(R)p-(L)q-，其中R、L、p和q如先前所定义.例如，Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf的任何相邻的对可连在一起形成5元或6元的饱和的或不饱和的环，所述环任选包括在环中的额外杂原子以及额外R取代基。在一些-实施方案中，所述R取代基为SO3、磺酰胺基、卤素、羟基、氨基或烷基。
[0249] 在另一实施方案中，所述荧光团为下式的化合物：
[0250]
[0251] 其中 将所述荧光团与所述-(L)m-部分或所述 部分连接；
[0252] R4、R5和R6各自独立为(R)p-(L)q-；R4、R5、R6中的每个R独立为i)当与反应配偶体反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、三氟烷基、卤素基团、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H；R4、R5、R6中的每个L独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分；R4、R5、R6中的每个p独立为1至20的整数；R4、R5、R6中的每个q独立为0至20的整数；以及a、b和c独立为0、1、2或3。
[0253] 在一实施方案中，T为包括一个碳原子的三价部分如
[0254] 可供选择的，T可以是三价氮原子。例如，式I中 可具有式
[0255] 当R1为水溶性聚合物基团时，所述水溶性聚合物基团可具有大于约300Da的分子量。可供选择的，所述分子量可大于约800Da，或其可为约800Da至约3000Da。R1可例如包括水溶性基团如聚乙二醇基团。在一些实施方案中，聚乙二醇基团的分子量在450和5000Da之间。
[0256] 当R2为反应性基团时，所述反应性基团可形成共价键，例如，与氨基、巯基或羟基亲核体形成共价键。在一些实施方案中，反应性基团为异硫氰酸酯基团、异氰酸酯基团、一氯三嗪基团、二氯三嗪基团、卤素取代的吡啶基团、卤素取代的二嗪基团、亚磷酰胺基团、马来酰亚胺基团、氮丙啶基团、磺酰卤基团、酰卤基团、羟基琥珀酰亚胺基酯基团、羟基磺基琥珀酰亚胺基酯基团、亚胺酯基团、肼基团、叠氮基硝基苯基、叠氮基团、炔基团、3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酰胺基团、乙二醛基团或醛基团。在一些实施方案中，反应性基团为N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。
[0257] 在本发明的另一方面，提供了具有最大荧光激发波长的化合物，其中所述化合物具有式II的结构：
[0258]
[0259] 其中F为具有以下结构的部分：
[0260]
[0261] Z为抗衡离子。
[0262] Y为允许在F和Ψ之间发生电子离域作用的桥单元。就对花青荧光基团而言，合适的部分为本领域熟知的。一般而言，Y基团允许在所述两个结构之间发生电子离域作用。例如，Y可以是次甲基单元(methine unit)或可供选择地为多次甲基单元(三、五或七次甲基)，且任选具有一个或多个4、5或6元环。对本发明R基团的额外取代也包括在本发明的范围内。例如，Y可包括这样的R基团，其中所述R基团为如上定义的水溶性聚合、反应性基团或额外取代基。例如，烷基、SO3-和卤素是作为Y基团的一部分存在的所有可能的取代基。
[0263] 在一些实施方案中，Ψ为具有以下结构之一的部分：
[0264]
[0265] X1和X4独立为 X1和X4可任选经额外取代或不经额外取代。
[0266] X2和X3独立为
[0267] a和b独立为0、1、2或3。
[0268] b′为0、1或2。
[0269] 在一些实施方案中，当Ψ为式1，且所述化合物的最大荧光激发波长小于660nm时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，其中R5和R6不能组合起来形成取代的环；在本发明的其它实施方案中，当Ψ为式1且所述化合物的最大荧光激发波长等于或大于660nm时，或当Ψ不是式1时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，或R5和R6可结合形成环状部分，所述环状部分是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。如此形成的环状部分为5、6或7元环，所述环为碳环或杂环，以及在一些实施方案中，所述环被一个或多个反应性基团和/或一个或多个水溶性聚合物基团取代。
[0270] 在其它实施方案中，当Ψ为式1，且所述化合物的最大荧光激发波长小于655nm时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，其中R5和R6不能组合起来形成取代的环；在本发明的其它实施方案中，当Ψ为式1，且所述化合物的最大荧光激发波长等于或大于665nm时，或当Ψ不是式1时，则R5和R6独立为(R)p-(L)q-，或R5和R6可结合形成环状部分，所述环状部分是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
[0271] 在多种实施方案中，Y为：
[0272]
[0273] 其中当存在C时，其为5元或6元环状基团。
[0274] R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立为(R)p-(L)q-。
[0275] 所述化合物的每个(R)P-(L)q中的每个R独立为i)当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；ii)水溶性聚合物基团；iii)烷基、芳基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、三氟烷基、卤素基团、磺酰基、磺酸根基团或磺酰胺基；或iv)-H。
[0276] 所述化合物的每个(R)p-(L)q-中的每个R独立为由一个或多个化学键形成且含有约1-100个原子的连接部分。
[0277] 每个(R)p-(L)q-中的每个p独立为约1至约20的整数。
[0278] R1或R2的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为0至约20的整数。
[0279] R3、R4、R5、R6或R7的每个(R)p-(L)q-中的每个q独立为1至约20的整数。
[0280] c为0或1。
[0281] d为0或1。
[0282] 所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为反应性部分；以及
[0283] 所述化合物的(R)p-(L)q-中的至少一个R为水溶性聚合物。
[0284] 在一些实施方案中，当存在至少两个相邻的R1和/或两个相邻的R2时，所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2可结合形成6元环，所述6元环是未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。在一些其它实施方案中，当所述两个相邻的R1和/或所述两个相邻的R2可结合形成6元环时，如此形成的环为芳族的。在一些实施方案中，两个相邻的(R2)b与环B中它们所连接的原子结合形成碳环，所述碳环任选额外取代有可进一步增加荧光基团的溶解性的基团。在一些实施方案中，两个相邻的(R2)b与环B中它们所连接的原子结合形成碳环，所述碳环为芳族的且任选额外取代有可进一步增加荧光基团的溶解性的基团。在一些实施方案中，两个相邻的(R1)b与环A中它们所连接的原子结合形成碳环，且所述碳环任选额外取代有可进一步增加荧光基团的溶解性的基团。在一些实施方案中，两个相邻的(R1)b与环A中它们所连接的原子结合形成碳环，所述碳环为芳族的且任选额外取代有可进一步增加荧光基团的溶解性的基团。
[0285] c可以是0或1。当c为1时，与R3相连的氮原子为带正电的。类似地，d可以是0或1。
[0286] 在多种实施方案中，R1和R2中至少一个R为带电的部分。在一些实施方案中，R1和R2中至少一个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。在其它实施方案中，R1和R2中的每个R包括磺酸根基团或膦酸根基团。
[0287] 在本发明的多种实施方案中，X2和X3独立为 在相关实施方案中，X2和X3为烷基如甲基或乙基。在一些实施方案中，X2和X3为 在一些实施方案中，X2和
X为 其中R5包括反应性基团或水溶性聚合物基团。
[0288] 式II化合物含有至少一种反应性基团和水溶性聚合物基团。这些基团可在式II中所示的任何位置相连。例如，反应性基团或水溶性聚合物基团可以与环A或环B相连。可供选择的，所述反应性基团或所述水溶性聚合物基团可取代在式II中所示的氮原子，如R3可为反应性基团以及R4可为水溶性聚合物，上述基团任选通过L连接体部分相连。此外，反应性基团和/或水溶性聚合物也可与式II中的X2和/或X3位置相连，或可以是连接体结构Y的一部分。
[0289] 在一些情形中，期望的是在环A上或环B、D、E、F和G中的一个环上包括至少一个R取代基或环A和环B、D、E、F和G的一个环两者上包括至少一个R取代基，所述R取代基为带电部分，从而增加式II化合物的溶解性。这样的部分可以是磺酸根基团或先前所述的任何其它基团。可进行类似的取代作为基团R3、R4、X2和X3的一部分，例如通过连接取代有磺酸根、膦酸根或其它带电基团的连接体部分来进行取代。
[0290] 在本发明的各种实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧烷。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为聚环氧乙烷。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物为碳水化合物。在一些其它实施方案中，所述水溶性聚合物为多肽。在多种实施方案中，所述水溶性聚合物分子量为约800至约3000。在一些实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于300。在其它实施方案中，所述水溶性聚合物分子量大于800。
[0291] 在一些实施方案中式II化合物包括至少一种反应性基团和至少两种水溶性聚合物基团。
[0292] 在式II化合物的一些实施方案中所述化合物具有式：
[0293]
[0294] 在多种实施方案中，式II化合物具有式：
[0295]
[0296] 其中c为1；d为1；R3和R4中的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团以及R3和R4中的至少一个R为水溶性聚合物基团。
[0297] 在其它实施方案中，所述化合物具有式：
[0298]
[0299] 其中c为1；d为1；R3、R4和R5中至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5中至少一个R为水溶性聚合物的基团。在另一实施方案中，c为1，d为1；R3、R4和R5中至少一个R为反应性基团，以及R3、R4和R5中至少两个R为水溶性聚合物的基团。在一实施方案中，对Y进行选择以使最大吸收波长为约550nm、约650nm，或约750nm。
[0300] 在其它实施方案中，所述化合物具有式：
[0301]
[0302] 其中c为1；d为1；
[0303] R3和R4中的一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3和R4中的一个R为水溶性聚合物基团。
[0304] 在一些其它实施方案中，所述化合物具有式：
[0305]
[0306] 其中c为1；d为1；
[0307] R3、R4和R5的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5的至少一个R为水溶性聚合物的基团。
[0308] 在其它实施方案中，所述化合物具有式：
[0309]
[0310] 其中c为1；d为1；
[0311] R3、R4和R5的至少一个R为当与反应底物反应时能够形成共价键的反应性基团；以及R3、R4和R5的至少一个R为水溶性聚合物的基团。在另一实施方案中，所述化合物具有结构：
[0312]
[0313] 其中c为1，d为1；R3、R4和R5中一个R为反应性基团，以及R3、R4和R5中至少两个R各自包括水溶性聚合物的基团。在一实施方案中，对Y进行选择以使最大吸收波长为约580nm、约680nm，或约790nm。
[0314] 在另一实施方案中，所述化合物具有结构：
[0315]
[0316] 其中c为1，d为1；R3、R4和R5中一个R为反应性基团，以及R3、R4和R5中至少两个R各自为水溶性聚合物的基团。在一实施方案中，对Y进行选择以使最大吸收波长为约560nm、约660nm，或约770nm。
[0317] 就式II化合物而言，本领域技术人员熟知的是对桥单元Y进行选择，结合式F的部分的具体实施方案，结合Y部分的具体实施方案，以及结合具体取代基，以使所述化合物的最大荧光激发波长范围为约350至约1200nm。为了确定最大吸收波长和最大荧光发射波长，使用本领域公知的标准分析来获得所述染料的吸收和发射光谱。上述基团的任何组合都可用于形成本发明化合物，所述化合物最大荧光激发波长为约550nm、约560nm、约570nm、约580nm、约590nm、约600nm、约610nm、约620nm、约615nm、约620nm、约625nm、约630nm、约635nm、约640nm、约650nm、约655nm、约660nm、约665nm、约670nm、约675nm、约680nm、约685nm、约690nm、约695nm、约700nm、约705nm、约710nm、约715nm、约720nm、约725nm、约730nm、约735nm、约740nm、约745nm、约750nm、约755nm、约760nm、约765nm、约770nm、约775nm、约780nm、约790nm、约800nm、约810nm、约820nm、约830nm、约840nm、约850nm、约860nm、约870nm、约880nm、约890nm、约900nm、约910nm、约920nm、约930nm、约940nm、约950nm，about960nm、约970nm、约980nm、约990nm、约1000nm、约1020nm、约1040nm、约1060nm、约1080nm、约1100nm、约1120nm、约1140nm、约1160nm、约1180nm，或约
1200nm。上述的部分可用于任何组合中。染料的最大荧光激发波长通常为染料具有最大吸收或最大光密度处的波长，所述波长激发颜料发出荧光。在一些实施方案中，式II化合物最大吸收波长＞670nm。在一实施方案中，最大吸收波长＞700nm。根据另一实施方案，最大吸收波长＞800nm。
[0318] 本领域技术人员也可对桥单元Y进行选择，结合式F的部分的具体实施方案，结合Y部分的具体实施方案，以及结合具体取代基，从而本领域技术人员获得式II化合物，所述化合物的最大荧光发射波长为约550nm、约560nm、约570nm、约580nm、约590nm、约600nm、约610nm、约620nm、约615nm、约620nm、约625nm、约630nm、约635nm、约640nm、约650nm、约655nm、约660nm、约665nm、约670nm、约675nm、约680nm、约685nm、约690nm、约695nm、约700nm、约705nm、约710nm、约715nm、约720nm、约725nm、约730nm、约735nm、约740nm、约745nm、约750nm、约755nm、约760nm、约765nm、约770nm、约775nm、约780nm、约790nm、约800nm、约810nm、约820nm、约830nm、约840nm、约850nm、约860nm、约870nm、约880nm、约890nm、约900nm、约910nm、约920nm、约930nm、约940nm、约950nm，about960nm、约970nm、约980nm、约990nm、约1000nm、约1020nm、约1040nm、约1060nm、约1080nm、约1100nm、约
1120nm、约1140nm、约1160nm、约1180nm、约1200nm、约1220nm、约1240nm，或约1250nm。上述的部分可用于任何组合中。
[0319] 根据一实施方案，式II化合物的最大吸收波长至少大于655nm。
[0320] 根据一实施方案，，式II化合物的最大吸收波长至少大于670nm。在另一实施方案中，式II化合物的最大吸收波长至少大于670nm。在另一实施方案中，式II化合物的最大吸收波长至少大于700nm。
[0321] 在本发明的另一方面，提供了含有一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大荧光激发波长。在一些实施方案中，所述取代的花青染料包括至少一个反应性基团。在一些实施方案中，所述取代的花青染料被非螺环部分取代。
[0322] 在本发明的另一方面，提供了含有一个或多个水溶性聚合物基团的取代的花青染料，其中所述花青染料具有等于或大于约660nm的最大吸收波长。在一些实施方案中，所述取代的花青染料包括至少一个反应性基团。在一些实施方案中，所述取代的花青染料被非螺环部分取代。
[0323] 式II化合物的示例性结构示于下表3中。
[0324] 表3.式II化合物的示例性结构
[0325]
[0326] 表3.式II化合物的示例性结构
[0327]
[0328] 表3.式II化合物的示例性结构
[0329]
[0330] 表3.式II化合物的示例性结构
[0331]
[0332] 表3.式II化合物的示例性结构
[0333]
[0334] 表3.式II化合物的示例性结构
[0335]
[0336] 表3.式II化合物的示例性结构
[0337]
[0338] *为了简便，抗衡离子未示出。
[0339] 式II的染料化合物具有优越的溶解性和极好的荧光亮度和耐光性。具体地，最大吸收波长大于约655nm的式II化合物通常被称为近红外染料，显示了优于现有技术的类似波长的染料的主要优点。水溶性聚合物取代基显著改善了本发明的近红外染料的性能，导致了前所未有的荧光亮度(参见附图)。水溶性聚合物取代基显著改善了近红外染料的稳定性(参见附图)。近红外染料的稳定性是个问题，这要求在储存和处理时极度小心，由此限制了染料的使用。
[0340] 本发明还提供了式III化合物：
[0341]
[0342] Z可以是-H、烷基或取代基如-CF3或-CN。可供选择的，Z为：
[0343]
[0344] 式III化合物通常属于占吨荧光基团的种类。对X1、X2和Z的选择进一步确定所述化合物是否属于以下基团的种类：荧光素荧光基团(X1为＝O，X2为-OH，Z为取代的苯+ +基)，或若丹明荧光基团(X1为＝NH2 或＝NR6R7，X2为-NH2或-N8R9，Z为取代的苯基)，或rhodol基团(X1为＝O、X2为-NH2或-NR8R9)。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立为(R)p-(L)q-，其中L、p和q通常如本申请文件中其它地方所定义的那样。R如先前所定义，此外R还包括同时具有水溶性聚合物和反应性基团的部分，例如经结合部分连接的部分。变量c、d和e指示基团Z的苯环上R3、R4和R5取代基的数目，并且可以是0、1、2或3，使得c、d和e的总和小于或等于5。
[0345] 各式III的化合物包括反应性部分以及水溶性聚合物基团。因此，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中至少一个R为反应性部分而R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7中至少一个R为水溶性聚合物基团。
[0346] 在一些实施方案中，式III化合物属于荧光素荧光基团的种类，且X1和X2分别为＝O和-OH，而Z为取代有至少一个式(R)p-(L)q-部分的苯基。在一个相关实施方案中，Z包括至少一个为水溶性聚合物基团的R和至少一个为反应性基团的R。
[0347] 在其它实施方案中，式III化合物属于若丹明荧光基团的种类，其中X1为＝NH2+或+＝NR6R7，X2为-NH2或-NR8R9，且Z为取代有至少一个(R)p-(L)q-部分(c、d或e中至少一个不是0)的苯基部分。通过举例的方式，X2可以是氨基，所述氨基任选取代有一个或两个基团如烷基。在这种情形中，X2可以是例如二甲基氨基、二乙基氨基、甲基氨基或乙基氨基取代基。若R1或X2都不包括水溶性聚合物基团或反应性基团，则基团Z可取代有至少一个反应性基团和至少一个水溶性聚合物基团。
[0348] 在其它情况中，式III中的R1和X2一起形成与环A稠合的碳环或杂环。在相关实施方案中，式III中的R2和X1一起形成与环B稠合的碳环或杂环。所述稠环可额外取代有-额外R基团例如SO3、烷基，或甚至水溶性聚合物基团或反应性基团。如此由R6、R7、R8和R9和相邻的R1和/或R2结合形成的环是不饱和的或饱和的，且可为未取代的或被一个或多个(R)p-(L)q-取代。
[0349] 当基团Z为-H、-CN或-CF3时，R1、X1、R2或X2中的R包括水溶性聚合物基团而R1、X1、R2或X2中另一个R包括反应性基团。
[0350] 在一些实施方案中，水溶性基团包括经由连接体部分或结合部分与式III的核心结构相连的聚环氧烷。可能的是，R3、R4或R5为经由独立的连接体部分将水溶性聚合物基团和反应性基团两者连接的结合部分。
[0351] 示例性式III化合物示于表4中。
[0352] 表4.示例性占吨化合物*
[0353]
[0354] 表4.示例性占吨化合物*
[0355]
[0356] 表4.示例性占吨化合物*
[0357]
[0358] 表4.示例性占吨化合物*
[0359]
[0360] *为了简便，抗衡离子未示出。
[0361] 在本发明的一实施方案中，所述化合物为具有以下所示的式IV的香豆素荧光基团：
[0362]
[0363] 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6为先前定义的(R)p-(L)q-，条件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个R包括水溶性聚合物基团，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少另一个R包括反应性基团。
[0364] 根据一实施方案，R5为-OH或-NR7R8，其中R7和R8独立为H、任选包括至少一个杂原子的烷基、反应性基团、水溶性聚合物基团或磺酸根基团。可供选择的，R7与R8组合形成取代的或未取代的5元或6元环，所述环任选包括至少一个杂原子。在本发明的另一方面，R7与R4组合，和/或R8与R6组合形成饱和或不饱和的5元或6元环，所述环可以是取代的或未取代的，和/或所述环可与另一个5元杂环稠合，任选取代有额外R基团。
[0365] 根据另一实施方案，R3和R6各自为H；R2和R1独立包括先前定义的R基团；R1可额外包括为芳基的R基团，其中所述芳基任选包括至少一个选自卤素、N、P、O、S和Si的杂原子，以及任选包括一个或多个额外R取代基。
[0366] 所选择的本发明的香豆素染料在表5中列出。
[0367] 表5.所选择的本发明的香豆素基染料的列表*
[0368]
[0369] *为了简便，所述结构的任何抗衡离子都未示出。
[0370] 本发明还提供了式V化合物：
[0371]
[0372] 在式V中，R1、R2、R3和R4各自独立为(R)p-(L)q-，条件是R1、R2、R3和R4的至少一个R为反应性部分；以及R1、R2、R3和R4的至少一个R为水溶性聚合物基团。变量a、b、c和d独立为0、1、2或3。一般而言，a、b、c和d的总和为2，3或4.在一实施方案中，a、b、c和d的总和为4。例如，R1、R2和R3各自可包括水溶性聚合物基团，以使各(R)p-(L)q-基团可独立具有式-SO2NH(CH2CH2O)nCH3，其中n为约至约30，或为约7至约24。在该实施方案中，R4包括R，所述R为反应性基团如羧酸的活化的酯。
[0373] 在其它实施方案中，L可包括将反应性基团或水溶性聚合物基团与式V中的芘部分连接的C1-C8 N-烷基氨磺酰基或C2-C10 N，N-二烷基氨磺酰基团，以使各氨磺酰基经由S-C键与芘碳相连，其中各烷基部分任选包括至少一个O。
[0374] 在另一实施方案中，R1、R2和R3包括取代基如磺酸根基团，R4为经由独立的连接体部分将水溶性聚合物基团和反应性基团两者连接的结合部分。
[0375] 式V的示例性化合物在表6中列出。
[0376] 表6.示例性芘化合物*
[0377]
[0378] 表6.示例性芘化合物*
[0379]
[0380] *为了简便，所述结构的任何抗衡离子都未示出。
[0381] 本发明提供了制备本发明化合物的方法，所述方法包括以下步骤：1)使包括与胺-反应性基团连接的荧光团的化合物与具有下式的氨基化合物反应：
[0382]
[0383] 其中n可以是选自约3至约30的整数；h为选自1至5的整数；Rp为潜在的或受保护的反应性基团；2)将得到的化合物中潜在的或受保护的反应性基团Rp转化为反应性基团。
[0384] 可容易地制备上文所示的上述氨基化合物，例如，使合适的mPEG烷化化合物如mPEG甲苯磺酸酯或mPEG卤化物与包括合适的Rp基团的合适的氨基烷基化合物反应。合适的Rp基团包括羧酸基团、羧酸基团的甲酯基团、羧酸基团的叔丁酯基团、t-BOC保护的胺基团和苄氧羰基保护的基团，以上仅为列举。若Rp基团为潜在的反应性基团，如游离羧酸基团，可使用技术人员熟知的方法将其直接转化为反应性基团。若Rp为受保护的基团，可使用已知方法对其进行脱保护，然后转化为反应性基团。
[0385] (1)主题化合物的用途
[0386] 主题化合物在各种不同应用中都存在用途。相关的一个应用是主题化合物作为标记试剂的用途，所述标记试剂能够赋予特定物质组成的荧光特性。本发明化合物可用于与任何宽范围的分子反应，包括但不限于生物分子如多肽、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、多核苷酸(包括DNA和RNA)、脂质和碳水化合物或它们的任何组合。此外，本发明化合物可用于与以下物质反应：半抗原、药物、离子络合剂如金属螯合剂、微粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒或其它荧光分子(包括本发明的染料分子)，或表面。底物分子通常包括一个或多个官能团，所述官能团与主题化合物的反应性基团反应以形成共价连接键或非共价连接键。在一方面，本发明化合物的反应性基团为活化的酯(如琥珀酰亚胺基酯或SE)、马来酰亚胺、酰肼或氨基氧基基团。因此，在一些方面，来自底物分子(或反应底物)的官能团为胺、硫醇、醛或酮基团。得到的经荧光标记的底物分子可以被称为缀合物或经标记的底物分子。本领域实践的用于制备荧光基团-底物缀合物的任何方法(如Brinkley，Bioconjugate Chem.3，2(1992)，在此引入作为参考)适用于实践本发明的主题。
[0387] 生物分子和本发明化合物的缀合物通常具有高的荧光产率，同时通常保持了未标记的分子的关键参数，如溶解性、与受体或核酸选择性结合、使具体的酶活化或抑制或掺入到生物膜中的能力。然而，具有最高标记程度的缀合物仍然可沉淀或非特异性结合。必要时，为了保持功能或结合特异性，比最大值小的(less-than-maximal)标记程度是可接受的。制备本发明的缀合物可涉及优化特性的实验。进行缀合后，未缀合的标记试剂可以通过本领域已知的技术除去，所述技术如凝胶过滤、透析、缀合物沉淀和再溶解、HPLC或这些技术的组合。游离染料的存在，特别是当染料保持化学反应性时，可使得随后与生物缀合物的实验复杂。
[0388] 核酸
[0389] 在另一实施方案中，主题化合物可用于与核苷、核苷酸或多核苷酸缀合，其中任何所述分子可以是天然的或合成的、修饰的或未修饰的。用于标记的本发明化合物可包括反应性基团，所述反应性基团为亚磷酰胺、活化的酯(如琥珀酰亚胺基酯)、烷化基团或反应性铂络合物。所述分子可含有或衍生为含有本发明化合物上反应性基团的一个或多个反应配偶体。本发明化合物的反应性基团可在所述分子上与合适的反应配偶体反应以形成共价连接键。例如，亚磷酰胺基团可与羟基反应在脱保护后形成磷酸酯连接键；琥珀酰亚胺基酯等可与胺基团反应形成酰胺连接键；以及反应性铂络合物可与鸟苷碱基反应形成铂络合物连接键。在一实施方案中，包括活化的酯的本发明的反应性化合物与包括碱基的三磷酸核苷酸反应，所述碱基包括氨基炔基、氨基烯丙基或氨基烷基，以形成荧光标记的三磷酸核苷酸。这样标记的三磷酸核苷酸通常用于经由酶法掺入(enzymatic incorporation)制备荧光标记的核酸聚合物。
[0390] 在一些实施方案中，本发明的荧光化合物与尿苷或胞苷残基的C-5位连接的基团或连接体反应。该位置不涉及沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base-pairing)且很少干扰与互补序列的杂交。为了减少荧光团与酶或靶标结合位点的相互作用，氨基炔基连接体可在荧光部分和核苷酸之间引入。除了这种四原子的桥之外，可引入含7-10个原子的间隔物(spacer)，所述间隔物进一步将荧光团与碱基隔离。使用较长的间隔物可导致更亮的缀合物，对第二检测试剂的半抗原易接近性(hapten accessibility)增加。
[0391] 可供选择的，可制备三磷酸脱氧胞苷，所述磷酸脱氧胞苷使用2-氨基乙氧基乙基(OBEA)连接体在胞嘧啶的N-4位修饰。由荧光性荧光团的存在所导致的可能的立体阻碍可由于使用额外的间隔物而降低。
[0392] 荧光标记的DNA可通过以下反应从荧光标记的三磷酸核苷酸制备：PCR反应、末端转移酶催化的加成或切口转译(nick translation)。各种聚合酶可用于所述反应。所述聚合酶包括Taq聚合酶(用于聚合酶链反应(PCR)测定)、DNA聚合酶I(用于切口转译和引物延伸测定)、克列诺聚合酶(Klenow polymerase)(用于随机引物标记)、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)(用于如3′-末端标记)、逆转录酶(如用于从RNA模板合成DNA)或其他聚合酶如用于体外转录的SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶。
[0393] 可供选择的，荧光标记的核酸聚合物可如下制备：首先将胺标记的核苷酸通过酶法引入到核酸聚合物中，从而得到胺标记的核酸聚合物，接着用本发明化合物标记所述胺标记的聚合物。关于制备和使用荧光标记的三磷酸核苷酸的更多信息可参见美国专利4,711,955和5,047,519。仍然可供选择地，核酸聚合物如DNA可直接用包括反应性铂络合物作为反应性基团的本发明化合物标记，其中所述铂络合物与如美国专利5,714,327所述的鸟苷碱基的氮原子形成配位键。
[0394] 氨基酸和多肽
[0395] 在另一实施方案中，主题化合物可用于与氨基酸、氨基酸类似物或多肽缀合。经标记的氨基酸、氨基酸类似物和多肽可如下标记：使本发明化合物与氨基酸、氨基酸类似物和多肽反应，所述氨基酸、氨基酸类似物和多肽包括针对所述化合物上的反应性基团的反应配偶体。所述反应配偶体可为所述多肽上存在的天然或非天然基团。通过举例的方式，反应配偶体可为天然残基如氨基，其为天然赖氨酸残基的一部分，或为硫醇基团，其为天然半胱氨酸残基的一部分。
[0396] 为了使实现最大荧光成为可能，蛋白质可用尽量多的相同荧光基团的分子标记，标记的程度为蛋白质的生物活性受标记的影响最小。在其它情况中，期望的是避免由于蛋白质上的多个荧光基团分子彼此相互作用而导致的荧光淬灭。染料-染料相互作用可为物理性的，如染料聚集，或可为光谱性的，如基于FRET的能量转移，或两者的组合。无论哪种类型的相互作用都可导致荧光淬灭，其特征可为随着标记程度增加经标记的蛋白质的总荧光缓慢增强，然后快速下降。图1-9显示了，与不含水溶性聚合物基团的现有技术的类似荧光基团相比，本发明的荧光基团更不可能或者基本上更不可能在抗体或抗生物素蛋白链菌素上淬灭其荧光。在蛋白质上标记荧光基团的荧光淬灭的主要原因被认为是由于染料聚集物如染料二聚体的形成所导致的。当发生染料二聚体形成时，荧光基团-蛋白质缀合物的吸收光谱通常显示了双峰。如图1中所示，与现有技术的类似荧光基团相比，本发明的荧光基团比较更不可能发生二聚体形成。因此，本发明的荧光基团在蛋白质上更亮(图2)。就本发明的荧光基团而言，在蛋白质上相对低的聚集倾向允许为了更大的荧光强度而将蛋白质标记多次(即，更高标记程度(DOL))(图3-8)。因此，与现有技术的荧光基团相比，用本发明的荧光基团标记的抗体在检测其靶标时更敏感(图9)。用本发明的荧光基团标记的抗体的另一优点是，它们的染色特异性相对荧光标记的抗体得到了改进(图10)，例如，与用常规染料以相同标记程度标记的相同抗体相比，用本发明的荧光基团标记的抗体保持了与其抗原结合的更高结合特异性。本发明的荧光基团的进一步优点为导致聚集降低和结合特异性增加；与用相同结合配偶体和用不是本发明化合物的常规荧光基团标记的相同生物分子所形成的复合物相比，本发明的标记的生物分子当与其结合配偶体结合时，将提供信噪比更高的荧光信号。
[0397] 在一些实施方案中，本发明方法的复合物信噪比等于或大于约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约
220、约230、约240、约250、约255、约260、约265、约270、约275、约280、约285、约290、约
295、约300、约305、约310、约315、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390，或约400。在本发明方法的复合物的一些实施方案中，所述信噪比不超过约100、约
110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约
230、约240、约250、约255、约260、约265、约270、约275、约280、约285、约290、约295、约
300、约305、约310、约315、约320、约330、约340、约350、约360、约370、约380、约390，或约400。
[0398] 在一些实施方案中，由包括本发明标记物的生物分子形成的复合物当与其结合配偶体结合时，所提供的荧光信号比用相同结合配偶体和用常规荧光基团以相同标记程度标记的相同生物分子所形成的复合物的荧光信号高约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％，或约1000％。
[0399] 所述荧光基团的另一优点是它们的高耐光性，这对荧光显微法研究而言是特别重要的(图11)。此外，用本发明的荧光化合物标记的多肽具有不短于不具有荧光标记物的相应多肽的血清半衰期。
[0400] (2)本发明的标记的生物分子的用途
[0401] 主题化合物提供了标记用于多种宽泛应用的生物分子的有效工具。标记使得技术人员能够辨别涉及生物分子的相互作用，所述生物分子如蛋白质、糖蛋白、核酸和脂质，以及无机化学物质，或它们的任何组合。所述相互作用可为核酸分子之间、核酸和蛋白质之间，以及蛋白质和小分子之间的相互作用。所述相互作用可在以下系统中辨别：无细胞的生物系统、细胞系统(包括细胞内和细胞外系统)或在体内辨别，所述相互作用涵盖在组织或器官或受试者中的细胞中的活性。描述各种相互作用通常是在科学研究和开发、药物设计、筛选和优化、系谱分类、个体基因分型(genotyping individuals)、亲本和法医鉴定、环境研究、病症的诊断、预测和/或治疗中重要的手段。
[0402] 如上所述，根据本发明的方法标记的生物分子可用作结合剂，以检测其结合配偶体、它们的生物学相互作用的靶标。例如，蛋白质可用本发明的染料标记，然后用于结合细胞表面受体。在本发明的一些实施方案中，在将染料与结合剂有效交联的条件下，将结合剂用取代的花青染料标记，所述花青染料具有等于或大于660nm的最大荧光激发波长、水溶性聚合物基团和反应性基团。在一些实施方案中，所述取代的花青染料被非螺环取代基取代。使如此标记的结合剂与其结合配偶体接触，然后检测荧光标记。在其它实施方案中，使结合剂与式I、II、III、IV或V结构的化合物在将用结合剂对所述化合物进行有效交联的条件下反应。
[0403] 本发明的标记的分子在各种生物学测定和方法中可用作FRET对的一部分，无论是作为供体还是受体分子。本领域技术人员应知晓基于具体应用选择合适的FRET对。所述应用包括但不限于，涉及分子信标(molecular beacon)的测定、FRET蛋白酶测定、流式细胞术、核酸杂交和必须探测两个或多个部分的相对空间定位的其它应用。FRET通常在10至 的标度上是有用的。在一实施方案中，FRET对的供体和受体都是本发明的经标记的分子。在另一实施方案中，FRET对的一个成员为本发明的经标记的寡核苷酸，其能够与用FRET对的第二成员标记的互补寡核苷酸退火(anneal)，从而所述退火导致能量转移的效率增加。在这个实例中，FRET对的第二成员可为本发明的荧光团或可为不同的荧光团。
[0404] 在一些应用中，期望的是对本发明的标记的分子进行淬灭。可使用本领域已知的各种淬灭剂。非限制性实例包括Black Hole QuencherTM部分、DABCYL、Reactive Red4(Cibacron Brilliant Red 3B-A)、孔雀绿(Malachite Green)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)和4，4′-二异硫氰酸根合二氢-均二苯乙烯-2，2′-二磺酸。通过举例的方式，分子信标可用本发明化合物以及合适的淬灭剂标记。在信标的闭合构象中，所述荧光团被淬灭。当所述信标由于识别或结合事件打开时，荧光团的荧光显著增加。
[0405] 在另一实施方案中，本发明提供了能量转移荧光基团，其包括第一供体荧光基团和第二受体荧光基团，其中：所述供体荧光基团和受体荧光基团共价连接形成FRET对；供体荧光基团和受体荧光基团中至少一个为本发明的荧光基团；以及所述能量转移荧光基团任选包括反应性基团。制备能量转移荧光基团的方法及其用途先前已有描述。参见美国专利6,479,303和WO 00/13026。
[0406] 在一实施方案中，本发明的荧光基团用于标记荧光蛋白质以形成所谓的串联染料，其中本发明的荧光基团和荧光蛋白的荧光团形成能量转移对(即，FRET对)。在这样的FRET对中，本发明的荧光基团是供体荧光基团或受体荧光基团，同样地，所述蛋白质的荧光团是受体荧光基团或供体荧光基团，从而FRET对在供体荧光基团的最大吸收处或接近最大吸收处被激发，在受体荧光基团的最大发射处收集荧光，导致较大的斯托克斯位移(Stokes shift)。制备串联染料的合适的荧光蛋白质包括但不限于，各种藻胆蛋白如别藻蓝蛋白B、别藻蓝蛋白(APC)、C-藻蓝蛋白、R-藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin)、C-藻红蛋白、b-藻红蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白(R-PE)等。藻胆蛋白是包括作为辅基的胆汁三烯(bilin)，所述胆汁三烯也是蛋白质的荧光团。优选地，所述藻胆蛋白为R-PE或APC。为了获得合适的FRET效率，本领域技术人员可选择适当波长的荧光基团，从而供体荧光基团的发射和受体荧光基团的吸收具有足够的光谱重叠。选择荧光基团和制备串联染料的详细方法披露于美国专利4,520,110和5,714,386中。本发明的串联染料由于它们斯托克斯位移较大，因而可用于多色检测，其中仅有限数目的激发光源是可获得的。具体而言，本发明的串联染料可用于荧光激活细胞分选术(FACS)或流式细胞术研究。市售流式细胞仪通常配备1至3个激发光源，更常见配备1至2个激发光源。
例如，一些市售流式细胞仪配备有488nm氩激光器和633nm He-Ne激光器或635nm红色二极管激光器，非常多数目的流式细胞仪仅具有488nm氩激光器。由此，为了检测多重靶标，每种靶标可用具有不同发射的不同荧光基团染色，所述不同荧光基团都需要由常见激发源有效激发。本发明的串联染料可满足该需要，这是因为可容易地制备具有相同最大激发但是不同最大发射的不同串联染料。例如，R-PE可被表3的染料10和表3的化合物18分别标记，得到两种串联染料，其中第一种串联染料可在488nm激发，在665nm发射，第二种串联染料也可在488nm发，但在775nm发射。
[0407] 在一实施方案中，将本发明化合物在有利于对多肽进行共价标记的条件下应用至生物样品，所述生物样品包括多种多肽和任选其它生物分子。在一些实施方案中，所述化合物的反应性基团为活化的酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺、溴乙酰胺、酰肼、胺或氨基氧基基团。所述生物样品可为细胞溶解物或组织溶解物。生成的经标记的多肽或细胞成分可通过各种已知工具或技术进行分析和/或纯化，包括但不限于蛋白微阵列、色谱和凝胶电泳。
[0408] 本发明还提供了试剂盒(kit)，其包括本发明化合物和/或本发明的荧光基团-底物缀合物，用于如上选择性描述的各种测定。本发明的试剂盒可包括一种或多种本发明化合物和指示所述化合物用途的说明书。例如，试剂盒可包括用于标记底物的一种或多种本发明化合物、用于标记反应混合物和产物纯化的一种或多种缓冲剂、用于纯化生成的荧光基团-底物缀合物的色谱柱，用于进行操作的规程、任选任何额外试剂和任选任何参比标准。在另一实施方案中，试剂盒包括一种或多种本发明的荧光基团-底物缀合物、一种或多种缓冲剂、使用所述缀合物的规程、用于测定的任选任何其他试剂和任选任何一种或多种校准标准(calibration standard)。所述试剂盒还可含有用于纯化缀合产物的其他物质和装置。
[0409] 本发明的荧光基团产生的信号可用各种方式检测。一般而言，信号强度的变化可由本领域已知的任何方法检测，且通常取决于对所使用的荧光基团的选择。这可在光学系统的辅助下进行。所述系统通常包括至少两种元件，即激发源和光子检测器。这些元件的多种实例是本领域可获得的。示例性激发源为激光器，如偏振激光器。激光的选择依赖于与探针相连的荧光基团。对多数荧光基团而言，所需要的激发光的范围为约300nm至约1200nm，或更常见为约350nm至约900nm。可供选择的，本发明化合物可使用以下范围的激发波长激发：约300至约350nm、350至400nm、400至450nm、450至500nm、500至550nm、
550至600nm、600至650nm、650至700nm、750nm至800nm或800nm至850nm，以上仅为列举。本领域技术人员可通过常规实验容易地确定激发给定荧光团的适当激发波长(参见例如The Handbook-‘A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，Tenth Edition’(2005)(得自Invitrogen，Inc./Molecular Probes)先前在此引入作为参考)。
期望时，本领域技术人员可采用其他光学系统。这些光学系统可包括元件如光学读数器、高效光子检测系统、光电倍增管(photo multiplier tube)、门控感应的FET、纳米管FET、光电二极管(如雪崩光电二极管(APD))、照相机、电荷耦合器件(charge couple device，CCD)、电子倍增电荷耦合器件(electron-multiplying charge-coupled device，EMCCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)和共焦显微镜。这些光学系统还可包括光传输元件如光纤、光开关、反射镜、透镜(包括显微透镜和纳米透镜(nanolens))、准直仪。其他实例包括光学衰减器、偏振片(如分色镜)、滤饼器(低通、带通或高通)、波片和延迟线。在一些实施方案中，所述光传输元件可为与阵列光限制器件(arrayed optical confinement)进行光通信的平面波导。参见如美国专利7,292,742、7,181,122、7,013,054、6,917,726、,267,673和
7,170,050。本领域已知的这些和其他光学器件可按照各种方式组合和装备以实现对可辨别的信号进行检测。
[0410] 本发明的荧光标记的多核苷酸可应用于各种应用中。所述应用涉及核酸之间的相互作用，如DNA和DNA之间、DNA和RNA之间，以及RNA和RNA之间或任何其他非天然存在的核酸PNA、LNA和/或TNA之间的相互作用。各种应用也可涉及核酸和蛋白质、脂质或其组合之间的相互作用。具体核酸测定的非限制性实例包括核酸扩增，包括定量扩增和终点扩增、在溶液中或底物上的杂交(如阵列杂交)、凝胶移位(gel shift)和核酸序列测定。荧光标记的多核苷酸可以溶液相使用或固定在底物上使用。
[0411] 在一实施方案中，所述经标记的多核苷酸用作杂交探针(hybridization probe)。杂交探针的一个应用是荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)。在这种技术中，将与有关序列互补的经标记的多核苷酸和固定的染色体制剂退火，有关序列的存在和染色体定位通过显微镜检法检测。FISH可如下进行：将有关核酸固定在底物上，所述底物包括但不限于玻璃、硅或纤维。FISH也可定量使用(Q-FISH)以检测重复序列如端粒的存在和长度。这可通过对由显微镜检法测量的发射荧光的强度进行定量来实现。可进行利用主题荧光化合物的FISH测定，来检测DNA分子或染色体的特定片段。这些特征可用于基因遗传咨询(如产前筛查)、医学和物种鉴定。
[0412] 在一些实施方案中，经标记的多核苷酸可用作扩增反应如PCR中的引物。在另一实施方案中，本发明化合物可用于标记多核苷酸，所述多核苷酸随后可用作探针(可为杂交探针或实时PCR探针)。这样的探针可用第二种荧光基团标记，从而与本发明的第一种荧光基团形成FRET对。制备和使用PCR探针的方法是本领域技术人员熟知的。
[0413] 在本发明的一实施方案中，提供了检测或定量靶标核酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供本发明的经标记的多核苷酸(“探针”)；b)使所述经标记的多核苷酸与所述核酸靶标接触，从而允许探针与核酸靶标杂交；以及c)通过测量探针与核酸靶标杂交时探针荧光的变化来检测或定量所述核酸靶标。
[0414] 如本申请使用的那样，当探针与靶标核酸形成复合物时发生杂交。一般而言，所述复合物至少部分经由核苷酸残基的碱基之间的氢键得到了稳定。氢键可通过沃森克-里克碱基对、Hoogstein结合或任何其他序列特异性方式出现。在更广泛的方法(如PRC反应的起始，多核苷酸通过核酶进行酶法裂解)中，杂交可构成一个步骤。
[0415] 在探针和靶标之间发生杂交后，可测量探针的荧光强度的变化。所述杂交前后的变化可得到所检测的信号强度的正增益(positive gain)或负降低(negativereduction)。取决于进行的具体杂交测定，杂交后不止一种事件可促成信号强度变化的产生。例如，报道分子(reporter)信号的增加可通过空间延伸或报道分子荧光基团与淬灭剂基团在仍然与探针相连时将报道分子与淬灭剂分离而导致。此外，探针的报道分子或淬灭剂可通过经酶(如具有5’至3’外切核酸酶的聚合酶)裂解来分离，由此产生所检测的报道分子信号。如上所述，报道分子和淬灭剂都以功能性术语定义，从而使得这些基团是相同的，尽管在杂交反应中使用时相对彼此发挥不同功能。例如，与探针相连的基团为淬灭剂，因为当探针(通常假定探针为随机态)不与靶标核酸杂交时，所述基团降低光信号的发射。
相同基团当在与靶标核酸杂交后经酶裂解时刻变成报道分子荧光基团，因为在测定期间此时对荧光基团的信号进行检测。
[0416] 先前描述的信号检测方法可应用至核酸扩增，其中靶标核酸副本数目增加。这种增加可按照线性或指数方式发生。扩增可通过天然或重组DNA聚合酶(如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、T7 DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的克列诺片段、Tma DNA聚合酶、外-Tli DNA聚合酶、外-KOD DNA聚合酶、外-JDF-3 DNA聚合酶、外-PGB-D DNA聚合酶、U1Tma(N-截短的)海栖热袍菌(Thermatoga martima)DNA聚合酶)、测序酶和/或RNA聚合酶如逆转录酶进行。
[0417] 优选的扩增方法为聚合酶链反应(PCR)。PCR的一般操作在美国专利4,683195(Mullis)和4,683,202(Mullis等人)中有教导。简而言之，由PCR扩增核酸涉及这样的重复循环：使DNA热变性、将两种引物与要扩增的靶标核酸片段侧翼的序列退火，然后用聚合酶延伸退火的引物。引物与靶标核酸的相反链杂交，然后定向，以使由聚合酶进行的合成沿着引物之间的片段进行，使得靶标片段的量有效加倍。此外，因为延伸产物与引物是互补的且能够与引物结合，每个相继的循环实质上使先前循环中合成的靶标核酸量加n
倍。这导致具体的靶标核酸以约2 的速率进行指数积累，其中n为循环的数目。
[0418] 典型的常规PCR热循环规程包括30个这样的循环：(a)在90℃至95℃的范围变性0.5至1分钟，(b)在50℃至65℃的温度范围退火1至2分钟，然后(c)在68℃至75℃延伸至少1分钟。其它规程包括但不限于普遍规程以及快循环规程(fast cycling protocol)也可进行完成主题探针。
[0419] 常规PCR的变化形式是称为“热启动PCR”的反应。热启动PCR技术关注在反应制备期间对聚合酶活性进行抑制。通过在PCR循环前限制聚合酶活性，降低了非特异性扩增，且增加了目标产率。热启动PCR的一般方法包括对聚合酶进行化学修饰(参见例如美国专利5,773,258)、通过聚合酶特异性抗体抑制聚合酶(参见例如美国专利5,338,671)，以及在热循环发生前在反应位点引入物理障碍以隔离聚合酶(如蜡屏障(wax-barrier)方法)。进行热启动PCR所必要的试剂常规地包装在市售试剂盒中(参见例如Sigma的JumpStart试剂盒)。
[0420] 可用主题探针进行的常规PCR的另一种变化形式是使用嵌套引物(nestedprimer)的“嵌套式PCR”。当样品中靶标核酸的量极度受限(如使用档案样品或法医样品)时，该方法是优选的。在进行嵌套式PCR时，首先用外侧的一组引物扩增核酸，所述引物能够与靶标核酸的较大片段侧翼的序列杂交。在该扩增反应后，使用内侧一组的引物进行第二轮扩增循环，所述内侧引物与较大片段中的靶标序列杂交。
[0421] 主题探针可用于逆转录PRC反应(RT-PCR)中，其中逆转录酶首先将RNA分子转化为双链cDNA分子，然后采用所述双链cDNA分子作为聚合酶链反应中后续扩增的模板。在进行RT-PCR时，在对靶标核酸进行热变性后，通常将所述逆转录酶加到反应样品中。然后将反应混合物维持在合适的温度(如30℃-45℃)，持续足够量的时间(如5-60分钟)以在预定的扩增循环发生前产生cDNA模板。所述反应特别用于检测遗传信息储存在RNA分子中的生物学实体。这些类别的生物学实体的非限制性实例包括RNA病毒如HIV和致肝炎病毒(hepatitis-causing viruses)。本发明实现的RT-PCR的另一重要应用是基于测试样品中检测的mRNA水平同时对生物学实体进行定量。
[0422] 主题探针也可用于进行连接酶聚合酶链反应(LCR-PCR)。所述方法涉及将靶标核酸与一组引物对连接(ligate)，所述引物对各自具有靶标特异性部分和与靶标序列不相关的短锚定序列(anchor sequence)。然后将含有所述锚定序列的第二组引物用于扩增第一组引物所连接的靶标序列。进行LCR-PCR的操作是本领域技术人员熟知的，因此未在本申请中进行详细描述(参见例如美国专利5,494,810)。
[0423] 主题探针特别适用于同质性测定(homogeneous assay)。在这样的测定中，对靶标核酸进行检测和/或定量化，而不要求测定后加工来记录测定的结果。例如，同质性PRC反应可在密封的样品容器(如试管、样品毛细管或热芯片(thermalchip))中进行，并且当测定开始时，在记录结果时不必进一步加入或除去试剂。同质性测定允许实时记录测定结果。期望时，在实践主题方法时，测定结果可随着测定进行及时连续地记录，或在测定期间或测定完成时在一个或多点间歇记录。
[0424] 期望时，同质性测定可多路进行，即，在一种测定中可检测多于一种靶标核酸。在多路测定中，将与所共价连接的荧光基团性质不同的两种或多种特异性核酸探针加到要测定的混合物中。选择荧光基团，以便从各种特异性核酸探针产生可辨别的荧光信号。可同时记录核酸探针的不同荧光基团组合的信号，以检测和/或定量相应的靶标核酸。多路测定大大降低了分析成本，且可极度增加高容积设定下的通量。
[0425] 主题探针可用于检测单突变。因此，提供了这样的方法，其使用本发明的探针来检测探针序列和靶标序列之间的尽量少的单一误配(single mismatch)。通过PCR进行的核酸检测中的这种高特异性在临床诊断和遗传研究中是有高度价值的。例如，许多疾病与人体基因组不同位点的单突变相关。尽管理论上这种类型的遗传变异(也称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)或SNP)，可通过序列测定来检测，但由于高成本和低效率，预期所述序列测定方法不能进行大规模实践。使用主题探针通过扩增反应检测SNP是可行的。
[0426] 主题探针还特别适用于监测核酸扩增反应。在一个相关实施方案中，本发明提供了在靶标扩增期间监测靶标核酸增加的方法。所述方法通常涉及a)提供扩增反应混合物，所述混合物包括所述靶标核酸、与靶标核酸杂交的至少一种引物、提供可检测信号的本发明的经标记的寡核苷酸探针，所述信号的强度与扩增中靶标核酸的增加成比例；(b)在扩增所述靶标核酸的条件下处理所述混合物；以及(c)在所述处理步骤(b)期间测量由所述混合物产生的所述信号的量。期望时，信号的量在扩增反应全程连续确定，或在扩增反应期间间歇确定。在使用引物对时扩增可以是指数性的，或在使用所述引物对的一种引物时扩增可以是线性的。
[0427] 在扩增反应期间信号强度的增加可能是由于探针与靶标核酸杂交的步骤，以及经由扩增反应中利用的聚合酶活化进行裂解的步骤所引起的。
[0428] 在一方面，当与PCR结合使用时，主题方法利用了聚合酶的5′至3′核酸酶活性。当在PCR的开始同时加入主题探针与引物时，经标记的探针的核苷酸水解产生的信号提供了在靶标序列扩增期间监测靶标序列的方式。多种聚合酶适于催化引物和模板依赖性核酸合成且具有5′至3′核酸酶活性。非限制性实例包括DNA聚合酶如大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus littoralis DNA聚合酶和嗜热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶。期望时，温度稳定的聚合酶可用于核酸扩增反应。参见例如美国专利4,889,818，其披露了从嗜热水生菌分离的代表性耐热酶。额外的代表性温度稳定的聚合酶包括而不限于，如从以下细菌提取的聚合酶：耐热细菌黄色栖热菌(thermostable bacteria Thermus flavus)、红色栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽胞杆菌(其比所列的其它细菌具有稍微低的温度最适度)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermus rubens)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、Thermococcus littoralis和甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)。
[0429] 在另一实施方案中，核酸扩增可用显示出链置换活性的聚合酶进行(也称为滚环聚合(rolling circle polymerization))。链置换可导致环状DNA模板的串联副本的合成，特别用于等温PRC反应。适用于本发明的滚环聚合酶的非限制性实例包括但不限于，T5 DNA聚合酶(Chatterjee et al.，Gene 97：13-19(1991))和T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord and Benkovic，Curr.Biol.5：149-157(1995))、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto et al.，Gene 84：247(1989))、噬菌体PRD1 DNA聚合酶(Jung et al.，Proc.Natl.Aced.Sci.USA84：8287(1987)和Zhu and Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219：267-276(1994))、DNA聚合酶I的克列诺片段(Jacobsen et al.，Eur.J.Biochem.45：623-627(1974))。
[0430] 优选的一类滚环聚合酶利用蛋白质引发(protein priming)作为启动复制的方式。示例性的这类聚合酶是修饰的或未修饰的DNA聚合酶，选自或衍生自噬菌体Φ29、PRD1、Cp-1、Cp-5、Cp-7、Φ15、Φ1、Φ21、Φ25、BS 32L17、PZE、PZA、Nf、M2Y(或M2)、PR4、PR5、PR722、B103、SF5、GA-1和短尾病毒科(Podoviridae family)的相关成员。具体而言，野生型噬菌体Φ29基因组由具有19,285个碱基对的线性双链DNA(dsDNA)组成，碱基对具有与每个5’末端共价连接的末端蛋白(TP)。为了启动复制，组蛋白样病毒蛋白与可能促成DNA两端的双螺旋解旋的复制起始区(origins of replication)形成核蛋白复合物(Serrano et al.，The EMBO Journal 16(9)：2519-2527(1997))。DNA聚合酶催化第一dAMP与TP提供的羟基之间的加成。这种蛋白引发的事件在模板的第二3’核苷酸相反方向发生，启动产物(TP-dAMP)在DNA中滑动回一个位置以恢复末端核苷酸。启动后，相同DNA聚合酶复制DNA链中的一条同时替换另一条。Φ29 DNA聚合酶的较高持续合成能力(processivity)和链置换能力使得在不存在任何解螺旋酶或辅助持续合成能力因子的情况下完成含Φ29 TP基因组(TP-DNA)的复制变成可能(由Serrano et al.，The EMBO Journal 16(9)：2519-2527(1997)综述)。
[0431] 链置换可通过使用各种辅助蛋白来增强。它们包括但不限于，解螺旋酶(Siegel et al.，J.BioL Chem.267：13629-13635(1992))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Skaliter and Lehman，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 91(22)：10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(Rigler and Romano，J.Biol.Chem.270：8910-8919(1995))、腺病毒DNA结合蛋白(Zijderveld and van der Vliet，J.Virology 68(2)：1158-1164(1994))和BMRF1聚合酶辅助亚单元(Tsurumi et al.，J.Virology 67(12)：7648-7653(1993))。
[0432] 主题探针可用在等温扩增反应中。所述扩增反应不单独依赖热循环。所述操作可在宽范围的环境温度应用。具体地，仅仅通过双链模板序列的解链温度之上的温度增加不能实现双链模板序列的变性。更准确的说，变性过程涉及将链分离以允许引物退火和延伸的物理和机械力。进行等温扩增反应包括等温PCR的各种机理描述在美国专利申请20060019274和美国专利5,824,477和6,033,850中，将其在此引入作为参考。
[0433] 核酸扩增通常通过使用扩增试剂进行。扩增试剂通常包括酶、含水缓冲液、盐、引物、靶标核酸和三磷酸核苷。取决于上下文，扩增试剂可以是完全或不完全扩增反应混合物。
[0434] 对用于核酸扩增中的引物进行选择将取决于靶标核酸序列。本发明中使用的引物通常为寡核苷酸，如长度为10至100或10至25个碱基，其可以模板特异性方式经由聚合酶的作用来延伸。一般而言，在引物设计中考虑以下因素：a)一对引物中每种单独的引物优选在扩增反应中不发生自杂交；b)单独的引物对优选在扩增反应中不发生交叉杂交；以及c)为了将所选择的引物对与将要扩增的核酸片段侧翼的两个不同区域退火，所选择的引物对必须具有适当的长度和序列同源性。然而，并不是引物的每个核苷酸都必须与用于发生延伸的模板退火。引物序列不需要反映靶标核酸的精确序列。例如，非互补性核苷酸片段可与引物的5’末端相连，引物序列的其余部分与靶标互补。可供选择的，非互补性碱基可散布到引物中，条件是所述引物序列与用于发生退火的靶标具有足够的互补性，且允许合成互补核酸链。
[0435] 核酸扩增反应通常包括在缓冲液中的靶标核酸，所述缓冲液与用于扩增靶标的酶相容。缓冲液通常包括能引入模板序列的复制链中的核苷酸或核苷酸类似物(ATP、TTP、CTP、GTP或其类似物包括但不限于具有分别的碱基单元的五磷酸盐)。
[0436] 期望时，扩增反应作为自动化过程进行。多种热循环装置(thermocycler)在本领域是可获得的，其能够容纳48个、96个或更多种样品。合适的光学系统将来自光源的激发光移动到反应位点并测量来自每种样品的发射光。例如，多光导纤维(multiple fiber optic)实现在进行热循环时同时读取所有的PCR管。然而，可能仅需要单一的荧光计读取反应位点的荧光。类似的检测方案在96孔微量滴定板中是合适的。这种类型的板在用于大规模样品筛选的临床实验室中是时常期望的，例如，用于遗传分析如在血库筛选操作中筛选AIDS病毒。
[0437] 因此，本发明还提供了检测由主题探针产生的信号的装置，其可用于在扩增之前、期间或之后检测、测量和定量信号。所述装置包括能够容纳包括主题探针的扩增反应混合物且实现靶标序列扩增的热装置(如热循环装置)，以及检测主题探针产生的信号的检测器。
[0438] 在本发明的另一实施方案中，主题探针在这样的测定中使用，所述测定在核酸微阵列上进行以检测或定量核酸靶标。在所述测定中，当存在互补靶标核酸时，核酸荧光信号就在核酸微阵列上产生。
[0439] 包括基因芯片的核酸微阵列包括与固体表面共价连接的有序核酸阵列，参见例如美国专利5,871,928、6,040193、6,262,776、6,403,320和6,576,424。在测定中产生的荧光信号可用光学检测器监测和定量，所述光学检测器包括但不限于荧光成像仪，如Hitachi Corp.，San Bruno，Calif提供的市售仪器，或共焦激光显微镜(共焦荧光扫描仪)如来自General Scanning，Inc.，Watertown，Mass市售仪器。
[0440] 在核酸微阵列上进行的测定中，靶标核酸可作为得自任何合适的生物来源的核酸序列的混合物提供。它们可得自体液、固体组织样品、组织培养物或从中得到的细胞和其后代和从任何这些来源制备的组织切片或涂片，或含有核酸的任何其他样品。
[0441] 当测定表达模式时，mRNA序列首先通过逆转录PCR用普遍引物扩增，然后将它们在测定中用作靶标序列。在一实施方案中，测试样品中存在的所有核酸序列同时应用至用于分析的微阵列，由此允许所有靶标核酸序列与阵列上存在的所有核酸发生相互作用。在另一实施方案中，利用微阵列对应用至阵列的靶标核酸进行预先选择以得到用于精修的杂交分析的亚组。例如，有限数目的靶标序列可含有要分析的特异性核苷酸序列的多于一种伸展，如多于一种单核苷酸多态性。这种设置的核酸序列可通过PCR在特异性引物辅助下扩增，然后在微阵列对它们进行分析。
[0442] 在测定受试者的多基因表达时，在杂交反应中允许靶标多核苷酸与上述阵列上的探针形成稳定的复合物。本领域技术人员应该理解，当反义RNA用作靶标核酸时，选择固定在阵列上的序列使其与反义核酸的序列互补。相反，当靶标核酸库为有义核酸库时，选择固定在阵列上的序列使其与有义核酸的序列互补。最后，当核酸库为双链时，所述探针可为有义的和/或反义的，因为靶标核酸既包括有义链又包括反义链。
[0443] 在一实施方案中，经标记的探针用于在微阵列上进行竞争性杂交(competitive hybridization)。在该测定格式中，来自测试样品的靶标核酸与本发明的探针竞争结合微阵列上固定的已知序列。与固定的已知序列结合的经标记的探针的量与测试样品中相应的靶标核酸的浓度成反比。
[0444] 变体杂交测定涉及在微阵列上使用聚合酶通过对报道分子进行裂解以增强探针的信号。例如，首先允许靶标序列的混合物与阵列上固定的已知序列杂交。然后洗掉未杂交的序列。之后，允许对应于靶标序列的探针与靶标上不同区域杂交。当洗掉过量的未结合探针时，经杂交的探针上的报道分子荧光基团经由聚合酶作用而裂解，由此产生可检测的信号，所述信号是测试样品中最初存在的靶标序列的存在和/或数量的指示。
[0445] 就使用本发明的经标记的探针而言，合适的杂交条件是使得阵列上的序列和靶标之间的识别相互作用都足够特异性和足够稳定的条件。如上所述，杂交反应可在不同“严格”条件下进行。相关条件包括温度、离子强度、孵育时间、在反应混合物中额外溶质如甲酰胺的存在和洗涤操作。更高的严格条件是那样的条件，如较高温度和较低钠离子浓度，这要求就形成稳定的杂交复合物而言杂交组分之间最小互补性更高。增强杂交反应的严格性的条件是广泛已知的且在本领域中公开。参见例如(Sambrook，et al.，(1989)，同上)。
[0446] 一般而言，在杂交特异性(严格性)和信号强度之间存在折衷。在一优选的实施方案中，在检测靶标-探针复合物之前对经杂交的阵列进行洗涤以增强信噪比。通常，经杂交的阵列在依次更高的严格溶液中洗涤，在每次洗涤间读出信号。由此产生数据组的分析将显示了洗涤严格性，高于洗涤严格性时，杂交模式并未明显改变，并且所述洗涤严格性对有关特定多核苷酸探针提供了足够信号。管理洗涤严格性的参数通常与杂交严格性的参数相同。其它量度如在杂交期间包括阻断剂(如精子DNA、洗涤剂或其它有机或无机物质)也可降低非特异性结合。
[0447] 在微阵列上的成像特异性杂交事件通常在光学系统辅助下进行。合适系统的非限制性实例包括照相机、电荷耦合器件(CCD)、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)和共焦显微镜。
[0448] 微阵列提供了对发生杂交的序列的位置定位。杂交区域的位置与特定序列相关，因此与测试样品中表达的靶标的本性有关。所述检测方法还提供了对在每个杂交区域的杂交强度水平进行定量测量，由此提供了对给定的基因转录的表达水平进行直接测量。收集指示阵列板上存在的杂交区域和它们各自强度的数据构建了杂交模式，该杂交模式代表了受试者表达的基因转录的多样性。通过对得自不同受试者的靶标多核苷酸进行杂交产生的杂交模式中所检测的偏差(discrepancies)是这些受试者中基因转录多样性的差异表达的指示。
[0449] 在一方面，将要比较的杂交模式可在相同阵列上产生。在这种情形下，不同模式由不同类型的可检测的标记物来区别。在一个不同的方面，用于比较的杂交模式在不同阵列上产生，其中偏差指示了特定基因在待比较的受试者中的差异表达。
[0450] 用于比较杂交分析的测试可核酸得自(a)来自相同物种的不同有机体的细胞(如得自不同人的细胞)；(b)得自相同有机体但不同组织类型的细胞，包括正常组织或疾病组织、胚胎组织或成人组织；(c)在细胞周期中不同点的细胞；(d)用或不用外源或内源刺激物处理的细胞。由此，使用本发明阵列的比较杂交分析可用于在多种宽泛的情形下监测基因表达。可将所述分析延伸为检测疾病组织和正常组织之间、不同类型的组织和细胞之间、不同细胞周期点的细胞之间或不同发育阶段的细胞之间以及接受各种环境刺激物或先导药物的细胞之间的基因的差异表达。因此，本发明的检测表达方法可用于多种宽泛的状况，包括检测疾病、对至少两种样品间的差异基因表达进行鉴定和定量、将差异表达的基因与特定染色体位置连接，和/或筛选上调或下调特定基因的表达或改变具体基因的表达模式的组分。
[0451] 本申请描述的扩增和任何其他杂交测定可用于检测来自怀疑含有靶标的任何来源的任何靶标核酸。并非旨在对样品的来源或样品制得的方式进行限制。一般而言，测试样品可为生学样品和/或环境样品。生物样品可得自人或其他动物、体液、固体组织样品、组织培养物或从中得到的细胞和其后代，和从任何这些来源制备的组织切片或涂片，或含有核酸的任何其他样品。优选的生物样品为体液，包括但不限于尿、血液、脑脊液、脊髓液、滑膜液、精液、含氨体液(ammoniac fluid)、脑脊液(CSF)和唾液。其他类型的生物样品可包括食物产品和成分如牛奶制品(dairy item)、蔬菜、肉和肉类副产品和废渣。环境样品得自环境物质，包括但不限于土壤、水、污水、化妆、农业和工业样品，以及获自食物和牛奶处理仪器、装置、设备的样品、一次性和非一次性制品。
[0452] 本发明的经标记的多核苷酸也可用于凝胶位移测定(gel shift assay)。这样的测定液也称为电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)、凝胶迁移率变动分析(gel mobility shift assay)、条带移位分析(band shift assay)，或凝胶阻滞分析(gel retardation assay)，为用于研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用的常见技术。该操作可确定蛋白质或蛋白质混合物是否能够与给定的DNA或RNA序列结合，以及有时可指示是否多于一种蛋白质分子涉及在结合复合物中。经标记的寡核苷酸可用于通过以下方式进行凝胶位移测定：进行电泳，随后通过显现荧光标记的发射确定经标记的寡核苷酸在凝胶中迁移的程度。当研究转录起始、DNA复制、DNA修复或RNA加工和成熟时，凝胶位移测定可在体外进行，同时进行DNA酶足迹法(DNase footprinting)、引物延伸和启动子-探针实验。进行凝胶位移测定的方法是已知的。参见例如Garner，M.M.and Revzin，A.(1981)“A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions：application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.”Nucleic Acids Res.9：3047-3060 or Fried，M.and Crothers，D.M.(1981)“Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis”Nucleic Acids Res.，9：6505-6525。
[0453] 本发明的荧光标记的多肽可用于多种宽泛的测定。进行所述测定以辨别特异性蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、有关蛋白质和候选抑制剂或活化剂之间的相互作用。候选抑制剂或活化剂包括但不限于，反义寡核苷酸、双链RNA、核酶、核酶衍生物、抗体、脂质体、小分子、无机或有机化合物。也可进行主题测定以研究酶动力学，用于如药物设计、筛选和/或优化，并且可使用溶液形式的荧光标记的多肽或固体底物上固定的荧光标记的多肽进行。
[0454] 特别有关的为细胞表面受体及其相应配体之间的特异性相互作用。细胞表面受体是锚定在或插入细胞质膜中的分子。它们构成了蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质的一个大家族，其不仅充当质膜的结构性成分，还充当管理各种生物功能的调控元件。在另一方面，特异性蛋白质-蛋白质相互作用涉及细胞表面受体和免疫脂质体或免疫毒素。在另一方面，所述特异性蛋白质-蛋白质相互作用可涉及胞质蛋白(cytosolic protein)、核蛋白(nuclear protein)、伴侣蛋白(chaperon protein)或锚定在其它细胞内膜结构的蛋白质。在另一方面，所述特异性蛋白质-蛋白质相互作用靶标蛋白(如抗原)和所述抗原的特异性抗体之间发生。
[0455] 经标记的多肽和相互作用实体之间的特异性相互作用通过在怀疑发生所述相互作用的条件下将两种实体混合来测定。通常，相互作用在光学装置的辅助下显现。期望时，可将这些实体置于光限制器件内(参见例如美国专利7,267,673和7,170,050)。当检测单个分子时，每个光限制器件仅含有要研究的一种靶标。这可如下实现：将少量靶标稀释在较大体积的溶液中，从而在限制器件的阵列上的沉积导致基本分布，或大量的限制器件具有沉积在其中的单个靶标分子。经标记的多肽和相互作用实体可通过本领域可获得的任何方法固定在光限制器件的内表面上。所述方法包括使用受各种结合部分影响的共价或非共价连接物。结合部分的选择将取决于标记的多肽和/或相互作用实体的性质。固定标记的多肽或蛋白质性探针的一种方式是使用抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白/生物素结合对。
[0456] 在一实施方案中，与本发明化合物反应的多肽包括3至约80个氨基酸。所述多肽的实例包括但不限于，神经肽、细胞因子、毒素和肽酶或蛋白酶底物。荧光标记的神经肽、细胞因子和毒素可用于描绘或显现对各自的肽特异性的受体的分布。作为举例，当用本发明化合物标记时，鬼笔环肽(其为含有环肽结构的毒素)，可用于染色细胞中的F-肌丝。作为另一个实例，当用本发明的荧光基团标记时，α-银环蛇毒素即肽基蛇毒素，可用于检测乙酰胆碱受体。用本发明的荧光基团的肽酶或蛋白酶底物可用于测定肽酶或蛋白酶的活性，以及用于筛选设计为肽酶或蛋白酶抑制剂的药物。例如，包括可被肽酶裂解的肽序列的肽可用第一种荧光基团即荧光供体荧光基团在肽序列的一端标记，所述荧光供体荧光基团选自本发明的荧光基团，用第二荧光基团即荧光受体荧光基团(如本发明的另一种荧光基团或淬灭剂)在肽序列的另一端标记，其中第一种染料和第二种染料形成荧光共振能量转移(FRET)对。通过在由所述肽酶裂解多肽之前或之后检测FRET对的供体荧光基团或受体荧光基团的荧光差异，可评价酶活性的水平。
[0457] 可根据本发明制备的其他多肽缀合物包括以下物质的缀合物：抗体、凝集素、酶、脂蛋白、白蛋白、抗生物素蛋白，抗生物素蛋白链菌素、膜联蛋白(annexin)蛋白A、蛋白G、转铁蛋白、脱辅基转铁蛋白、藻胆蛋白和其他荧光蛋白质、毒素、生长因子、微管蛋白、激素、各种受体和离子通道。
[0458] 在一实施方案中，本发明化合物可与抗体反应。取决于期望的应用所述抗体可为第一抗体或第二抗体。若要检测的抗原以非常小的量存在，为了提供信号放大可使用第二抗体。可标记各种第二抗体同种型。第二抗体同种型的非限制性实例为抗小鼠IgG、抗小鼠IgM、抗兔IgG、抗大鼠IgG、抗大鼠IgM、抗豚鼠IgG、抗鸡IgG、抗仓鼠IgG、抗人IgG、抗人IgM、抗山羊IgG、抗小鼠IgG、抗兔IgG、抗大鼠IgG、抗绵羊IgG、抗山羊IgG、抗小鼠IgG、抗人IgG、抗大鼠IgG、抗小鼠IgG、抗人IgG、抗大鼠IgG、抗山羊IgG和抗兔IgG。
[0459] 可供选择的，Fab片段可用本发明化合物标记。因为所述片段缺乏Fc区，所以它们可优于完整抗体缀合物，这可降低与带有Fc受体的细胞膜的非特异性相互作用且可允许更好的穿透组织。
[0460] 本发明的经标记的第二抗体可用于信号放大试剂盒中，如由Molecular Probes，Inc市售的那些。所述试剂盒可各自提供对第一抗体如小鼠抗体特异性的两种标记的抗体。在一实施方案中，本发明的兔抗小鼠IgG抗体缀合物首先用于结合小鼠衍生的第一抗体。
然后通过加入山羊抗兔IgG抗体的第二缀合物剧烈增强了荧光。
[0461] 在另一实施方案中，本发明化合物可用于标记蛋白A和/或蛋白G。蛋白A和蛋白G是细菌蛋白，其以高亲和力与来自各种物种(如牛、猫、鸡、狗、山羊、豚鼠、马、人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，人IgM、IgA、IgE，人IgD，小鼠IgG1或其它、猪、兔、大鼠或绵羊)的各类或亚类的免疫球蛋白的Fc部分结合，可用于检测免疫球蛋白。可供选择的，免疫球蛋白可用具有式I、II、III、IV或V结构的本发明化合物标记，并在所述标记后保持与其靶标的结合特异性。这些经标记的免疫球蛋白可用于体外或体内检测靶标抗原。在一些实施方案中，标记的免疫球蛋白包括最大吸收波长等于或大于750nm的荧光团。在其它实施方案中标记的免疫球蛋白包括最大吸收波长等于或大于685nm的荧光团。在本发明的各种实施方案中，所述标记的免疫球蛋白与癌细胞上的抗原结合。在一些实施方案中，标记的免疫球蛋白与erb2结合。
[0462] 根据本发明制备的经标记的抗体可为用于各种应用的第一抗体。尽管二级检测方法可提供显著的信号放大，而直接标记的第一抗体通常产生较低的背景荧光和较少的非特异性结合。使用第一抗体还允许相同同种型或得自相同物种的多重第一抗体在被直接标记时用于相同实验中。
[0463] 所述第一抗体的实例包括对报道分子基因产物而言特异性的多克隆抗体。这些包括抗绿荧光蛋白抗体(Anti-Green-Fluorescent Protein Antibodies)、抗谷胱甘肽S-转移酶抗体(Anti-Glutathione S-Transferase Antibody)、抗β-葡糖
醛酸糖苷酶抗体(Anti-beta-Glucuronidase Antibody)、抗β-半乳糖苷酶抗体
(Anti-beta-Galactosidase Antibody)、对附加表位特异性的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies Specific for Epitope Tags)、Penta·His抗体(Penta·His Antibody)、抗HA抗体(Anti-HA Antibody)和抗c-myc抗体(Anti-c-myc Antibody)。
[0464] 也可制备细胞器特异性标记的抗体来标记各种亚细胞细胞器和组分，如内质网、过氧化物酶体、线粒体或细胞色素C。经标记的抗体对氧化磷酸化系统中的蛋白质而言也可为特异性的，如抗细胞色素氧化酶(复合物IV)的抗体或抗复合物I、II、III和V的抗体，或其他线粒体蛋白如抗线粒体膜孔蛋白抗体或抗丙酮酸脱氢酶抗体。
[0465] 在其它实施方案中，可制备对增殖标志和细胞周期控制蛋白而言特异性的经标记的抗体。所述抗体包括抗溴脱氧尿苷抗体(抗BrdU抗体)，其可例如例如用于TUNEL测定中，抗人mRNA结合蛋白HuR抗体(抗HuR抗体)，抗人神经元蛋白HuC/HuD抗体(抗Hu抗体)，抗cdc6肽抗体，抗CD抗的抗体和抗磷酸肌醇抗体。
[0466] 一些经标记的抗体可为结构细胞蛋白特异性的。所述抗体的实例为抗α-微管蛋白单克隆抗体、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、抗结蛋白抗体或抗纤连蛋白抗体。适用于本发明的额外抗体包括对神经元蛋白特异性的抗体，如抗突触蛋白I抗体或抗NMDA受体抗体。可根据本发明标记的其他多克隆和单克隆抗体包括抗人Golgin-97抗体、抗人转铁蛋白受体抗体、抗基质金属蛋白酶的抗体和抗牛血清白蛋白抗体。
[0467] 抗原和抗体之间的特异性相互作用已经在免疫测定的背景下利用主题荧光化合物进行了探究。免疫测定可允许单一分子检测(single-molecule detection)或全体检测(ensemble detection)。可进行主题免疫测定以鉴定生物学实体、就抗体治疗进行筛选和确定靶标抗原的结构构象。例如涉及对所述生物学实体而言特异性或对所述生物学实体产生的副产物而言特异性的抗体的免疫测定已通过形成抗体-实体复合物常规地用于鉴定实体。免疫测定也可用于筛选能够活化或下调具有治疗潜能的靶标抗原的生物活性的抗体。免疫测定也用于通过使用能够区别以不同构象折叠的靶标蛋白的独特型抗体来确定结构构象。
[0468] 根据本发明的一实施方案，用本发明的荧光基团标记的生物分子如蛋白质适用于体内成像，包括但不限于对细胞内部、细胞、组织、器官或整体受试者中存在的生物分子进行成像。期望时，经标记的生物分子可用于进行“细胞内印迹法(In Cell Western)”，其中对细胞内部存在的给定的分子(如特异性细胞蛋白)进行染色和成像。
[0469] 本发明的荧光基团和/或本发明的经标记的生物分子可按适于所选择给药途径的各种形式给予受试者，即口服或肠胃外。在这一方面肠胃外给药包括但不限于，通过以下途径给药：静脉内、肌内、皮下、肠胃外、眼内、滑膜腔内、经上皮，包括透皮、眼部(opthalmic)、舌下给药和含服；局部给药包括眼部、经皮、眼部(ocular)、经由吸入和气雾剂和直肠系统经直肠和经鼻吸入。具体地，用包括mPEG作为水溶性聚合物基团的本发明的荧光基团标记的蛋白质可以是有益的。体内成像可提供用于早期检测、筛查、诊断、图像引导的外科手术(image-guided surgical intervention)和各种疾病的治疗的手段。例如，近红外荧光基团标记的毒素(Veiseh，et al.Cancer Res.67(14)，6882(2007))和抗体(Kulbersh，et al.Arch Otolaryngol Head Neck Surg.133(5)，511(2007)已经用于检测和引导肿瘤的手术摘除。在体内成像时，首先将荧光探针如用荧光基团标记的抗体给予动物(如哺乳动物)。然后对动物如下成像：施加具有适于荧光基团吸收的波长的激发光，然后在适于荧光基团发射的另一波长收集荧光信号。通常，就激发光和发射光的有效组织穿透而言，荧光基团的吸收波长和发射波长可大于470nm、大于550nm、大于600nm或大于640nm。吸收波长和发射波长可小于1,200nm。波长在640nm-1,200nm范围的荧光基团可称为近红外染料，其优选用于组织或体内成像。使用抗体进行体内成像的一个重要挑战是荧光标记的抗体的半衰期相对短。已报道，用多于3个荧光基团分子标记的抗体通过易位到肝中而从体内快速清除，由此它们变成可代谢的(BioProbes 52，10-11，March 2007，by Molecular Probes，Inc)。为了延长标记的抗体的半衰期，以使得足够抗体随时间推移，以用于检测靶标是可获得的，必要的是将每个抗体的荧光基团分子的数目(即，标记程度或DOL)降低至约2。然而，DOL的降低是以个体标记的抗体分子的荧光亮度的消耗为代价的。由此，具有用3个或更多荧光基团分子且具有相对长的体内半衰期的抗体是期望的。
PEG为常用于对可植入医疗装置的表面进行功能化(Balakrishanan，et al.Biomaterials
26(17)，3495(2005))以及对药物进行修饰(Mehvar，et al.Pharm.Pharmaceut.Sci.3，
125(2000)；Wang，et al.J.Biochem.Cell Biology 34，396(2002))的已知生物相容性物质。在实践主题本发明时，蛋白质如抗体可被标记单次或多次，如用多于3、4、5、6个或更多的本发明的染料分子标记，以这种方式标记的抗体在体内可具有相对长的半衰期。具体地，荧光基团中的一个或多个PEG基团可掩蔽所述荧光基团，从而与用常规染料(如Cy5.5、Cy7或Alexa Fluor 750)标记的相同抗体相比，用多分子的荧光基团标记的抗体免疫原性较小。在一些方面，荧光基团上的一个或多个PEG基团可掩蔽或保护抗体自身，使得抗体对蛋白酶的水解更具抵抗性。
[0470] 在本发明的其它实施方案中，提供了对受试者进行体内成像的方法，所述方法包括以下步骤：将生物分子给予有所需要的受试者，所述生物分子包括具有式I、II、III、IV或V结构的标记物，其中对标记物的至少一个反应性部分已进行了将标记物与生物分子相连的反应，其中所述生物分子还包括与受试者细胞上的结合配偶体(其是细胞的指示)结合的靶标部分；将细胞上的结合配偶体与生物分子上的靶标部分结合，由此对所述细胞相对于相邻细胞进行差异性标记；将激发波长指向所述细胞；以及检测从受试者细胞发射的荧光，由此检测差异标记的受试者细胞。所述生物分子可为抗体、抗体片段、蛋白质、肽、脂质或碳水化合物。
[0471] 本发明化合物也可用于产生用于免疫组织化学和免疫细胞化学实验的经标记的生物分子。在免疫组织化学(IHC)中，在组织切片中通过利用抗体与生物组织中存在的抗原特异性结合的原理来确定蛋白质的存在和位置。所述实验例如可用于诊断和治疗癌症。特异性分子标志是具体癌症类型特征性的且为本领域技术人员已知的。IHC也可用于基础研究以确定生物标记在组织的不同部分的分布和定位。使抗体-抗原相互作用显现可通过使抗体与本发明的反应性荧光化合物反应以及利用经标记的抗体对组织切片进行染色来实现。在免疫细胞化学中，经标记的抗体用于对培养的细胞群落进行染色。这些技术可与共焦激光扫描显微镜法结合，所述共焦激光扫描显微镜法是高度敏感的且也可用于显现多种蛋白质之间的相互作用。使用共焦显微镜也可进行蛋白质的亚细胞定位。
[0472] 特别有关的是经标记的多肽用于辅助免疫细胞化学的用途。荧光免疫细胞化学与荧光显微法组合提供了对细胞内生物分子如蛋白质和核酸的显现。一种方法使用与期望的靶标杂交的第一抗体。然后，使用与主题染料缀合且靶向于第一抗体的第二抗体对复合物进行标记。所述复合物通过用于染料的激发光谱匹配的光的波长激发染料来显现。
[0473] 免疫细胞化学也可用于确定给定蛋白质或核酸的亚细胞定位。例如在细胞中生物分子的共定位(colocalization)使用针对各种细胞靶标的不同组抗体进行。例如，一种细胞成分可用小鼠单克隆抗体靶向，另一种组分用兔多克隆抗体靶向。这些称为第一抗体。随后，第二抗体用于显现细胞靶标，第二抗体与所述小鼠抗体或兔抗体结合且与具有不同发射波长的本发明的不同染料缀合。
[0474] 本发明化合物或本发明的经标记的生物分子也可用于标记细胞或粒子以用于各种应用。因此，本发明提供了对细胞群落中的单独细胞进行标记，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞(neighboring cell)被差异性标记的方法。所述方法通常包括使所述细胞与本发明的经标记的生物分子接触，其中所述生物分子包括靶标部分，所述靶标部分与作为细胞指示的结合配偶体结合，由此使所述细胞相对于群落中的相邻细胞被差异性标记。所述靶标部分可为识别要检测的细胞上的结合配偶体的任何生物分子。靶标部分的选择将根据要标记的细胞而变化。例如，就癌细胞而言，选择靶标部分从而结合配偶体在癌细胞上差异表达的。多种癌标志是本领域已知的。它们包括而不限于细胞表面受体如erb2、PDGF受体、VEGF受体、多种细胞内蛋白如磷脂酰肌醇3-激酶c-abl、raf、ras、以及多种核蛋白包括转录因子和其他核酸结合分子。在一些其它实施方案中，所述癌标志是免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1，CD20、EGF受体、FGF受体、NGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、粘蛋白1、粘蛋白16、内皮糖蛋白(Endoglin)、Mesothelin受体、Nogo受体、叶酸盐受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3和α或β整联蛋白。为了差异性标记各种细胞类型，可使用识别细胞特异性结合配偶体的靶标部分。例如，与B细胞或其他不同谱系细胞相反，在T细胞上存在多种差异表达的蛋白质标志。神经元标志、肌细胞标志，以及指示外胚层、中胚层和内胚层起源的细胞的标志也是本领域已知的，这些标志将根据预期的应用而使用。靶标部分可为抗体、受体、细胞因子、生长因子和可被要标记的细胞上的结合配偶体识别的任何其他部分或它们的组合。所标记的细胞可在细胞内标记。
[0475] 差异性标记的细胞可如下成像：将激发波长指向所述细胞；以及检测从于多个体外格式的细胞发射的荧光，所述细胞以溶液形式存在或固定在底物上。
[0476] 经标记的细胞和/或荧光的强度可通过进行流式细胞术来检测或定量。用本发明化合物标记或用本发明的经标记的生物分子染色的细胞或粒子也可使用荧光激活细胞分选术(FACS)基于标记物的具体特性来分离和隔离。所述技术是本领域已知的。简而言之，用主题染料标记细胞，然后通过窄的滴液喷嘴(dropping nozzle)于悬浮的培养基流动经过，从而每个孔通常在一个小滴中。基于激光的检测器系统用于激发荧光，且带有正性荧光细胞的液滴被赋予了电荷。带电和不带电的液滴在当它们落入带电板之间时得到分离，并收集在不同的管中。所述机器可用作分析工具，对群落中经标记的细胞的数目进行计数或分离细胞，以用于选定群落的随后生长。通过利用第二激光系统，可将进一步的精致化引入到该系统中，所述第二激光系统与第一系统呈适当的角度以观察第二荧光标记或基于光散射计量细胞大小。
[0477] 进行荧光细胞分选的额外指导可参见诸如以下的出版物：Darzynkiewicz，Z.，Crissman，H.A.and Robinson，J.P.，Eds.，Cytometry，Third Edition Parts A and B(Methods in Cell Biology，Volumes 63 and 64)，Academic Press(2001)；Davey，H.M.and Kell，D.B.，“Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations：the importance of single-cell analyses，”Microbiological Rev 60，641-696(1996)；Givan，A.L.，Flow Cytometry：First Principles，Second Edition，John Wiley and Sons(2001)；Herzenberg，L.A.，Parks，D.，Sahaf，B.，Perez，O.，Roederer，M.and Herzenberg，L.A.，“The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry：a view from Stanford，”Clin Chem
48，1819-1827(2002)；Jaroszeski，M.J.and Heller，R.，Eds.，Flow Cytometry Protocols(Methods in Molecular Biology，Volume 91)，Humana Press(1997)；Ormerod，M.G.，Ed.，Flow Cytometry：A Practical Approach，Third Edition，Oxford University Press(2000)；Robinson，J.P.，Ed.，Current Protocols in Cytometry，John Wiley and Sons(1997)；Shapiro，H.M.，“Optical measurement in cytometry：light scattering，extinction，absorption and fluorescence，”Meth Cell Biol 63，107-129(2001)；
Shapiro，H.M.，Practical Flow Cytometry，Fourth Edition，Wiley-Liss(2003)；Weaver，J.L.，“Introduction to flow cytometry，”Methods 21，199-201(2000)。
[0478] 本发明的荧光化合物也可用于荧光寿命成像(FLIM)。FLIM是一种有用的技术，基于荧光样品特征性的荧光衰变中的变化来产生图像。其可用作共焦显微镜和其他显微镜系统中的成像技术。在FLIM中利用荧光团信号的寿命，而不是其强度，创建图像，所述FLIM具有使厚层的样品中光子散射的影响最小化的优点。FLIM可用于生物医学组织成像，允许探测比常规荧光显微法更大的组织深度。
[0479] 本发明化合物可用于单一分子应用。通过观测荧光基团的单独分子除去总体均值可允许确定生物学和化学过程的机理。所述过程可包括运动蛋白(protein motor)如驱动蛋白或肌球蛋白的易位，细胞蛋白复合物的形成、溶解和易位和DNA或RNA聚合酶的作用机理。在所述实验中，可使用本发明化合物来标记与表面如显微镜载玻片或流式小室连接的生物分子。随后可使用全反射荧光显微法观测单独的荧光团。
[0480] 本发明化合物也可用于标记脂质。脂质涉及在许多生物过程中，对脂质和脂筏(lipid raft)进行标记通常可以是研究它们特性的有价值方法。各种脂质单层和双层可在活细胞或人造系统如脂质体和微团中标记。例如，活细胞群落可用荧光缀合物标记，所述荧光缀合物通过使荧光缀合物与霍乱毒素亚基B反应来制备，所述霍乱毒素亚基B与脂筏发生特异性相互作用。然后所述脂筏可通过使用抗霍乱毒素抗体交联到不同膜片中，所述抗霍乱毒素抗体可用一种本发明化合物标记。
[0481] 本发明的经标记的多肽可用作原核和真核细胞中的生物传感器，如用作钙离子指示剂、用作pH指示剂、用作磷酸化指示剂、用作其他离子(包括而不限于镁离子、钠离子、钾离子、氯离子和卤离子)的指示剂。例如，就检测钙离子而言，已知含有EF手基序的蛋白质当与钙离子结合时从胞质溶胶易位至细胞膜。这些蛋白质含有通过与蛋白质的其他区域疏水相互作用包埋在分子内的肉豆蔻酰基。钙离子的结合包括使肉豆蔻酰基暴露的构象变化，然后肉豆蔻酰基可插入脂质双层中。用主题染料标记所述含EF手的蛋白质使其通过监测钙离子从胞质溶胶易位至细胞膜而成为细胞内钙离子浓度的指示剂。这种监测可使用光学检测器如共焦显微镜进行。适用于该系统的EF手蛋白包括但不限于：恢复蛋白(1-3)、钙依赖磷酸酶B(calcineurin B)、肌钙蛋白C、视椎蛋白、神经钙蛋白、钙调蛋白、小白蛋白(parvalbumin)等。
[0482] 就用作pH指示剂而言，可采用基于富组亲动蛋白(hisactophilin)的系统。富组亲动蛋白是已知存在于网柄菌属(Dictyostelium)中的富含肉豆蔻酰化的组氨酸的蛋白质。它们与肌动蛋白或酸性脂质的结合在细胞质pH变化范围内是严重pH依赖性的。在活细胞膜中，结合似乎超越了富组亲动蛋白与肌丝(actin filament)的相互作用。在pH约6.5时，它们通常定位至质膜和细胞核。相反，在pH为7.5时，它们均衡地分布在整个细胞质空间中。这种分布的变化是可逆的，并且是由于暴露在分子表面的环中的组氨酸簇所导致的。在细胞质pH变化范围内细胞内分布的可逆是与pK为6.5的组氨酸残基一致的。细胞内分布不依赖于蛋白质的肉豆蔻酰化。通过将主题染料与富组亲动蛋白缀合，经标记的富组亲动蛋白的细胞内分布可通过激光扫描、共焦显微镜法或标准荧光显微法跟踪。定量荧光分析可通过进行穿过细胞的行扫描(激光扫描共焦显微镜)或其他电子数据分析(如使用MetaMorph软件(Universal Imaging Corp)并且对细胞群落中收集的数据进行平均来完成。
[0483] 主题荧光蛋白质也可用于涉及通过使用显微镜成像和电子分析的自动化筛选细胞的阵列的应用中。筛选可用于药物开发和功能性基因组学领域：例如其中主题蛋白质用作全细胞的标志以检测多细胞重组和迁移的变化，如由内皮细胞形成多细胞小管(血管形成)、细胞通过Fluoroblok Insert System(Becton Dickinson Co.)的迁移、创伤愈合、神经突向往生长(neurite outgrowth)；其中所述蛋白质用作与肽(如靶标序列)和蛋白质融合的标志，这允许检测作为细胞活性指示剂的细胞内定位的变化，例如：信号转导，如当有刺激物激酶和转录因子易位，如蛋白激酶C、蛋白激酶A、转录因子NFkB和NFAT；细胞周期蛋白，如细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白E；蛋白酶裂解，裂解的底物的随后移动、磷脂，细胞内结构如内质网、高尔基体、线粒体、过氧化物酶体、细胞核、核仁(nucleoli)、质膜、组蛋白、内体(endosome)、溶酶体、微管、肌动蛋白的标志。
[0484] 主题荧光蛋白质也可用于高通量筛选测定。主题荧光蛋白质通常比缺乏主题染的蛋白质更稳定。在一些方面，荧光蛋白质可显示超过1小时、2小时、5小时或24小时或更长的血清半衰期。
[0485] 主题荧光蛋白质可用作第二信使检测器，如通过将主题染料与特异性信号转导结构域缀合，所述结构域如钙结合SH2-、SH3-、PH-、PDZ-结构域等。
[0486] 以下实施例是出于阐述本发明的实践的目的。不应该将它们解释为对本发明的范围或权利要求的限制。
[0487] 实施例
[0488] 实施例1：2-(苯胺基乙烯基)-1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-磺基吲哚鎓，钾盐(化合物1)的制备
[0489]
[0490] 化合物1
[0491] 将1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钾盐(Bioconjugate Chem.4，105(1993))(5g)、N，N′-二苯基甲脒(2.3g)和乙酸酐(1.1mL)的混合物在120℃加热30分钟。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化(3.5g)。
[0492] 实施例2：2-(4-苯胺基丁二烯基)-1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-磺基吲哚鎓，钾盐(化合物2)的制备
[0493]
[0494] 化合物2
[0495] 将1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钾盐(10g)、丙二醛缩二苯胺盐酸盐(malonaldehyde dianil hydrochloride)(8g)、Et3N(0.356mL)于AcOH(40mL)中的混合物在120℃加热3小时。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化得到深棕色胶状固体(5g)。
[0496] 实施例3：化合物3a和3b的制备
[0497]
[0498] 化合物3a R＝(CH2CH2O)24CH3
[0499] 化合物3b R＝(CH2CH2O)12CH3
[0500] 向1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钾盐(0.1g)于DMF(1mL)中的溶液中加入Et3N(0.1mL)和TSTU(80mg)。将混合物在室温搅拌1小时，接着加入
Et3N(40μL)和m-dPEG24胺(0.4g)(QuantaBiodesign，Powell，OH)或m-dPEG12胺(0.2g)(QuantaBiodesign，Powell，OH)。将混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩至干。残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到淡棕色固体(250mg化合物3a和102mg化合物3b)。
[0501] 实施例4：化合物4的制备
[0502]
[0503] 化合物4
[0504] 将化合物3a(40mg)、化合物1(30mg)、乙酸酐(15μL)和Et3N(45μL)于DMF(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将深红色溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到深红色固体(40mg)。
[0505] 实施例5：化合物5的制备
[0506]
[0507] 化合物5
[0508] 将化合物4(15mg)、Et3N(3.5μL)和TSTU(3mg)于DMF(0.2mL)中的混合物在室温搅拌1小时。加入Et2O(5mL)，经离心分离收集沉淀(19mg)。
[0509] 实施例6：化合物6的制备
[0510]
[0511] 化合物6
[0512] 将化合物3a(30mg)、化合物2(20mg)、乙酸酐(10μL)和Et3N(30μL)于DMF(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将深蓝色溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到深蓝色固体(20mg)。
[0513] 实施例7：化合物7的制备
[0514]
[0515] 化合物7
[0516] 向化合物6(13mg)于DMF(0.2mL)中的溶液中加入Et3N(3μL)和TSTU(2.5mg)，然后将混合物在室温搅拌1小时。加入Et2O(2mL)，经离心分离收集沉淀(23mg)。
[0517] 实施例8：化合物8的制备
[0518]
[0519] 化合物8
[0520] 化合物8(60mg)根据化合物6的制备从化合物2(35mg)和化合物3b(50mg)合成。
[0521] 实施例9：化合物9的制备
[0522]
[0523] 化合物9
[0524] 化合物9(10mg)根据化合物7的制备从化合物8(14mg)合成。
[0525] 实施例10：化合物10的制备
[0526]
[0527] 化合物10
[0528] 化合物10(75mg)根据化合物3的合成从1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钾和mPEG-NH2(Mwt～2,000)(Laysan Bio.Arab，AL)制备。
[0529] 实施例11：化合物11的制备
[0530]
[0531] 化合物11
[0532] 化合物11(15mg)根据化合物6的合成从化合物10(20mg)和化合物2(6mg)制备。
[0533] 实施例12：化合物12的制备
[0534]
[0535] 化合物12
[0536] 化合物12(3mg)根据化合物7的合成从化合物11(4mg)制备。
[0537] 实施例13：化合物13的制备
[0538]
[0539] 化合物13
[0540] 将对肼基苯磺酸(5g)、7-甲基-8-氧代壬酸甲酯(6g)(美国专利2006/0121503 A1)于乙酸(20mL)中的混合物温和回流3小时。冷却至室温后，将混合物浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到红棕色固体(3g)。将固体与NaOAc(1当量)的MeOH(100mL)溶液混合，将得到的溶液在室温搅拌30分钟。将溶液真空浓缩至干，得到红棕色固体(3g)。
[0541] 实施例14：化合物14的制备
[0542]
[0543] 化合物14
[0544] 将化合物13(0.86g)和1，3-propanesulftone(0.83g)的混合物在120℃加热3小时。加入EtOAc(50mL)，然后将混悬液温和回流2小时。冷却至室温后，经抽滤收集沉淀(1g)。
[0545] 实施例15：化合物15的制备
[0546]
[0547] 化合物15
[0548] 将化合物14(0.8g)、丙二醛缩二苯胺盐酸盐(0.52g)、Et3N(23μL)于AcOH(3mL)中的混合物在120℃加热3小时。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化得到深红色胶状固体(0.5g)。
[0549] 实施例16：化合物16的制备
[0550]
[0551] 化合物16
[0552] 化合物16(80mg)根据化合物6的合成从化合物15(50mg)和化合物3a(120mg)制备。
[0553] 实施例17：化合物17的制备
[0554]
[0555] 化合物17
[0556] 向化合物16(50mg)于H2O(2mL)中的溶液中加入1M NaOH(120μL)。将溶液在室温搅拌1小时，然后经LH-20柱纯化(35mg)。
[0557] 实施例18：化合物18的制备
[0558]
[0559] 化合物18
[0560] 化合物18(5mg)根据化合物7的合成从化合物17(4mg)制备。
[0561] 实施例19：化合物19的制备
[0562]
[0563] 化合物19
[0564] 将化合物13(0.6g)和6-溴己酸(0.63g)的混合物在140℃加热1小时。加入EtOAc(30mL)，将混悬液温和回流1小时，然后经抽滤收集沉淀(0.45g)。
[0565] 实施例20：化合物20的制备
[0566]
[0567] 化合物20
[0568] 将化合物19(84mg)、化合物2(52mg)、乙酸酐(32μL)和Et3N(0.1mL)于DMF(2mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到深蓝色固体(20mg)。
[0569] 实施例21：化合物21的制备
[0570]
[0571] 化合物21
[0572] 化合物21(17mg)根据化合物3的合成从化合物20(9mg)和m-dPEG24胺(27mg)制备。
[0573] 实施例22：化合物22的制备
[0574]
[0575] 化合物22
[0576] 向化合物21(17mg)于H2O(0.5mL)中的溶液中加入1M NaOH(0.1mL)，然后将溶液在室温搅拌30分钟。将溶液用1N HCl(0.1mL)酸化，然后经LH-20柱纯化，冻干后得到深蓝色固体(10mg)。
[0577] 实施例23：化合物23的制备
[0578]
[0579] 化合物23
[0580] 化合物23(4mg)根据化合物7的合成从化合物22(6mg)制备。
[0581] 实施例24：化合物24a和24b的制备
[0582]
[0583] 化合物24a：R＝-(CH2CH2O)10CH2CH2-
[0584] 化合物24b：R＝-(CH2CH2O)23CH2CH2-
[0585] 在0℃向十一烷二醇甲基醚(1g)(Polypure AS，Oslo，Norway)或m-dPEG24醇(1g)(QuantaBiodesign，Powell，OH)于CH2Cl2(5mL)和吡啶(5mL)中的溶液中分批加入p-TsCl(1.1当量)。将混合物在0℃搅拌2小时，然后在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，残余物经硅胶柱色谱纯化，得到无色油状物(1.25g化合物24a和1.10g化合物24b)。
[0586] 实施例25：化合物25a和25b的制备
[0587] H3CO-R-OCH2CH2I
[0588] 化合物25a：R＝-(CH2CH2O)10CH2CH2-
[0589] 化合物25b：R＝-(CH2CH2O)23CH2CH2-
[0590] 将化合物24a(1.2g)或化合物24b(1.1g)和NaI(1.1当量)于丙酮(10mL)中的混合物温和回流过夜。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到无色固体(1.1g化合物25a和1g化合物25b)。
[0591] 实施例26：化合物26的制备
[0592]
[0593] 化合物26
[0594] 将乙醇钠(0.13g)和2-甲基乙酰乙酸乙酯(0.28g)于无水EtOH(5mL)中的混合物在室温搅拌1小时，接着加入化合物25a(0.8g)。将混合物温和回流过夜，然后将溶液真空浓缩至干。残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到灰白色油状物(0.75g)。
[0595] 实施例27：化合物27的制备
[0596]
[0597] 化合物27
[0598] 向化合物26(0.7g)于MeOH(10mL)中的溶液中加入NaOH(0.21g)于H2O(2mL)中的溶液。将混合物在60℃加热过夜。冷却至室温后，将溶液用6M HCl(1mL)中和。将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到无色油状物(0.55g)。
[0599] 实施例28：化合物28的制备
[0600]
[0601] 化合物28
[0602] 将对肼基苯磺酸(100mg)和化合物27(300mg)于乙酸(5mL)中的混合物加热至回流并过夜。冷却至室温后，将混合物浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化得到浅棕色固体(270mg)。将固体与NaOAc(1当量)的MeOH(10mL)溶液混合。将得到的溶液在室温搅拌30分钟。将溶液真空浓缩至干，得到红棕色固体(280mg)。
[0603] 实施例29：化合物29的制备
[0604]
[0605] 化合物29
[0606] 将化合物28(200mg)和大量过量的碘乙烷(10mL)的混合物加热至沸腾并过夜。加入EtOAc(20mL)，然后将混悬液温和回流1小时。冷却至室温后，经抽滤收集沉淀(250mg)。
[0607] 实施例30：化合物30的制备
[0608]
[0609] 化合物30
[0610] 化合物30(55mg)根据化合物6的合成从化合物29(100mg)和化合物2(65mg)制备。
[0611] 实施例31：化合物31的制备
[0612]
[0613] 化合物31
[0614] 化合物31(120mg)根据化合物19的合成从化合物30(200mg)和6-溴己酸(1g)制备。
[0615] 实施例32：化合物32的制备
[0616]
[0617] 化合物32
[0618] 化合物32(75mg)从根据化合物2的合成化合物31(100mg)制备。
[0619] 实施例33：化合物33的制备
[0620]
[0621] 化合物33
[0622] 化合物33(7mg)根据化合物6的合成从化合物32(30mg)和化合物3a(45mg)制备。
[0623] 实施例34：化合物34的制备
[0624]
[0625] 化合物34
[0626] 化合物34(3mg)根据化合物7的合成从化合物33(5mg)制备。
[0627] 实施例35：化合物35的制备
[0628]
[0629] 化合物35
[0630] 化合物35(7mg)根据化合物6的合成从化合物32(30mg)和化合物29(23mg)制备。
[0631] 实施例36：化合物36a和36b的制备
[0632]
[0633] 化合物36b
[0634] 化合物36a(110mg)和化合物36b(100mg)根据化合物19的合成各自如下制备：分别用化合物25a(600mg)和化合物25b(400mg)对2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钠盐(1当量)进行季铵化。
[0635] 实施例37：化合物37的制备
[0636]
[0637] 化合物37
[0638] 化合物37(11mg)根据化合物6的合成从化合物36a(25mg)和化合物32(40mg)制备。
[0639] 实施例38：化合物38的制备
[0640]
[0641] 化合物38
[0642] 化合物38(36mg)根据化合物19的制备从化合物13(15mg)和化合物25b(50mg)合成。
[0643] 实施例39：化合物39的制备
[0644]
[0645] 化合物39
[0646] 化合物39(70mg)根据化合物2的制备从化合物36b(100mg)合成。
[0647] 实施例40：化合物40的制备
[0648]
[0649] 化合物40
[0650] 化合物40(38mg)根据化合物6的制备从化合物38(30mg)和化合物39(32mg)合成。
[0651] 实施例41：化合物41的制备
[0652]
[0653] 化合物41
[0654] 根据化合物22的合成对化合物40(20mg)进行水解，得到游离酸形式(14mg)。然后根据化合物23的制备将染料的游离酸形式转化为化合物41(10mg)。
[0655] 实施例42：化合物42的制备
[0656]
[0657] 化合物42
[0658] 化合物42(0.19mg)根据化合物3b的合成从1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(0.1g)和m-dPEG24胺(0.3g)合成。
[0659] 实施例43：化合物43的制备
[0660]
[0661] 化合物43
[0662] 化合物43(0.5g)根据化合物2的制备从1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(1g)和丙二醛缩二苯胺盐酸盐(0.85g)合成。
[0663] 实施例44：化合物44的制备
[0664]
[0665] 化合物44
[0666] 化合物44(25mg)根据化合物6的合成从化合物42(40mg)和化合物43(15mg)制备。
[0667] 实施例45：化合物45的制备
[0668]
[0669] 化合物45
[0670] 化合物45(20mg)根据化合物7的合成从化合物44(25mg)制备。
[0671] 实施例46：的制备化合物46
[0672]
[0673] 化合物46
[0674] 在0℃向氢化钠(300mg)于DMF中的溶液中一次性加入5，6-二氯-2-甲基苯并咪唑(500mg)。将混合物在0℃搅拌15分钟，接着加入6-溴己酸乙酯(0.66mL)。将混合物在0℃再搅拌15分钟，然后在室温搅拌1小时。将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到浅棕色固体(0.75g)。
[0675] 实施例47：化合物47的制备
[0676]
[0677] 化合物47
[0678] 将化合物46(170mg)和6-溴己酸(200mg)的混合物在140℃加热1小时。加入EtOAc(20mL)，然后将混悬液温和回流30分钟。冷却至室温后，经抽滤收集沉淀(260mg)。
[0679] 实施例48：化合物48的制备
[0680]
[0681] 化合物48
[0682] 化合物48(55mg)根据化合物3a的合成从化合物47(0.1g)和m-dPEG24胺(200mg)合成。
[0683] 实施例49：化合物49的制备
[0684]
[0685] 化合物49
[0686] 化合物49(700mg)根据化合物14的合成从2-甲基-6-叔丁基苯并噁唑(540mg)和1，3-propanesulftone(450mg)制备。
[0687] 实施例50：化合物50的制备
[0688]
[0689] 化合物50
[0690] 化合物50(270mg)根据化合物1的合成从化合物49(460mg)和N，N’-二苯基甲脒(340mg)制备。
[0691] 实施例51：化合物51a的制备
[0692]
[0693] 化合物51
[0694] 根据化合物4的合成使化合物48(30mg)和化合物50(10mg)偶联，得到花青染料乙酯中间体(16mg)。根据化合物22的合成使用1M NaOH水解生成的中间体，得到游离酸染料化合物51(10mg)。
[0695] 实施例52：化合物52的制备
[0696]
[0697] 化合物52
[0698] 化合物52(7mg)根据化合物5的合成从化合物51(8mg)制备。
[0699] 实施例53：化合物53的制备
[0700]
[0701] 化合物53
[0702] 化合物53(18g)根据化合物49的合成从2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸钠盐(11g)(Bioconjugate Chem.4，105(1993))制备。
[0703] 实施例54：化合物54的制备
[0704]
[0705] 化合物54
[0706] 化合物54(2.4g)根据化合物1的合成从化合物53(5.7g)制备。
[0707] 实施例55：化合物55的制备
[0708]
[0709] 化合物55
[0710] 根据化合物4的合成使化合物54(19mg)和化合物48(33mg)偶联，得到花青染料乙酯中间体(25mg)。根据化合物22的合成使用1M NaOH水解中间体，得到化合物55(17mg)。
[0711] 实施例56：化合物56的制备
[0712]
[0713] 化合物56
[0714] 化合物56(6mg)根据化合物5的合成从化合物55(10mg)制备。
[0715] 实施例57：化合物57的制备
[0716]
[0717] 化合物57
[0718] 化合物57(55mg)根据化合物3a的合成从化合物19(80mg)和m-dPEG24胺(100mg)合成。
[0719] 实施例58：化合物58的制备
[0720]
[0721] 化合物58
[0722] 化合物58(8mg)根据化合物4的合成从化合物57(20mg)和化合物50(10mg)制备。
[0723] 实施例59：2-(6-苯胺基己三烯基)-1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-磺基吲哚鎓内盐(化合物59)的制备
[0724]
[0725] 化合物59
[0726] 化合物59(4g)根据化合物2的合成从制备1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓-5-磺酸盐内盐(12g)和戊二醛缩二苯胺盐酸盐(18g)。
[0727] 实施例60：化合物60的制备
[0728]
[0729] 化合物60
[0730] 化合物60(15mg)根据化合物6的合成从化合物59(50mg)和化合物3a(50mg)制备。
[0731] 实施例61：化合物61的制备
[0732]
[0733] 化合物61
[0734] 化合物61(6mg)根据化合物7的合成从化合物60(10mg)制备。
[0735] 实施例62：化合物62的制备
[0736]
[0737] 化合物62
[0738] 化合物62(5.37g)根据化合物13的合成从6-肼基萘1，3-二磺酸盐(5.3g)(Bioconjugate Chem.7，356(1996))和7-甲基-8-氧代壬酸甲酯(3.8g)制备。
[0739] 实施例63：化合物63的制备
[0740]
[0741] 化合物63
[0742] 化 合 物 63(15g) 根 据 化 合 物 14的 合 成 从 化 合 物 62(5.37g)、1，3-propanesulftone(6g)制备。
[0743] 实施例64：化合物64的制备
[0744]
[0745] 化合物64
[0746] 化合物64(1.5g)根据化合物2的合成从化合物63(7g)制备。
[0747] 实施例65：化合物65的制备
[0748]
[0749] 化合物65
[0750] 化合物65(17mg)根据化合物6的合成从化合物64(60mg)和化合物3a(100mg)制备。
[0751] 实施例66：化合物66的制备
[0752]
[0753] 化合物66
[0754] 化合物66(6mg)根据化合物17的合成从化合物72(15mg)制备。
[0755] 实施例67：化合物67的制备
[0756]
[0757] 化合物67
[0758] 化合物67(3mg)根据化合物7的合成从化合物66(5mg)制备。
[0759] 实施例68：化合物68的制备
[0760]
[0761] 化合物68
[0762] 使用填充有 分子筛的迪安-斯达克分水器(Dean-Stark trap)将化合物31(86mg)、化合物36a(76mg)和方形酸(squaric acid)(12mg)于1-丁醇∶甲苯(10mL，
1∶1)中的混合物加热至回流并过夜。冷却至室温后，将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到深蓝色固体(8mg)。
[0763] 实施例69：化合物69的制备
[0764]
[0765] 化合物69
[0766] 化合物69(60mg)根据化合物1的合成从化合物31(100mg)制备。
[0767] 实施例70：化合物70的制备
[0768]
[0769] 化合物70
[0770] 化合物70(50mg)根据化合物1的合成从化合物36a(100mg)制备。
[0771] 实施例71：化合物71的制备
[0772]
[0773] 化合物71
[0774] 将化合物69(40mg)、化合物70(36mg)、3-吡咯烷子基-1-环戊烯(6mg)，乙酸酐(12μL)和Et3N(30μL)于DMF(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到绿色固体(10mg)。
[0775] 实施例72：化合物72的制备
[0776]
[0777] 化合物72
[0778] 将化合物31(45mg)、化合物36a(40mg)、2-氯-3-(苯胺基亚甲基)-1-(苯铵甲基)环己-1-烯(17mg)、乙酸酐(16μL)和Et3N(38μL)于DMF(1mL)中的混合物在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到绿色固体(9mg)。
[0779] 实施例73：化合物73的制备
[0780]
[0781] 化合物73
[0782] 向Boc-Glu(OBut)-OH(30mg)(Advanced ChemTech，Louisville，KY)于DMF(1mL)中的溶液中加入Et3N(42μL)和TSTU(30mg)。将混合物在室温搅拌3小时，接着加入m-dPEG24胺(100mg)。将混合物保持在室温搅拌过夜，然后真空浓缩至干。残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到化合物73，其为无色油状物(70mg)。
[0783] 实施例74：化合物74的制备
[0784]
[0785] 化合物74
[0786] 在0℃向化合物73(68mg)于CH2Cl2(1mL)中的溶液中加入TFA(1mL).将混合物在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，得到无色油状物(68mg)。
[0787] 实施例75：化合物75的制备
[0788]
[0789] 化合物75
[0790] 在室温向5-(和-6)-羧基若丹明110琥珀酰亚胺基酯(14mg)(Biotium，Hayward，CA)于DMF(500μL)中的混悬液中加入Et3N(50μL)和化合物74(34mg)。将混合物在室温搅拌过夜，然后真空浓缩至干。残余物经LH-20柱纯化(24mg)。
[0791] 实施例76：化合物76的制备
[0792]
[0793] 化合物76
[0794] 在0℃向化合物75(24mg)于DMF(500μL)中的溶液中加入Et3N(10μL)和TSTU(4.5mg)。将混合物在0℃搅拌1小时，接着加入Et3N(5μL)和6-氨基-1-己酸(4mg)于H2O(100μL)中的溶液。将混合物在室温搅拌过夜，然后真空浓缩至干。残余物经LH-20柱纯化，得到黄色固体(10mg)。
[0795] 实施例77：化合物77的制备
[0796]
[0797] 化合物77
[0798] 在0℃向化合物76(10mg)于DMF(500μL)中的溶液中加入Et3N(3μL)和TSTU(2mg)。将混合物在0℃搅拌1小时，然后加入Et2O(3mL)。经离心分离收集沉淀(5mg)。
[0799] 实施例78：化合物78的制备
[0800]
[0801] 化合物78
[0802] 向7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺基酯(20mg，根据美国专利4956480制备)于DMF(500μL)中的溶液中加入Et3N(50μL)和化合物74(34mg)。将混合物在室温搅拌2小时，然后真空浓缩至干。残余物经LH-20柱纯化(30mg)。
[0803] 实施例79：化合物79的制备
[0804]
[0805] 化合物79
[0806] 化合物79(10mg)根据化合物76的合成从化合物78(15mg)制备。
[0807] 实施例80：化合物80的制备
[0808]
[0809] 化合物80
[0810] 化合物80(7mg)根据化合物77的合成7从化合物79(10mg)制备。
[0811] 实施例81：化合物81的制备
[0812]
[0813] 化合物81
[0814] 化合物81(12mg)根据化合物75的合成从1，3，6-三磺基-8-芘基氧基乙酰叠氮钠盐(15mg，美国专利5132432)和化合物74(15mg)制备。
[0815] 实施例82：化合物82的制备
[0816]
[0817] 化合物82
[0818] 化合物82(6mg)根据化合物76的合成从化合物81(14mg)制备。
[0819] 实施例83：化合物83的制备
[0820]
[0821] 化合物83
[0822] 化合物83(5mg)根据化合物77的合成从化合物82(5mg)制备。
[0823] 实施例84：化合物84的制备
[0824]
[0825] 化合物84
[0826] 将化合物72(8mg)和苯酚钠(10mg)的混合物在70℃加热过夜，然后真空浓缩至干。残余物经LH-20柱纯化(3mg)。
[0827] 实施例85：化合物85的制备
[0828]
[0829] 化合物85
[0830] 向化合物7(5mg)于DMF(200μL)中的溶液中加入Et3N(5μL)和N-(5-氨基戊基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(4mg，Biotium)。将混合物在室温搅拌1小时，然后真空浓缩至干。残余物通过硅胶柱色谱纯化(2mg)。
[0831] 实施例86：化合物86的制备
[0832]
[0833] 化合物86
[0834] 向化合物7(5mg)于DMF(200μL)中的溶液中加入无水肼(10μL)。将混合物在室温搅拌2小时，然后用1N HCl酸化。将溶液真空浓缩至干，残余物经LH-20柱纯化(3mg)。
[0835] 实施例87：化合物87的制备
[0836]
[0837] 化合物87
[0838] 化合物87(5mg)根据化合物85的合成从化合物7(10mg)和单t-BOC-尸胺(2当量)制备。
[0839] 实施例88：化合物88的制备
[0840]
[0841] 化合物88
[0842] 在5℃向化合物87(4mg)于CH2Cl2(500μL)中的溶液中加入TFA(250μL)。将混合物在5℃搅拌30分钟，然后真空浓缩至干。残余物经LH-20柱纯化，得到深蓝色固体(1.5mg)。
[0843] 实施例89：化合物89的制备
[0844]
[0845] 化合物89
[0846] 将化合物24a(1g)、6-氨基己酸甲酯(0.32g)和二异丙基乙基胺(0.61mL)于CH3CN(5mL)中的混合物温和回流过夜。冷却至室温后，将溶液真空浓缩至干。残余物经硅胶柱纯化，得到浅黄色油状物(0.4g)。
[0847] 实施例90：化合物90的制备
[0848]
[0849] 化合物90
[0850] 向7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺基酯(17mg)的溶液中加入Et3N(50μL)和化合物89(60mg)于DMF(0.5mL)中的溶液。将混合物在室温搅拌30分钟，然后真空浓缩至干。残余物经硅胶柱纯化(46mg)。
[0851] 实施例91：化合物91的制备
[0852]
[0853] 化合物91
[0854] 向化合物90(40mg)于H2O(0.5mL)中的溶液中加入1M NaOH溶液(0.15mL)。将混合物在室温搅拌1hr，然后用1M HCl(0.15mL)酸化。水溶液经LH-20柱纯化(35mg)。
[0855] 实施例92：化合物92的制备
[0856]
[0857] 化合物92
[0858] 化合物92(30mg)根据化合物80的合成从化合物91(34mg)制备。
[0859] 实施例93：化合物93的制备
[0860]
[0861] 化合物93
[0862] 化合物93(40mg)根据化合物90的合成从7-氨基-4-甲基-6-磺基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺基酯(16mg)(Bioorg.& Med.Chem.Letters，9，2229(1999))制备。
[0863] 实施例94：化合物94的制备
[0864]
[0865] 化合物94
[0866] 化合物94(20mg)根据化合物91的合成从化合物93(35mg)制备。
[0867] 实施例95：化合物95的制备
[0868]
[0869] 化合物95
[0870] 化合物95(15mg)根据化合物80的合成从化合物94(17mg)制备。
[0871] 实施例96：化合物96的制备
[0872]
[0873] 化合物96
[0874] 向5-(和-6)-羧基若丹明110琥珀酰亚胺基酯(CR110 SE)(60mg)(Biotium，Hayward，CA)和Et3N(90μL)于DMF(500μL)中的化合物中加入化合物89(68mg)。将混合物在室温搅拌2天，然后真空浓缩至干。将残余物再溶于H2O(500μL)中，然后加入1N NaOH(400μL)。将混合物在室温搅拌过夜，然后装载到LH 20柱上。用水洗脱LH-20柱，得到纯的游离酸形式的若丹明染料(45mg)。根据化合物80的合成将游离酸形式的若丹明染料(30mg)转化为化合物96(22mg)。
[0875] 实施例97：蛋白染料-缀合物的制备
[0876] 山羊抗小鼠IgG(GAM)、山羊抗兔IgG(GAR)和抗生物素蛋白链菌素的荧光缀合物遵循公开的操作(美国专利6,974873；Haugland et al.，Meth.Mol.Biol.45，
205(1995)；Haugland et al.，Meth.Mol.Biol.45，223(1995)；Haugland et al.，Meth.Mol.Biol.45，235(1995)；Haugland et al.，Current Protocols in Cell Biology，
16.5.1-16.5.22(2000))从相应的蛋白质和活性染料制备。简而言之，将在0.1mM pH 8.5碳酸氢钠缓冲液中浓度为1mg/mL的抗体或抗生物素蛋白链菌素以不同染料分子/蛋白质分子比例与活性染料之一混合。在室温孵育约1小时后，使用经PBS(pH 7.4)平衡的Sephadex G-25，由凝胶过滤法分离反应混合物。在标记反应中使用的不同染料分子/蛋白质比例产生了不同染料标记程度(DOL)的蛋白质缀合物，在以下表7中对每种染料/蛋白质对列出了染料标记程度。
[0877] 表7.根据本发明制备的所选择的抗体和抗生物素蛋白链菌素缀合物的列表
[0878] 蛋白质 染料 标记程度(DOL)
[0879] 抗生物素蛋白链菌素 化合物5 2.8；3.8；4.6；7.8；9.1；9.4；10.6[0880] 山羊抗小鼠IgG 化合物5 1.1；1.7；2.9；3.7；4.9；5.8；7.4；7.6
[0881] 山羊抗兔IgG 化合物41 1.4；1.9；3.0；5.2；6.1；7.1；9.3[0882] 山羊抗小鼠IgG 化合物41 1.1；1.7；2.7；3.9；4.8；5.8；6.6；7.3
[0883] 山羊抗小鼠IgG 化合物67 1.7；3.5；4.9；6.2；8.3
[0884] 山羊抗小鼠IgG 化合物92 1.7；4.9；7.2；8.6
[0885] 山羊抗小鼠IgG 化合物96 1.35；1.87；2.69；3.49；4.20
[0886] 使用JACSO荧光分光光度计测量缀合物的荧光，然后针对DOL进行绘图，得到图4-7。
[0887] 实施例98：鬼笔环肽染料缀合物的制备
[0888] 向氨基鬼笔环肽(1mg)和化合物5、7和23(1.5当量)于DMF(200μL)中的混合物中，加入N，N-二异丙基乙基胺(3当量)，然后将混合物在室温搅拌过夜。将溶液真空浓缩至干，残余物经LH-20柱进行柱色谱纯化(1.5mg)。产物为固定细胞制品中F-肌丝的有效染料。
[0889] 实施例99：荧光α-银环蛇毒素染料缀合物的制备和使用
[0890] 向α-银环蛇毒素(1mg)于0.1M碳酸氢钠(25μL)中的溶液中一次性加入化合物7(1.5当量)，然后将混合物在室温搅拌2小时。产物经G-25尺寸排阻色谱(size exclusion column)纯化，然后经反相HPLC纯化。对乙酰胆碱受体进行染色，并检测它们生成的荧光，尽管在较长的波长检测，但仍然与用德克萨斯红α-银环蛇毒素缀合物生成的荧光具有可比性。
[0891] 实施例100：的制备氨基葡聚糖-染料缀合物
[0892] 向具有平均13个氨基的70000MW的氨基葡聚糖于0.1M碳酸氢钠(400μL)中的溶液中加入化合物7从而得到约12的染料/葡聚糖。6小时后，用水作为洗脱剂，缀合物在SEPHADEX G-50上纯化。通常有4-6摩尔染料与70000MW葡聚糖缀合。
[0893] 实施例101：染料-细菌缀合物的制备
[0894] 将热灭活大肠杆菌(Heat killed Escherichia coli)悬浮在pH 8-9的缓冲液(10mg/mL)中，然后用0.5-1.0mg/mL胺-活性染料如化合物7孵育。30-60分钟后，对经标记的细菌进行离心并用缓冲液洗涤数次以除去任何游离的染料。经标记的细菌经流式细胞术分析。
[0895] 实施例102：核苷酸-染料缀合物的制备
[0896] 向5-(3-氨基烯丙基)-2-脱氧尿苷5’-三磷酸(2mg，Sigma Chemical)于H2O(100μL)中的溶液中加入化合物7或化合物23于DMF和三乙胺(5μL)中的溶液。将混合物在室温搅拌3小时，然后真空浓缩至干。残余物经制备性HPLC纯化。将产物级份冻干，得到深蓝色核苷酸缀合物。
[0897] 可供选择的，脱氧尿苷5’-三磷酸的荧光染料缀合物从5-(3-氨基-1-丙炔基)-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸制备，或通过用本发明的硫醇活性染料如化合物85处理硫醇化的核苷酸或硫代磷酸核苷酸制备。
[0898] 此外，使2’-(或3’)-2-氨基乙基氨基羰基腺苷5’-三磷酸与稍微过量的化合物7反应，然后用乙醇沉淀，核糖修饰的产物经制备性HPLC纯化。具有本发明染料的额外核苷酸缀合物可容易地由本领域技术人员遵循公开的操作如Nimmakayalu M.et al.，Biotechniques，2000，28，518；Muhlegger K.et al.，Biol.Chem.Hoppe Seyler，1990，371，953；Giaid A.et al.Histochemistry，1989，93，191来制备。
[0899] 实施例103：寡核苷酸染料缀合物的制备
[0900] 向5’-胺修饰的、18个碱基的M13引物序列(100μg)于H2O(4μL)中的溶液中加入化合物7(500μg)于0.1M硼酸钠pH＝8.5缓冲液(200μL)中的溶液。将混合物在室温搅拌过夜，然后加入3体积的冷乙醇。将混合物冷却至-20℃，离心，滗出上清液，沉淀用乙醇冲洗，然后溶于H2O(100μL)中。经标记的寡核苷酸用制备性HPLC纯化。收集期望的峰成分并蒸发，得到荧光性寡核苷酸。
[0901] 实施例104：用染料-抗体缀合物对细胞外染色的细胞进行流式细胞术测定
[0902] 将含有一百万个Jurkat细胞的每种样品用0.25μg小鼠抗人CD3(BDBiosciences)染色，随后用1μg山羊抗小鼠IgG染色，所述山羊抗小鼠IgG用化合物96以图8所示的DOL(实施例97)染色。流式细胞术在Beckman Coulter FC-500上使用CXP软件进行。噪音表示仅用山羊抗小鼠-化合物41缀合物(作为背景对照)染色的细胞的平均荧光强度。信号表示用CD3和山羊抗小鼠-化合物41染色的细胞的平均荧光强。
[0903] 实施例105：用染料-抗体缀合物对细胞内染色的细胞进行流式细胞术分析
[0904] 将一百万个Jurkat细胞用0.25μg小鼠抗人CD3抗体(BD Biosciences)固定、透化和孵育。CD3抗体随后用1μg山羊抗小鼠IgG缀合的AlexaFluor647(DOL 3.1)或化合物41(DOL 3.9)(实施例97)孵育。来自每种样品的约10,000个细胞在BD FACS Calibur流式细胞仪上进行分析，荧光在FL4通道检测。
[0905] 实施例106：用硫醇活性染料标记β-半乳糖苷酶
[0906] β-半乳糖苷酶，即一种富含游离硫醇基团的蛋白质在PBS缓冲液中制备(1mg于200μL中)，然后用硫醇反应性化合物85(5mg)于DMF(100μL)中的溶液处理。使用Nanosep离心装置经离心除去未反应的染料。经染料的取代程度使用实施例97中描述的方法评价。
[0907] 实施例107：化合物96、Alexa Fluor 488和荧光素之间的耐光性比较
[0908] 肌丝用鬼笔环肽染色，所述鬼笔环肽用化合物96、Alexa Fluor 488或荧光素标记(鬼笔环肽缀合物使用实施例98中描述的操作从氨基鬼笔环肽和琥珀酰亚胺基酯形式的染料制备)。洗涤后，每种染色的样品被连续照亮，荧光强度通过每隔5秒进行测量来监测。对每种样品的相对荧光相对时间进行绘图(图11)。就长时间而言，荧光素是绿色荧光色的染料选择，因为所述染料的吸收峰与488nm氩激光器线良好匹配。然而，荧光素非常快速地进行光漂白作用(photobleaching)，这限制了它的显微镜研究的应用。由于Molecular Probes，Inc的Alexa Fluor 488的异常的耐光性，因而将其开发为极好的候选物。图11显示本发明的化合物96比Alexa Fluor 488更具有耐光性。
[0909] 实施例108.测量本发明的经标记的生物分子的血清半衰期
[0910] 可测量本发明的经标记的生物分子的体外血清半衰期，例如，将经标记的生物分子注入经插管的大鼠中，例如如[Pepinsky，R.B.，et al.(2001)J Pharmacol Exp Ther，297：1059-66]所述的那样。然后在提取的血样中测量生物分子的血浆浓度。所述样品取决于研究的时程可在不同时间点取出。经标记的生物分子的浓度可使用各种方法测量，包括荧光测量和/或生物化学技术如ELISA或蛋白质印迹(Western Blots)。本发明的荧光基团的稳定作用可通过将本发明的经标记的生物分子的稳定性相对缺乏所述染料的相应生物分子的稳定性作比较来进行测量。
[0911] 实施例109.用本发明的染料标记的抗体与用其它市售染料标记的相同抗体的聚集行为的测量和比较
[0912] 一组山羊抗小鼠IgG缀合物通过用三种近红外染料中的一种标记山羊抗小鼠IgG的一部分来制备。此外对每种染料而言，单独的部分以几种不同标记程度(DOL)中的一种来标记，以便观察当抗体上染料分子的浓度随标记程度的增加而增加时聚集行为的吸收光谱。所用的染料为Cy7 染料、Alexa Fluor 750 (AF750 )染料和本发明的染料即染料29(表3)。图12A显示用Cy7 染料以4种不同的DOL(每个抗体1.2至3.4个染料分
子)标记山羊抗小鼠IgG所形成的缀合物的吸收光谱。图12B显示用Alexa Fluor 750
(AF750 )染料以4种不同的DOL(每个抗体2.2至5.9个染料分子)标记山羊抗小鼠IgG
所形成的缀合物的吸收光谱。图12C显示用染料29(表3)以6种不同的DOL(每个抗体
1.1至7.4个染料分子)标记山羊抗小鼠IgG所形成的缀合物的吸收光谱。所有光谱在室温在PBS 7.4缓冲液中获得。Cy7 染料标记的缀合物和AF750 染料标记的缀合物(A和B)显示了染料聚集的特征性双峰，而化合物29标记的缀合物(C)主要显示了单峰，这表明基本上缺乏染料聚集。
[0913] 实施例110.用本发明的染料标记的抗体与用缺乏水溶性聚合物基团的其它市售染料标记的相同抗体的荧光信号的测量和比较
[0914] 一组山羊抗小鼠IgG缀合物通过用三种近红外染料中的一种标记山羊抗小鼠IgG的一部分来制备。此外对每种染料而言，单独的部分以几种不同标记程度(DOL)中的一种来标记，以便观察当抗体上染料分子的浓度随标记程度的增加而增加时的荧光输产量(output)。所用的染料为：本发明的染料即染料29(表3)、Cy7 染料和Alexa Fluor 750(AF750 )染料。所述Cy7 染料和Alexa Fluor 750 (AF750 )染料不具有水溶性聚合物基团。图13显示在pH 7.4PBS缓冲液中在相同蛋白质浓度下，在735nm激发时，染料
29、Alexa Fluor 750 (AF750 )染料和Cy7 染料的总荧光相对标记程度(DOL)。所
述数据显示，与AF750 染料和Cy7 染料相比，染料29的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率，并且抗体处于较高标记程度时发生更少的荧光淬灭。
[0915] 实施例111.用三种近红外染料标记的山羊抗小鼠IgG对Jurkat细胞进行细胞内染色所得到的荧光信号的测量和比较
[0916] 一组山羊抗小鼠IgG标记的缀合物通过用染料29(表3)、Alexa Fluor750 染料或Cy7 染料中的一种标记山羊抗小鼠IgG的一部分来制备。Jurkat细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用三种经标记的第二抗体中一种来染色，所述三种经标记的第二抗体具有相似的标记程度。为了测量每种经标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也每种荧光第二抗体而不是第一抗体直接染色(深色柱)。图14显示如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG染色的Jurkat细胞的相对荧光水平，所述山羊抗小鼠IgG分别用本发明的近红外染料即染料29(表3)、Alexa Fluor 750 染料和Cy7 染料标记。结果显示，用本发明的抗体缀合物染色的细胞显著更亮，并且信噪比极好。
[0917] 实施例112.三种红外染料的耐光性的确定和比较
[0918] 图15比较了以下三种近红外染料的耐光性：表3的化合物29、Alexa Fluor 750(AF750 )染料和Cy7 染料。将染料浓度为5μM的三种染料溶液暴露于日光1/2小时。在光解作用之前和之后记录各溶液的吸收光谱。结果显示，本发明的近红外染料比AF750染料和Cy7 染料都显著更稳定。
[0919]山羊
抗小鼠IgG对Jurkat细胞进行细胞内染色所得到的荧光信号的测量和比较
[0920] 图16A和B显示用下述抗体进行细胞内染色的Jurkat细胞的相对荧光水平，所述抗体用Alexa Fluor 750 (AF750 )串联染料或染料29(表3)标记。图16A为显示如流式细胞术测量的，用指定量的山羊抗小鼠IgG(用化合物29标记(DOL＝3.5))或市售山羊抗小鼠IgG(用APC-AF750 串联染料(Invitrogen)标记)染色的Jurkat细胞的相对
荧光水平的图示。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用两种经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也每种荧光第二抗体而不是第一抗体直接染色(深色柱)。图16B为显示图16A的染色的信噪比的图示。流式细胞术实验在配备633nm激光器和780/60nm PMT检测器的BD LSR II上进行。结果显示，染料29产生了极好的荧光信号，背景非常少，而APC-AF750 串联染料显示了显著的非特异性染色。染料29在633nm具有非常小的吸收，而所述串联染料在所述激光波长由于供体染料APC具有几乎最大吸收。因为串联染料如APC-AF750 染料更难以制备由此花费也更昂贵，染料29，即本申请披露的近红外染料等就使用633nm或更长波长的激发源进行流式细胞术分析而言是特别有利的。
[0921] 实施例114.对具有相似波长的三种近红外染料形成的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，确定总荧光对标记程度的函数
[0922] 图17为就以下具有相似波长的染料的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，总荧光相对TM标记程度(DOL)：染料31(表3)、获自Thermo Fisher的Dylight 800染料和获自Li-Cor Biosciences的IRDye 800 CW染料。数据显示，染料31在宽范围的DOL下比其它两种染料显著更亮。
[0923] 实施例115.就三种近红外染料形成的山羊抗小鼠IgG缀合物而言荧光信号作为标记程度的函数的确定和荧光淬灭和信噪比的比较
[0924] 图18显示为如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平，所述山羊抗小鼠IgG抗体分别用染料31(表3)、获自Thermo Fisher的TMDylight 800和获自Li-Cor Biosciences的IRDye 800 CW染料标记。为了评价三种近红外染料的荧光淬灭，将所述抗体以所指明的不同标记程度(DOL)用每种染料标记。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也每种荧光第二抗体而不是第一抗体直接染色(同TM
种型，深色柱)。结果显示，染料31在宽范围的DOL下比Dylight 800染料和IRDye 800CW染料都显著更亮。还为重要的是，染料31比其它两种染料产生更好的信噪比。
[0925] 实施例116.四种光谱学相似的近红外染料的荧光量子产率的测量和比较
[0926] 图19为就分别以下染料的山羊抗小鼠IgG缀合物而言，总荧光相对标记程度(DOL)的绘图：本发明的近红外染料即染料32(表3)和三种光谱学相似的近红外荧光基团即获自GE Healthcare的Cy5.5 染料、获自Invitrogen的Alexa Fluor 680 (AF680)TM
染料和获自Thermo Fisher的Dylight 680。荧光测量在pH 7.4PBS缓冲液中使用660nmTM
激发进行。所述数据显示，与Cy5.5 Alexa Fluor 680 和Dylight 680相比，本发明的荧光基团在宽标记程度下具有更高的荧光量子产率。
[0927] 实施例117.用四种不同近红外染料各自标记的山羊抗小鼠IgG抗体对Jurkat细胞进行细胞内染色形成的相对荧光信号的测量和比较
[0928] 图20A和B显示涉及用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平的数据，所述山羊抗小鼠IgG抗体各自用四种不同的近红外染料标记。图20A显示如流式细胞术测量的，用山羊抗小鼠IgG抗体染色的Jurkat细胞的相对荧光水平，所述山羊抗小鼠IgG抗体用染料32(表3)、获自GEHealthcare的Cy5.5 染料、获自Thermo Fisher的TMDylight 680染料或获自Invitrogen的Alexa Fluor 680 (AF680)染料标记。为了评价三种近红外染料的荧光淬灭，山羊抗小鼠IgG抗体的各部分用一种染料以所指示的两种不同标记程度(DOL)中的一种来标记，以形成具有8个抗体的一组。所述细胞首先用小鼠抗人CD3抗体标记，然后用经标记的第二抗体中一种来染色。为了测量每种标记的第二抗体的背景荧光，将细胞也每种荧光第二抗体而不是第一抗体直接染色(同种型，深色柱)。
图20B为针对图20A中染色结果的信噪比(S/N)的绘图。数据显示，与从其它三种市售近红外染料制备的缀合物相比，用染料32标记的缀合物更亮并且在染色时更具有特异性。
[0929] 实施例118.染料29的制备
[0930]
[0931] 染料29(表3)
[0932] 染料29从本申请先前实施例中使用的常见中间体分4步制备。将化合物19(84mg)、化合物59和乙酸钠(4当量)在乙酸(2mL)和乙酸酐(1mL)的混合物中混合。得到的混合物在120℃加热20分钟，从而形成中间体化合物29a。
[0933]
[0934] 化合物29a：R＝-(CH2)5CO2H；R′＝-CH3。
[0935] 化合物29b：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-CH3。
[0936] 化合物29c：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-H。
[0937] 将溶剂真空馏出。使用水作为洗脱剂，将产物用Sephadex LH-20纯化。遵循制备化合物21(实施例21)的操作将化合物29a(30mg)转化为PEG化的中间体化合物29b。遵循制备化合物22(实施例22)的操作将甲酯中间体化合物29b(18mg)水解为游离酸化合物29c。使用TSTU和三乙胺如就实施例23中化合物23所述的那样将化合物29c(5mg)活化为最终产物染料29。
[0938] 实施例119.染料31的制备
[0939]
[0940] 染料31
[0941] 染料31从本申请先前实施例中使用的常见中间体分4步制备。化合物19(12g)首先用戊二醛缩二苯胺盐酸盐(18g)和Et3N(0.5mL)在AcOH(40mL)中在120℃处理3小时。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到化合物31a，其为红棕色胶状固体(3g)。
[0942]
[0943] 化合物31a：R＝-(CH2)5CO2H；R′＝-CH3。
[0944] 使用制备实施例118中化合物29a的条件，使上述中间体(1g)与N-(5-羧基戊基)-1，3，3-三甲基苯并吲哚鎓-6，8-二磺酸盐(1当量)(Bioconjugate Chem.7，
356(1996))偶联，得到化合物31b(80mg)。
[0945]
[0946] 化合物31b：R＝-(CH2)5CO2H；R′＝-CH3
[0947] 化合物31c：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-CH3
[0948] 化合物31d：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-H
[0949] 使用实施例118中所述的操作，将化合物31b(25mg)转化为化合物31c(60mg)，接着水解为游离酸化合物31d。最后，使用TSTU和三乙胺(实施例118)将游离酸染料化合物31d(10mg)活化为染料31。
[0950] 实施例120.染料32的制备
[0951]
[0952] 染料32
[0953] 染料32使用与制备化合物23(实施例23)类似的磺酸化的苯并咪唑鎓中间体和操作制备。简而言之，使N-(5-羧基戊基)-1，3，3-三甲基苯并吲哚鎓-6，8-二磺酸盐(实施例119)(5g)与丙二醛缩二苯胺盐酸盐(5g)、Et3N(0.5mL)在AcOH(50mL)中在120℃加热3小时。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干，残余物通过硅胶柱色谱纯化得到化合物32a，其为橙红色胶状固体(2.5g)。
[0954]
[0955] 化合物32a：R＝-(CH2)5CO2H
[0956] 将化合物62(实施例62)(5g)与6-溴己酸(1.5当量)充分混合，然后在95℃加热24h形成苯并咪唑鎓中间体化合物32b：
[0957]
[0958] 化合物32b
[0959] 使化合物32a和化合物32b偶联形成花青甲酯中间体化合物32c，随后对其进行PEG化以形成化合物32d，接着水解形成游离酸化合物32e，最后转化为琥珀酰亚胺基酯染料32。
[0960]
[0961] 化合物32c：R＝-(CH2)5CO2H；R′＝-CH3
[0962] 化合物32d：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-CH3
[0963] 化合物32e：R＝-(CH2)5CONH(CH2CH2O)24CH3；R′＝-H
[0964] 使化合物32c变为化合物32e的步骤的操作与制备化合物23(实施例23)的操作类似。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900