噬菌体的P3作为淀粉样蛋白结合剂的用途
阅读：552发布：2020-05-11
专利汇可以提供噬菌体的P3作为淀粉样蛋白结合剂的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于减少 淀粉 样蛋白形成和/或用于促进淀粉样蛋白解聚的 试剂 和药物组合物。所述组合物也可以用于检测淀粉样蛋白。，下面是噬菌体的P3作为淀粉样蛋白结合剂的用途专利的具体信息内容。
1.一种药物组合物，其包含结合淀粉样蛋白的多肽和药学上可接受的载体，其中所述多肽包含至少一个基因3蛋白(g3p)或其淀粉样蛋白结合片段，其中所述组合物不包含噬菌体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋
白结合片段。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的整个N2结构域。
4.根据权利要求2-3中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含g3p的
N1结构域的片段。
5.根据权利要求2-3中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含g3p的
整个N1结构域。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的药物组合物，其中所述多肽进一步包含载体，所述载体与所述多肽共价地或非共价地连接。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的药物组合物，其中存在于所述多肽中的至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段的氨基酸序列与野生型g3p的对应部分的氨基酸序列相同。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的药物组合物，其中存在于所述多肽中的至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段是突变体g3p。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的药物组合物，其中所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-20中的任一个的对应部分具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的药物组合物，其中所述多肽包含g3p的N1和
N2结构域，其中N2的铰链区是突变的，使得铰链Tm低于野生型M13噬菌体的铰链Tm，且其中所述多肽以比M13更高的亲和力结合淀粉样蛋白。
12.一种融合蛋白，其包含第一结构域和第二结构域，所述第一结构域结合淀粉样蛋白，其中所述第一结构域包含至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的N2结构域的淀
粉样蛋白结合片段。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含整个
N2结构域。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一结构域进一步包含g3p的N1结构域的片段。
16.根据权利要求13或权利要求14所述的融合蛋白，其中所述第一结构域进一步包含g3p的整个N1结构域。
17.根据权利要求12-16中的任一项所述的融合蛋白，其中存在于所述第一结构域中
的至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段的氨基酸序列与野生型g3p的对应部分的氨基酸序列相同。
18.根据权利要求12-17中的任一项所述的融合蛋白，其中，存在于所述融合蛋白中的至少一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段是突变体或变体g3p。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的突变体或变体
或它们的片段，其保留g3p的结合淀粉样蛋白的能力，且当与SEQ ID NO:1-20中的任一个的氨基酸序列的对应部分比对时，其具有包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、
7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
20.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一结构域包含g3p的N1和N2结构
域片段，其中N1和N2结构域中的至少一个包含没有破坏所述片段的结合淀粉样蛋白的能力的突变，且其中所述N1和N2结构域片段当与SEQ ID NO:1-20中的任一个的对应氨基酸比对时，具有包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列。
21.根据权利要求12-20中的任一项所述的融合蛋白，其中所述第二结构域包含免疫
球蛋白恒定区。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白恒定区是Fc片段。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述Fc片段选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM的Fc片段。
24.根据权利要求12所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:11或SEQ ID NO:13具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少
98％同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求24所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:11或SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列。
26.一种药物组合物，其包含根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白。
27.一种药物组合物，其包含分离的丝状噬菌体，所述丝状噬菌体表达突变体或变体g3p。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述突变体或变体g3p的氨基酸序列与
SEQ ID NO:1具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性。
29.一种药物组合物，其包含分离的丝状噬菌体，所述丝状噬菌体表达g3p的5个或更多个拷贝，或突变体或变体g3p的5个或更多个拷贝。
30.根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25
中的任一项所述的融合蛋白，其用于在有此需要的患者中减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋白形成、抑制淀粉样蛋白聚集、或除去有毒寡聚体和/或阻止有毒寡聚体的形成。
31.根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25
中的任一项所述的融合蛋白，其用于治疗选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默氏病，包括早发型阿尔茨海默氏病、迟发型阿尔茨海默氏病和症状发生前的阿尔茨海默氏病；帕金森病；
SAA淀粉样变性；半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；遗传性冰岛综合征；年老；多发性骨髓瘤；朊病毒病，包括库鲁病、克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊瘙痒症和牛海绵状脑炎(BSE)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓小脑性共济失调(SCA1、SCA3、SCA6或SCA7)；亨廷顿病；齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩；脊髓延髓肌肉萎缩症；遗传性脑淀粉样蛋白血管病；家族性淀粉样变性；额颞叶痴呆；英国/丹麦痴呆；和家族性脑病。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的药物组合物，其中当将生物标志物
florbetapir用作正电子发射断层摄影术中的成像剂时，所述患者是所述生物标志物阳性的。
33.根据权利要求30-32中的任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是帕金
森病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默氏病。
35.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是朊病毒病。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述朊病毒病选自：克雅病、库鲁病、致死性家族性失眠症和 综合征。
37.一种减少有此需要的患者中的淀粉样蛋白的方法，所述方法包括：给所述患者施用有效量的根据权利要求1-11或26-29中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求
12-25中的任一项所述的融合蛋白。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述患者正在表现出与淀粉样蛋白的存在有关的神经变性疾病的征状。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中当将生物标志物florbetapir用
作正电子发射断层摄影术中的成像剂时，所述患者是所述生物标志物阳性的。
40.根据权利要求37-39中的任一项所述的方法，其中所述神经变性疾病是帕金森病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述患者正在表现出朊病毒介导的疾病的征
状。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述朊病毒介导的疾病选自：克雅病、库鲁病、致死性家族性失眠症或 综合征。
44.一种编码结合淀粉样蛋白的多肽的核酸，其中所述多肽包含g3p或其淀粉样蛋白
结合片段，其中所述多肽与SEQ ID NO:1相比包含在所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段中的一个或多个突变，且其中所述突变非排它地选自Q129H、G153D、W181A、F190A和F194A。
45.根据权利要求44所述的核酸，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋白结
合片段。
46.一种载体，其包含根据权利要求44或权利要求45所述的核酸。
47.一种宿主细胞，其包含根据权利要求46所述的载体。
48.一种制备结合淀粉样蛋白的多肽的方法，其中所述多肽包含g3p或其淀粉样蛋白
结合片段，其中所述多肽与SEQ ID NO:1相比包含在N2部分中的一个或多个突变，且其中所述突变非排它地选自Q129H、G153D、W181A、F190A和F194A，所述方法包括：表达由根据权利要求46所述的载体中的核酸编码的多肽，和分离表达的蛋白。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述多肽包含g3p的N2结构域的淀粉样蛋白结
合片段。
50.一种核酸，其编码根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白。
51.一种载体，其包含根据权利要求50所述的核酸。
52.一种宿主细胞，其包含根据权利要求51所述的载体。
53.一种制备根据权利要求12-25中的任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括：
表达由根据权利要求51所述的载体中的核酸编码的融合蛋白，和分离表达的融合蛋白。
54.根据权利要求1-11中的任一项所述的药物组合物或根据权利要求12-25中的任一
项所述的融合蛋白，其中所述组合物中的多肽或所述融合蛋白进一步包含可检测标记。
18 11
55.根据权利要求54所述的药物组合物或融合蛋白，其中所述标记是选自 F、C或
123
I的放射性标记。
56.一种检测患者中的淀粉样蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：
a)给所述患者施用根据权利要求54所述的药物组合物或融合蛋白；和
b)检测所述标记。
57.根据权利要求56所述的方法，其中通过正电子发射断层摄影术(PET)检测所述标
记。
58.一种成像剂，其包含根据权利要求54或55所述的组合物。
59.一种用于诊断患者中与淀粉样蛋白有关的疾病或障碍的方法，所述方法包括下述步骤：
a)给所述患者施用根据权利要求58所述的成像剂；
b)允许所述试剂结合存在的任何淀粉样蛋白；
c)检测已经与淀粉样蛋白结合的任何成像剂，和
d)当检测到所述成像剂时，诊断与淀粉样蛋白有关的疾病或障碍。
噬菌体的P3作为淀粉样蛋白结合剂的用途
技术领域
[0001] 本发明涉及药物组合物，其包含丝状噬菌体g3p蛋白、g3p的淀粉样蛋白结合片段以及g3p的结合淀粉样蛋白的突变体和变体，并涉及这样的组合物作为治疗剂用于降低与疾病有关的淀粉样蛋白负载的用途，所述疾病为诸如全身性和周围性淀粉样蛋白疾病、神经变性疾病包括神经变性Tau病变和传播性海绵状脑病(朊病毒相关的疾病)。也包括那些组合物用于预防与这些疾病有关的淀粉样蛋白负载的积累的用途，以及那些组合物作为诊断剂用于检测淀粉样蛋白和从而诊断这样的疾病的用途。
背景技术
[0002] 丝状噬菌体M13和有关的丝状噬菌体已经表现出在蛋白错误折叠疾病的动物模型中的效用，并因此代表蛋白错误折叠疾病的潜在治疗剂类别。参见美国专利公开US
2011/0142803，通过引用整体并入本文。具体地，已经发现，丝状噬菌体具有介导已经在脑中形成的淀粉样蛋白的清除的能力。参见，例如，WO2006083795和WO2010060073，通过引用整体并入本文。
2011/0142803，通过引用整体并入本文。具体地，已经发现，丝状噬菌体具有介导已经在脑中形成的淀粉样蛋白的清除的能力。参见，例如，WO2006083795和WO2010060073，通过引用整体并入本文。
[0003] 形成淀粉样蛋白的疾病的特征在于神经元变性和错误折叠的、聚集的蛋白在脑中的存在。这些错误折叠的和聚集的蛋白在不同的疾病中存在差异，但是在大多数情况下，它们具有结合刚果红染料并显示苹果绿双折射的交叉-β-折叠片结构。预期淀粉样蛋白的除去会减轻多种以淀粉样蛋白为特征的疾病、减慢所述疾病的进展、或甚至逆转与所述疾病有关的征状。
[0004] 用于预防和/或逆转与形成淀粉样蛋白的疾病有关的病理学和/或征状的潜在治疗方案包括，例如，抑制淀粉样蛋白形成、促进淀粉样蛋白清除和抑制淀粉样蛋白聚集。参见，例如，Aguzzi&O-Connor,Nature Review Drug Discovery(2010)9:237-48。除去有毒寡聚体和/或阻止有毒寡聚体的形成，在形成淀粉样蛋白的疾病的治疗和预防中也可能是有益的。出处同上。
[0005] 已知与错误折叠的和/或聚集的蛋白有关的神经变性疾病包括：阿尔茨海默氏病、帕金森病、朊病毒病、神经变性Tau病变、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷顿病、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、遗传性脑淀粉样蛋白血管病、家族性淀粉样变性、额颞叶退化(FTLD)包括额颞叶痴呆、英国/丹麦痴呆和家族性脑病。其它疾病涉及周围的错误折叠的和/或聚集的蛋白—所以被称作周围性淀粉样变性。参见，例如，Chiti&Dobson,Annu Rev Biochem(2006)75:333-66；和Josephs等人,Acta Neuropathol(2011)122:137-153。对于预防和/或减少淀粉样蛋白聚集体形成(即，错误折叠的和/或聚集的蛋白)以治疗这些
疾病或减轻这些疾病的征状或严重程度，存在巨大需求。
疾病或减轻这些疾病的征状或严重程度，存在巨大需求。
[0006] 近年来，国立老龄研究所(National Institute on Aging)和阿尔茨海默氏病协会(Alzheimer’s Association)公布了诊断“所有原因”痴呆和阿尔茨海默氏病痴呆的标准。参见，McKhann等人,Alzheimer’s&Dementia,(2011)7(3):263-9。基于该指导，当行为或认知征状满足5个试验时，诊断为“所有原因”痴呆，所述试验包括，例如，干扰在工作时或在惯常活动时起作用的能力，和从以前的功能和执行水平的下降。所述试验包括病史采集和客观认知评估的组合。如本文中所述的，丝状噬菌体g3p蛋白、g3p的淀粉样蛋白结合片段和g3p的结合淀粉样蛋白的突变体和变体会结合淀粉样蛋白的发现，提供了用于诊断任何疾病或由淀粉样蛋白形成引起的痴呆(包括“所有原因”痴呆和阿尔茨海默氏病痴呆)的补充方法。
[0007] 丝状噬菌体是一组结构上相关的病毒，其感染细菌细胞且含有环形单链DNA基因组。它们在生产性感染过程中不会杀死它们的宿主。Rasched和Oberer,MicrobiolRev(1986)50:401-427。丝状噬菌体的例子包括Ff家族的噬菌体(例如，M13、f1
和fd)。自1978年以来，已经知道fd的核苷酸序列。Beck等人,Nucleic Acids
Research(1978)5(12):4495-4503。在1980年公布了M13的完整序列。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。在1982年之前对噬菌体f1进行了测序。Hill和Petersen,J.Virol.(1982)44(1):32-46。f1基因组包含6407个核苷酸，其比噬菌体fd小。它与fd序列相差186个核苷酸(包括1个核苷酸缺失)，从而导致噬菌体f1和fd的蛋白之间的12个
氨基酸差异。f1序列与M13序列相差52个核苷酸，从而导致对应的蛋白之间的5个氨基酸差异。出处同上。M13和fd的DNA序列相差192个(3％)核苷酸，但是这些差异中的仅12
个导致对应的氨基酸序列的变化(6.25％)。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。
和fd)。自1978年以来，已经知道fd的核苷酸序列。Beck等人,Nucleic Acids
Research(1978)5(12):4495-4503。在1980年公布了M13的完整序列。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。在1982年之前对噬菌体f1进行了测序。Hill和Petersen,J.Virol.(1982)44(1):32-46。f1基因组包含6407个核苷酸，其比噬菌体fd小。它与fd序列相差186个核苷酸(包括1个核苷酸缺失)，从而导致噬菌体f1和fd的蛋白之间的12个
氨基酸差异。f1序列与M13序列相差52个核苷酸，从而导致对应的蛋白之间的5个氨基酸差异。出处同上。M13和fd的DNA序列相差192个(3％)核苷酸，但是这些差异中的仅12
个导致对应的氨基酸序列的变化(6.25％)。van Wezenbeek等人,Gene(1980)11:129-148。
[0008] 丝状噬菌体的结构是非常确定的，且综述在，例如，Marvin,Curr.Opin.in Struct.Biol.(1998)8:150-158；Rasched 和 Oberer,Microbiological Reviews
(1986)50(4):401-427。丝状噬菌体具有“外壳”，其包含由基因8编码的主要衣壳蛋白(g8p、p8或pVIII)的数千个拷贝。装配的g8p-DNA复合物形成噬菌体的特征性丝状形状。
次要外壳蛋白(即，仅以几个(3-5个)拷贝存在的那些)位于丝的末端处。这些尖蛋白之一g3p(也被称作p3或pIII)是细菌宿主结合和开始感染所必需的。
(1986)50(4):401-427。丝状噬菌体具有“外壳”，其包含由基因8编码的主要衣壳蛋白(g8p、p8或pVIII)的数千个拷贝。装配的g8p-DNA复合物形成噬菌体的特征性丝状形状。
次要外壳蛋白(即，仅以几个(3-5个)拷贝存在的那些)位于丝的末端处。这些尖蛋白之一g3p(也被称作p3或pIII)是细菌宿主结合和开始感染所必需的。
[0009] M13噬菌体具有406个氨基酸的成熟g3p。GenBank Ref Seq NP_510891.1提供了一种参照序列，其包括18残基氨基端信号序列。与公开的序列相比具有氨基酸差异的变体是常见的。I-家族的丝状噬菌体具有与Ff家族成员不同的g3p，但是即使在家族g3p之间仍然是高度保守的。Stassen等人,J Mol Evol(1992)34:141-52。
[0010] 可得到g3p的晶体结构。Lubkowski等人,Structure(1998)7(6)711-722。该蛋白包含3个被柔性的富含甘氨酸的接头序列隔开的折叠结构域。2个氨基端结构域N1和N2(包含262个氨基酸)相互作用以形成N1-N2复合物。羧基端(CT,也称为N3)结构域
是146个氨基酸，它通过与g8p的疏水相互作用而起将g3p锚定在噬菌体颗粒中的作用。
Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8:150-158。在图1中呈现了可公开得到的、使用Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4):649-57的N1-N2结构域融合蛋白2g3p制备的带结构。
是146个氨基酸，它通过与g8p的疏水相互作用而起将g3p锚定在噬菌体颗粒中的作用。
Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8:150-158。在图1中呈现了可公开得到的、使用Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4):649-57的N1-N2结构域融合蛋白2g3p制备的带结构。
[0011] 不同于大多数蛋白，g3p需要N1和N2结构域从潜在的“锁定”形式解折叠才能获得它的天然生物活性。Eckert&Schmid,J.Mol.Biol.(2007)373:452-461。在感染的初始步骤中，N2经由在N2的外边缘上的残基结合细菌性菌毛。Deng&Perham,2002。N2的该初始结合会通过“打开”N1-N2复合物而“解锁”g3p，从而允许N1然后结合共受体TolA。在g3p的N1-N2片段中，在其中N2展开的初始解锁步骤的热转变发生在48.1℃的解链温度(TM)。该过程的一部分涉及在Gln212-Pro213肽键处的异构化。Pro213转化在解锁状态是反式的。在发生于TM60.2℃的第二步之前，N1保持稳定折叠。综述见Eckert&Schmid,2007。
[0012] 已经使用N1-N2片段中的突变来研究不同突变体的稳定性和侵染性。Eckert&Schmid,2007。一种变体(被命名为“3A”)会损害菌毛结合和降低N2结构域的稳定性。由于该突变，TM下降至42.6℃。3A携带下述突变：W181A、F190A和F194A。N2的另一种突变体G153D会使N2失稳，从而使TM下降至44.4℃。Q129H突变体会稳定化N2，从而使TM增加至51.4℃。IY变体含有在铰链中的突变T101I和D209Y，并增加N1-N2片段的稳定性(TM＝56.5℃)。IHY含有突变T101I、Q129H和D209Y(TM＝60.1℃)。IIHY含有突变
T13I、T101I、Q129H和D209Y(TM＝61.8℃)。Q129Y和T13I突变都是起稳定作用的，添加这些突变会进一步增加解链温度TM。噬菌体侵染性随着g3p内的结构域相互作用的强度而相反地变化。Eckert&Schmid,2007。N2结构域的删除(噬菌体fd(ΔN2))会通过除去N2
结构域对TolA的N1结合的阻断作用而增加侵染性。出处同上。
T13I、T101I、Q129H和D209Y(TM＝61.8℃)。Q129Y和T13I突变都是起稳定作用的，添加这些突变会进一步增加解链温度TM。噬菌体侵染性随着g3p内的结构域相互作用的强度而相反地变化。Eckert&Schmid,2007。N2结构域的删除(噬菌体fd(ΔN2))会通过除去N2
结构域对TolA的N1结合的阻断作用而增加侵染性。出处同上。
发明内容
[0013] 本发明部分地基于下述发现：g3p也以类似于噬菌体感染细菌的过程的方式介导丝状噬菌体与淀粉样蛋白的结合。美国专利号7,867,487假定，在该专利中报道的噬菌体在解聚淀粉样蛋白中的治疗效果的根本机制是，噬菌体的长、薄结构可能使它沿着淀粉样蛋白纤维构造。另外，有人提议，在g8p(主要外壳蛋白)中存在的高α螺旋含量可能干扰淀粉样蛋白的β折叠结构。该机制与所述专利的以下报道相一致：纳摩尔量的噬菌体可以解聚微摩尔量的β-淀粉样蛋白，这可以提示，噬菌体的高拷贝组分(即，g8p)在介导该效应。它也与US20110182948中的以下报道相一致：烟草花叶病毒(其具有与丝状噬菌体类似的结构)可以造成解聚。因而，该早期工作提示，完整结构(具有许多α螺旋的长丝)对于治疗效果而言是重要的，或者，如果特定外壳蛋白是重要的，那么在噬菌体外壳上高度呈现该蛋白，诸如g8p。该早期工作都没有提供噬菌体的分离组分(相对于完整噬菌体)可以结合淀粉样蛋白和/或造成它的解聚的任何暗示。此外，从未存在丝状噬菌体的次要外壳蛋白在它的结合和解聚淀粉样蛋白的能力中起作用的任何暗示。
[0014] 但是，本公开内容提供了替代性的(尽管不一定相互排斥的)作用机理的证据。发明人已经发现，噬菌体g3p会直接地结合淀粉样蛋白纤维，并且噬菌体介导的解聚依赖于该初始结合步骤。发明人的g3p负责丝状噬菌体介导的淀粉样蛋白结合的认识提供了噬菌体治疗效果的机制，以及提供了新类型的治疗剂和诊断剂的基础。
[0015] 本发明的其它目的和优点将在下面的描述中部分地阐述，并且将从所述描述部分地明白，或者可以通过本发明的实践来获知。借助于在所附权利要求中特别指出的要素和组合，将会实现和达到本发明的目的和优点。
[0017] 图1呈现了g3p的N1和N2结构域的带结构和铰链。
[0018] 图2A-2C呈现了得自不同来源的g3p的比对。图2A是得自噬菌体M13(SEQ IDNO:1)、Fd(SEQ ID NO:2)和F1(SEQ ID NO:3)的g3p的比对，包括共有序列(SEQ ID NO:4)。
Fig2B显示了得自噬菌体I2-2(SEQ ID NO:5)和Ike(SEQ ID NO:6)的g3p的比对，以及在I2-2和Ike之间的共有序列(SEQ ID NO:7)。图2C呈现了得自噬菌体If的g3p的氨基酸
序列(SEQ ID NO:8)。
Fig2B显示了得自噬菌体I2-2(SEQ ID NO:5)和Ike(SEQ ID NO:6)的g3p的比对，以及在I2-2和Ike之间的共有序列(SEQ ID NO:7)。图2C呈现了得自噬菌体If的g3p的氨基酸
序列(SEQ ID NO:8)。
[0019] 图3A呈现了噬菌体结合的表面等离子体共振(SPR)研究。使用流过生物传感器14
芯片的10 噬菌体/mL，对比了与Aβ纤丝的结合和与Aβ单体的结合。图3B显示了从图
3A所示的SPR数据计算出的Ka、Kd和KD。
芯片的10 噬菌体/mL，对比了与Aβ纤丝的结合和与Aβ单体的结合。图3B显示了从图
3A所示的SPR数据计算出的Ka、Kd和KD。
[0020] 图4A和4B呈现了结合研究。图4A显示了2种噬菌体剂量(1011/mL和1012/mL)的直接结合测定，其中逐渐增加fAβ42的摩尔量。图4B是结合竞争研究，并提供了用于确定M13结合的KD的替代方式。使用了构建体1。
[0021] 图5显示了在淀粉样蛋白纤维结合竞争测定中使用热变性的(框-90℃保持10分钟)相对于天然构象(圆圈)M13(构建体1)的结合竞争结果。
[0022] 图6显示了硫代黄素T(ThT)荧光测定，其使用在有或没有2种浓度的M13噬菌体(构建体1)存在下温育的fAβ42。
[0023] 图7A和7B显示了在ThT解聚测定中改变各个测定参数的作用。图7A呈现了在有2种盐浓度(0.15M和1.5M)存在下的解聚百分比。图7B呈现了在2种温度(4℃和37℃)
下剩余的fAβ的百分比。使用了构建体1。
下剩余的fAβ的百分比。使用了构建体1。
[0024] 图8A和8B描绘了使用fAβ42的M13-淀粉样蛋白结合测定。在图8A中，使用保持3小时的18℃至58℃的温育温度，报告了M13结合。图8B显示了在37℃相对于50℃的
温育的结合动力学。
温育的结合动力学。
[0025] 图9A-9C显示了g3p的蛋白水解除去对噬菌体-淀粉样蛋白相互作用的影响。使用蛋白酶Arg C从M13噬菌体切掉g3p(M13Δg3p)。图9A呈现了使用M13Δg3p噬菌体相对于天然(与ArgC处理的噬菌体相同地处理，但是没有蛋白酶处理)噬菌体的Aβ结合竞争研究的结果。图9B显示了与天然噬菌体相比，Arg C处理对M13Δg3p噬菌体的侵染性的影响。图9C在解聚测定中对比了ArgC处理的噬菌体和天然噬菌体。
[0026] 图10A和10B呈现了使用g3p的N1-N2片段作为标记的M13与fAβ42的结合的竞争剂的结合竞争测定的结果，所述N1-N2片段在本文中被称作重组可溶性
N1N2(rs-g3p(N1N2)；“构建体3”)、M13Δg3p(Arg C处理的)和M13。图10B显示了所述竞争测定的重复。
N1N2(rs-g3p(N1N2)；“构建体3”)、M13Δg3p(Arg C处理的)和M13。图10B显示了所述竞争测定的重复。
[0027] 图11呈现了噬菌体fd、IIHY、AAA和M13的竞争数据。将噬菌体fd、AAA和IIHY在50℃预活化1.5小时，然后对比活化的和非活化的Fd、AAA和IIHY在37℃温育45分钟中与标记的M13竞争结合Aβ的能力。
[0028] 图12A显示了rs-g3p(N1N2)(构建体3)的示意图。图12B呈现了rs-g3p(N1N2)的离子交换特性。图12C显示了使用Sephacryl S-300和rs-g3p(N1N2)的凝胶过滤测定
的结果。图12D显示了rs-g3p(N1N2)以及g3p和g8p对照的蛋白质印迹。M13噬菌体在泳
道1和2中泳动作为阳性对照，并用多克隆抗-M13抗体(其检测g8p和g3p)检测。纯化
的rs-g3p在泳道3和4中泳动，并用相同的多克隆抗-M13抗体检测。
的结果。图12D显示了rs-g3p(N1N2)以及g3p和g8p对照的蛋白质印迹。M13噬菌体在泳
道1和2中泳动作为阳性对照，并用多克隆抗-M13抗体(其检测g8p和g3p)检测。纯化
的rs-g3p在泳道3和4中泳动，并用相同的多克隆抗-M13抗体检测。
[0029] 图13呈现了使用rs-g3p(N1N2)(构建体3)的SPR数据。rs-g3p(N1N2)以约160nM的KD有效地结合fAβ42，但是不会结合单体。
[0030] 图14呈现了用于测量在给定样品中存在的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。将10μM Aβ42单体在有或没有5种浓度的rs-g3p(N1N2)(构建体3)存在下在37℃温育3天。通过定量结合的ThT荧光，测量在3天结束时形成的纤维的量。IC50是大约20nM，从而指示rs-g3p(N1N2)有效地抑制Aβ42纤维的形成。该图也指示，结合是剂量依赖性的。
[0031] 图15A显示了在有或没有rs-g3p(N1N2)(构建体3)存在下温育fAβ42的透射电子显微镜检查(TEM)结果。图15B显示了ThT荧光测定的结果，其中使用在37℃温育7天
的Aβ42和2μM rs-g3p(N1N2)(构建体3)。rs-g3p(N1N2)会阻断fAβ42的形成。
的Aβ42和2μM rs-g3p(N1N2)(构建体3)。rs-g3p(N1N2)会阻断fAβ42的形成。
[0032] 图16证实，rs-g3p(N1N2)(构建体3)有效地抑制α-突触核蛋白纤维的形成。通过在37℃在300rpm搅拌4天，装配25μMα-突触核蛋白(参见，条1)。该图上的条2描-13
绘了在37℃摇动3天的α-突触核蛋白单体+1x10 五聚体M13噬菌体。条2所示的结果
指示，五聚体M13会阻断α-突触核蛋白纤维的装配。该图上的条3描绘了α-突触核蛋
白单体+83nM rsg3p单体。条3所示的结果指示，单体在抑制α-突触核蛋白纤维形成方面的有效性低于五聚体M13。条4是显示在时间0的α突触核蛋白单体的阴性对照。在条
5中，显示了在没有α-突触核蛋白纤维的情况下的g3p单体，以确定g3p是否结合pTAA和隔离染料从而免于结合纤维。条5所示的结果指示，g3p不会结合pTAA。
绘了在37℃摇动3天的α-突触核蛋白单体+1x10 五聚体M13噬菌体。条2所示的结果
指示，五聚体M13会阻断α-突触核蛋白纤维的装配。该图上的条3描绘了α-突触核蛋
白单体+83nM rsg3p单体。条3所示的结果指示，单体在抑制α-突触核蛋白纤维形成方面的有效性低于五聚体M13。条4是显示在时间0的α突触核蛋白单体的阴性对照。在条
5中，显示了在没有α-突触核蛋白纤维的情况下的g3p单体，以确定g3p是否结合pTAA和隔离染料从而免于结合纤维。条5所示的结果指示，g3p不会结合pTAA。
[0033] 图17呈现了rs-g3p(N1N2)(构建体3)、M13(构建体2)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4)和IgG4-Fc阴性对照的竞争结合数据。
[0034] 图18呈现了对比M13(构建体2；正方形)、rs-g3p(N1N2)(构建体3；三角形)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4；倒转三角形)和重组IgG4-Fc阴性对照(菱形)的竞争结合数据。
[0035] 图19显示了对比5种浓度的Aβ42纤维加或减2种浓度的M13(构建体2)、800nM rs-g3p(N1N2)(构建体3)和3种浓度的rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4)的过滤器截留测定。
[0036] 图20呈现了rs-g3p(N1N2)(构建体3；“单体”)和抗生蛋白链菌素缀合的rs-g3p(N1N2)(“SA[g3pN1N2]n＝2-4”；“SA-g3p”；“四聚体”)的竞争结合数据。对比了rs-g3p(N1N2)和SA-g3p在37℃温育3小时过程中与标记的M13竞争结合Aβ的能力。
[0037] 图21显示了对比5种浓度的fAβ42加或减2种浓度的rs-g3p(N1N2)(构建体3；“单体”)和2种浓度的SA-g3p(“四聚体”)的过滤器截留测定。
[0038] 图22A和22B显示了在时间0(图22A)和与SA-g3p一起温育3天后(图22B)的fAβ42的TEM。
[0039] 图23显示了一种rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体“构建体4”的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。从“构建体1”(SEQ ID NO:10)的N1N2区域衍生出“构建体4”的N1N2区域。
[0040] 图24显示了另一种rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体“构建体5”的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。从“构建体2”(SEQ ID NO:12)的N1N2区域衍生出“构建体5”的N1N2区域。
[0041] 图25显示了一种rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc构建体“构建体6”的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。从“构建体2”的N1N2区域衍生出“构建体6”的N1N2区域。
[0042] 图26显示了得自fd(SEQ ID NO:14)、f1(SEQ ID NO:15)、M13(SEQ ID NO:16)、Ike(SEQ ID NO:17)、I2-2(SEQ ID NO:18)和If1(SEQ ID NO:19)的N2的氨基酸序列比对。星号“*”指示具有单个完全保守残基的位置。冒号“:”指示在Gonnet PAM250矩阵中具有大于0.5的评分的、具有强类似性质的基团之间的保守。句点“.”指示在Gonnet PAM250矩阵中具有等于或小于0.5的评分的、具有弱类似性质的基团之间的保守。
[0043] 图27A显示了构建体3的示意图。图27B显示了构建体3的g3p部分的DNA序列(SEQ ID NO:23)。图27C显示了构建体3的g3p部分的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
[0044] 图28显示了测试2种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白在阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中减少淀粉样蛋白β的能力的实验的结果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)都显著地降低阿尔茨海默氏病小鼠的海马中的淀粉样蛋白β的水平。
[0045] 图29显示了测试2种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白在阿尔茨海默氏病的转基因小鼠模型中减少淀粉样蛋白β的能力的实验的结果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)都能够显著地降低阿尔茨海默氏病小鼠的大脑皮质中的淀粉样蛋白β的水平。
[0046] 图30显示了rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)对Aβ42的装配抑制。图30A显示了在没有SDS的情况下制备的“天然”琼脂糖凝胶。将样品在不含SDS的TEA缓冲液中泳动，且不沸腾。结果指示，构建体6能够抑制fAβ42的装配。图30B呈现了用于测量存在于给定样品中的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。将10μM Aβ42单体在有或没有2种浓度的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)存在下在37℃温育1天。通过定量结合的ThT荧
光，测量在第1天结束时形成的纤维的量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)有效地抑制Aβ42纤维的形成。该图也指示，构建体6对纤维形成的抑制是剂量依赖性的。
光，测量在第1天结束时形成的纤维的量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)有效地抑制Aβ42纤维的形成。该图也指示，构建体6对纤维形成的抑制是剂量依赖性的。
[0047] 图31呈现了代表性的圆二色性数据，其表明Aβ42装配被rs-g3p(N1N2)(构建体3)抑制。圆二色性会测量要评估的Aβ纤维的α-螺旋和β-折叠含量。图31A显示了在
T＝0、T＝24小时和T＝48小时，Aβ42的椭圆性与波长的关系。图31B显示了在T＝
0、T＝24小时和T＝48小时，Aβ42+构建体3的椭圆性与波长的关系。图31C显示了代
表性的ThT测定，其中通过定量结合的ThT荧光，测量在24-48小时之间形成的纤维的量。
构建体3有效地抑制Aβ42纤维的形成。图31D显示了在T＝0、T＝24小时和T＝48小
时，构建体3的椭圆性与波长的关系。这些数据一起证实了构建体3的抑制Aβ42装配的能力。
T＝0、T＝24小时和T＝48小时，Aβ42的椭圆性与波长的关系。图31B显示了在T＝
0、T＝24小时和T＝48小时，Aβ42+构建体3的椭圆性与波长的关系。图31C显示了代
表性的ThT测定，其中通过定量结合的ThT荧光，测量在24-48小时之间形成的纤维的量。
构建体3有效地抑制Aβ42纤维的形成。图31D显示了在T＝0、T＝24小时和T＝48小
时，构建体3的椭圆性与波长的关系。这些数据一起证实了构建体3的抑制Aβ42装配的能力。
[0048] 图32呈现了表明M13(构建体2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)会阻断寡聚体诱导的N2a细胞毒性的代表性数据。参见，例如，Stine等人(2003)J.Biol.
Chem.278(13):11612-11622和 Stine 等 人 (2011)Erik D.Roberson( 编 )Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology, 第 670
卷:13-32。在处理之前，通过血清饥饿48小时，使N2a细胞分化。将Aβ42寡聚体(2uM)与构建体2和构建体6一起在37℃预温育3小时，然后加给N2a细胞。时间0(“TO”)复
合物不进行预温育。温育24小时以后，监测腺苷酸激酶(“AK”)释放。向培养基中的AK释放指示细胞死亡/裂解。如Stine等人,2011所述，制备Aβ42寡聚体。结果指示，M13和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc是有毒寡聚体的有效抑制剂。
Chem.278(13):11612-11622和 Stine 等 人 (2011)Erik D.Roberson( 编 )Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology, 第 670
卷:13-32。在处理之前，通过血清饥饿48小时，使N2a细胞分化。将Aβ42寡聚体(2uM)与构建体2和构建体6一起在37℃预温育3小时，然后加给N2a细胞。时间0(“TO”)复
合物不进行预温育。温育24小时以后，监测腺苷酸激酶(“AK”)释放。向培养基中的AK释放指示细胞死亡/裂解。如Stine等人,2011所述，制备Aβ42寡聚体。结果指示，M13和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc是有毒寡聚体的有效抑制剂。
[0049] 图33显示的过滤器截留测定对比了6种浓度的Aβ42纤维加或减1x1012/mlM13(构建体2)；80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体(构建体5)；和80nm和
800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)。将Aβ42纤维与构建体2、5和6一起在37℃
温育3天，然后进行过滤器截留。用mAb 6E10(1:15000)探测过滤器，所述mAb6E10识别被
14
捕集在过滤器上的Aβ42纤维。800nM构建体5或构建体6等于5x10 /ml分子摩尔浓度
的构建体2。结果指示，构建体2、5和6有效地解聚β-淀粉样蛋白纤维。
800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)。将Aβ42纤维与构建体2、5和6一起在37℃
温育3天，然后进行过滤器截留。用mAb 6E10(1:15000)探测过滤器，所述mAb6E10识别被
14
捕集在过滤器上的Aβ42纤维。800nM构建体5或构建体6等于5x10 /ml分子摩尔浓度
的构建体2。结果指示，构建体2、5和6有效地解聚β-淀粉样蛋白纤维。
[0050] 图34A和34B呈现了用于测量与ftau一起预温育3小时以后与fAβ42结合的M13(构建体2)的量的代表性测定。在有或没有4种浓度的ftau存在下，将5μM的与
构建体2结合的Aβ42单体在37℃温育3小时。由于fAβ:M13-Alexa488会沉淀，但是
ftau:M13-Alexa488不会沉淀，测量来自沉淀物的荧光的损失指示，ftau竞争fAβ结合。
在这里，通过定量沉淀的结合竞争反应中的Alexa488荧光，测量在3小时结束时形成的M13-fAβ的量。结果指示，ftau能够与M13-Alexa488(构建体2)竞争结合fAβ42。
构建体2结合的Aβ42单体在37℃温育3小时。由于fAβ:M13-Alexa488会沉淀，但是
ftau:M13-Alexa488不会沉淀，测量来自沉淀物的荧光的损失指示，ftau竞争fAβ结合。
在这里，通过定量沉淀的结合竞争反应中的Alexa488荧光，测量在3小时结束时形成的M13-fAβ的量。结果指示，ftau能够与M13-Alexa488(构建体2)竞争结合fAβ42。
[0051] 图35显示了测试rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体4)的结合ftau的能力的一种代表性的SPR测定的结果。结果指示，构建体4有效地结合ftau。
[0052] 图36显示了rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的解聚ftau的能力。通过将40uM的tau的微管结合重复区域(“MTBR”)稀释进50mM超氧化物歧化酶(“Sod”)中，
制备Tau纤维。将不同浓度的构建体6和制备的ftau在乙酸盐缓冲液(pH7.0)中在37℃
温育72小时。在有5倍过量的ThT存在下，记录ThT荧光。图36A呈现了代表性的ThT测
定的结果，所述测定显示了构建体6的解聚ftau的能力。图36B显示了另一个代表性的实验，其证实了构建体6的解聚tau的能力。图36A和36B也表明，构建体6对ftau的解聚
是剂量依赖性的。
制备Tau纤维。将不同浓度的构建体6和制备的ftau在乙酸盐缓冲液(pH7.0)中在37℃
温育72小时。在有5倍过量的ThT存在下，记录ThT荧光。图36A呈现了代表性的ThT测
定的结果，所述测定显示了构建体6的解聚ftau的能力。图36B显示了另一个代表性的实验，其证实了构建体6的解聚tau的能力。图36A和36B也表明，构建体6对ftau的解聚
是剂量依赖性的。
[0053] 图37呈现了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)和rs-g3p(N1N2)(构建体3)随时间对Aβ聚集的抑制的代表性实验。将Aβ42溶解在DMSO中，并在含有NaN3的PBS中稀释。在有或没有不同浓度的构建体3和构建体6存在下，Aβ42在37℃聚集。通过ThT荧光，测量Aβ42的聚集。图37A显示了样品的SDS PAGE。图37B显示了得自一个代表性实验的结果。图37C显示了得自另一个代表性实验的结果。图37D总结了结果。
[0054] 图38A和图38B呈现了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的阻断PrP向PrP-Sc转变的能力的实验的结果。对构建体6和IgG细胞裂解物进行超速离心以分离可
溶性的(上清液)和不溶性的(沉淀物)PrP物质。用抗-PrP单克隆抗体(6D11)，使PrP
物质生化地显影。在有IgG存在下，PrP分配在可溶性级分和不溶性级分中。在有构建体6存在下，存在有限的不溶性的PrP。数据代表n＝4。
溶性的(上清液)和不溶性的(沉淀物)PrP物质。用抗-PrP单克隆抗体(6D11)，使PrP
物质生化地显影。在有IgG存在下，PrP分配在可溶性级分和不溶性级分中。在有构建体6存在下，存在有限的不溶性的PrP。数据代表n＝4。
[0055] 图39A和图39B呈现了表明rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)在朊病毒病的细Sc
胞培养模型中减少PrP 的积累和聚集的能力的实验的结果。图39A显示了在用构建体6
Sc
和IgG处理以后，生化地分辨的未消化的和PK-消化的N2a22L 细胞裂解物。在用递增浓Sc
度的构建体6处理的细胞中，明显观察到PrP 水平的显著下降。用～0.08ug/ml构建体6Sc Sc
的处理实现了PrP 水平的大约50％下降。用10ug/ml构建体6的处理使PrP 水平下降
Sc Sc
至5.725％，p<0.0001。在用1ug/ml鼠IgG处理的N2A22L 细胞中没有观察到PrP 水平
的显著变化。对于图39B，随后将X-射线胶片数字化，并初步标准化为得自相同通道的IgGSc
处理的N2a22L 细胞中的作用(其被视作100％)。然后相对于同样印迹的未消化的裂解
Sc
物，分析得自PK-消化的印迹的密度测定数据，并表达为变化百分比PrP /PrPc。数据代表n＝4。
胞培养模型中减少PrP 的积累和聚集的能力的实验的结果。图39A显示了在用构建体6
Sc
和IgG处理以后，生化地分辨的未消化的和PK-消化的N2a22L 细胞裂解物。在用递增浓Sc
度的构建体6处理的细胞中，明显观察到PrP 水平的显著下降。用～0.08ug/ml构建体6Sc Sc
的处理实现了PrP 水平的大约50％下降。用10ug/ml构建体6的处理使PrP 水平下降
Sc Sc
至5.725％，p<0.0001。在用1ug/ml鼠IgG处理的N2A22L 细胞中没有观察到PrP 水平
的显著变化。对于图39B，随后将X-射线胶片数字化，并初步标准化为得自相同通道的IgGSc
处理的N2a22L 细胞中的作用(其被视作100％)。然后相对于同样印迹的未消化的裂解
Sc
物，分析得自PK-消化的印迹的密度测定数据，并表达为变化百分比PrP /PrPc。数据代表n＝4。
具体实施方式
[0056] 本发明部分地基于发明人对基因3蛋白(“g3p”，也被称作“p3”或“pIII”)在介导淀粉样蛋白结合和淀粉样蛋白聚集体的解聚中的作用的认识。本发明也基于发明人鉴别出的与淀粉样蛋白结合所需的g3p的最小序列。
[0057] 因而，在某些实施方案中，本发明提供了包含从g3p衍生出的最小共有淀粉样蛋白结合序列的分子，尤其是多肽。在这些实施方案的一个方面，所述分子是可溶性的。在这些实施方案的另一个方面，所述分子解聚淀粉样蛋白(例如，淀粉样蛋白斑块)和/或阻止所述淀粉样蛋白的聚集。在这些实施方案的另一个方面，所述分子是融合蛋白。在这些实施方案的一个更具体的方面，所述分子是额外包含免疫球蛋白链的氨基酸序列的融合蛋白。在这些实施方案的一个甚至更具体的方面，所述分子是额外包含免疫球蛋白G(例如，IgG)或免疫球蛋白M(例如，IgM)链的氨基酸序列的融合蛋白。在这些实施方案的另一个方面，所述分子包含g3p的N2结构域。在这些实施方案的一个更具体的方面，所述分子包含g3p的N1-N2结构域。在这些实施方案的另一个方面，所述分子包含全长g3p。在另一个方面，所述分子是作为任意前述分子的片段、突变体或变体的多肽。
[0058] 在其它方面，本发明提供了结合TolA的分子，诸如TolA抑制剂分子，尤其是多肽，其包含最小共有淀粉样蛋白结合序列。本发明的TolA结合分子和/或TolA抑制剂会结合、解聚、分解淀粉样蛋白和阻止淀粉样蛋白聚集。所述TolA结合分子和/或TolA抑制剂分子包括融合蛋白。在某些实施方案中，所述TolA结合分子和/或TolA抑制剂分子是大肠菌素或大肠菌素的淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，所述大肠菌素是A组大肠菌素。参见，例如，Cascales等人,Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2007)71(1):158-229。本发明的TolA结合分子和TolA抑制剂分子是用于减少与疾病有关的淀粉样蛋白负载的有用治疗剂，所述疾病为诸如全身性和周围性淀粉样蛋白疾病、神经变性疾病包括神经变性Tau病变和传播性海绵状脑病(朊病毒相关的疾病)。也包括那些组合物用于预防与这些疾病有关的淀粉样蛋白负载的积累的用途，以及那些组合物作为诊断剂用于检测淀粉样蛋白和从而诊断这样的疾病的用途。
[0059] 在另一个实施方案中，本发明提供了丝状噬菌体，其已经被修饰以与野生型噬菌体相比过表达g3p，以表达g3p的淀粉样蛋白结合片段、g3p的结合淀粉样蛋白的突变体或变体形式、或包含g3p的结合淀粉样蛋白的融合蛋白。
[0060] 本发明提供了任意前述分子或噬菌体的物质组合物和/或药物组合物，以及它们的结合、解聚淀粉样蛋白和阻止淀粉样蛋白聚集的用途，和它们的检测淀粉样沉着物并诊断以淀粉样蛋白为特征的疾病和障碍的用途。
[0061] 定义
[0062] 术语“g3p”当单独使用或在术语诸如“g3p衍生的”中使用时，表示任意野生型或重组丝状噬菌体g3p蛋白(包括g3p的片段、变体和突变体)。该术语不应解释为限于任何特定丝状噬菌体g3p。作为例子，术语“g3p”包括SEQ ID NO:1和图2中所示的有关蛋白。
[0063] 术语“丝状噬菌体”包括野生型丝状噬菌体和重组丝状噬菌体。在本申请中，“丝状噬菌体”也可以被称作“噬菌体(bacteriophage)”、“噬菌体(phage)”或“M13”。
[0064] 本文中使用的术语“野生型丝状噬菌体”表示：在自然界中发现的丝状噬菌体，在任意核苷酸或氨基酸序列数据库中指定为“野生型”的丝状噬菌体，商购可得的且被表征为“野生型”的丝状噬菌体，和通过传代已经获得相对于任意前述丝状噬菌体的非重组突变的丝状噬菌体。
[0065] 术语“结构域”是指多肽(包括蛋白)的具有一些独特物理特征或作用的区域，包括例如由多肽链的一段组成的独立折叠的结构。结构域可以含有多肽的独特物理特征的序列，或者它可以含有保留它的结合特征的物理特征的片段(即，它可以结合第二结构域)。一个结构域可以与另一个结构域结合。换而言之，第一结构域可以天然地结合第二结构域。
例如，g3p N2结构域会结合性菌毛，g3p N1结构域会结合TolA。
例如，g3p N2结构域会结合性菌毛，g3p N1结构域会结合TolA。
[0066] 本文中使用的术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白纤丝”和“淀粉样蛋白纤维”是三级结构的一般术语，所述三级结构通过几种不同蛋白中的任意蛋白的聚集而形成，且由垂直于纤维轴线堆叠的β折叠的有序排列组成。Sunde等人,J.Mol.Biol.(1997)273:729-39。一种示例性的淀粉样蛋白是在阿尔茨海默氏病中形成的淀粉样蛋白-β的聚集体，其由β-淀粉样肽“βA”组成，所述βA是从人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)切出的39-43氨基酸内部片段。存在短形式(诸如Aβ40)和长形式(诸如更纤维原性的Aβ异形体Aβ42)。其它示例性的淀粉样蛋白包括错误折叠的α-突触核蛋白(与帕金森病有关)、huntingtin(与Sc
亨廷顿病有关)、tau(与阿尔茨海默氏病有关)和朊病毒蛋白的异常构象PrP 。其它例子提供在说明书中，并且是本领域技术人员已知的(参见，例如，Aguzzi(2010),和Eichner和Radford,Mol.Cell(2011)43:8-18)。因而，除非指明蛋白或肽，否则术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白纤丝”或“淀粉样蛋白纤维”的应用不应解释为限于任何特定蛋白或疾病。
亨廷顿病有关)、tau(与阿尔茨海默氏病有关)和朊病毒蛋白的异常构象PrP 。其它例子提供在说明书中，并且是本领域技术人员已知的(参见，例如，Aguzzi(2010),和Eichner和Radford,Mol.Cell(2011)43:8-18)。因而，除非指明蛋白或肽，否则术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白纤丝”或“淀粉样蛋白纤维”的应用不应解释为限于任何特定蛋白或疾病。
[0067] 术语“β淀粉样肽”与“β-淀粉样肽”、“βAP”、“βA”和“Aβ”同义。所有这些术语表示从人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)衍生出的形成淀粉样蛋白的肽。
[0068] “结合淀粉样蛋白纤丝”或“结合淀粉样蛋白”的噬菌体、蛋白、融合蛋白、融合蛋白结构域、或前述物质的突变体、片段或变体是在淀粉样蛋白结合测定中为阳性的个体。使用直接结合测定诸如表面等离子体共振(SPR)，可以在体外检测淀粉样蛋白结合，在该情况-8 -9 -10 -11下，它通常以至少10 M、10 M、10 M或10 M的Kd结合淀粉样蛋白。可替换地，使用在实施例中描述的fAβ42结合测定，可以检测淀粉样蛋白结合。g3p的结合淀粉样蛋白的片段、变体和突变体也可以如下鉴别：当注射进任意蛋白错误折叠疾病的转基因小鼠模型中时，它们共同局部化至淀粉样蛋白。
[0069] 被描述为“解聚”或“介导解聚”的本发明的任意产品或组合物会减少已经形成的聚集体。通过过滤器截留测定，可以测量解聚。Wanker等人,Methods
Enzymol(1999)309:375-86。过滤器截留测定在本文中进行了描述，且可以用于检测聚集体和监测由本发明的组合物介导的解聚。将解聚检测为淀粉样蛋白在过滤器上的截留减少，这通过在有递增浓度的解聚剂存在下的染色减少来证实。
Enzymol(1999)309:375-86。过滤器截留测定在本文中进行了描述，且可以用于检测聚集体和监测由本发明的组合物介导的解聚。将解聚检测为淀粉样蛋白在过滤器上的截留减少，这通过在有递增浓度的解聚剂存在下的染色减少来证实。
[0070] 本文中使用的“减少淀粉样蛋白”的组合物会实现下述一项或多项：抑制淀粉样蛋白形成，造成淀粉样蛋白解聚，促进淀粉样蛋白清除，抑制淀粉样蛋白聚集，阻断和/或阻止有毒淀粉样蛋白寡聚体的形成，和/或促进有毒淀粉样蛋白寡聚体的清除。
[0071] 被描述为“保护神经元免于淀粉样蛋白损伤”的本发明的任意产品或组合物会阻止新淀粉样蛋白的积累和/或阻止有毒淀粉样蛋白寡聚体的形成。可以预防性地施用被描述为“保护神经元免于淀粉样蛋白损伤”的本发明的产品或组合物。通过本文描述的神经元细胞培养物细胞毒性测定，可以测量产品或组合物是否保护神经元免于淀粉样蛋白损伤。
[0072] 本文中使用的“PrP蛋白”、“PrP”和“朊病毒”表示，能够在适当条件下诱导c引起蛋白错误折叠疾病的聚集体的形成的多肽。例如，正常细胞的朊病毒蛋白(PrP)
Sc
在这样的条件下被转化成对应的羊瘙痒症异形体(PrP )，后者会引起疾病例如、但不
限于：牛海绵状脑病(BSE)或疯牛病、猫海绵状脑病、库鲁病(kuru)、克雅病(CJD)、
Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)和致死性家族性失眠症(FFI)。
Sc
在这样的条件下被转化成对应的羊瘙痒症异形体(PrP )，后者会引起疾病例如、但不
限于：牛海绵状脑病(BSE)或疯牛病、猫海绵状脑病、库鲁病(kuru)、克雅病(CJD)、
Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)和致死性家族性失眠症(FFI)。
[0073] 本文中与噬菌体、蛋白、多肽或氨基酸序列结合使用的术语“变体”(例如，g3p变体或g3p的淀粉样蛋白结合片段的变体)表示，与参比物相比，含有至少一个氨基酸差异(置换、插入或缺失)的对应物质。在某些实施方案中，与参照序列相比，“变体”具有高氨基酸序列同源性和/或保守的氨基酸置换、缺失和/或插入。在某些实施方案中，与参照序列相比，变体具有不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差异。“保守置换”表示第一种氨基酸被第二种氨基酸替换，所述第二种氨基酸基本上不改变g3p蛋白或g3p的淀粉样蛋白结合片段的化学、物理和/或功能性质(例如，g3p蛋白或淀粉样蛋白结合片段保留相同的电荷、结构、极性、疏水性/亲水性，和/或保持功能诸如识别、结合和/或减少淀粉样蛋白的能力)。这样的保守氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到不同前述特征的示例性保守置换是本领域技术人员众所周知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0074] 术语“突变体”(例如，“突变体g3p”或“结合淀粉样蛋白的突变体片段”)表示这样的蛋白：其在一个或多个氨基酸处被突变，以便调节它的治疗或诊断效力。在某些实施方案中，突变体含有在已知与淀粉样蛋白相互作用的氨基酸处的置换、缺失和/或插入。在其它实施方案中，突变体含有在特定氨基酸处的置换、缺失和/或插入，所述特定氨基酸是在野生型g3p或其淀粉样蛋白结合片段中存在的保守氨基酸。在某些实施方案中，与参照序列相比，突变体具有不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差异。在某些实施方案中，所述氨基酸置换是保守置换。除了“变体”通常在性质上是非重组的、而“突变体”通常是重组的以外，术语“变体”和“突变体”在本文中可互换地使用。
[0075] 本文中使用的术语“高严谨性”包括，技术人员基于例如DNA的长度容易地确定的条件。通常，这样的条件定义在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版.第1卷,第1.101-104页,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，且包括使用：用于硝酸纤维素过滤器的预洗涤溶液5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(PH8.0)，50％甲酰胺、6X SSC在42℃的杂交条件(或其它类似的杂交溶液，诸如Stark氏溶液，在
50％甲酰胺中，在42℃)，和在大约68℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤。技术人员会认识到，根据诸如探针长度等因素，可以在必要时调节温度和洗涤溶液盐浓度。
50％甲酰胺中，在42℃)，和在大约68℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤。技术人员会认识到，根据诸如探针长度等因素，可以在必要时调节温度和洗涤溶液盐浓度。
[0076] 本文中使用的术语“中等严谨性”包括，本领域普通技术人员基于例如DNA的长度可以容易地确定的条件。基础条件阐述在：Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版.第1卷,第1.101-104页,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)，且包括使用：用于硝酸纤维素过滤器的预洗涤溶液5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，50％甲酰胺、6X SSC在42℃的杂交条件(或其它类似的杂交溶液，诸如Stark氏溶液，在50％甲酰胺中，在42℃)，和60℃、0.5X SSC、0.1％SDS的洗涤条件。
[0077] 术语“高序列同源性”是指，使用已知的计算机程序(诸如Bestfit程序)测得的与参照序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同源性。
[0078] “融合蛋白”是包含包含至少2个多肽结构域的非天然存在的蛋白。
[0079] “g3p融合蛋白”包含与第二结构域连接的g3p蛋白。
[0080] “N1-N2融合蛋白”(也被称作“N1N2融合蛋白”)包含与第二结构域连接的g3p蛋白的N1和N2结构域(或任一种的突变体、片段或变体)，但是不包含N3/CT结构域。N1N2融合蛋白可以包含或不包含铰链区。
[0081] “N2融合蛋白”包含与第二结构域连接的g3p蛋白的N2结构域(或N2的突变体、片段或变体)，但是既不包含N1结构域也不包含N3/CT结构域。N2融合蛋白可以包含或不包含铰链区。
[0082] 本文中使用的“构建体1”衍生自野生型M13(参见，Genbank文件：NC_003287.2,版本GI:56718463。与野生型M13相比，在构建体1中，Ser378(AGC)被改变为Gly(GGC)，且Ile87(ATT)被改变为Asn(AAC))。构建体1包含SEQ ID NO:10的核酸。
[0083] “构建体2”是野生型M13分离物(GenBank JX412914.1)。构建体2包含SEQ ID NO:12的核酸。
[0084] “构建体3”是包含g3p的N1和N2结构域的重组可溶性g3p片段(rs-g3p(N1N2))，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸。
[0085] “构建体4”是重组可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸。“构建体4”的N1N2区域衍生自“构建体1”的N1N2区域。
[0086] “构建体5”是重组可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸。“构建体5”的N1N2区域衍生自“构建体2”的N1N2区域。
[0087] “构建体6”是重组可溶性g3p片段IgG1Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸。“构建体6”的N1N2区域衍生自“构建体2”的N1N2区域。
[0088] g3p的来源
[0089] 丝状噬菌体是一组感染革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))的相关病毒。参见，例如，Rasched and Oberer,Microbiology Reviews(1986)Dec:401-427。丝状噬菌体的例子包括、但不限于：Ff家族的噬菌体(即，至少M13、f1和fd)和I-家族的噬菌体(即，至少I22、Ike、If1)。
[0090] 所有天然存在的丝状噬菌体含有g3p作为次要外壳蛋白，其存在于每个噬菌体的3-5个拷贝中。因而，在本发明的一个方面，从任何天然存在的丝状噬菌体得到分离的g3p。
还可以生产重组形式的g3p。重组g3p可以对应于得自任何天然存在的丝状噬菌体的野生型g3p。因而，本发明也包括分离的重组g3p。
还可以生产重组形式的g3p。重组g3p可以对应于得自任何天然存在的丝状噬菌体的野生型g3p。因而，本发明也包括分离的重组g3p。
[0091] 在SEQ ID NO:1中呈现了得自噬菌体M13的g3p的一个例子。除非另外清楚地指明，描述的任何g3p突变是参照在下面以清洁和注解形式显示的SEQ ID NO:1：
[0092] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVVVCTGDE TQCYGTWVPI
[0093] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN[0094] 121PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY[0095] 181WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE[0096] 241GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID[0097] 301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNNFRQYLPSLPQ SVECRPFVFS[0098] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0099] 注解的SEQ ID NO:1
[0100] 1AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVVVCTGDE TQCYGTWVPI
[0101] 61GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN[0102] 121 PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY[0103] 181 WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE[0104] 241 GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID[0105] 301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNN FRQYLPSLPQ SVECRPFVFS[0106] 361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES
[0107] 表1-注解的SEQ ID NO:1的表解
[0108]
[0109] SEQ ID NO:1是除去了18氨基酸信号肽的GenBank NP-510891.1，因而氨基酸编号是针对成熟g3p。在任何表达构建体中通常包括信号肽，并且在本发明的不同实施方案的范围内包括包含信号肽的未成熟g3p，除非上下文澄清将它明确地排除。提供SEQ ID NO:1仅作为参照序列。它绝不意图限制本发明。
[0110] 得自多个来源的g3p的序列是已知的。Ff家族的噬菌体的示例性g3p氨基酸序列包括在UniProt登录号P69169(噬菌体f1)、P03661(噬菌体fd)和P69168(噬菌体m13)中发现的那些序列。I-家族的噬菌体的示例性g3p氨基酸序列包括P15415(噬菌体I22)、P03663(噬菌体Ike)和O80297(噬菌体If1)。在图2中呈现了几个g3p序列的比对。
[0111] 在本发明中有用的g3p还包括g3p的片段、突变体和/或变体。可以参考全长g3p或参考g3p的片段来描述突变体或变体。在本发明范围内包括任何全长或片段g3p，包括它们的保留结合淀粉样蛋白的能力的突变体和/或变体，无论它们的解聚淀粉样蛋白的能力如何。本发明也包括“包含”这样的g3p的任何蛋白。同样地，也包括“包括”、“具有”这样的g3p或“由其组成”、“基本上由其组成”的蛋白。
[0112] g3p的淀粉样蛋白结合片段和淀粉样蛋白解聚片段
[0113] 如提及的，g3p具有2个氨基端结构域N1和N2(其相互作用以形成N1-N2复合物)和一个羧基端结构域N3(也称为“CT”)。在Ff噬菌体中，N1结构域包含成熟g3p的残基1-67，且N2结构域包含残基87-217。残基87-123形成铰链，其允许在N1和N2之间的打开和关闭。有时，认为铰链是N2的一部分，而在其它情况下，将它视作单独的元件。N1和N2也通过柔性的富含甘氨酸的接头序列连接。在N1内，2个二硫桥存在于Cys7和Cys36之间以及Cys46和Cys53之间。在N2中，单个二硫桥存在于Cys188和Cys201之间。N3/CT结
构域包含残基257-406。Hollinger,1999；Marvin,1998。在羧基端结构域中，二硫桥存在于Cys354和Cys371之间。Marvin,1998。在g3p中不存在结构域间二硫桥。
构域包含残基257-406。Hollinger,1999；Marvin,1998。在羧基端结构域中，二硫桥存在于Cys354和Cys371之间。Marvin,1998。在g3p中不存在结构域间二硫桥。
[0114] g3p的淀粉样蛋白结合片段的非限制性例子包括：具有铰链(例如，至少SEQ ID NO:1的残基87-217)或没有铰链(例如，至少SEQ ID NO:1的残基124-217)的N2结构域；和具有或没有插入接头序列(例如，具有或没有SEQ ID NO:1的残基68-86)且具有或没有铰链的N1-N2结构域(例如，至少SEQ ID NO:1的残基1-67和87-217)。在任意前述实施
例中，N2或N1N2片段可以是在野生型丝状噬菌体或重组N2或N1N2中发现的N2或N1N2。
在任意前述实施例中，N2或N1N2片段可以是野生型丝状噬菌体序列的突变体或变体。
例中，N2或N1N2片段可以是在野生型丝状噬菌体或重组N2或N1N2中发现的N2或N1N2。
在任意前述实施例中，N2或N1N2片段可以是野生型丝状噬菌体序列的突变体或变体。
[0115] 有用的g3p的淀粉样蛋白结合片段包括g3p的任意片段，包括保留结合淀粉样蛋白的能力的N2和N1N2片段，无论所述片段的解聚淀粉样蛋白的能力。本发明包括“包含”这样的淀粉样蛋白结合片段(或其突变体或变体)的任何蛋白。同样地，也包括“包括”、“具有”所述g3p片段或变体或“由其组成”、“基本上由其组成”的蛋白。
[0116] N2和N2多肽突变体和变体
[0117] 在图26中显示了得自fd、f1、M13、Ike、I2-2和If1的N2的一级结构比对。fd的氨基酸显示在SEQ ID NO:14中；f1的氨基酸显示在SEQ ID NO:15中；M13的氨基酸显示在SEQ ID NO:16中；Ike的氨基酸显示在SEQ ID NO:17中；I2-2的氨基酸显示在SEQ ID NO:18中；且If1的氨基酸显示在SEQ ID NO:19中。使用该图和比对作为指导，本发明的一个实施方案包括N2多肽、N2多肽突变体和N2多肽变体，其包含SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19的氨基酸，包括它们的任意淀粉样蛋白结合片段。
[0118] 在其它实施方案中，所述N2多肽是这样的N2多肽突变体或变体：其保留它的结合淀粉样蛋白的能力，且当与SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的任一个的氨基酸序列比对时，具有包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列。在图26中，星号“*”指示具有单个完全保守残基的位置。冒号“:”指示在Gonnet PAM250矩阵中具有大于0.5的评分的、具有强类似性质的基团之间的保守。句点“.”指示在Gonnet PAM250矩阵中具有等于或小于0.5的评分的、具有弱类似性质的基团之间的保守。在这些实施方案的某些方面，所述N2多肽突变体或变体不包含在图26中用“*”指示的任意位置处的氨基酸差异。在更具体的方面，所述N2多肽突变体或变体不包含用“*”指示的任意位置处的氨基酸差异，并且包含在图26中用“:”指示的每个位置处的、与SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的至少一个相同的氨基酸。在甚至更具体的方面，所述N2多肽突变体或变体不包含用“*”指示的任意位置处的氨基酸差异，并且包含在图26中用“:”指示的每个位置和用“.”指示的每个位置处的、与SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19中的至少一个相同的氨基酸。
[0119] 在其它实施方案中，通过指定与SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19的氨基酸相似性百分比来描述N2多肽变体，仍然具有所述N2多肽变体结合淀粉样蛋白的条件。在这些实施方案中，所述N2多肽与SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19所示的参照序列的氨基酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0120] 在其它实施方案中，通过指定与SEQ ID NO:1的N2区域的氨基酸相似性百分比来描述N2多肽变体，仍然具有所述N2多肽变体结合淀粉样蛋白的条件。在这些实施方案中，所述N2多肽与SEQ ID NO:1的N2区域具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0121] 在其它实施方案中，通过二级或三级结构来描述N2多肽。已知的是，fd-N2和If1-N2结构域使用它们的表面的同源部分来结合大肠杆菌的性菌毛上的相同位点。Lorenz等人,J Mol Biol.405:989-1003(2011)，例如，990。介导N2与性菌毛的结合的氨基酸残基以及二级和三级结构也介导N2与淀粉样蛋白的结合。因而，对于N2与性菌毛的结合而言关键性的氨基酸残基以及二级和三级结构对于N2-淀粉样蛋白结合而言也是关键性的。在本发明范围内包括这样的N2多肽变体：其包含在N2-性菌毛结合区域中维持二级和三级结构所需的氨基酸。
[0122] N1N2和N1N2多肽突变体和变体
[0123] fd、f1和M13的一级结构比对显示为图2A，Ike、I2-2和If1的一级结构比对显示为图2B。使用该比对作为指导，本发明的一个实施方案包括这样的N1N2多肽、多肽突变体或多肽变体：其包含在fd、f1和M13之间或者在I2-2、Ide和If1之间保守的氨基酸，所述保守参考图2的序列来鉴别。在其它实施方案中，所述N1N2多肽是这样的N1N2多肽突变体或变体：其保留它的结合淀粉样蛋白的能力，且当与SEQ ID NO:1、2、3、5或6中的任一个的氨基酸序列比对时，其氨基酸序列包含不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸差异。
[0124] 在其它实施方案中，通过指定与SEQ ID NO:1的N1N2区域的氨基酸相似性百分比来描述N1N2多肽、突变体或变体，仍然具有所述N1N2多肽变体结合淀粉样蛋白的条件。在这些实施方案中，所述N1N2多肽变体与SEQ ID NO:1的N1和N2区域具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0125] 融合蛋白
[0126] 在一个方面，本发明涉及融合蛋白。所述融合蛋白包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段、TolA结合分子或TolA抑制剂。完全包括包含突变体或变体g3p或g3p片段的融合蛋白。所述融合蛋白与它通常不结合的至少一个额外蛋白或蛋白结构域连接、融合、缀合、偶联或结合。在一个实施方案中，所述融合蛋白是g3p融合蛋白，其包含与第二结构域连接的g3p蛋白。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是与第二结构域连接的g3p蛋白的淀粉样蛋白结合片段。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是N1N2融合蛋白，其包含g3p蛋白的N1和N2结构域，但是不包含CT结构域。在另一个实施方案中，所述融合蛋白是N2融合蛋白，其包含g3p蛋白的N2结构域，但是既不包含N1结构域也不包含CT结构域。如指出的，本发明的某些方面涉及突变的或变化的g3p蛋白或其淀粉样蛋白结合片段，并且涉及结合淀粉样蛋白纤维的突变的或变化的N1N2或N2结构域。因而，包含这些突变或变化形式的融合蛋白也是本发明的一部分。
[0127] g3p或淀粉样蛋白结合片段和融合配偶体多肽可以是连续氨基酸序列的一部分，其中所述融合配偶体多肽直接地或通过短肽接头连接至g3p或淀粉样蛋白结合片段多肽的N末端或C末端。在这样的情况下，g3p或其淀粉样蛋白结合片段和融合配偶体多肽可以从编码g3p或其淀粉样蛋白结合片段和融合配偶体多肽的编码序列翻译为单个多肽。
[0128] 在某些实施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白恒定区作为第二结构域。已经描述了这样的融合蛋白：其包含与目标蛋白或其片段连接的免疫球蛋白恒定区(参见，例如，美国专利号5,480,981和5,808,029；Gascoigne等人.1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2936；Capon等人.1989,Nature337:525；Traunecker等人.1989,Nature339:68；Zettmeissl 等 人.1990,DNA Cell Biol.USA9:347；Byrn 等 人 .1990,Nature344:667；
Watson等人.1990,J.Cell.Biol.110:2221；Watson等人.1991,Nature349:164；Aruffo等人.1990,Cell61:1303；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.173:721；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.174:561；Stamenkovic等人,1991,Cell66:1133；Ashkenazi等人.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535；Lesslauer等人.1991,Eur.J.Immunol.27:2883；Peppel等人.1991,J.Exp.Med.174:1483；Bennett等人.1991,J.Biol.Chem.266:23060；Kurschner等 人 .1992,J.Biol.Chem.267:9354；Chalupny 等 人 .1992,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA89:10360；Ridgway 和 Gorman,1991,J.Cell.Biol.115,Abstract No.1448；Zheng 等人.1995,J.Immun.154:5590)。这些分子通常具有与连接的目标分子有关的生物活性以及效应子功能，或与免疫球蛋白恒定区有关的某种其它期望的特征(例如，生物稳定性、细胞分泌)。
Watson等人.1990,J.Cell.Biol.110:2221；Watson等人.1991,Nature349:164；Aruffo等人.1990,Cell61:1303；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.173:721；Linsley等人.1991,J.Exp.Med.174:561；Stamenkovic等人,1991,Cell66:1133；Ashkenazi等人.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535；Lesslauer等人.1991,Eur.J.Immunol.27:2883；Peppel等人.1991,J.Exp.Med.174:1483；Bennett等人.1991,J.Biol.Chem.266:23060；Kurschner等 人 .1992,J.Biol.Chem.267:9354；Chalupny 等 人 .1992,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA89:10360；Ridgway 和 Gorman,1991,J.Cell.Biol.115,Abstract No.1448；Zheng 等人.1995,J.Immun.154:5590)。这些分子通常具有与连接的目标分子有关的生物活性以及效应子功能，或与免疫球蛋白恒定区有关的某种其它期望的特征(例如，生物稳定性、细胞分泌)。
[0129] 在某些实施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白恒定区的Fc片段。可以商业购得Fc表达盒。Fc片段可以包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域以及免疫球蛋白的铰链区。Fc片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白恒定区的该部分是IgG1的Fc片段。在另一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区的该部分是IgG4的Fc片段。在另一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区的该部分是IgM的Fc片段。
[0130] 因而，在一个实施方案中，使用标准的分子生物学技术，将重组可溶性g3p或淀粉样蛋白结合片段与免疫球蛋白Fc结构域融合。重组可溶性g3p或淀粉样蛋白结合片段可以是突变的或变化的。例如，可以将g3p的淀粉样蛋白结合片段(诸如N1N2结构域或N2结构域)克隆进IgGFc融合表达载体中。示例性的IgGFc融合载体包括，例如，可从InvivoGen得到的pFUSE-Fc载体之一。在某些实施方案中，得到的二价(例如，g3p(N1N2)-IgGFc或g3p(N2)-IgGFc融合蛋白将具有比重组可溶性g3p更高的结合淀粉样蛋白的亲合力，因为它现在是二价的。
[0131] 在其它实施方案中，所述融合蛋白包含与g3p或g3p的淀粉样蛋白结合片段连接的非-Fc蛋白。
[0132] 在其它实施方案中，所述融合蛋白包含至少2个g3p多肽或其淀粉样蛋白结合片段。在其它实施方案中，所述融合蛋白包含3个或更多个g3p多肽或其淀粉样蛋白结合片段。在其它实施方案中，所述融合蛋白包含5个g3p多肽或其淀粉样蛋白结合片段。这样的二聚体的和多聚体的融合蛋白会提供更高的亲合力相互作用，因为它们包括超过一个g3p或其淀粉样蛋白结合片段。
[0133] 在其它实施方案中，所述融合蛋白包含白蛋白。参见例如，Fleer的美国专利号6,686,179。
[0134] 在所有情况下，所述融合蛋白中的g3p或g3p的淀粉样蛋白结合片段包括其突变体和变体。
[0135] 一般而言，所述融合蛋白至少象对应的未连接的g3p或其g3p片段一样有效地结合淀粉样蛋白。在适用时，所述融合蛋白至少象对应的未连接的g3p或其片段一样有效地介导淀粉样蛋白的解聚、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚体的形成。在某些实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且至少象包含SEQ ID NO:1的重组可溶性g3p一样有效地介导淀粉样蛋白的解聚、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚体的形成。在其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且至少象噬菌体M13一样有效地介导淀粉样蛋白的解聚、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚体的形成。在其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且比噬菌体M13更有效地介导淀粉样蛋白的解聚、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白聚集、和/或除去或阻止有毒寡聚体的形成。在某些实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且至少象噬菌体M13一样有效地减少蛋白错误折叠疾病中的淀粉样蛋白。在其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且比噬菌体M13更有效地减少蛋白错误折叠疾病中的淀粉样蛋白。在其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白且至少象噬菌体M13一样有效地或比噬菌体M13更有效地阻止淀粉样蛋白形成。
[0136] 使用本领域众所周知的技术，可以合成融合蛋白。例如，可以在细胞中重组地合成本发明的融合蛋白(参见，例如，Sambrook等人.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y. 和 Ausubel 等 人 .1989,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley
Interscience,N.Y.)。可替换地，使用已知的合成方法诸如固相合成，可以合成本发明的融合蛋白。合成技术是本领域众所周知的(参见，例如，Merrifield,1973,Chemical Polypeptides,(Katsoyannis和Panayotis编)第335-61页；Merrifield1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等人.1985,Biochem.Intl.10:394；Finn等人.1976,The Proteins(3d ed.)2:105；Erikson等人.1976,The Proteins(第3版)2:257；美国专利号3,941,763。可替换地，最终的构建体可以基本上具有与重组生产的融合蛋白相同的功能，但是简单地使用非重组技术(诸如连接化学)来生产。使用关于g3p表达和g3p突变描述的相同一般方
法，可以制备融合蛋白的组分。
Interscience,N.Y.)。可替换地，使用已知的合成方法诸如固相合成，可以合成本发明的融合蛋白。合成技术是本领域众所周知的(参见，例如，Merrifield,1973,Chemical Polypeptides,(Katsoyannis和Panayotis编)第335-61页；Merrifield1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等人.1985,Biochem.Intl.10:394；Finn等人.1976,The Proteins(3d ed.)2:105；Erikson等人.1976,The Proteins(第3版)2:257；美国专利号3,941,763。可替换地，最终的构建体可以基本上具有与重组生产的融合蛋白相同的功能，但是简单地使用非重组技术(诸如连接化学)来生产。使用关于g3p表达和g3p突变描述的相同一般方
法，可以制备融合蛋白的组分。
[0137] 在某些实施方案中，可以将g3p或淀粉样蛋白结合片段(或其突变体或变体形式)与标志物序列融合，所述标志物序列为诸如促进融合的多肽(单独地或此外与另一种蛋白融合或掺入载体分子)的纯化的肽。标志物氨基酸序列可以是六组氨酸肽，诸如在pQE载体(Qiagen,Mississauga,Ontario,加拿大)中提供的标签，以及其它，其中的许多是商购可得的。例如，如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1989)86:821-824中所述，六组氨酸会提供融合蛋白的方便纯化。可用于纯化的另一种肽标签，即血凝素(HA)标签，对应于从流感HA蛋白衍生出的表位(Wilson等人,(1984)Cell37:767)。
[0138] 过表达g3p的噬菌体
[0139] 在另一个方面，本发明涉及噬菌体，其经过修饰以使由该噬菌体表达的g3p的拷贝数增加至超过在野生型丝状噬菌体中常见的3-5个拷贝。在一个实施方案中，表达增加的g3p数目的噬菌体可以选自天然存在的变体。在另一个实施方案中，使用重组技术来增加g3p的拷贝数。
[0140] 在某些实施方案中，编码g3p或g3p的淀粉样蛋白结合片段(包括其突变体或变体)的野生型序列可以用于替代编码另一种噬菌体外壳蛋白的基因之一。取决于替代的噬菌体基因，g3p的数目可以增加至6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、500、1000个或甚至接近3000个拷贝(例如，如果使用基因3编码序列来替代基因8编码序列或与基因8编码序列的末端融合)。
[0141] 为了生产表达g3p的额外拷贝的噬菌体，如在说明书别处所述克隆g3p编码序列(或其突变体或变体形式)。然后可以使用g3p编码序列(或其突变体或变体形式)来替代另一个噬菌体基因并表达(如果必要的话，与辅助噬菌体结合)。
[0142] 可替换地，在某些实施方案中，将g3p编码序列(或其突变体或变体形式)与另一个噬菌体基因的编码序列在框架内融合，使用或不用插入“间隔区”序列。制备与另一种蛋白或肽“融合”的噬菌体蛋白的方法是噬菌体展示领域众所周知的，且可以以与例如抗原或抗体链相同的方式“展示”g3p或其淀粉样蛋白结合片段。例如Scott&Smith,Science(1990)249:386-90；Devlin等人,Science(1990)249:404-06。当仅期望g3p片段的表达时，所述片段(或其突变体或变体形式)的编码序列可以连接至其它基因，使得存在于g3p中的天然Ser/Gly接头序列之一充当接头。在某些实施方案中，仅N2或N1N2结构域(或其突
变体或变体形式)的编码序列与其它基因在框架内融合。
变体或变体形式)的编码序列与其它基因在框架内融合。
[0143] 突变体G3P和淀粉样蛋白结合片段
[0144] 在另一个方面，本发明涉及突变体g3p蛋白及其结合淀粉样蛋白的突变体片段。包含突变体g3p蛋白和淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白和噬菌体也是本发明的一部分。可以生产突变体g3p及其结合淀粉样蛋白的突变体片段，或针对促进在本申请中描述的药物组合物的治疗效果的性能进行选择。例如，可以重组地突变或以其它方式选择g3p或其淀粉样蛋白结合片段，以具有相对于M13的g3p的下述性能中的一种或多种：增加的对淀粉样蛋白结合的亲和力、减少的铰链TM、增加的亲合力(亲合力与亲和力的差别在于，在g3p包含超过一个淀粉样蛋白结合位点的情况下，亲合力用于描述所有可得到的淀粉样蛋白结合的总和)、增加的解聚淀粉样蛋白聚集体的能力、或增加的阻止淀粉样蛋白纤丝聚集的能力。可替换地，或额外地，突变体g3p或其突变体淀粉样蛋白片段可以包含在说明书别处描述的其它有用的性能。
[0145] 通过噬菌体诱变或通过重组技术，诸如基于PCR的定位诱变或随机诱变，可以生产突变体g3p蛋白。
[0146] 在某些实施方案中，如下生产具有较高亲和力的突变体：诱变处理M13，然后在与严谨洗涤条件偶联的淀粉样蛋白亲和柱上选择噬菌体。选定的噬菌体的结合、洗涤、洗脱、然后繁殖的成功循环会富集对淀粉样蛋白具有高结合亲和力的那些噬菌体。使用淀粉样蛋白淘选实现噬菌体群体的亲和力增加以后，选择和分析具有高亲和力的各个克隆。以此方式，在随机诱变以后可以针对高亲和力结合来选择噬菌体突变体。
[0147] 使用重组技术也可以诱变处理g3p或其任意淀粉样蛋白结合片段(例如，N1N2结构域或N2结构域)。例如，使用基于PCR的诱变策略，可以突变如本文中所述的携带g3p或其淀粉样蛋白结合片段(例如，N1N2或N2)的载体。然后表达编码的突变蛋白，并如所述评估突变体的淀粉样蛋白结合和亲和力。
[0148] 也可以从突变体g3p衍生出突变体g3p的淀粉样蛋白结合片段。例如，通过突变g3p和/或选择具有合乎需要的性能的突变的g3p，然后从其得到期望的淀粉样蛋白结合片段，例如，通过蛋白酶解和随后的纯化。
[0149] 针对增加的淀粉样蛋白结合亲和力、结合的温度敏感性的变化等筛选携带突变体g3p的噬菌体，可以用于鉴别噬菌体以进一步表征该噬菌体的g3p。针对性能(诸如结合的温度敏感性)的筛选可以利用淀粉样蛋白亲和柱，其中以温度依赖性的方式进行结合、洗涤或洗脱步骤中的一个或多个。
[0150] 在某些实施方案中，所述突变体g3p或g3p淀粉样蛋白结合片段结合淀粉样蛋白的亲和力是得自M13的对应的未突变的g3p或g3p片段的结合的至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500倍或甚至1000倍。在其它实施方案中，所述突变体g3p或g3p淀粉样蛋白结合片段保留的淀粉样蛋白结合的强度是得自M13的对应的未突变的g3p或淀粉样蛋白结合g3p片段的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，显示出比对应的未突变形式更低的淀粉样蛋白结合亲和力的突变体g3p或淀粉样蛋白结合片段也具有其它合乎需要的生物学(例如，更大的解聚淀粉样蛋白的能力；更大的阻止淀粉样蛋白纤丝聚集的能力)或药学(例如，更大的代谢稳定性、有利的药代动力学分布、更大的溶解度)性质，所述性质与对应的未突变形式相比改善。如在实施例中所述，通过表面等离子体共振或在竞争性ELISA中可以评估淀粉样蛋白结合。
96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，显示出比对应的未突变形式更低的淀粉样蛋白结合亲和力的突变体g3p或淀粉样蛋白结合片段也具有其它合乎需要的生物学(例如，更大的解聚淀粉样蛋白的能力；更大的阻止淀粉样蛋白纤丝聚集的能力)或药学(例如，更大的代谢稳定性、有利的药代动力学分布、更大的溶解度)性质，所述性质与对应的未突变形式相比改善。如在实施例中所述，通过表面等离子体共振或在竞争性ELISA中可以评估淀粉样蛋白结合。
[0151] 在某些实施方案中，通过使用与M13g3p的杂交来筛选DNA文库以选择有关的在高严谨性或中等严谨性条件下与M13g3p杂交的DNA，可以鉴别g3p的变体和/或突变体。
[0152] 在某些实施方案中，突变的g3p是与成熟的M13g3p蛋白(SEQ ID NO:1)相差至少一个氨基酸残基、但是仍然结合淀粉样蛋白的、重组生产的g3p或其淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，通过提供M13g3p在成熟蛋白的特定残基处的氨基酸和在该残基处的替代氨基酸，指定各个点突变。例如，“F194A”是指在成熟M13序列的位置194处的苯丙氨酸已经被改变为丙氨酸。在其它实施方案中，通过指定与SEQ ID NO:1的氨基酸相似性百分比来描述突变的g3p，仍然具有突变的g3p结合淀粉样蛋白纤丝的条件。在这些实施方案中，突变的g3p与SEQ ID NO:1的全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在涉及突变的g3p的淀粉样蛋白结合片段的那些实施方案中，所述突变的淀粉样蛋白结合片段与SEQ ID NO:1的对应片段的全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在涉及突变的g3p的淀粉样蛋白结合片段的那些实施方案中，所述突变的淀粉样蛋白结合片段与SEQ ID NO:1的对应片段的全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
[0153] 作为实用内容，使用已知的计算机程序(诸如Bestfit程序)，可以常规地确定任何特定多肽是否与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。当使用Bestfit或其它序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参照序列具有例如95％同一性时，当然这样设定参数，使得在与查询序列同源的参照氨基酸序列部分的全长上计算同一性百分比。
[0154] 在不同方面的某些实施方案中，突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段不包括在特定氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之间是保守的。在其它实施方案中，所述突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之间是保守的。在其它实施方案中，所述突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段包括至多在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，
[0155] 所述氨基酸残基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之间不是保守的。在另一个实施方案中，所述突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段包括至多在0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在I22、Ike和If1中的一个或多个之间不是保守的。在其它实施方案中，所述突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之间不是保守的。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10个突变位于N1结构域内。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或
10个突变位于N2结构域内。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变位于N2结构域内，且不是在铰链区内。
6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在I22、Ike和If1中的一个或多个之间不是保守的。在其它实施方案中，所述突变体g3p和其淀粉样蛋白结合片段包括至多在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基在Ff家族、I-家族或Ff和I-家族二者的g3p之间不是保守的。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10个突变位于N1结构域内。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或
10个突变位于N2结构域内。在某些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变位于N2结构域内，且不是在铰链区内。
[0156] 定位诱变可以靶向已知对于g3p、N1N2或N2结构域的稳定性而言重要的残基。例如，以前已经证实，在以下位置处的丙氨酸替换突变不会显著影响噬菌体与性菌毛的结合：D94和T95；E115；N122；L125；E126和E127；E127和E128；Q129；Q145；T154和T156；Q157；
T159和D160；K163和T164；Y166；和E196和D197,Deng&Perham,2002。因此，这些位置允许突变，并且在这些位置中的一个或多个处的突变可以增强本发明的g3p和g3p淀粉样蛋白结合片段的淀粉样蛋白结合能力或者对所述能力具有中性影响。因而，在某些实施方案中，本发明包括在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197(相对于SEQ ID NO:1)中的一个或多个处突变的g3p或g3p淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中的一个或多个处的突变不排它地是对丙氨酸的突变。
T159和D160；K163和T164；Y166；和E196和D197,Deng&Perham,2002。因此，这些位置允许突变，并且在这些位置中的一个或多个处的突变可以增强本发明的g3p和g3p淀粉样蛋白结合片段的淀粉样蛋白结合能力或者对所述能力具有中性影响。因而，在某些实施方案中，本发明包括在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197(相对于SEQ ID NO:1)中的一个或多个处突变的g3p或g3p淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，在D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中的一个或多个处的突变不排它地是对丙氨酸的突变。
[0157] 以前已经证实，在以下位置处的丙氨酸替换突变会减少与性菌毛的结合：F194；F190和H191；K184,R186,和D187；R142和R144，Deng&Perham,2002。因而，在某些实施方案中，突变选自不包括一个或多个下述残基的突变：R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194(相对于SEQ ID NO:1的编号)。但是，用非丙氨酸残基替换R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194可能增加淀粉样蛋白结合。因而，在一个实施方案中，所述突变是在R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194中的一个或多个处的非丙氨酸突变。在一个实施方案中，所述突变是在F194处的非丙氨酸突变。在另一个实施方案中，所述突变是在F190和H191处的非丙氨酸突变。在另一个实施方案中，所述突变是在K184、R186和D187处的非丙氨酸突变。在另一个实施方案中，所述突变是在W181处的非丙氨酸突变。在另一个实施方案中，所述突变是在R142和R144处的非丙氨酸突变。在某些实施方案中，所述突变非排它地是以下的一个、一些或全部：T13I、T101I、Q129H、G153D、W181A、F190A、F194A和D209Y。
[0158] 在某些实施方案中，所述突变是在一个或多个残基处，所述残基位于N2结构域的表面上，所述表面是g3p的结合性菌毛的部分。在一个实施方案中，所述突变是在一个或多个残基处，所述残基位于N2结构域的外边缘上。在其它实施方案中，所述突变是在一个或多个残基处，所述残基位于N1结构域的表面上，所述表面是g3p的结合TolA的部分。在一个实施方案中，所述突变是在一个或多个残基处，所述残基位于N1结构域的外边缘上。在另一个实施方案中，所述突变是在g3p的一个或多个溶剂可接近的残基处。在另一个实施方案中，所述突变将Pro213处的顺/反平衡转换为大于50％、60％、70％、80％、90％或
95％反式。因而，在某些实施方案中，所述g3p是在Pro213处具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％反式的顺/反平衡的突变的g3p。
95％反式。因而，在某些实施方案中，所述g3p是在Pro213处具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％反式的顺/反平衡的突变的g3p。
[0159] 在某些实施方案中，所述g3p突变体或其淀粉样蛋白结合片段不包括在结构上保守的残基处的突变。在结构上保守的残基的例子包括这样的残基：尽管存在潜在序列插入，其参与提供Ff和I-家族成员的结构域结构。
[0160] 在某些实施方案中，产生的任何突变保持淀粉样蛋白结合。在其它实施方案中，所述突变不会替换脯氨酸残基。
[0161] 在某些实施方案中，产生的任何突变保持淀粉样蛋白结合且不会替换半胱氨酸残基。在某些实施方案中，所述突变保持全部、至少1个、至少2个、至少3个或所有4个在g3p内存在的二硫桥。因而，在一个实施方案中，任何突变保持N1中在Cys7和Cys36之间以及在Cys46和Cys53之间的2个二硫桥。在另一个实施方案中，任何突变保持N1中在Cys7和Cys36之间以及在Cys46和Cys53之间的二硫桥中的任一个，但是不是2个。在一
个实施方案中，保持在Cys188和Cys201之间的二硫桥。在某些实施方案中，保持在Cys7和Cys36之间、在Cys46和Cys53之间、以及在Cys188和Cys201之间的二硫桥中的每一个。
在一个实施方案中，所述突变保持在Cys354和Cys371之间的二硫桥。在某些实施方案中，所述突变保持在Cys7和Cys36之间、在Cys46和Cys53之间、在Cys188和Cys201之间、以及在Cys354和Cys371之间的二硫桥。
个实施方案中，保持在Cys188和Cys201之间的二硫桥。在某些实施方案中，保持在Cys7和Cys36之间、在Cys46和Cys53之间、以及在Cys188和Cys201之间的二硫桥中的每一个。
在一个实施方案中，所述突变保持在Cys354和Cys371之间的二硫桥。在某些实施方案中，所述突变保持在Cys7和Cys36之间、在Cys46和Cys53之间、在Cys188和Cys201之间、以及在Cys354和Cys371之间的二硫桥。
[0162] 在某些实施方案中，产生的任何突变保持淀粉样蛋白结合并降低N1N2的解链温度(TM)。使用在实施例中描述的任意方法，可以测量TM。预见到降低N1N2的TM的突变体会表现出更好的与Aβ的结合、在更大程度上抑制Aβ装配、和在解聚测定中至少象M13的g3p一样有效。因此，预见到这样的突变体、以及包含这些突变体的融合蛋白和噬菌体在治疗一种或多种蛋白错误折叠疾病时分别至少象M13中的对应序列、其融合蛋白和完整M13一样治疗上有效。
[0163] 也可以设计突变体以包括靶向序列。可以将这样的靶向序列插入在N1N2之间、或在N2和N2融合蛋白的另一个结构域之间的柔性接头区域中。靶向核定位序列(NLS)在亨廷顿病中可能是有益的。靶向核内体在帕金森病中可能是有益的。
[0164] 除了靶向细胞中的特定区域以外，可以使用靶向序列靶向不同种类的淀粉样蛋白。成核序列(Nucleating sequence)可以增加亲和力和将突变体蛋白导向特定淀粉样蛋白。可以制备包括肽序列的其它突变体，所述肽序列是疏水的，以致于它们自己沉淀。例如，可以将多个AVVAI序列添加至g3p和/或其淀粉样蛋白结合片段(例如，N2和N1N2)和/或它们的融合蛋白以产生具有增强的、多个结合序列的嵌合蛋白。结合淀粉样蛋白且可以掺入包含g3p、N2和N1N2和/或它们的融合蛋白的突变体或嵌合蛋白中的肽的一些例子
是，基于在Sato,Biochemistry(2006)45:5503-16中描述的GxFxGxF(SEQ ID NO:21)框架和在Tjernberg等人,J.Biol.Chem.(1996)271:8545-48中描述的KLVFF(SEQ ID NO:22)
肽的肽抑制剂。其它靶向部分是已知的，且也可以用在本发明中。参见，例如，Sciarretta等人,Methods in Enzymology(2006)413:273-312。
是，基于在Sato,Biochemistry(2006)45:5503-16中描述的GxFxGxF(SEQ ID NO:21)框架和在Tjernberg等人,J.Biol.Chem.(1996)271:8545-48中描述的KLVFF(SEQ ID NO:22)
肽的肽抑制剂。其它靶向部分是已知的，且也可以用在本发明中。参见，例如，Sciarretta等人,Methods in Enzymology(2006)413:273-312。
[0165] 淀粉样蛋白结合展示媒介物和载体
[0166] 在本发明的另一个方面，g3p和其淀粉样蛋白结合片段(包括前述任一种的突变体和变体)(包括、但不限于N1N2结构域和N2结构域、以及分子、多肽和包含它们的融合蛋白)可以与其它有机或甚至无机载体组合，所述载体提供保持淀粉样蛋白结合的分子支架，但是提供额外特征。
[0167] 在某些实施方案中，所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段或g3p融合蛋白和所述载体通过非重组方式共价地连接，例如，除了肽键以外的化学连接。可以使用任意合适的化学交联剂。也可以使用将多肽与其它分子(例如，载体)共价连接的任何已知方法。在某些实施方案中，所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段或g3p融合蛋白和所述载体可以通过接头融合，所述接头包含至少一个氨基酸或化学部分。
[0168] 在某些实施方案中，非共价地连接所述g3p或其淀粉样蛋白结合片段或g3p融合蛋白和所述载体。在某些这样的实施方案中，可以使用例如结合对连接它们。示例性的结合对包括、但不限于：生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素、抗体和它的抗原等。
[0169] 载体的例子包括、但不限于：病毒颗粒(包括噬菌体，参见下文)，其中g3p蛋白或其淀粉样蛋白结合片段(其不是病毒的天然部分)作为病毒结构的一部分掺入；聚合物，无论天然的、合成的还是混合的；聚合物-外壳结构，诸如珠子(包括表面衍生化的珠子)；聚氨基酸、核酸；和脂质体。所述载体可以直接地或间接地连接至g3p或淀粉样蛋白结合片段。取决于载体，可以使用中间连接来提供载体和淀粉样蛋白结合结构域之间的适当间距。
[0170] 聚氨基酸可以是载体蛋白。这样的聚氨基酸可以选自血清白蛋白(诸如HSA)、另外的抗体或其部分(例如Fc区)、胎球蛋白A、胎球蛋白B、亮氨酸拉链核因子红系衍生物-2(NFE2)、神经视网膜亮氨酸拉链、四连接素或其它聚氨基酸(例如，赖氨酸)。聚氨基酸的连接位置可以是在N末端或C末端或二者之间的其它位置，且也可以通过化学接头部分连接至g3p或其淀粉样蛋白结合片段。
[0171] 在某些实施方案中，载体包括具有寡聚化结构域的分子。当蛋白或其片段的功能之一是结合时，寡聚化会提供功能优点，包括多价、增加的结合强度和不同结构域的组合功能。这些特征在天然蛋白中观察到，并且也可以通过蛋白质工程引入。因此，本发明也提供了包含寡聚化结构域(例如，二聚化结构域)的g3p和淀粉样蛋白结合片段(包括其突变体和变体)诸如N1N2结构域和N2结构域。合适的寡聚化结构域包括卷曲螺旋结构域，包括α-螺旋卷曲螺旋结构域；胶原结构域；胶原-样结构域和二聚体的免疫球蛋白结构域。
本发明的合适的卷曲螺旋多肽融合配偶体包括四连接素卷曲螺旋结构域，软骨寡聚体基质蛋白的卷曲螺旋结构域；血管生成素卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。当使用胶原或胶原-样寡聚化结构域时，它们可以包含例如在以下物质中发现的那些：胶原、结合甘露糖的凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂联素、纤维胶凝蛋白、胶固素、巨噬细胞清道夫受体和emilin。尽管这些结构域中的一些可以作为融合蛋白掺入，在许多实施方案中，它们非重组地连接至g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段，例如，通过共价键合。
本发明的合适的卷曲螺旋多肽融合配偶体包括四连接素卷曲螺旋结构域，软骨寡聚体基质蛋白的卷曲螺旋结构域；血管生成素卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。当使用胶原或胶原-样寡聚化结构域时，它们可以包含例如在以下物质中发现的那些：胶原、结合甘露糖的凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂联素、纤维胶凝蛋白、胶固素、巨噬细胞清道夫受体和emilin。尽管这些结构域中的一些可以作为融合蛋白掺入，在许多实施方案中，它们非重组地连接至g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段，例如，通过共价键合。
[0172] 另外，本发明提供了与聚合物连接的g3p或其淀粉样蛋白结合片段或g3p融合蛋白。就治疗性产品或组合物的制备而言，在本发明中采用的聚合物是药学上可接受的。
[0173] 考虑到对多肽的功能或抗原结构域的影响，通常将聚合物连接至g3p或其淀粉样蛋白结合片段。一般而言，可以在用于使蛋白与活化的聚合物分子反应的任意合适条件下进行化学衍生化。可以用于将聚合物连接至活性部分的活化基团包括砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲基磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙啶(azidirine)、环氧乙烷、和5-吡啶基。
[0174] 合适的、临床上可接受的、水溶性的聚合物包括、但不限于：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(同聚物或无规共聚物)、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇同聚物(PPG)和其它聚氧化烯(polyakylene oxide)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(POG)(例如，甘油)和其它聚氧乙基化的多元醇、聚氧乙基化的山梨糖醇或聚氧乙基化的葡萄糖、结肠酸或其它碳水化合物聚合物，蔗聚糖或葡聚糖及其混合物。
[0175] 本发明的PEG部分可以是支链或直链聚合物。在一个实施方案中，中，本发明预见到包括单-或聚-(例如，2-4个)PEG部分的化学衍生化的多肽。通过本领域已知的任意聚乙二醇化反应，可以实现聚乙二醇化。用于制备聚乙二醇化的蛋白产物的方法通常是本领域已知的。最佳反应条件将根据个例来确定，取决于已知的参数和期望的结果。
[0176] 本领域技术人员可得到许多PEG连接方法，例如，EP 0 401 384；Malik等人,Exp.Hematol.,(1992)20:1028-1035；Francis,Focus on Growth Factors,3:4-10(1992)；EP 0154 316；EP 0 401384；WO 92/16221；WO 95/34326；和在本文中引用的与聚乙二醇化有关的其它出版物。
[0177] 当将g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段(以及它们的突变体和变体，和包含前述任一种的化合物、多肽和融合蛋白)聚乙二醇化时，可以通过化学衍生化g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段来连接PEG。在其它实施方案中，可以将适合用于PEG分子修饰的氨基酸残基重组地引入g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段中。
[0178] 通过与反应性聚乙二醇分子的酰化反应或或烷基化反应，可以执行聚乙二醇化。因而，本发明的蛋白产物包括聚乙二醇化的蛋白，其中PEG基团经由酰基或烷基而连接。这样的产物可以是单-聚乙二醇化的或多-聚乙二醇化的(例如，含2-6个或2-5个PEG基
团的那些)。合适的活化的PEG酯的一个例子是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化的PEG。
团的那些)。合适的活化的PEG酯的一个例子是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化的PEG。
[0179] 通过烷基化进行的聚乙二醇化通常包括在有还原剂存在下使PEG的末端醛衍生物与多肽反应。就还原性烷基化反应而言，选择的聚合物应当具有单个反应性醛基。一种示例性的反应性PEG醛是水稳定的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物，参见例如，美国专利号5,252,714。
[0180] 在某些实施方案中，将g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段表达为噬菌体的一部分，并通过从噬菌体颗粒分离它来制备g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段。但是，一般而言，使用重组技术来制备g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段(包括其突变体和变体)。一般而言，在与载体组合之前，分离得到的蛋白。
[0181] 在某些实施方案中，所述展示媒介物是噬菌体。在这些实施方案中，将编码g3p蛋白、N1N2结构域、N2结构域和其它淀粉样蛋白结合片段(包括所有前述的突变体和变体)的基因掺入噬菌体基因组中，并作为噬菌体的一部分来表达。例如，在一个实施方案中，使用与M13噬菌体的g3p相比具有更高淀粉样蛋白结合亲和力的突变体g3p蛋白来替代M13噬菌体的野生型g3p。得到的噬菌体因而也具有比野生型M13改善的结合。但是，描述的任意g3p或淀粉样蛋白结合片段可以掺入噬菌体中。在这些实施方案中，野生型基因3可以被本发明的g3p完全替换。可替换地，如关于具有增加的g3p拷贝数的噬菌体所讨论的，可以将重组分子与编码噬菌体外壳蛋白(包括野生型g3p)的基因融合，并以类似于噬菌体展示文库中的抗原和抗体链的方式在噬菌体上展示。可以修饰任意丝状噬菌体以表达本发明的g3p，包括、但不限于M13、fd、f1、I22、Ike或If1。在某些实施方案中，可以与经修饰的噬菌体结合使用辅助噬菌体。
[0182] 重组技术
[0183] 一般而言，使用常规重组DNA技术，诸如g3p基因的克隆、直接DNA合成或通过使用例如M13序列作为探针从文库分离对应DNA，制备编码g3p蛋白或其淀粉样蛋白结合片段(以及它们的突变体和变体，和包含前述任一种的化合物、多肽和融合蛋白)的DNA(参见，例如，Sambrook等人.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y. 和 Ausubel 等 人 .1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.)。
[0184] 就重组生产而言，将编码g3p或其淀粉样蛋白结合片段的核酸序列插入适当的表达载体中，所述表达载体含有插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件，或者在RNA病毒载体的情况下，复制和翻译所必需的元件。将编码核酸插入载体内的适当读码框中。
[0185] 因此，本发明提供了载体，其包含编码g3p或其淀粉样蛋白结合片段(包括其突变体和变体)的多核苷酸。也提供了这样的载体，其包含编码g3p或g3p-融合分子的多核苷酸。这样的载体包括、但不限于：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0186] 在某些实施方案中，选择为在CHO或CHO-衍生的细胞中表达多肽而优化的载体。示例性的这类载体描述在，例如，Running Deer等人,Biotechnol.Prog.
(2004)20:880-889。
(2004)20:880-889。
[0187] 在某些实施方案中，为g3p、其淀粉样蛋白结合片段和/或g3p融合分子在动物(包括人类)中的体内表达而选择载体。在某些这样的实施方案中，所述多肽的表达是在以组织特异性方式起作用的启动子的控制下。
[0188] 将表达载体转染或共转染进表达所述多肽的合适靶细胞中。非限制性的示例性转染方法描述在，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据本领域已知的方法，可以将核酸瞬时地或稳定地转染进期望的宿主细胞中。多种宿主表达载体系统可以用于表达本文描述的蛋白，包括原核或真核细胞。这些包括、但不限于：用含有适当编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌(例如，大肠杆菌)；用含有适当编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有适当编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒)感染的或用含有适当编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包括哺乳动物细胞(例如，CHO、Cos、HeLa细胞)。还可以在浮萍中重组地生产蛋白。参见，例如，美国专利8,022,270。
[0189] 在转化中使用的载体经常含有用于鉴别转化体的选择标记。在细菌系统中，这可以包括抗生素抗性基因诸如氨苄西林或卡那霉素。用于培养的哺乳动物细胞的选择标记包括赋予对药物(诸如新霉素、潮霉素和甲氨蝶呤)的抗性的基因。所述选择标记
可以是可扩增的选择标记。一种可扩增的选择标记是DHFR基因。另一种可扩增的标志
物是DHFRr cDNA(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、(1983)80:2495)。
Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)综述了选择标记，选择标记的选择完全在本领域的普通技术水平内。
可以是可扩增的选择标记。一种可扩增的选择标记是DHFR基因。另一种可扩增的标志
物是DHFRr cDNA(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、(1983)80:2495)。
Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)综述了选择标记，选择标记的选择完全在本领域的普通技术水平内。
[0190] 表达系统的表达元件在它们的强度和特异性方面存在差异。取决于使用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译元件(包括组成型和诱导型启动子)中的任一种可以用在表达载体中。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子诸如pL噬菌体λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用启动子诸如杆状病毒多角体启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用源自植物细胞基因组(例如，热激启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或源自植物病毒(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)的启动子；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子；当制备含有表达产物的多个拷贝的细胞系时，可以与适当的选择标记一起使用基于SV40、BPV和EBV的载体。
[0191] 在使用植物表达载体的情况下，编码本发明的线性或非环化形式的表达产物的序列的表达可以由许多启动子中的任一种驱动。例如，可以使用病毒启动子诸
如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人,Nature(1984)310:511-514)或
TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等人,EMBO J.(1987)6:307-311)；可替换地，可以
使用植物启动子诸如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等人,EMBO J.(1984)3:1671-1680；
Broglie等人,Science(1984)224:838-843)或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或
hsp17.3-B(Gurley等 人 ,Mol.Cell.Biol.(1986)6:559-565)。 使 用 Ti 质 粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等，可以将这些构建体引入植物细胞中。关于这样的技术的综述，参见，例如，Weissbach&Weissbach1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII, 第 421-463 页； 和
Grierson&Corey1988,Plant Molecular Biology,第2版,Blackie,London,第7-9章。
如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人,Nature(1984)310:511-514)或
TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等人,EMBO J.(1987)6:307-311)；可替换地，可以
使用植物启动子诸如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等人,EMBO J.(1984)3:1671-1680；
Broglie等人,Science(1984)224:838-843)或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或
hsp17.3-B(Gurley等 人 ,Mol.Cell.Biol.(1986)6:559-565)。 使 用 Ti 质 粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等，可以将这些构建体引入植物细胞中。关于这样的技术的综述，参见，例如，Weissbach&Weissbach1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII, 第 421-463 页； 和
Grierson&Corey1988,Plant Molecular Biology,第2版,Blackie,London,第7-9章。
[0192] 在一个可以用于生产本发明蛋白的昆虫表达系统中，使用苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病病毒(AcNPV)作为载体来表达外源基因。在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中培养该病毒。可以将编码序列克隆进该病毒的非必需区域(例如，多角体基因)中，并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)控
制下。编码序列的成功插入会导致多角体基因的灭活和未闭合重组病毒(即缺乏由多角体基因编码的蛋白性外壳的病毒)的产生。然后使用这些重组病毒感染草地贪夜蛾细胞，在其中表达插入的基因(参见，例如，Smith等人,J.Virol.(1983)46:584；美国专利号
4,215,051)。该表达系统的其它例子可以参见：Ausubel等人编.1989,Current Protocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience。
制下。编码序列的成功插入会导致多角体基因的灭活和未闭合重组病毒(即缺乏由多角体基因编码的蛋白性外壳的病毒)的产生。然后使用这些重组病毒感染草地贪夜蛾细胞，在其中表达插入的基因(参见，例如，Smith等人,J.Virol.(1983)46:584；美国专利号
4,215,051)。该表达系统的其它例子可以参见：Ausubel等人编.1989,Current Protocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience。
[0193] 在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将编码序列连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后，通过体外或体内重组，可以将该融合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中的插入将产生可在受感染宿主中存活并能表达肽的重组病毒(参见，例如，Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81:3655)。可替换地，可以使用牛痘7.5K启动子(参见，例如，Mackett等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:7415；Mackett等人,J.Virol.(1984)49:857；Panicali等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:4927)。其它病毒表达系统包括腺伴随病毒和慢病毒。
[0194] 在适当的生长培养基中培养含有DNA构建体的宿主细胞。本文中使用的术语“适当的生长培养基”是指含有细胞生长所需的营养物的培养基。使用本领域中的常规技术，可以从培养基中分离本发明的重组生产的蛋白。
[0195] 体外测定
[0196] 在某些实施方案中，使用硫代黄素T荧光(ThT)测定，可以监测淀粉样蛋白的解聚。
[0197] 在某些实施方案中，通过监测在有或没有本发明组合物存在下的去污剂增溶来试验解聚。例如，可以用本发明组合物处理聚集的α-突触核蛋白。使聚集的α-突触核蛋白解聚的组合物会造成α-突触核蛋白纤维在去污剂(诸如SDS)中比未处理的纤维更快地溶解。通过在聚集过程中掺入一定比例的标记的(例如，用Cy5)α-突触核蛋白单体，可以监测淀粉样蛋白纤维向可溶形式的这种转化。
[0198] 在某些实施方案中，通过神经元细胞培养物细胞毒性测定，试验阻止有毒淀粉样蛋白寡聚体的形成。在该测定中，将分化的N2a神经母细胞瘤细胞或等效细胞与Aβ42寡聚体共温育。所述寡聚体结合膜并造成膜微扰和细胞溶质酶向培养基中的泄漏。与高浓度的寡聚体一起长时间温育会杀死细胞。当在与细胞一起温育之前用噬菌体或g3p预处理寡聚体时，所述寡聚体是至少更低毒性的，且有时是无毒的。通过测量腺苷酸激酶(在膜微扰以后由神经元细胞释放的一种示例性的细胞溶质酶)的释放，可以定量该中和效应。
[0199] 在某些实施方案中，本发明组合物会在蛋白错误折叠循环扩增(PMCA)测定中抑制可溶性的朊病毒蛋白转化成蛋白水解酶K抗性的构象异构体。Wang等
人,Science,(2010)327:1132-35。在该测定中，在有或没有本发明组合物存在下，将重组PrP与脂质POPG和RNA混合。然后对该材料进行多个(例如，48个)30秒声处理的循环，随后温育29.5分钟。然后使用反应混合物的一部分接种另一个底物试管，并重复所述循环。
针对蛋白水解酶K抗性材料的存在(其指示PrP的传染形式)，试验每个循环。在有本发明组合物存在下蛋白水解酶K抗性材料的减少指示，所述组合物抑制PK抗性的构象异构体的形成。
人,Science,(2010)327:1132-35。在该测定中，在有或没有本发明组合物存在下，将重组PrP与脂质POPG和RNA混合。然后对该材料进行多个(例如，48个)30秒声处理的循环，随后温育29.5分钟。然后使用反应混合物的一部分接种另一个底物试管，并重复所述循环。
针对蛋白水解酶K抗性材料的存在(其指示PrP的传染形式)，试验每个循环。在有本发明组合物存在下蛋白水解酶K抗性材料的减少指示，所述组合物抑制PK抗性的构象异构体的形成。
[0200] 如上面所指出的，还可以在过滤器截留测定中检测淀粉样蛋白形式的某些朊病毒蛋白，诸如酵母朊病毒蛋白NM。因此，在某些实施方案中，取决于朊病毒蛋白，可以在过滤器截留测定中试验本发明组合物的解聚朊病毒蛋白聚集体的能力。
[0201] 体内功能测定
[0202] 除了可以在体外测定中证实的活性(诸如增加的对淀粉样蛋白的结合亲和力或TM的减小)以外，本发明的组合物也可以在几种体内测定之一中减少淀粉样蛋白。一种用于确定体内淀粉样蛋白减少的方法使用正电子发射断层摄影术(PET)，其中在处理之前和之后使用成像剂florbetapir(F18-AV-45,Eli Lilly)，以对比β-淀粉样蛋白的数目和/或分布。当然，随着额外生物标志物被鉴别出，它们也可以用于测量淀粉样蛋白的减少。
[0203] 另一种确定组合物是否会减少体内淀粉样蛋白的方法使用hAPP小鼠模型。Rockenstein,J Neurosci Res.(2001)66(4):573-82。这些小鼠在早期年龄(3-4个月)发展出高水平的β-淀粉样蛋白。可以如下确定组合物的减少淀粉样蛋白的能力：给小鼠注射本发明组合物，然后将那些小鼠中的淀粉样蛋白水平与未注射的对照进行对比。也可能仅将组合物注射进hAPP小鼠的一个半球中，从而允许在相同小鼠的注射的半球和未注射的半球之间对比淀粉样蛋白水平。
[0204] 在另一个实施例中，在以下文献描述的阿尔茨海默氏病(TgAD)的转基因小鼠模型中试验本发明的组合物：US2011/0142803,Hsiao等人,Science(1996)274:99-102,或Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38。简而言之，攻击野生型以及转基因小鼠。为了评估本发明组合物的充当解聚剂的潜力，将组合物颅内地注射给转基因小鼠(Taconic,APPSWE(2576),10月龄)。例如，对于包含噬菌体的组合物，历时10分钟将2.5μl14
丝状噬菌体溶液(10 噬菌体/ml)注射(前囟点-2.8mm,外侧2.5mm,腹侧2.5mm)至一个
半球，同时向对侧施加磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照。然后在不同的时间点处死经治疗的小鼠，将脑在4％低聚甲醛中后固定过夜，并使用切片机切片。进行硫代黄素-S(ThS)染色，以评价淀粉样蛋白负载。用Mayer氏苏木精将切片染色以淬灭核自发荧光，并在洗涤以后，施加ThS溶液(1％)3分钟。使用1％乙酸进行分化20min，在洗涤以后，干燥载玻片，并用抗衰老固定介质固定。使用LEICA Qwin程序，计算淀粉样蛋白负载。可替换地，可以用抗-淀粉样蛋白抗体评估淀粉样蛋白负载。
丝状噬菌体溶液(10 噬菌体/ml)注射(前囟点-2.8mm,外侧2.5mm,腹侧2.5mm)至一个
半球，同时向对侧施加磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照。然后在不同的时间点处死经治疗的小鼠，将脑在4％低聚甲醛中后固定过夜，并使用切片机切片。进行硫代黄素-S(ThS)染色，以评价淀粉样蛋白负载。用Mayer氏苏木精将切片染色以淬灭核自发荧光，并在洗涤以后，施加ThS溶液(1％)3分钟。使用1％乙酸进行分化20min，在洗涤以后，干燥载玻片，并用抗衰老固定介质固定。使用LEICA Qwin程序，计算淀粉样蛋白负载。可替换地，可以用抗-淀粉样蛋白抗体评估淀粉样蛋白负载。
[0205] 还可以测量放射性的(例如，I125)或荧光地标记的组合物或未标记的组合物(包括丝状噬菌体)的生物分布，以证实组合物在体内结合淀粉样蛋白。例如，当组合物包含噬菌体时，可以放射性地或荧光地标记丝状噬菌体。将BALB/c小鼠分组。然后每只小鼠历时12
1小时鼻内地接受100μl噬菌体(1.25x10 噬菌体)。在使用4％低聚甲醛施用贲门内灌
注以后1小时，处死第一组小鼠。在治疗后3小时，处死第二组，并在24小时后处死最后一组。灌注以后，取出脑以及周围器官，并测量标记。可替换地，使用类似的方法，可以评估未标记的组合物或噬菌体的结合，但是用识别淀粉样蛋白的染色剂和识别组合物或噬菌体的染色剂将脑切片共染色。
1小时鼻内地接受100μl噬菌体(1.25x10 噬菌体)。在使用4％低聚甲醛施用贲门内灌
注以后1小时，处死第一组小鼠。在治疗后3小时，处死第二组，并在24小时后处死最后一组。灌注以后，取出脑以及周围器官，并测量标记。可替换地，使用类似的方法，可以评估未标记的组合物或噬菌体的结合，但是用识别淀粉样蛋白的染色剂和识别组合物或噬菌体的染色剂将脑切片共染色。
[0206] 还使用丝状噬菌体的鼻内施用来完全评价包含本发明提供的噬菌体(诸如包含突变体g3p或g3p的淀粉样蛋白结合片段的噬菌体，或与野生型噬菌体相比具有增加
的g3p数目的噬菌体)的组合物。例如，将噬菌体鼻内地施用给SWE/APP2576转基因小
鼠(Taconic,10月龄)，即阿尔茨海默氏病的小鼠模型。每2周施用20微升噬菌体溶液
12
(5x10 /ml)持续4-12个月，并评价认知功能。治疗阶段以后，进行新物体识别试验以研究噬菌体治疗对记忆改善的影响。在第一天，将小鼠暴露于2个新物体持续20分钟。次日，替换一个物体，并试验小鼠的探究该新物体的好奇心。如下计算每只小鼠的识别指数：将它在新物体附近花费的时间除以在2个物体附近花费的总时间。因而，超过0.5的值指示识别旧物体和在新物体附近花费更多的时间来进行它的研究。
的g3p数目的噬菌体)的组合物。例如，将噬菌体鼻内地施用给SWE/APP2576转基因小
鼠(Taconic,10月龄)，即阿尔茨海默氏病的小鼠模型。每2周施用20微升噬菌体溶液
12
(5x10 /ml)持续4-12个月，并评价认知功能。治疗阶段以后，进行新物体识别试验以研究噬菌体治疗对记忆改善的影响。在第一天，将小鼠暴露于2个新物体持续20分钟。次日，替换一个物体，并试验小鼠的探究该新物体的好奇心。如下计算每只小鼠的识别指数：将它在新物体附近花费的时间除以在2个物体附近花费的总时间。因而，超过0.5的值指示识别旧物体和在新物体附近花费更多的时间来进行它的研究。
[0207] 蛋白错误折叠疾病的其它转基因模型也可以用于证实，本发明组合物会减少淀粉样蛋白。非限制性例子包括：“D系”α-突触核蛋白小鼠(一种帕金森病模型,Masliah等人,Science(2000)287:1265-1269)；Tg2576小鼠(一种阿尔茨海默氏病模型,Hsiao等人,Science(1996)274:99-102和Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38在9)；用于帕金森病研究的不同 小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)；和可
得自JSW Lifescience的小鼠和大鼠模型，包括用于帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病的那些。
得自JSW Lifescience的小鼠和大鼠模型，包括用于帕金森病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病的那些。
[0208] 预见到其中已经使g3p为无活性的噬菌体在这些测定中是无活性的，而野生型噬菌体会共同局部化至淀粉样蛋白、减少淀粉样蛋白负载、阻止淀粉样蛋白形成和/或除去有毒寡聚体，并导致认知功能的改善。因而可以相对于这些阴性和阳性对照试验本发明提供的包含g3p或其淀粉样蛋白结合片段的噬菌体的体内活性。
[0209] 药物组合物
[0210] 在另一个方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含本发明的任意上述试剂(即，(a)g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体；(b)化合物、多肽和融合蛋白，其包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体；(c)丝状噬菌体，其携带与野生型噬菌体相比增加的g3p拷贝数；(d)结合淀粉样蛋白的展示媒介物，其携带：g3p，g3p的淀粉样蛋白结合片段，其突变体或变体，或者包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体的化合物、多肽和融合蛋白；或(e)经修饰的丝状噬菌体，其携带g3p的变体、g3p的淀粉样蛋白结合片段(不是作为展示的g3p蛋白的一部分)、这样的结合片段的突变体或变体、或者包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体的融合蛋白或其它异源多肽)。
[0211] “药物组合物”表示治疗有效量的如本文中所述的组合物和生理学上合适的载体和/或赋形剂。药物组合物不会造成对生物体的显著刺激。短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可以互换使用，表示不会造成对生物体的显著刺激且不会废除施用的组合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。
[0212] 术语“赋形剂”表示，加入到药物组合物中以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。例子包括、但不限于，例如，盐水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖和不同类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨酯20。
[0213] 使用一种或多种生理上可接受的载体(包含赋形剂和助剂)，可以以常规方式配制用于根据本发明的用途的药物组合物，所述载体促进将所述活性成分加工成在药学上可以使用的组合物。适当的制剂取决于选择的施用途径和递送的组合物的性质(例如，蛋白相对于噬菌体)。
[0214] 本发明的药物组合物的合适施用途径可以包括，例如，透粘膜递送，特别是经鼻递送；胃肠外递送，包括肌肉内、皮下、骨髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射；口服；或直肠递送。
[0215] 在某些实施方案中，以局部方式而不是全身方式施用药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射进患者的脑中。在某些实施方案中，所述注射技术是避开血脑屏障的任意技术，例如，通过直接骨髓内、鞘内或心室内注射。
[0216] 对于注射，本发明的活性成分可以配制在水溶液中，优选地在生理上相容的缓冲液(诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)中。对于透粘膜施用，在所述制剂中使用适合要透过的屏障的穿透剂。所述穿透剂在本领域内是公知的。
[0217] 在某些实施方案中，通过鼻内给药来施用本发明的药物组合物。已经报道，鼻内递送能使病毒和大分子直接进入脑脊液(CSF)或CNS中。Mathison等人,1998；Chou等人,1997；Draghia等人,1995。
[0218] 对于通过鼻内途径的施用，以气溶胶喷雾的形式从加压包装或喷雾器借助于合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)方便地递送组合物。在加压气溶胶的情况下，通过提供阀来递送计量的量，可以确定剂量单元。可以配制在分配器中使用的胶囊和药盒(例如由明胶制成)，其含有所述化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
[0219] 使用嗅觉受体神经元作为递送点，也可以将在本文中描述为药物组合物组分的各种蛋白递送至脑。例如，经由嗅觉受体神经元，可以递送包含编码那些蛋白中的任一种的基因的腺病毒载体。Draghia等人,1995。
[0220] 可以配制本文描述的组合物用于胃肠外施用，例如，通过快速推注或连续输注。用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶形式的组合物的水溶液。另外，可以将活性成分的混悬液制备为油性的或基于水的注射混悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬液可以含有增加该混悬液的粘性的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，所述混悬液还可以含有合适的稳定剂或试剂(例如，表面活性剂诸如聚山梨酯(吐温20))，其增加活性成分的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液。基于蛋白的试剂(例如，白蛋白)可以用于阻止M13向递送表面(即，IV袋、导管、针头等)的吸附。
[0221] 对于口服施用，通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体相组合，可以容易地配制组合物。
[0222] 制剂可以以单位剂型形式存在，例如，在管形瓶、安瓿中或在多剂量容器中，任选地含有添加的防腐剂。所述组合物可以是在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。单个剂型可以呈液体或固体形式。可以将单个剂型不经修改地直接施用给患者，或者可以在施用之前稀释或重构。在某些实施方案中，可以以推注形式(例如，单次注射、单次口服剂量，包括包含多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量)施用单个剂型。在替代实施方案中，可以在一段时间内施用单个剂型，诸如通过输注，或经由植入泵，诸如ICV泵。在后一种实施方案中，所述单个剂型可以是预装了指定数目的丝状噬菌体的输注袋或泵蓄池。可替换地，可以在即将施用给患者之前，通过将单次剂量的丝状噬菌体与输注袋或泵蓄池溶液混合来准备所述输注袋或泵蓄池。
[0223] 本发明的另一个方面包括用于制备本发明的药物组合物的方法。用于配制药物的技术可以参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版，其通过引用整体并入本文。
[0224] 适合用在本发明范围内的药物组合物包括这样的组合物，其中含有有效地达到预期目的的量的活性成分。
[0225] 治疗或诊断有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是考虑到本文中提供的详细公开内容。
[0226] 可以个别地调节给药量和间隔，以提供足以治疗或诊断特定脑疾病、障碍或病症的噬菌体展示媒介物的脑水平(最低有效浓度,MEC)。所述MEC将随每种制剂而变化，但是可以从体外数据估测。达到MEC所必需的剂量将取决于个体特征。
[0227] 给药间隔也可以使用MEC值来确定。应当使用特定方案来施用制剂，所述方案维持高于MEC的脑水平持续10-90％的时间，优选30-90％，且最优选50-90％。
[0228] 取决于要治疗的病症的严重程度和应答性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续几天至几周，或直到实现治愈或达到疾病状态的减轻。
[0229] 要施用的组合物的量当然取决于被治疗或诊断的受试者、痛苦的严重程度、处方医师的判断等。
[0230] 如果需要的话，本发明的组合物可以存在于包装或分配器装置(诸如FDA批准的试剂盒)中，其可以含有一个或多个包含活性成分的单位剂型。所述包装可以包含例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。所述包装或分配器装置可以伴有施用说明书。所述包装或分配器还可以包纳与容器结合的公告，所述公告采用管理药物的制备、使用或销售的政府机构指定的形式，所述公告反映了所述机构对所述组合物的形式或人或兽施用的批准。例如，这样的公告可以是由美国食品和药品管理局关于处方药物批准的标记，或是批准的产品插页。也可以制备包含在相容药用载体中配制的本发明制剂的组合物，将其放置在适当的容器中，并且标记用于指定病症的治疗，如同上文更详细所述那样。
[0231] 应当理解，前面的和下面的描述仅仅是示例性的和解释性的，且不限制要求保护的发明。
[0232] 治疗用途
[0233] 如指出的，丝状噬菌体M13和有关的丝状噬菌体已经在蛋白错误折叠疾病的动物模型中表现出效应。参见美国专利公开US 2011/0142803，通过引用整体并入本文。具体地，已经发现，丝状噬菌体具有解聚在脑中已经形成的淀粉样蛋白的能力。预见到淀粉样蛋白的除去会减轻以脑中错误折叠的和/或聚集的蛋白为特征的多种疾病、减慢所述疾病的进展、或甚至逆转与所述疾病有关的征状。参见，例如，WO2006083795和WO2010060073，通过引用整体并入本文。
[0234] 此外，已经证实M13会解聚至少4种不同的淀粉样蛋白纤维：淀粉样蛋白-β1-42纤维(fAβ42)、α-突触核蛋白纤维(fαsyn)、酵母朊病毒NM纤维(fNM)和tau纤维(ftau)。
[0235] 因此，本发明的另一个方面涉及本发明的任意组合物在治疗蛋白错误折叠疾病(包括、但不限于，涉及fAβ42、fαsyn、fNM或ftau中的任一种的那些疾病)中的用途，所述组合物为诸如包含g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段(包括所有前述物质的突变体或变体)的那些，或包含以上任一种的g3p融合蛋白、展示媒介物或噬菌体。
[0236] 在治疗的上下文中，术语“患者”、“受试者”和“受体”互换使用，且包括人类以及其它哺乳动物。在某些实施方案中，患者是与蛋白错误折叠疾病有关的生物标志物阳性的人。在一个实施方案中，所述患者表现出β-淀粉样沉着物，如通过使用florbetapir的PET成像所检测出。
[0237] 术语“治疗”意图表示，在表现出疾病的一种或多种临床征状的患者中，减轻、减慢或逆转疾病的进展。“治疗”也意图表示，在表现出疾病的一种或多种临床征状的患者中，减轻、减慢或逆转疾病的征状。在一个实施方案中，所述患者表现出β-淀粉样沉着物(如通过使用florbetapir的PET成像所检测出)，并且所述治疗会减少β-淀粉样沉着物的数目。在一个实施方案中，所述患者表现出β-淀粉样沉着物(如通过本发明的g3p组合物所检测出)，并且所述治疗会减少或维持β-淀粉样沉着物的数目。在另一个实施方案中，所述患者表现出任意类型的淀粉样沉着物(如通过PET成像所检测出)，并且所述治疗会改善所述患者的认知功能。通过McKhann等人,Alzheimer’s&Dementia(2011)May；7(3):263-9的方法和试验，可以测定认知功能的改善。
[0238] “预防”不同于治疗，且表示在任何临床征状发作之前给个体施用组合物。包括使用本发明的任意g3p和/或TolA组合物的预防。预防可能涉及已知处于高疾病风险中的个体或确定会发展疾病的个体(仅仅基于一种或多种遗传标记)。已经为不同的蛋白错误折叠疾病鉴别出许多遗传标记。例如，具有人淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的瑞典突变、印第安纳突变或伦敦突变中的一种或多种的个体，处于增加的发展早发型阿尔茨海默氏病的风险中，且所以是预防的候选人。同样地，具有亨廷顿基因中的三核苷酸CAG重复的个体，特别是具有36个或更多个重复的那些个体，将最终发展亨廷顿病，且所以是预防的候选人。
[0239] 在某些实施方案中，将蛋白或片段直接用作治疗剂。在这些实施方案中，将g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段(包括前述任一种的突变体或变体)直接掺入药物组合物或制剂中。在其它实施方案中，g3p、N1N2结构域、N2结构域或其它淀粉样蛋白结合片段(包括前述任一种的突变体或变体)是融合蛋白或展示媒介物(诸如噬菌体)的一部分，且在这些实施方案中，将所述融合蛋白或展示媒介物掺入本发明的药物组合物或制剂中。在其它实施方案中，所述组合物包含含有g3p或其淀粉样蛋白结合片段的噬菌体，其比野生型M13噬菌体的g3p更有效地降低或维持淀粉样蛋白的水平。在某些实施方案中，所述比M13更有效地降低或维持淀粉样蛋白的水平的噬菌体表达g3p的超过5个拷贝。
[0240] 术语“蛋白错误折叠”表示，以通过聚集蛋白(形成淀粉样蛋白的肽)而形成淀粉样蛋白为特征的疾病，所述淀粉样蛋白为例如，但不限于，β-淀粉样蛋白、血清淀粉样蛋白A、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、IgGκ轻链或朊病毒蛋白。已知与错误折叠的和/或聚集的淀粉样蛋白有关的疾病包括阿尔茨海默氏病(包括早发型阿尔茨海默氏病、迟发型阿尔茨海默氏病和症状发生前的阿尔茨海默氏病)、帕金森病、SAA淀粉样变性、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、遗传性冰岛综合征、年老、多发性骨髓瘤、朊病毒疾病，包括、但不限于库鲁病(kuru)、克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊瘙痒症和牛海绵状脑炎(BSE)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷顿病、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、遗传性脑淀粉样蛋白血管病、家族性淀粉样变性、额颞叶痴呆、英国/丹麦痴呆和家族性脑病。本发明的g3p组合物可以用于治疗“蛋白错误折叠”疾病。
[0241] 这些错误折叠的和/或聚集的淀粉样蛋白疾病中的许多发生在中枢神经系统(CNS)中。发生在CNS中的疾病的一些例子是：帕金森病；阿尔茨海默氏病；额颞叶痴呆(FTD)，包括具有下述临床综合征的那些患者：行为变体FTD(bvFTD)、进展性非流利型失语症(PNFA)和词义性痴呆(SD)；额颞叶退化(FTLD)；和亨廷顿病。本发明的g3p组合物可以用于治疗发生在中枢神经系统(CNS)中的以错误折叠的和/或聚集的淀粉样蛋白为特征的疾病。
[0242] 蛋白的错误折叠和/或聚集也可能发生在CNS以外。淀粉样变性A(AA)(其中前体蛋白是血清急性期载脂蛋白，SAA)和多发性骨髓瘤(前体蛋白免疫球蛋白轻链和/或重链)是2种广泛已知的发生在CNS以外的蛋白错误折叠和/或聚集的蛋白疾病。其它例子
包括涉及由以下物质形成的淀粉样蛋白的疾病：β2-微球蛋白、转甲状腺素蛋白(家族性淀粉样变性病的多神经病[FAP]、家族性淀粉样变性病的心肌病[FAC]和老年性全身性淀粉样变性[SSA])、(脱辅基)血清AA、载脂蛋白AI、AII和AIV、钙结合微丝蛋白(家族性淀粉样变性病的多神经病的芬兰形式)、溶菌酶、纤维蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(脑淀粉样蛋白血管病、冰岛型遗传性脑出血伴淀粉样变性)、(原)降钙素、胰岛淀粉样多肽(IAPP淀粉样变性)、心钠素、催乳素、胰岛素、乳粘素、角质上皮素、乳铁蛋白、牙源性成釉质细胞相关蛋白和精液凝固蛋白I。本发明的g3p组合物可以用于治疗发生在CNS以外的涉及蛋白的错误折叠和/或聚集的疾病。
包括涉及由以下物质形成的淀粉样蛋白的疾病：β2-微球蛋白、转甲状腺素蛋白(家族性淀粉样变性病的多神经病[FAP]、家族性淀粉样变性病的心肌病[FAC]和老年性全身性淀粉样变性[SSA])、(脱辅基)血清AA、载脂蛋白AI、AII和AIV、钙结合微丝蛋白(家族性淀粉样变性病的多神经病的芬兰形式)、溶菌酶、纤维蛋白原、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(脑淀粉样蛋白血管病、冰岛型遗传性脑出血伴淀粉样变性)、(原)降钙素、胰岛淀粉样多肽(IAPP淀粉样变性)、心钠素、催乳素、胰岛素、乳粘素、角质上皮素、乳铁蛋白、牙源性成釉质细胞相关蛋白和精液凝固蛋白I。本发明的g3p组合物可以用于治疗发生在CNS以外的涉及蛋白的错误折叠和/或聚集的疾病。
[0243] 神经变性疾病也可能涉及tau病变(综述见Lee等人(2001)Annu.Rev.Neurosci.24:1121-159)。Tau蛋白是在中枢和周围神经系统神经元的轴突中表达的微管相关蛋白。包括神经变性Tau病变(有时被称作Tau病变)。Tau病变的例子包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化/帕金森-痴呆复合征、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底变性、克雅病、拳击员痴呆、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆(包括连锁于17号染色体的伴帕金森症的额颞叶痴呆)、 病、哈-斯二
氏病、肌强直性营养不良、C型Niemann-Pick病、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、皮克病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结性痴呆。这些疾病中的一些还可以包括纤丝状淀粉样蛋白β肽的沉着物。例如，阿尔茨海默氏病表现出淀粉样蛋白β沉着物和tau病变。类似地，朊病毒介导的疾病诸如克雅病、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病和综合征也可能具有tau病变。因而，疾病是“Tau病变”
的指示不应当解释为排除来自其它神经变性疾病分类或分组的疾病，其仅仅为了方便而提供。本发明的g3p组合物可以用于治疗神经变性疾病以及涉及tau病变的疾病。
氏病、肌强直性营养不良、C型Niemann-Pick病、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、皮克病、脑炎后帕金森症、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结性痴呆。这些疾病中的一些还可以包括纤丝状淀粉样蛋白β肽的沉着物。例如，阿尔茨海默氏病表现出淀粉样蛋白β沉着物和tau病变。类似地，朊病毒介导的疾病诸如克雅病、朊病毒蛋白脑淀粉样蛋白血管病和综合征也可能具有tau病变。因而，疾病是“Tau病变”
的指示不应当解释为排除来自其它神经变性疾病分类或分组的疾病，其仅仅为了方便而提供。本发明的g3p组合物可以用于治疗神经变性疾病以及涉及tau病变的疾病。
[0244] 在一个实施方案中，药物组合物或制剂是用在减少患者中的淀粉样蛋白的方法中，所述患者表现出与淀粉样蛋白的存在有关的征状，或者是与蛋白错误折叠疾病有关的生物标志物(诸如florbetapir(AV-45,Eli Lilly))阳性的，所述方法包括：给所述患者施用有效量的如本文中所述的药物组合物或制剂。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0245] 在一个实施方案中，药物组合物或制剂是用在维持患者中的淀粉样蛋白水平的方法中，所述患者表现出与淀粉样蛋白的存在有关的征状，或者是与蛋白错误折叠疾病有关的生物标志物(诸如florbetapir(AV-45,Eli Lilly))阳性的，所述方法包括：给所述患者施用有效量的如本文中所述的药物组合物或制剂。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0246] 在一个实施方案中，药物组合物或制剂是用在解聚患者中的淀粉样蛋白的方法中，所述方法包括：给具有淀粉样蛋白的患者施用有效量的如本文中所述的药物组合物或制剂。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0247] 在一个实施方案中，药物组合物或制剂是用在造成脑中的β-淀粉样沉着物解聚的方法中，所述方法包括：将有效量的如本文中所述的药物组合物直接注射进有此需要的患者的脑中，由此造成脑中-淀粉样沉着物的减少。
[0248] 在一个实施方案中，药物组合物或制剂是用在减少脑中淀粉样蛋白形成的方法中。减少脑中淀粉样蛋白形成可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0249] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂是用在促进脑中的淀粉样蛋白清除的方法中。促进淀粉样蛋白清除可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0250] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂是用在抑制脑中淀粉样蛋白聚集的方法中。抑制脑中淀粉样蛋白聚集可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0251] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂是用在清除脑中有毒淀粉样蛋白寡聚体的方法中。清除脑中有毒淀粉样蛋白寡聚体可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0252] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂是用在预防有毒淀粉样蛋白寡聚体在脑中形成的方法中。预防有毒寡聚体在脑中形成可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。
[0253] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物或制剂是用在保护神经元免于淀粉样蛋白损伤的方法中。保护神经元免于淀粉样蛋白损伤可以预防、治疗或减轻蛋白错误折叠或神经变性疾病的征状或严重程度。在一个实施方案中，所述施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、实质内注射或鼻内递送。在一个实施方案中，预防性地施用用于保护神经元免于淀粉样蛋白损伤的本发明的药物组合物或制剂。
[0254] 在某些实施方案中，所述患者是与蛋白错误折叠和/或聚集疾病有关的生物标志物阳性的。在一个实施方案中，所述生物标志物是florbetapir(AV45,Eli Lilly)。
[0255] 在某些实施方案中，所述患者正在表现出与淀粉样蛋白的存在有关的神经变性疾病的征状。在不同的实施方案中，所述淀粉样蛋白是fAβ42、fαsyn、fNM或ftau中的任一种。
[0256] 在某些实施方案中，所述神经变性疾病是帕金森病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。在一个实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默氏病，且所述患者表现出β-淀粉样蛋白，如通过成像剂florbetapir(AV-45,Eli Lilly)所检测出。
[0257] 在某些实施方案中，所述患者正在表现出朊病毒介导的疾病的征状。
[0258] 在某些实施方案中，所述朊病毒介导的疾病选自：克雅病、库鲁病(kuru)、致死性家族性失眠症或 综合征。
[0259] 在某些实施方案中，所述患者正在表现出除了阿尔茨海默氏病以外的神经变性Tau病变的征状。在某些实施方案中，要治疗的疾病选自：嗜银颗粒性痴呆、皮质基底变性、拳击员痴呆、伴发钙化的弥漫性神经原纤维缠结、唐氏综合征、额颞叶痴呆(包括连锁于17号染色体的伴帕金森症的额颞叶痴呆)、哈-斯二氏病、肌强直性营养不良、C型Niemann-Pick病、伴发神经原纤维缠结的非关岛型运动神经元病、皮克病、脑炎后帕金森症、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎和仅缠结性痴呆。
[0260] 诊断
[0261] 在本发明的另一个方面，本文描述的g3p和TolA组合物(包括g3p融合蛋白)被用于与本文描述的不同疾病有关的诊断应用中。例如，当在体内或在体外用作成像剂时，本发明组合物的结合可以是描述的蛋白错误折叠疾病之一的诊断的一部分。
[0262] 包括诊断剂(另外在本文中被称作诊断组合物)，且其可以包含本发明的上述试剂中的任一种(即，(a)g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体；(b)化合物、多肽和融合蛋白，其包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体；(c)丝状噬菌体，其携带与野生型噬菌体相比增加的g3p拷贝数；(d)结合淀粉样蛋白的展示媒介物，其携带：g3p，g3p的淀粉样蛋白结合片段，其突变体或变体，或者包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体的化合物、多肽和融合蛋白；或(e)经修饰的丝状噬菌体，其携带g3p的变体、g3p的淀粉样蛋白结合片段(不是作为展示的g3p蛋白的一部分)、这样的结合片段的突变体或变体、或者包含g3p、g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体的融合蛋白或其它异源多肽)。诊断剂可以进一步包含可检测标记，或者可以以其它方式在体内检测出。
[0263] 在某些实施方案中，本发明组合物，诸如包含可溶性g3p或淀粉样蛋白结合片段(包括其突变体和变体)或g3p融合蛋白的组合物，被用作淀粉样蛋白成像剂。所述成像剂可以检测淀粉样蛋白和诊断与淀粉样蛋白有关的疾病。因为本发明的组合物会结合淀粉样蛋白(不论纤维的类型)，它们是有利的，因为它们可以将任意淀粉样蛋白聚集体(Aβ、tau、α-突触核蛋白等)成像—都用单一成像剂。目前，对于CNS中的tau或α突触核蛋白聚集体而言，没有可接受的成像剂/方法。并且尽管存在针对β-淀粉样蛋白的成像剂，仍然需要这样的额外试剂：其可以提供改善的认知功能和成像结果之间的关联，和/或更好地预测哪个患者将恶化还是保持稳定。关于综述，参见Resnick&Sojkova,Alzheimer’s Res Ther.(2011)3(1):3。
[0264] 本发明的诊断组合物可以与对β-淀粉样蛋白特异性的成像剂(例如，F18-AV-45,Eli Lilly)联合地用作成像剂。由于目前没有针对非-β-淀粉样蛋白聚集体的已知成像剂，本发明的诊断组合物与β-淀粉样蛋白-特异性的成像剂一起的应用，会导致基于示差检测对非-β-淀粉样蛋白聚集体的检测。因而，在一个实施方案中，本发明的诊断组合物与β-淀粉样蛋白成像剂联合用作成像剂来检测非-β-淀粉样蛋白聚集体。
[0265] 在另一个实施方案中，将本发明的诊断组合物用作成像剂来检测CNS(包括脑)中的β-淀粉样蛋白。
[0266] 本发明的诊断组合物通常要求，当用作成像剂时，淀粉样蛋白结合组分连接至一种或多种可检测标记。使用用于标记蛋白的标准技术，可以将不同的标记连接至诊断组合物的淀粉样蛋白结合组分。标记的例子包括荧光标记和放射性标记。可以使用多种放射性18 11 123
标记，但是一般而言，所述标记经常选自放射性标记，包括、但不限于，F、C和 I。使用众所周知的化学方法，可以将这些和其它放射性同位素连接至蛋白。在一个实施方案中，使用正电子发射断层摄影术(PET)，检测所述标记。但是，用于检测放射性同位素的任意其它合适的技术也可以用于检测放射性示踪剂。
标记，但是一般而言，所述标记经常选自放射性标记，包括、但不限于，F、C和 I。使用众所周知的化学方法，可以将这些和其它放射性同位素连接至蛋白。在一个实施方案中，使用正电子发射断层摄影术(PET)，检测所述标记。但是，用于检测放射性同位素的任意其它合适的技术也可以用于检测放射性示踪剂。
[0267] 使用关于治疗组合物描述的相同途径，可以施用本发明的诊断组合物。在一个实施方案中，将鞘内施用用作施用诊断组合物的途径。在另一个实施方案中，将静脉内施用用作施用诊断组合物的途径。
[0268] 实施例
[0269] 尽管经证实的丝状噬菌体作为结合剂和抗聚集剂的治疗效果在任何特定作用机理上不是偶然的，对所述机理的理解允许设计具有更大治疗效果的噬菌体。另外，它充当制备额外抗聚集剂的基础。
[0270] 如以前指出的，已经证实M13会结合和解聚至少4种不同的淀粉样蛋白纤维：淀粉样蛋白-β1-42纤维(fAβ42)、α-突触核蛋白纤维(fαsyn)、酵母朊病毒NM纤维(fNM)和tau纤维(ftau)。构成这些淀粉样蛋白纤维的4种蛋白具有无关的一级氨基酸序列，但是所有4种都错误折叠成规范的淀粉样蛋白折叠。Eichner&Radford,2011。M13的结合和介导这些中的每一种的解聚的能力指示，M13会识别结构基序诸如交叉-β折叠构象或构象特征诸如疏水槽，它们二者是所有淀粉样蛋白纤维的确定特征。
[0271] 但是淀粉样蛋白解聚不是所有噬菌体的一般性质。例如，在结构上不同的二十面体噬菌体T7不会介导fAβ42的解聚，即使当将T7与fAβ42一起在37℃温育3天时。即使在M13将超过70％的共温育的淀粉样蛋白纤维解离的浓度，噬菌体T7不会显示出任何解离活性。相比而言，噬菌体fd与M13类似地结合和解聚fAβ42，与M13相比，所述噬菌体fd在它的g8p中携带带负电荷的氨基酸(并因此在给定g8p的拷贝数下展示出比M13
多2800个的负电荷/噬菌体)。这些初步研究与以下发现一起提示，噬菌体的形状可能对于它的淀粉样蛋白纤维-解离活性而言是关键性的：淀粉样蛋白解聚也可以由烟草花叶病毒(TMV)大肠杆菌菌毛和T4的尾管介导，它们都还具有螺旋柱形状和重复单元(参见US
2011/0182948)。
多2800个的负电荷/噬菌体)。这些初步研究与以下发现一起提示，噬菌体的形状可能对于它的淀粉样蛋白纤维-解离活性而言是关键性的：淀粉样蛋白解聚也可以由烟草花叶病毒(TMV)大肠杆菌菌毛和T4的尾管介导，它们都还具有螺旋柱形状和重复单元(参见US
2011/0182948)。
[0272] 但是，下述实施例描述了报道的丝状噬菌体的结合和抗聚集性质的替代性的(尽管非相互排斥的)机制。基于这些实施例和它们所支持的作用机理，与新淀粉样蛋白-结合剂一起提供了改进了噬菌体，其具有改善的与淀粉样蛋白的结合。
[0273] 实施例1:M13噬菌体优先结合Aβ纤丝
[0274] 通过表面等离子体共振(SPR)确定M13与Aβ纤丝(相对于Aβ单体)结合.
[0275] M13噬菌体优先结合Aβ纤丝；它不会结合Aβ单体。在图3中报道了表面等离14
子体共振研究，其使用流过具有固定化的fAβ的生物传感器芯片的10 个噬菌体/mL。图
3表明，M13结合的KD是约4nM，其与单克隆抗体的结合相当。该高亲和力相互作用指示，在噬菌体和淀粉样蛋白纤维之间发生特异性结合过程。
子体共振研究，其使用流过具有固定化的fAβ的生物传感器芯片的10 个噬菌体/mL。图
3表明，M13结合的KD是约4nM，其与单克隆抗体的结合相当。该高亲和力相互作用指示，在噬菌体和淀粉样蛋白纤维之间发生特异性结合过程。
[0276] 实施例2：M13与Ab纤丝的结合是剂量依赖性的
[0277] M13与fAβ42的结合也是剂量依赖性的。在图4A中，对比了2种噬菌体剂量与递增摩尔量的fAβ42的结合。在该M13-淀粉样蛋白纤维结合测定中，将M13-Alexa488与Aβ(fAβ)混合2-3小时以允许形成复合物，然后通过在7500rpm离心10分钟来沉淀复合物。在沉淀物中的荧光与结合至淀粉样蛋白上的M13成比例。该测定会提供噬菌体与fAβ的结合的定量量度，并提供用于评估其它试剂与噬菌体竞争结合的能力的系统。图4B表明，M13结合竞争的KD类似于使用表面等离子体共振观察到的结合的KD。
[0278] 实施例3：M13与Aβ纤丝的结合需要天然构象
[0280] 实施例4：温度与M13-淀粉样蛋白相互作用有关
[0281] M13有效地解聚淀粉样蛋白纤维。图6显示了使用fAβ的硫代黄素T(ThT)荧光测定。在有M13存在下，fAβ42解聚。
[0282] 图7A表明，使ThT荧光中的盐浓度改变10倍(从0.15至1.5M)仅会导致解聚的fAβ的百分比的2-3倍差异。这指示，疏水相互作用会引起观察到的大多数解聚。
[0283] 与盐浓度的相对微小的影响相比，图7B表明，使温度从4℃改变至37℃会导致解聚的8-10倍差异。
[0284] 这些结果指示，M13解聚依赖于在较高温度更有活性并且在测定中对盐的作用相对不敏感的蛋白，从而暗示疏水相互作用。噬菌体g3p适合该描述。它的N1和N2结构域通过柔性的富含甘氨酸的接头连接，所述接头在N2与细菌性菌毛结合以后“打开”。N1然后可用于结合细菌共受体，作为感染过程的一部分。预见到，在解聚测定中增加温度会“打开”g3p的N2和N1结构域。
[0285] 尽管在高温灭活M13(90℃,10分钟,参见图5)会废除结合，但是在M13-淀粉样蛋白结合测定中增加温育温度对结合具有积极作用。图8A表明，使温度从18℃增加至58℃会导致逐渐更好的结合，一直到接近铰链解折叠TM约50℃，在该点，结合开始下降。该最佳结合温度与g3p中的N1-N2解折叠的温度(所谓的解链温度，或TM)一致，其为48.1℃。使温育温度增加至50℃(相对于37℃)也会导致M13与fAβ42的更快速结合。图8B。
[0286] 实施例5：M13-β-淀粉样蛋白相互作用需要g3p
[0287] 为了直接试验M13-β-淀粉样蛋白相互作用是否需要g3p，通过使用ArgC的蛋白水解处理从噬菌体除去g3p(M13Δg3p)，并针对Aβ结合将M13Δg3p噬菌体与重折叠的噬菌体进行对比。使用ArgC(一种芽孢杆菌属蛋白酶)的处理会选择性地从噬菌体除去g3p亚基。结果呈现在图9A中。重折叠的M13在竞争结合测定中仍然与野生型M13竞争，尽管在降低的水平。但是，即使15倍的M13Δg3p也较差地(如果有的话)与野生型M13竞争。与野生型M13竞争的这种无能与M13Δg3p噬菌体的侵染性损失一致。图9B。ArgC处理也造成解聚活性的丧失。图9C。
[0288] 如果g3p以类似于它在感染中的作用的方式介导结合，那么对于感染而言重要的N1和N2结构域应当也会与M13竞争结合。为了试验这方面，制备了重组可溶性
N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“构建体3”)，并在竞争测定中试验。如在图10A和10B中所示，M13与标记的M13竞争对fAβ42的结合，但是M13Δg3p不会。相比而言，rs-g3p(N1N2)能够与M13竞争，从而指示g3p的N1和N2结构域对于β-淀粉样蛋白结合而言是足够的。在竞争测定的重复中得到了类似的结果。图10B。
N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“构建体3”)，并在竞争测定中试验。如在图10A和10B中所示，M13与标记的M13竞争对fAβ42的结合，但是M13Δg3p不会。相比而言，rs-g3p(N1N2)能够与M13竞争，从而指示g3p的N1和N2结构域对于β-淀粉样蛋白结合而言是足够的。在竞争测定的重复中得到了类似的结果。图10B。
[0289] 实施例6：g3p铰链解折叠突变会调节淀粉样蛋白结合
[0290] 影响g3p的N1和N2结构域之间的铰链的打开能力的突变应当也会影响携带那些突变的噬菌体的与野生型M13竞争对Aβ的结合的能力。Eckert&Schmid,2007描述了几种被用于试验该假设的变体噬菌体。变体“AAA”(也被称作“3A”)会损害菌毛结合并降低N2结构域的稳定性。AAA携带g3p中的下述突变：W181A、F190A和F194A。IIHY含有突变T13I、T101I、Q129H和D209Y，它们会稳定化N2结构域和增加TM。
[0291] 评估了以下噬菌体的结合竞争：fd，其在N1和N2结构域中具有与M13g3p相同的氨基酸序列(图2)；IIHY，其具有比M13和AAA更高的铰链Tm。将噬菌体fd、AAA和IIHY在50℃预活化1.5小时，然后针对它们的与标记的M13竞争的能力来对比活化的和非活化的Fd、AAA和IIHY。图11呈现了结果。当通过加热来活化时，野生型fd是更好的竞争剂。
相比而言，加热对IIHY(其具有较高的铰链Tm)几乎没有影响。在有或没有热预处理下，AAA(与M13相比，其具有降低的N2结构域稳定性)是更好的竞争剂。
相比而言，加热对IIHY(其具有较高的铰链Tm)几乎没有影响。在有或没有热预处理下，AAA(与M13相比，其具有降低的N2结构域稳定性)是更好的竞争剂。
[0292] 这些数据支持以下结论：M13与β-淀粉样蛋白的相互作用是经由与M13感染细菌的机制类似的机制。首先，它们指示，疏水相互作用对于M13-β-淀粉样蛋白相互作用而言是重要的。其次，M13结合和解聚活性的温度依赖性反映了N1-N2铰链解折叠Tm。第三，g3p的选择性蛋白酶解会废除M13-β-淀粉样蛋白相互作用。
[0293] 实施例7：g3p片段选择性地和有效地结合淀粉样蛋白，但是不会结合单体
[0294] 为了评估g3p片段是否保留结合淀粉样蛋白的能力，制备了包含N1和N2的g3p片段，并通过表面等离子体共振(SPR)评估它的结合Aβ纤丝(相对于Aβ单体)的能力。
结果指示，rs-g3p(N1N2)优先结合Aβ纤丝；它不会结合Aβ单体。在图13报告了使用
4μM rs-g3p(N1N2)的表面等离子体共振研究，该图也显示了rs-g3p(N1N2)结合的KD为约
160nM。该高亲和力相互作用指示，特异性结合过程发生在rs-g3p(N1N2)和淀粉样蛋白纤维之间。
结果指示，rs-g3p(N1N2)优先结合Aβ纤丝；它不会结合Aβ单体。在图13报告了使用
4μM rs-g3p(N1N2)的表面等离子体共振研究，该图也显示了rs-g3p(N1N2)结合的KD为约
160nM。该高亲和力相互作用指示，特异性结合过程发生在rs-g3p(N1N2)和淀粉样蛋白纤维之间。
[0295] 通过SPR评估了额外构建体。下表总结了结果。
[0296]
[0297]
[0298] 实施例8：g3p片段有效地解聚Aβ42纤维
[0299] 为了试验g3p片段是否可以解聚淀粉样蛋白纤维，在ThT荧光测定中试验了rs-g3p(N1N2)的降解预形成的fAβ42纤丝的能力。结果指示，rs-g3p(N1N2)有效地解聚fAβ42。图14A显示了该实验的结果，即rs-g3p(N1N2)以剂量依赖性的方式解聚fAβ42。
图14B表明IC50为大约20nM。
图14B表明IC50为大约20nM。
[0300] 在一个单独的实验中，将Aβ42在有或没有2μM浓度的rs-g3p(N1N2)存在下在37℃温育7天，并通过透射电子显微术评估Aβ42纤维的完整性。图15A显示了该实验的结果，即rs-g3p(N1N2)解聚Aβ42纤维。图15B报告了在这些相同样品上的ThT测定的结果。Rs-g3p(N1N2)在该ThT测定中降解预形成的Aβ42纤维。
[0301] 实 施 例 9：rs-g3p(N1N2) 会 阻 断 α- 突 触 核 蛋 白 和 Aβ 装 配 且rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc会阻断装配和抑制Aβ的聚集
[0302] 为了确定g3p是否可以阻断α-突触核蛋白纤维装配，并且也为了确定价(即，g3p的拷贝数)是否起作用，进行了测试五聚体g3p(5个g3p拷贝)和单体g3p(1个g3p拷贝)的阻断α-突触核蛋白活性的测定。结果表明，g3p会阻断α-突触核蛋白纤维装配，并且在该活性方面，五聚体g3p比单体g3p更有效。参见图16。
[0303] 还评估了rs-g3p(N1N2)(构建体3)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的抑制Aβ42装配的能力。如在图30和图31中所示，构建体3和构建体6能够以剂量依赖性的方式抑制fAβ42的装配。如在图37中所示，构建体3和构建体6能够抑制fAβ42聚集。
[0304] 实施例10：rs-g3p(N1N2)-Ig融合蛋白结合和解聚Aβ
[0305] 为了评估g3p价是否在g3p结合淀粉样蛋白的效能中起作用，制备了关于rs-g3p(N1N2)二价的Ig融合蛋白(“rs-g3p(N1N2)-Ig融合体”)，并与五价M13对比了它的结合Aβ纤维的能力。如在图17中所示，rs-g3p(N1N2)-Ig融合体以与M13类似的亲和力并且比单独的rs-g3p(N1N2)更有效地结合Aβ，从而指示g3p的价可能是重要的。在竞争测定的重复中得到了类似的结果。图18。在图18中，正方形代表构建体2(M13)；三角形代表构建体3(rs-g3p(N1N2))；倒转三角形代表构建体4(rs-g3p(N1N2)-Ig融合体)；且菱形代表r-IgG4Fc阴性对照。
[0306] 为了评估价是否也在解聚中起作用，在过滤器截留测定中对比了二价rs-g3p(N1N2)-Ig融合体(“构建体4”)和五价M13。图19。结果指示，二价rs-g3p(N1N2)-Ig融合体和五价M13都有效地解聚β-淀粉样蛋白纤维。也指示价对于解聚效能而言可能是重要的，如1.7nM五价M13以与40nMrs-g3p(N1N2)-Ig融合体类似的水平减少聚集体的能力所指示的。图19。
[0307] 在一个类似的测定中，在过滤器截留测定中针对它们的解聚Aβ42纤维的能力测12
定了1x10 /ml M13(构建体2)、80nm和800nMrs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)、和80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)。构建体2、5和6有效地解聚β-淀粉样蛋
白纤维。图33。
定了1x10 /ml M13(构建体2)、80nm和800nMrs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)、和80nm和800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)。构建体2、5和6有效地解聚β-淀粉样蛋
白纤维。图33。
[0308] 实施例11:四聚体抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]蛋白结合和解聚fAβ
[0309] 为了进一步评估价对g3p的结合和解聚淀粉样蛋白的能力的作用，通过在有NiSO4存在下组合rs-g3p(N1N2)与生物素-Lys-NTA，制备了四聚体抗生蛋白链菌素缀合的g3p(N1N2)。使用MWCO 3KDa膜，除去多余的配体。加入抗生蛋白链菌素，并使用MWCO
100 KDa膜除去多余的rs-g3p(N1N2)-生物素。得到的g3p构建体抗生蛋白链菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]具有4个rs-g3p(N1N2)部分。在结合测定中将抗生蛋白链菌素-[生物
素-g3p(N1N2)]与rs-g3p(N1N2)(“构建体3”)进行了对比。图20。四聚体抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]比单体rs-g3p(N1N2)更有效地结合fAβ，从而提供了价对于结合效能而言是重要的进一步指示。图20。但是，即使单体rs-g3p(N1N2)也以治疗上可接受的水平结合fAβ。
100 KDa膜除去多余的rs-g3p(N1N2)-生物素。得到的g3p构建体抗生蛋白链菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]具有4个rs-g3p(N1N2)部分。在结合测定中将抗生蛋白链菌素-[生物
素-g3p(N1N2)]与rs-g3p(N1N2)(“构建体3”)进行了对比。图20。四聚体抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]比单体rs-g3p(N1N2)更有效地结合fAβ，从而提供了价对于结合效能而言是重要的进一步指示。图20。但是，即使单体rs-g3p(N1N2)也以治疗上可接受的水平结合fAβ。
[0310] 为了评估价是否也在解聚中起作用，在过滤器截留测定中将单体rs-g3p(N1N2)与四聚体抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]进行了对比。图21。结果指示，单体rs-g3p(N1N2)和四聚体抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]有效地解聚fAβ纤
维。也指示价对于解聚效能而言可能是重要的，如360nM四聚体抗生蛋白链菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]的废除多达200ngfAβ聚集体的优越能力(相对于2.5μM单体
rs-g3p(N1N2)对Aβ的解聚的减少)所指示。图21，例如将第2行与第4行进行对比。
维。也指示价对于解聚效能而言可能是重要的，如360nM四聚体抗生蛋白链菌素-[生
物素-g3p(N1N2)]的废除多达200ngfAβ聚集体的优越能力(相对于2.5μM单体
rs-g3p(N1N2)对Aβ的解聚的减少)所指示。图21，例如将第2行与第4行进行对比。
[0311] 还通过TEM评估了抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]对Aβ的解聚。温育3天以后，抗生蛋白链菌素-[生物素-g3p(N1N2)]完全解聚fAβ42。图22。
[0312] 实施例12：N1N2-Ig融合蛋白显著地减少阿尔茨海默氏病的鼠模型中的Aβ
[0313] 使用众所周知的用于研究阿尔茨海默氏病的小鼠模型(Hsiao等人,Science(1996)274:99-102；Duyckaerts等人,Acta Neuropathol(2008)115:5-38)，将雄性Tg2576小鼠饲养至大于500天，在两侧向海马中注射(2μL/注射)N1N2-Ig融合体
的2种不同制剂(在7.8μg/注射的构建体5和在8.2μg/注射的构建体6)或盐水(作
为阴性对照)，并在第7天处死。收获脑组织，切片，并使用抗-淀粉样蛋白β单克隆抗体(82E1；目录号MBS490005-IJ10323，得自MyBioSource)染色用于斑块负荷定量。如在图28中所示，与盐水治疗的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白显著减少在海马中测得的斑块负荷。如在图29中所示，与盐水治疗的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白显著减少在大脑皮质中测得的斑块负荷。
的2种不同制剂(在7.8μg/注射的构建体5和在8.2μg/注射的构建体6)或盐水(作
为阴性对照)，并在第7天处死。收获脑组织，切片，并使用抗-淀粉样蛋白β单克隆抗体(82E1；目录号MBS490005-IJ10323，得自MyBioSource)染色用于斑块负荷定量。如在图28中所示，与盐水治疗的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白显著减少在海马中测得的斑块负荷。如在图29中所示，与盐水治疗的小鼠相比，N1N2-Ig融合蛋白显著减少在大脑皮质中测得的斑块负荷。
[0314] 实施例13：N1N2-Ig融合蛋白会阻断Aβ寡聚体诱导的细胞毒性
[0315] Aβ寡聚体会造成某些有毒酶在神经元细胞中的释放。可以测定酶以确定化合物是否可以抑制Aβ寡聚体诱导的细胞毒性。图32呈现的代表性数据表明，M13(构建体2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)会阻断寡聚体诱导的对N2a细胞的毒性。因此，g3p片段是Aβ寡聚体诱导的细胞毒性的有效抑制剂。
[0316] 实施例14：N1N2-Ig融合蛋白结合和解聚tau
[0317] 为了评估g3p片段是否结合tau，制备了包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白，并通过表面等离子体共振(SPR)评估了它的结合ftau的能力。图35显示了一种代表性的SPR测定的结果，其表明rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体4)有效地结合ftau。
[0318] 为了试验g3p片段是否可以解聚tau，针对它的降解预形成的ftau的能力，在ThT荧光测定中试验了包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白。结果指示，N1N2-Ig融合蛋白有效地解聚ftau。参见，图36A和图36B。
[0319] 实施例15:N1N2-Ig融合蛋白在朊病毒病的细胞培养模型(N2a22LSc)中抑制PrPScSc积累、聚集和PrP 形成。
[0320] 朊病毒病的特征在于正常细胞的朊病毒蛋白(PrPc)转化为蛋白酶抗性的病理学Sc Sc c Sc形式PrP 。基于蛋白酶抗性，将PrP 与PrP 区分开：蛋白酶部分地降解PrP 以形成蛋白Sc
酶抗性的C-端核心片段(PrPres)，后者具有19-21kDa分子量的未糖基化形式。PrP 的抑制、逆转和减少构成治疗几种变性疾病的可行治疗方案。
酶抗性的C-端核心片段(PrPres)，后者具有19-21kDa分子量的未糖基化形式。PrP 的抑制、逆转和减少构成治疗几种变性疾病的可行治疗方案。
[0321] 为了确定包含N1和N2的g3p片段-Ig融合蛋白(构建体6)在朊病毒病的体外模Sc
型中是否干扰病理学朊病毒构象异构体(PrP )的形成，并且为了验证在有或没有构建体6Sc
存在下N2a22L 细胞中的PrP的解聚或可溶性变化，将细胞在没有或有1ug/ml构建体6或IgG存在下培养24h并收获在裂解缓冲液中。将100μg总蛋白在Beckman Optima TL超
速离心机中在TLA100.1转子中在55,000rpm在4℃超速离心90min。对25μl溶解的沉淀
物和上清液的样品进行SDS-PAGE和使用抗-PrP抗体6D11mAb的下游分析。增加的去污剂Sc
不溶解性领先于PrP 或PrP突变体对蛋白水解酶K(PK)抗性的获取，因此评估了构建体6Sc
的改变PrP可溶性的能力。与IgG处理的N2a22L 细胞相比，构建体6处理过的细胞表现
出显著减少的量的聚集的/不溶性的PrP。参见图38A和图38B。
型中是否干扰病理学朊病毒构象异构体(PrP )的形成，并且为了验证在有或没有构建体6Sc
存在下N2a22L 细胞中的PrP的解聚或可溶性变化，将细胞在没有或有1ug/ml构建体6或IgG存在下培养24h并收获在裂解缓冲液中。将100μg总蛋白在Beckman Optima TL超
速离心机中在TLA100.1转子中在55,000rpm在4℃超速离心90min。对25μl溶解的沉淀
物和上清液的样品进行SDS-PAGE和使用抗-PrP抗体6D11mAb的下游分析。增加的去污剂Sc
不溶解性领先于PrP 或PrP突变体对蛋白水解酶K(PK)抗性的获取，因此评估了构建体6Sc
的改变PrP可溶性的能力。与IgG处理的N2a22L 细胞相比，构建体6处理过的细胞表现
出显著减少的量的聚集的/不溶性的PrP。参见图38A和图38B。
[0322] 对 于 图 38A和 38B，如 以 前 所 述 (Pankiewicz等 人 ,Eur.J.Neurosci.Sc(2006)23:2635-2647)制备N2a22L 细胞。简而言之，将用小鼠适应的22L朊病毒菌株感染的最终生病的CD-1小鼠的脑在无菌条件下通过声处理在冷磷酸盐缓冲盐水和5％葡萄糖中匀浆化(10％重量/体积)。为了感染，将脑匀浆物在Opti-MEM中进一步稀释至2％，
2
并以1mL/10-cm 孔加入到亚汇合的6-孔平板(Corning,Acton,MA,USA)中。5h以后，加
入1mL常规MEM，并将细胞在有传染性脑匀浆物存在下温育额外12h。洗涤细胞，并加入标
2
准的MEM生长培养基。将细胞培养至汇合，然后拆分成1:2稀释物，并转移至25-cm 烧瓶(Corning)。每4天1:2拆分在烧瓶之一内培养的细胞以得到后代，而将在其它烧瓶中培养Sc
的细胞收获和均质化以监测PrP 的水平。基于先前的研究，仅在第一代和第二代中检测出Sc
接种物衍生出的PrP 的存在，所以将第4代(P4)细胞用于所有后续研究。将细胞在匀浆化缓冲液(由50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM Na3VO4、
1mMNaF、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸盐、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、1mM亮抑酶肽、1mM胃酶抑素A、1mM)组成，或对于PK消化而言不含PMSF)中在4℃裂解5min，并通过在4℃在10,000g离心10min除去不溶物。对于细胞分级分离，将
100μg蛋白在55,000rpm离心90min，此后将沉淀物重构在开始体积中。生化地分辨和表征20％的沉淀物和上清液。
2
并以1mL/10-cm 孔加入到亚汇合的6-孔平板(Corning,Acton,MA,USA)中。5h以后，加
入1mL常规MEM，并将细胞在有传染性脑匀浆物存在下温育额外12h。洗涤细胞，并加入标
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准的MEM生长培养基。将细胞培养至汇合，然后拆分成1:2稀释物，并转移至25-cm 烧瓶(Corning)。每4天1:2拆分在烧瓶之一内培养的细胞以得到后代，而将在其它烧瓶中培养Sc
的细胞收获和均质化以监测PrP 的水平。基于先前的研究，仅在第一代和第二代中检测出Sc
接种物衍生出的PrP 的存在，所以将第4代(P4)细胞用于所有后续研究。将细胞在匀浆化缓冲液(由50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM Na3VO4、
1mMNaF、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸盐、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、0.5mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、1mM亮抑酶肽、1mM胃酶抑素A、1mM)组成，或对于PK消化而言不含PMSF)中在4℃裂解5min，并通过在4℃在10,000g离心10min除去不溶物。对于细胞分级分离，将
100μg蛋白在55,000rpm离心90min，此后将沉淀物重构在开始体积中。生化地分辨和表征20％的沉淀物和上清液。
[0323] 为了确定构建体6是否剂量依赖性地改变PrPSc的繁殖(通过解聚或改变它Sc
的物理化学性质)，将N2a22L 细胞在没有或有递增浓度的构建体6或IgG存在下培养
24h，并收获在裂解缓冲液中。将经过和没有经过PK处理的裂解的细胞的等分试样进行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗体6D11和6H4mAb进行下游分析。评估得自对照IgG和构建
体6处理过的细胞的、生化地分辨的PK消化的和未消化的裂解物的PrP免疫反应性。处
Sc
理包括：N2a22L +10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、Sc
0.012μg/ml和0.004μg/ml构建体6、或N2a22L +1μg/ml mIgG。
的物理化学性质)，将N2a22L 细胞在没有或有递增浓度的构建体6或IgG存在下培养
24h，并收获在裂解缓冲液中。将经过和没有经过PK处理的裂解的细胞的等分试样进行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗体6D11和6H4mAb进行下游分析。评估得自对照IgG和构建
体6处理过的细胞的、生化地分辨的PK消化的和未消化的裂解物的PrP免疫反应性。处
Sc
理包括：N2a22L +10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、Sc
0.012μg/ml和0.004μg/ml构建体6、或N2a22L +1μg/ml mIgG。
[0324] 结果指示在有构建体6存在下PrPSc的显著剂量依赖性的下降，与1ug/mlIgG相Sc比，在有0.08ug/ml构建体6存在下产生了少50％的PrP 。参见图39A和图39B。重复的
实验证实了这些结果。
实验证实了这些结果。
[0325] 为了评估PrP的蛋白水解酶K(PK)抗性的构象异构体，根据以前的方法(Perrier等人,J.Neurochem(2004)84:454-463,Pankiewicz等人,2006)，将裂解的细胞的等分试样用PK(1μg/μg)1:50稀释液在37℃处理30min。温育以后，通过加入PMSF至4mM，停止消化。
[0326] 使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)，确定蛋白浓度。在样品缓冲液(250mMTris-HCl(pH6.8)、10％SDS、5mMβ-巯基乙醇、50％甘油、0.02％考马斯蓝G250)中稀释样品，并煮沸5min。在还原条件下通过SDS-PAGE分辨经加工的样品。
[0327] 使 用 抗-PrP 单 克 隆 抗 体 6D11(参 见 Sadowski等 人 ,Neurobiol Dis.(2009)34(2):267-278)和6H4(参见Cordes等人,J Immunol Methods(2008)337:106-120)以及抗-肌动蛋白来表征样品。使用辣根过氧化物酶-缀合的抗-小鼠IgG(GEHealthcare UK Limited,Buckinghamshire,UK)检测抗原-抗体复合物，并使用ECL系统(GE Healthcare UK Limited)按照生产商的说明书显影。通过胶片的密度计分析(Image J,NIH)，进行蛋白带的定量。
[0328] 在图38A和38B和图39A和39B中显示的结果一起证实了g3p片段Ig融合蛋白Sc
的在体外直接抑制PrP 形成的能力。
的在体外直接抑制PrP 形成的能力。
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