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糖 氧化酶

阅读：832发布：2020-05-11

专利汇可以提供糖氧化酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及糖氧化酶。本发明还涉及编码变体糖氧化酶的多核苷酸，和涉及包含该核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及涉及使用变体酶的方法，如制备生面团和生面团产品组合物。，下面是糖氧化酶专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分离的变体糖氧化酶，其在对应于SEQ ID NO：2的位置4、15、19、21、22、27、
29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、112、
114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、169、
170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、251、252、
253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、316、317、
318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、357、358、
363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、415、
419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472和/或473的一个或多个位置包含取代，其中所述变体糖氧化酶包含与SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的成熟
多肽具有至少60％同一性的氨基酸序列，而且其中所述变体具有糖氧化酶活性。
2.权利要求1的变体，其中所述变体为(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与
SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的成熟多肽具有至少65％同一性，优选至少70％同一
性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性；或(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等严格条件，优选中-高严格条件，或高严格条件下与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其互补链杂交；或(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性，优选至少65％同
一性，至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的变体，其中所述变体是亲本糖氧化酶的变体，而且其中所述亲本糖
氧化酶包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，或由具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列
的多肽组成。
4.权利要求1-3任一项的变体，其在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代：15，
22，27，54，98，188，201，222和460，使用SEQ ID NO：2进行编号。
5.权利要求1-4任一项的变体，其包含一个或多个下述取代：D15N，Y22W，E27R，Q54D，
N98D，K188R，K201R，N222D和/或T460E。
6.权利要求1-5任一项的变体，其与变体酶的亲本糖氧化酶相比具有一种或多种改善
的性质，其中所述改善的性质选自下组：热活性，热稳定性，pH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性和化学稳定性。
7.权利要求1-6任一项的变体，其在高pH或在高温具有改善的稳定性。
8.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求1-7任一项的变体。
9.一种重组宿主细胞，其包含权利要求8的核苷酸序列。
10.一种用于产生变体糖氧化酶的方法，包括：
(a)在适于糖氧化酶的表达的条件下培养权利要求9的宿主细胞；和
(b)从培养基回收所述糖氧化酶。
11.一种用于制备生面团的方法，包括将权利要求1-7任一项的糖氧化酶添加至生面
团。
12.权利要求11的方法，进一步包括烘烤所述生面团。
13.一种生面团组合物，其包含面粉和权利要求1-7任一项的糖氧化酶。

说明书全文

糖氧化酶

[0001] 涉及序列表

[0002] 本申请包括计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。

[0003] 涉及结构坐标

[0004] 本申请包含以标准PDB格式(Protein Data Bank)显示的抑制的糖氧化酶已解析的晶体结构的结构坐标。该结构列于附录1，并通过提述并入本文。

技术领域

[0005] 本发明涉及糖氧化酶的变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。

背景技术

[0006] WO 99/31990公开了白小羊蹄菌(Microdochium nivale)糖氧化酶的氨基酸序列和核酸序列，以及其在烘烤中的用途。

[0007] 本发明的目的是提供改善的糖氧化酶。

发明内容

[0008] 本发明提供了分离的糖氧化酶变体，其在对应于SEQ ID NO：2的位置4、15、19、21、22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、
98、105、112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、
153、157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、
250、251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、
315、316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、
356、357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、
403、411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472和/或473的一个或多个(几个)位置包含取代，其中所述变体具有糖氧化酶活性。

[0009] 本发明亦提供了分离的糖氧化酶变体，或具有糖氧化酶活性的分离的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在对应于使用SEQ ID NO：2进行编号的位置4、15、19、21、
22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、
105、112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、
157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、
251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、
316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、
357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、
411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472和/或473的至少一个或多个(几个)位置与SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的成熟多肽
不同。

[0010] 本发明还提供了编码本发明的糖氧化酶的分离的多核苷酸，并涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及涉及产生本发明的糖氧化酶的方法。

[0011] 本发明进一步提供了本发明的糖氧化酶在制备生面团和/或从生面团制成的烘烤产物中的用途，包括将本发明的糖氧化酶添加至所述生面团。本发明还提供了生面团和/或面包改善组合物，其包含本发明的糖氧化酶。所述生面团和/或面包改善组合物可进一
步包含一种或多种生面团或面包添加剂，包括，例如第二酶如淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶或磷脂酶。

[0012] 本发明进一步提供了用于将乳糖转化为乳糖酸(LBA)的方法。LBA可用于产生食物和饮料产品，例如乳制品如乳酪，例如，通过将生成的LBA直接添加至食物和饮料产品和/或成分，或通过在食物和饮料产品或成分中原位生成LBA。LBA亦可用于化妆品。

[0013] 本发明还提供了包含本发明的糖氧化酶的酶颗粒、粉末和液体组合物。

具体实施方式

[0014] 糖氧化酶活性：术语“糖氧化酶活性”在本文中定义为在多种单糖或寡糖中催化伯醇的氧化，伴随将分子氧还原为过氧化氢的酶活性。就本发明而言，糖氧化酶活性是根据由Blake等，Analytical Biochemistry 177：156-160(1989)描述的方法来确定的。一个单位的糖氧化酶活性等于在pH 6.0，25℃每分钟能够释放1μmol过氧化氢的酶量。

[0015] 变体：术语“变体”在本文中定义为在一个或多个(几个)特定位置包含改变，如取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的具有糖氧化酶活性的多肽。经改
变的多核苷酸经过人为干预通过修饰多核苷酸序列，例如SEQID NO：1中公开的多核苷酸
序列或其同源序列而得到。

[0016] 野生型酶：术语“野生型”糖氧化酶表示由天然存在的微生物如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的糖氧化酶，即，编码糖氧化酶的多肽并不是经过人为干预通过修饰多核苷酸序列而得到的。

[0017] 亲本酶：术语“亲本”糖氧化酶用于本文指一种对其进行修饰，例如，取代、插入、缺失和/或截短(truncation)以产生本发明中的酶变体的糖氧化酶。该术语亦指变体用以比较和比对的多肽。所述亲本可为天然存在(野生型)多肽或变体。举例而言，所述亲本
多肽可为天然存在的多肽的变体，其氨基酸序列经修饰或改变。亲本亦可为等位基因变体，其为由占据相同染色体位点的基因的两种或更多可选形式中的任一种所编码的多肽。

[0018] 分离的变体或多肽：术语“分离的变体”或“分离的多肽”用于本文指一种自来源分离的变体或多肽。在一个方面，该变体或多肽至少是1％纯的，优选至少是5％纯的，更优选至少是10％纯的，更优选至少是20％纯的，更优选至少是40％纯的，更优选至少是60％纯的，甚至更优选至少是80％纯的，且最优选至少是90％纯的，其纯度由SDS-PAGE确定。

[0019] 基本上(substantially)纯的变体或多肽：术语“基本上纯的变体”或“基本上纯的多肽”在本文中指一种多肽制备物，其包含至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，且甚至最优选至多0.5％以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。因此，优选地，基本上纯的变体或多肽是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少92％纯的，优选至少94％纯的，更优选至少95％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少96％纯的，更优选至少
97％纯的，更优选至少98％纯的，甚至更优选至少99％纯的，最优选至少99.5％纯的，且甚至最优选100％纯的。本发明的变体或多肽优选为基本上纯的形式。其可通过，例如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而达成。

[0020] 成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有糖氧化酶活性的多肽，其为经翻译和任何翻译后修饰，如N末端加工、C末端截短、糖化、磷酸化等之后的其最终形式。在一个方面，所述成熟序列是SEQ ID NO：2的多肽。信号程序SignalIP3.0程序可用于预测成熟多肽。

[0021] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有糖氧化酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是编码SEQ ID NO：2的核苷酸。

[0022] 同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”同一性”所描述。

[0023] 就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如EMBOSS 软件包(EMBOSS：
欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)，
Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277；http://emboss.org)的Needle程序，
优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open
penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的
EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief 选项获
得)作为百分比同一性并如下计算：

[0024] (相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)

[0025] 就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定，如EMBOSS 软件包
(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上；http://emboss.org)的 Needle程序，优选为3.0.0版
或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和
EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输
出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

[0026] (相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。

[0027] 同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用白小羊蹄菌糖氧化酶CBS 100236在 tfasty 检索 (Pearson，W.R.，1999，于 Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中给出小于0.001的E值(或期望分数)的预
测的多肽。

[0028] 多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有糖氧化酶活性。

[0029] 亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有糖氧化酶活性的多肽片段。

[0030] 等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基
酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

[0031] 分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述分离的多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％
纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％，并且甚至最优选至少95％纯。

[0032] 基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程多肽生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷
酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物
基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以
是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

[0033] 编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。
编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

[0034] cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成
熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自
mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

[0035] 核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表
达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

[0036] 调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但
不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制
位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的
连接。

[0037] 可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表
达。

[0038] 表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

[0039] 表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

[0040] 宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的
(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。

[0041] 改善的性质：术语“改善的性质”在本文中定义为与相对于亲本糖氧化酶改善的变体相关的特征。此类改善的性质包括但不限于：改变的温度依存性活性概貌(profile)、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。在一个实施方案中，改善的性质包括对于温度、过氧化氢、pH、脱酰胺、肽键的酰胺水解之一或多种的稳定性，和针对阴离子型表面活性剂的稳定性。

[0042] 改善的热活性：术语“改善的热活性”在本文中定义为相对于亲本糖氧化酶的温度依存性活性概貌在特定温度显示糖氧化酶变体的温度依存性活性概貌的改变的变体酶。所述热活性值提供了酶在温度范围内进行水解反应催化的效率的量度。糖氧化酶具有特定的
温度范围，其中多肽稳定并保留其酶活性，但随着温度增加而变得越来越不稳定从而活性
越来越低。此外，由糖氧化酶催化的反应的起始速率可由温度的增加而加速，这通过确定变体的热活性来测量。

[0043] 改善的热稳定性：术语“改善的热稳定性”在本文中定义为在升高的温度温育一定期间之后显示相对于亲本酶保留酶活性的变体酶。此种变体可能显示或不显示相对于亲本改变的热活性概貌。举例而言，变体在升高的温度温育之后可具有相对于亲本改善的重折
叠能力。

[0044] 对于热稳定性的测试会涉及对纯化的样品进行差示扫描量热法(DSC)以确定糖氧化酶的熔融温度Tm。在DSC中，相对于参照小室测量样品小室中用于维持恒定温度增加
而消耗的热量。维持恒定的加热速率(例如，90℃/小时)。随着为了维持恒定温度增加而
转移至小室的热的增加，观察到吸热过程(热消耗过程，例如，酶/蛋白的解折叠)。

[0045] DSC可使用来自MicroCal的MC2-装置进行。将小室在20℃平衡20分钟，然后以90℃/h的扫描速率扫描至90℃。加载样品，例如0.1M乙酸钠，pH5.5中的约2.5mg/ml糖
氧化酶样品。

[0046] 若变体的Tm大于亲本或野生型的Tm，则可认为其为改善的。在一个方面，变体糖氧化酶的热活性与亲本酶相比为至少1.5倍，优选至少2倍，更优选至少5倍，最优选至少
7倍，并且甚至最优选至少20倍的热活性。

[0047] 改善的产物特异性：术语“改善的产物特异性”在本文中定义为与亲本相比显示改变的产物概貌的变体酶，其中所述改变的产物概貌改善了变体与亲本相比在给定应用中的性能。术语“产物概貌”在本文中定义为由酶水解产生的反应产物的化学组成。

[0048] 改善的化学稳定性：术语“改善的化学稳定性”在本文中定义为在减少亲本酶的酶活性的天然存在的或合成的化学品存在下在一段期间的温育之后显示酶活性的保留的变体酶。改善的化学稳定性亦可导致更好地能够在此类化学品存在下催化反应的变体。化学
品的实例包括阴离子型表面活性剂和H2O2。

[0049] 改善的对于蛋白水解性降解的抗性：术语“改善的对于蛋白水解性降解”在本文中定义为在蛋白酶存在下在一段期间的温育之后显示酶活性的保留的变体酶。改善的抗性亦可导致更好地能够在蛋白酶存在下催化反应的变体。

[0050] 变体命名规则：

[0051] 就本发明而言，公开于SEQ ID NO：2中的糖氧化酶的氨基酸序列用于确定在其他糖氧化酶中对应的氨基酸残基。将其他糖氧化酶的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO：2中的
糖氧化酶氨基酸序列进行比对，并基于该比对，可以确定SEQ ID NO：2所公开的糖氧化酶的氨基酸序列中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。

[0052] 多肽序列的比对可使用，例如，“ClustalW”(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.，1994，CLUSTAL W：Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)得到。DNA序列的比对可以使用所述多肽比对作为模板，将氨基酸用来自所述DNA序列的对应密码子替代来
进行。

[0053] 通常使用的逐对序列比较算法(pairwise sequence comparison algorithm)足以检测未分歧超越大约20-30％序列同一性的点的多肽序列之间的相似性(Doolittle，
1992，Protein Sci.1：191-200；Brenner 等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，
6073-6078)。然而，具有相同折叠(fold)和相似生物学功能的真正同源的多肽经常分歧
到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的点(Lindahl和Elofsson，2000，J. Mol.
Biol.295：613-615)。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表
现(probabilistic representation)(序型)搜索数据库的搜索程序来获得。举例而言，
PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远
的同源物(Atschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。当目标多肽的家族或
超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(几个)代表时，甚至可达成更高的敏感度。
程序如GenTHREADER(Jones 1999，J. Mol.Biol.287：797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics 19：874-881)使用来自多个来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary
structure prediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势
(solvation potential))的信息作为向预测查询序列(query sequence)的结构折叠
(structural fold)的神经网络的输入。类似地，Gough等，2000，J.Mol.Biol.313：903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对，且上述
模型可就其准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。

[0054] 对于已知结构的蛋白质，可用数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。举例而言，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可
下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment
matrix)(Holm 和 Sander，1998，Proteins 33：88-96) 或组合延伸 (combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Eng.11：739-747)进行比对，且这些算法的执行可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如
Holm和Park，2000，Bioinformatics 16：566-567)。这些结构比对可用于在相同结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息，连同来源于同源性建模与
序型搜索的信息，可用于在将目标突变从一个蛋白质移到一个接近的或较远的同源物时预
测哪个残基会突变。

[0055] 在描述本发明的不同糖氧化酶变体时，为了参照方便起见，采用了下面所述的命名法。在所有情况下，使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

[0056] 取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变可以用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在205和411位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。

[0057] 缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

[0058] 插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸#]，新插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为
“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

[0059] 在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：

[0060]亲本：变体：
195 195195a 195b
G G-K-A

[0061] 亲本糖氧化酶

[0062] 亲本糖氧化酶可从任何合适的来源获得，如微生物来源，如真菌，例如丝状真菌或酵母，或可为从已知的核酸或氨基酸序列信息制备的人工序列。

[0063] 糖氧化酶可来源于，例如有丝分裂孢子核菌纲(Pyrenomycetes)如枝顶孢霉属(Acremonium)，特别是局限枝顶孢霉(A.strictum)，如ATCC 34717或T1；A.fusidioides
如IFO 6813；或A.potronii如IFO 31197。在一个优选的实施方案中，寡糖氧化酶获得自
由(Lin et al.，1991，Biochimica et Biophysica Acta 1118：41-47)以及JP-A 5-84074中披露的来源。

[0064] 所述糖氧化酶还可从炭角菌目(Xylariales)，特别是有丝分裂孢子炭角菌目的微生物，如小羊蹄菌属(Microdochium)的微生物，特别是白小羊蹄菌种(M.nivale)获
得。公众可容易地在培养物保藏中心(culture collection)，如美国典型培养物保藏中
心(American Type Culture Collection，ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulruren GmbH，DSM)和荷兰真菌培
养物保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)中获得此类菌株。

[0065] 小羊蹄菌属描述于Microdochium Syd(Samuels和Hallett，1983，TBMS81：473)。一些小羊蹄菌属的菌株已经描述为同义词叶枯菌属(Gerlachia)、雪霉叶枯菌
(G.nivalis)、稻叶枯菌(G.oryzae)、雪腐镰孢(Fusarium nivale)或Rynchosporium
oryzae。其还描述于Monographella(Hyponectr)fide(Muller，1977，Rev.mycol.41：129)。

[0066] 所述糖氧化酶可从如描述于例如WO 99/31990的白小羊蹄菌菌株NN008551获得。在一个实施方案中，所述亲本糖氧化酶包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：
1的核酸编码的成熟多肽的糖氧化酶，或由所述糖氧化酶组成。

[0067] 在本发明中，亲本糖氧化酶包括(a)包含与SEQ ID NO：2具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在至少低严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)
SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的
cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或(c)由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽
编码序列具有至少60％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽。

[0068] 在第一个方面，所述亲本糖氧化酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：2具有优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少
96％，至少97％，至少98％，或至少99％的氨基酸序列同一性程度，且具有糖氧化酶活性
(下文中称作“同源多肽”)。在一个方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：
1编码的成熟多肽相差三十个氨基酸，二十九个氨基酸、二十八个氨基酸、二十七个氨基酸、二十六个氨基酸、二十五个氨基酸、二十四个氨基酸、二十三个氨基酸、二十二个氨基酸、二十一个氨基酸、二十个氨基酸、十九个氨基酸、十八个氨基酸、十七个氨基酸、十六个氨基酸、十五个氨基酸、十四个氨基酸、十三个氨基酸、十二个氨基酸、十一个氨基酸、十个氨基酸，优选五个氨基酸，更优选四个氨基酸，甚至更优选三个氨基酸，最优选两个氨基酸，并且甚至最优选一个氨基酸的氨基酸序列。

[0069] 基本上同源的亲本糖氧化酶可具有一个或多个(几个)氨基酸取代、缺失和/或插入。这些变化优选是性质上次要的(of a minor nature)，即如上所述的保守氨基酸取
代或其他不至于显著影响所述蛋白质或多肽的三维折叠或活性的取代；小缺失，通常为一
到约30个氨基酸；以及小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基、至多约
20-25个残基的小接头肽或有助于纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸序列(tract)，或
蛋白质A(Nilsson等，1985，EMBO J.4：1075；Nilsson等，1991，Methods Enzymol.198：3)。
亦可一般性的参见Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

[0070] 尽管上述变化优选为性质上次要的，该变化亦可为性质上重要的，如多达300个氨基酸以上的较大多肽的融合物作为氨基-或羧基-末端的延伸。

[0071] 所述亲本糖氧化酶可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有糖氧化酶活性的片段，或者可由EQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们具有糖氧化酶活性的片段组成。在一个方面，所述亲本糖氧化酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一个方面，所述亲本糖氧化酶包含SEQ ID NO：
1编码的成熟多肽，或由SEQ ID NO：1编码的成熟多肽组成。

[0072] SEQ ID NO：2的多肽或SEQ ID NO：1编码的成熟多肽的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽。

[0073] 在第二个方面，所述亲本糖氧化酶由在非常低严格条件、优选低严格条件下、更优选中等严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件，且最优选非常高严格条件下与以下杂交的多核苷酸编码：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch 和T.Maniatis，1989，Molecular
Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。所述亚序列可编码具有糖氧化酶活性的多肽片段。在一个方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟
多肽编码序列的全长互补链。

[0074] SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源物的亚序列，是从5’端和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列。

[0075] 所述亲本酶亦可为具有糖氧化酶活性的多肽的等位变体。

[0076] 可将SEQ ID NO：1的多核苷酸或其亚序列，或它们的片段用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株根据本领域中公知的方法鉴定和克隆编码亲本糖氧化酶的DNA。具体而
言，此类探针可用于遵循标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂
交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可远短于整个序列，但其长度应为至少14，优选至少25，更优选至少35，且最优选至少70个核苷酸。DNA和RNA探针两者均可使用。通
32 3 35
常标记探针以供检测相应的基因(例如，用 P，H，S，生物素或亲和素标记)。本发明涵盖
此类探针。

[0077] 可就与上述探针杂交并编码亲本糖氧化酶的DNA筛选从此类其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他生物的基因组或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰
胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并固定于
硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或
DNA，将该载体材料用于Southern印迹。就本发明而言，杂交指多核苷酸在低至非常高严格条件下，与对应于SEQ ID NO：1中所示的多核苷酸，其互补链，或它们的亚序列的标记的核酸探针杂交。与探针杂交的分子可使用例如X射线片或任何本领域已知的其他检测手段来
检测。

[0078] 亲本糖氧化酶亦可由包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成的多核苷酸所编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少60％，更优选
至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选96％，97％，98％或99％的同一性程度，并编码活性多肽。

[0079] 三维结构

[0080] 使用SEQ ID NO：2的糖氧化酶的氨基酸序列以阐明三维结构。该结构是依照例如，如X-Ray Structure Determination，Stout，G.K.和Jensen，L.H.，John Wiley &Sons，Inc.NY，1989中给出的用于X射线晶体学方法的原理而解析的。

[0081] 如由 ABL ＝ 2- 氨基 -2- 脱氧 - 纤维二糖酸 -1，5- 二内酰胺(5-amino-5-deoxy-cellobiono-1，5-lactam)抑制的SEQ ID NO：2的糖氧化酶的解析
的晶体结构的结构坐标以标准PDB格式(Protein Data Bank，Brookhaven National
Laboratory，Brookhaven，Conn.)如列于附录1给出，所述附录形成本公开一部分。在附录
1的上下文中，使用下述缩写：CA指c-alpha(碳原子)或钙离子(然而为了避免误解，在本
 说明书中我们使用全称“c-alpha原子”和“钙”或“离子”)。氨基酸残基以其标准三字母编码给出。所附的结构坐标包含糖氧化酶的结构。

[0082] 变体的制备

[0083] 亲本糖氧化酶的变体可根据本领域任何已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建(synthetic gene construction)、半合成基因构建(semi synthetic gene
construction)、随机诱变、改组(shuffling)等来制备。

[0084] 定点诱变是在编码亲本糖氧化酶的多核苷酸分子上的确定位点创建一个或几个突变的技术。所述技术可在体外或体内进行。

[0085] 合成基因构建涉及在体外合成设计为编码目标多肽分子的多核苷酸分子。基因合成可使用多种技术进行，如由Tian等所述基于多路微芯片(multiplex microchip-based)
的技术(Tian等，Nature 432：1050-1054)，以及类似的技术，其中合成寡核苷酸并在可用光编程(photo-programmable)的微流芯片(microfluidic chip)上组装。

[0086] 定点诱变可在体外通过PCR达成，涉及使用含有所期望突变的寡核苷酸引物。定点诱变亦可在体外通过表达盒诱变进行，涉及用限制酶在包含编码亲本糖氧化酶的多核苷
酸的质粒中的位点进行剪切，然后将含有突变的寡核苷酸连接于所述多核苷酸中。通常在
质粒上和在寡核苷酸上进行消化的限制酶是相同的，使所述质粒和插入物的粘性末端能够
彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4949-4955；
以及Barton等，1990，Nucleic AcidsResearch 18：7349-7355。

[0087] 定点诱变可在体内通过本领域已知方法达成。参见，例如，美国专利申请公开2004/0171154；Storici等，2001，Nature Biotechnology 19：773-776；Kren等，1998，Nat.Med.4：285-290；以及Calissano和Macino，1996，Fungal Genet.Newslett.43：15-16。

[0088] 任何定点诱变方法可用于本发明。有许多可用的商业试剂盒可用于制备亲本糖氧化酶的变体。

[0089] 可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或者WO 95/22625所公开的那些，来进行一
个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬
菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO
92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene
46：145；等，1988，DNA 7：127)。

[0090] 诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领
域标准方法迅速测序。这些方法使快速确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性成为可
能。

[0091] 半合成基因构建通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的方面达成。半合成构建通常为使用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合的方法。
基因的确定区域可因而从头开始合成，而其他区域可使用定点诱变引物扩增，还可对另外
的其他区域进行易错PCR或非易错PCR(non-error prone PCR)扩增。然后多核苷酸片段
可进行改组。

[0092] 变体

[0093] 在本发明中，分离的糖氧化酶变体在对应于SEQ ID NO：2的位置4、15、19、21、22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、
112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、
169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、251、
252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、316、
317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、357、
358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、
415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472和/或473的一个或多个位置包含取代，并具有糖氧化酶活性。所述糖氧化酶变体还可包含与SEQ ID NO：2的
氨基酸序列或由SEQ ID NO：1编码的成熟多肽具有至少60％，优选至少65％，更优选至少
70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少约96％，97％，98％或99％的氨基酸序列同一性程度的氨
基酸序列。

[0094] 本发明还涉及分离的糖氧化酶变体或具有糖氧化酶活性的分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的糖氧化酶在对应于使用SEQ ID NO：2进行编号的位置4、15、19、21、22、27、
29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、112、
114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、169、
170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、251、252、
253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、316、317、
318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、357、358、
363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、415、
419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472和/或473的相差至少一个或多个(几个)位置，并具有糖氧化酶活性的氨基酸序列。所述糖氧化酶变体还可包含与
SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由SEQ ID NO：1编码的成熟多肽具有至少60％，至少65％，
至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％氨基酸序列同一性程度的氨基酸序列。

[0095] 在一个方面，与亲本(例如具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的亲本糖氧化酶)相比，本发明的变体中的氨基酸改变数目包括20个改变，19个改变，18个改变，17个改变，16个改变，15个改变，14个改变，13个改变，12个改变，11个改变，10个改变，9个改变，
8个改变，7个改变，6个改变，5个改变，4个改变，更优选3个改变，甚至更优选2个改变，并且最优选1个改变，或者由20个改变，19个改变，18个改变，17个改变，16个改变，15个改变，14个改变，13个改变，12个改变，11个改变，10个改变，9个改变，8个改变，7个改变，
6个改变，5个改变，4个改变，更优选3个改变，甚至更优选2个改变，并且最优选1个改变
组成。在另一个方面，在本发明的变体中的氨基酸改变数目由优选20个改变，19个改变，18个改变，17个改变，16个改变，15个改变，14个改变，13个改变，12个改变，11个改变，10个改变，9个改变，8个改变，7个改变，6个改变，5个改变，4个改变，3个改变，2个改变或1个改变组成。

[0096] 在一个方面，与亲本(例如具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的亲本糖氧化酶)相比，本发明的变体中的氨基酸改变数目包括20个取代，19个取代，18个取代，17个取代，16个取代，15个取代，14个取代，13个取代，12个取代，11个取代，10个取代，9个取代，
8个取代，7个取代，6个取代，5个取代，4个取代，更优选3个取代，甚至更优选2个取代，和最优选1个取代，或者由20个取代，19个取代，18个取代，17个取代，16个取代，15个取代，
14个取代，13个取代，12个取代，11个取代，10个取代，9个取代，8个取代，7个取代，6个取代，5个取代，4个取代，更优选3个取代，甚至更优选2个取代，和最优选1个取代组成。在另一个方面，在本发明的变体中的氨基酸取代数目由20个取代，19个取代，18个取代，17个取代，16个取代，15个取代，14个取代，13个取代，12个取代，11个取代，10个取代，9个取代，8个取代，7个取代，6个取代，5个取代，4个取代，3个取代，2个取代或1个取代组成。

[0097] 在一个方面，所述变体包含或仅包含(consist of)在对应于SEQ ID NO：2的位置4的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQID NO：2的位置4的
位置用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gln作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置4的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E4Q。

[0098] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置15的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置15的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置15的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含取代D15N。

[0099] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置19的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置19的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置19的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代T19S。

[0100] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置21的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置21的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置21的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D21N。

[0101] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置22的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置22的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Trp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置22的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Y22W。

[0102] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置27的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置27的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg或Lys作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置27的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E27R，K。

[0103] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置29的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置29的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0104] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置30的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置30的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0105] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置31的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置31的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置31的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代I31R。

[0106] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置43的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置43的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Cys作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置43的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含取代T43C。在另一个方面，所述变体包
含或仅包含取代T43C和A52C。

[0107] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg，Asp，Ser或Thr作为在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N48R，D，S，T。

[0108] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置52的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置52的位置用
Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Cys作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置52的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代A52C。在另一个方面，所
述变体包含取代T43C和A52C。

[0109] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置54的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置54的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置54的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Q54E，D。

[0110] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置57的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置57的位置的取
代用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位置
57的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K57D。

[0111] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置58的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置58的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp，Glu或Arg作为在对应于SEQ ID
NO：2的位置58的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K58D，E，R。

[0112] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置59的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置59的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置59的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代L59D。

[0113] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置60的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置60的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gly作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置60的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N60G。

[0114] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置62的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置62的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Leu或Val作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置62的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K62L，V。

[0115] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置69的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置69的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0116] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置70的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置70的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0117] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置71的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置71的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0118] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置72的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置72的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0119] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置77的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置77的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Tyr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置77的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F77Y。

[0120] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置80的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置80的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置80的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E80A。

[0121] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置81的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置81的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala，His或Asp作为在对应于SEQ ID
NO：2的位置81的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N81A，H，D。

[0122] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置85的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置85的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Val或Ala作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置85的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代M85V，A。

[0123] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置91的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置91的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置91的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代M91A。

[0124] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg，Asp，Ser，Thr作为在对应于SEQ ID NO：2的位置48的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N48R，D，S，T。

[0125] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置93的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置93的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser或Thr作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置93的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D93S，T。

[0126] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置98的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置98的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置98的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N98D。

[0127] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置105的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置105的位置
用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gln，Asn，Asp，Glu作为在对应于SEQ ID NO：2的位置105的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代H105Q，N，D，E。

[0128] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置112的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置112的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0129] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置114的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置114的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置114的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代H114R。

[0130] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置118的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置118的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg或Lys作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置118的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代V118R，K。

[0131] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置122的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置122的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置122的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K122R。

[0132] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置129的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置129的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0133] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置130的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置130的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0134] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置131的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置131的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0135] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置132的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置132的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。

[0136] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置133的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置133的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0137] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置134的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置134的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0138] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置135的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置135的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。

[0139] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置138的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置138的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gly作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置138的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代S138G。

[0140] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置140的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置140的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0141] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置146的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置146的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Tyr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置146的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F146Y。

[0142] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置147的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置147的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0143] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置148的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置148的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp或Glu作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置148的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F148D，E。

[0144] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置152的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置152的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Thr或Ala作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置152的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代M152AT。

[0145] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置153的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置153的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置153的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代H153N。

[0146] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置157的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置188的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Cys作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置157的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代V157C。在另一个方面，
所述变体包含或仅包含取代V157C+K188C。

[0147] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置169的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置169的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置169的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D169A。

[0148] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置170的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置170的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置170的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代G170S。

[0149] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置174的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置174的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gln作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置174的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E174Q。

[0150] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置184的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置184的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Tyr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置184的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F184Y。

[0151] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置188的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置188的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg，Cys，Leu或Val作为在对应于SEQ ID NO：2的位置188的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K188R，C，L，V。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代V157C+K188C。

[0152] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置201的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置201的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置201的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K201R。

[0153] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置213的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置213的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0154] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置221的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置221的位置用
Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含R作为在对应于SEQ ID NO：2的位置
221的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K221R。

[0155] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置222的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置222的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置222的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N222D。

[0156] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置223的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置223的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置223的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K223R。

[0157] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置224的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置224的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置224的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代T224E，D。

[0158] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置227的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置227的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置227的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代L227D，E。

[0159] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置228的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置228的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置228的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K228R。

[0160] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置231的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置231的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gln作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置231的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E231Q。

[0161] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置235的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置235的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置235的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D235N。

[0162] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置248的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置248的位置用
Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0163] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置249的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置249的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0164] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置250的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置250的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0165] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置251的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置251的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0166] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置252的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置252的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0167] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置253的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置253的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0168] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置256的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置256的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置256的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N256A。

[0169] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置258的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置258的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0170] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置260的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置260的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0171] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置268的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置268的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Gln作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置268的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E268Q。

[0172] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置278的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置278的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置278的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代L278N，D。

[0173] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置287的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置287的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp或Glu作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置287的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代V287D，E。

[0174] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置288的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置288的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置288的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N288D。

[0175] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置300的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置300的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0176] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置301的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置301的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0177] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置302的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置302的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0178] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置303的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置303的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0179] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置304的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置304的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0180] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置305的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置305的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0181] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置307的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置307的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置307的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代H307R。

[0182] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置314的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置314的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置314的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Q314E。

[0183] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置315的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置315的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0184] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置316的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置316的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。

[0185] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置317的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置317的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0186] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置318的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置318的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0187] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置319的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置319的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0188] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置320的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置320的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0189] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置321的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置321的位置用
Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0190] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置322的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置322的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置322的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K322R。

[0191] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置323的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置323的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置323的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K323R。

[0192] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置327的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置327的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置327的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K327R。

[0193] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置330的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置330的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置330的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K330R。

[0194] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置332的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置332的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala或Pro作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置332的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D332A，P。

[0195] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置342的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置342的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Tyr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置342的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F342Y。

[0196] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置347的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置347的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置347的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K347R。

[0197] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置349的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置349的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置349的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K349R。

[0198] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置352的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置352的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0199] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置353的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置353的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Tyr或Val的取代。

[0200] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置354的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置354的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Tyr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置354的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F354Y。

[0201] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置355的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置355的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0202] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置356的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置356的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置356的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Q356E。

[0203] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置357的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置357的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0204] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置358的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置358的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asn作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置358的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D358N。

[0205] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置363的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置363的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置363的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K363R。

[0206] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置366的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置366的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置366的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Q366E。

[0207] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置368的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置368的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置368的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代T368S。

[0208] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置374的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置374的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser或Gln作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置374的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E374S，Q。

[0209] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置382的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置382的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Leu或Val作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置382的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K382L，V。

[0210] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置383的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置383的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置383的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代L383D。

[0211] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置385的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置385的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0212] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置386的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置386的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0213] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置387的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置387的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0214] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置388的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置388的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0215] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置389的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置389的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0216] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置390的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置390的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0217] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置391的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置391的位置用
Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0218] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置392的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置392的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0219] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置393的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置393的位置用
Ala，Arg，Asn，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser或Thr作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置393的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代D393S，T

[0220] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置400的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置400的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ser或Thr作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置400的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E400S，T。

[0221] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置403的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置403的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置403的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代F403E，D。

[0222] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置411的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置的位置411用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Asp或Glu作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置411的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代N411D，E。

[0223] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置415的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置415的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置415的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K415R。

[0224] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置419的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置419的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu，Asp或Arg作为在对应于SEQ ID
NO：2的位置419的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K419E，D，R。
在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K419E+K440R。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K419R+K440E。

[0225] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置420的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置420的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置420的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代S420E，D。

[0226] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置424的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置424的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Val或Ala作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置424的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代M424V，A。

[0227] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置425的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置425的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0228] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置427的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置427的位置用
Ala，Arg，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0229] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置428的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置428的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。

[0230] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置429的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置429的位置用
Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。

[0231] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置433的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置433的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Val或Ala作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置433的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代M433V，A。

[0232] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置437的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置437的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置437的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代Y437E。

[0233] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于的位置SEQ ID NO：2的位置440的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置440的位置
用Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu，Asp或Arg作为在对应于SEQ
ID NO：2的位置440的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K440E，D，R。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K419E+K440R。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K419R+K440E。

[0234] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置445的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置445的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Ala或Pro作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置445的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代E445A，P。

[0235] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置456的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置456的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置456的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K456R。

[0236] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置460的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置460的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Glu或Asp作为在对应于SEQ ID NO：
2的位置460的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代T460E，D。

[0237] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置472的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置472的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp或Tyr的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Thr作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置472的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代V472T。

[0238] 在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ ID NO：2的位置473的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含在对应于SEQ IDNO：2的位置473的位置用
Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr或Val的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含Arg作为在对应于SEQ ID NO：2的位
置473的位置的取代。在另一个方面，所述变体包含或仅包含取代K473R。

[0239] 涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的热稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：19，22，60，81，98，118，138，146，152，170，188，
354，368，374和420，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的T19S，Y22W，N60G，N81D，N98D，V118R，K，S138G，F146Y，M152T，G170S，K188R，F354Y，T368S，E374S和/或S420E，D。

[0240] 具有一个或多个额外的氢键并涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的热稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：77，184，342和
472，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQID NO：2和同源糖氧化酶中的
F77Y，F184Y，F342Y和/或V472T。

[0241] 具有额外的二硫键并涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的热稳定性的糖氧化酶变体包括SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的T43C/A52C和/或V157C/K188C。

[0242] 其他涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的热稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：4，15，27，31，48，57，54，58，59，81，93，98，
105，114，148，222，224，227，278，287，288，330，356，366，383，403，411，419，437，460，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的E4Q，D15N，Q356E，H48R，D，S，T，K419E，R，K440E，R(包括，例如K419E+K440R或K419R+K440E)，K57D，T460E，D，D93S，T，E27R，K，K58D，E，Q54E，D，K330R，N222D，N81D，N411D，E，N288D，N98D，Q366E，L227D，E，L278N，D，L383D，L59D，V287D，E，T224E，D，F403E，D，Y437E，F 148D，E，H105D，E，H114R，和/或I31R。

[0243] 优选地，与亲本糖氧化酶相比具有改善的热稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：22，27，54，98，222，460，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的Y22W，E27R，Q54D，N98D，N222D和/或T460E。

[0244] 涉及与亲本糖氧化酶相比具有减少的氧化(例如由H2O2造成的氧化)的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含甲硫氨酸被取代的变体：85，91，152，
424和433，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的M85V，A，M91A，M152A，M424V，A和/或M433V，A。

[0245] 涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的低pH(例如pH 5或更低)下稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：21，105，153，174，
231，235，268，374，393和400，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：
2和同源糖氧化酶中的E231Q，E400S，T，D393S，T，H105Q，N，H153N，E174Q，E268Q，D235N，D21N和/或E374Q。

[0246] 涉及与亲本糖氧化酶相比具有改善的高pH(例如pH 8或更高)下稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：15，114，188，201，223和207；优选15，188和201，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：
2和同源糖氧化酶中的K223R，K201R，K188R，D15N，H114R和/或H307R；优选D15N，K188R
和/或K201R。

[0247] 涉及与亲本糖氧化酶相比具有减少的脱酰胺(例如，作为高温和极端pH值的结果)的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：81和256，
使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的N81A，H和/或N256A。

[0248] 涉及具有减少的对肽键的酰胺水解易感性(特别是在低pH时)的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：80，169，332和445，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的D169A，D332A，P，E445A，P和/或E80A。

[0249] 涉及对底物分子和/或抑制剂具有改变的特异性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：29，30，69，70，71，72，112，129，130，131，132，
133，134，135，140，145，146，147，148，213，248，249，250，251，252，253，258，260，300，301，
302，303，304，305，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，352，353，354，355，356，
357，358，385，386，387，388，389，390，391，392，425，427，428，429，使用SEQ ID NO：2进行编号。鉴定了含和不含抑制剂的SEQ ID NO：2的结构，且其原子坐标鉴定于附录1。附录1中
的结构中存在的抑制剂给出了在酶的背景下二糖底物分子的样态的非常清晰的图像。距离
所述抑制剂在不同距离范围之内的氨基酸残基如下所述：

[0250] 之内：Y72，R391。

[0251] 之内：F29，Y72，T131，C132，R248，Y252，N304，E317，F354，Q356，Q387，Y389，R391，Y428。

[0252] 之内：F29，Y72，T131，C132，R248，Y252，E260，N304，E317，F352，F354，Q356，Q387，Y389，R391，Y428。

[0253] 之内：F29，H70，Y72，T131，C132，F146，R248，Y252，E260，Y302，N304，E317，F319，F352，F354，Q356，Q387，Y389，R391，Y428。

[0254] 之内：F29，H70，Y72，G130，T131，C132，V135，F146，F148，R213，R248，Y252，E260，Y302，S303，N304，Q314，E317，F319，F352，F354，Q356，D358，Q387，Y389，R391，Y425，N427，Y428。

[0255] 之内：F29，H70，Y72，G130，T131，C132，V135，H140，F146，G147，F148，R213，R248，G250，D251，Y252，G253，E260，S301，Y302，S303，N304，F305，Q314，P315，E317，F319，A321，F352，W353，F354，Y355，Q356，D358，L385，Q387，Y389，R391，Y425，N427，Y428。

[0256] 之内：F29，N30，H70，S71，Y72，L112，H129，G130，T131，C132，P133，V135，H140，G145，F146，G147，F148，R213，R248，G250，D251，Y252，G253，E260，S301，Y302，S303，N304，F305，Q314，P315，V316，E317，N318，F319，Y320，A321，F352，W353，F354，Y355，Q356，D358，L385，I386，Q387，F388，Y389，D390，R391，Y425，N427，Y428。

[0257] 之内：F29，N30，G69，H70，S71，Y72，L112，H129，G130，T131，C132，P133，G134，V135，H140，G145，F146，G147，F148，R213，R248，I249，G250，D251，Y252，G253，G258，E260，L300，S301，Y302，S303，N304，F305，Q314，P315，V316，E317，N318，F319，Y320，A321，K322，S323，F352，W353，F354，Y355，Q356，L357，D358，L385，I386，Q387，F388，Y389，D390，R391，Y392，Y425，N427，Y428，A429。

[0258] 涉及改变活性pH的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：148，324和/或385，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的F148D，E，D358N和/或Q314E。

[0259] 涉及具有增加的对阴离子型表面活性剂的稳定性的糖氧化酶变体包括在对应于一个或多个下述位置的位置包含取代的变体：58，62，122，188，201，221，223，228，322，327，
347，349，363，382，415，419，440，456，473，使用SEQ ID NO：2进行编号，所述取代包括，例如SEQ ID NO：2和同源糖氧化酶中的K122R，K201R，K188L，V，K62L，V，K58R，K456R，K473R，K363R，K228R，K221R，K349R，K347R，K415R，K322R，K440E，D，K419E，D，K327R，K382L，V和/或K223R。

[0260] 多核苷酸

[0261] 本发明涉及编码本文中如上所述的糖氧化酶变体的分离的多核苷酸。本发明还涉及编码亲本糖氧化酶的变体的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码在对应于SEQ ID NO：2的位置4、15、19、21、22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、
77、80、81、85、91、93、98、105、112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、
146、147、148、152、153、157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、
231、235、248、249、250、251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、
304、305、307、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、
352、353、354、355、356、357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、
391、392、393、400、403、411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、
460、472和473的一个或多个(几个)位置包含取代的糖氧化酶变体，其中所述变体糖氧化
酶为(a)包含与SEQ ID NO：2具有至少60％序列同一性，与SEQID NO：2具有至少65％同
一性，至少70％同一性，至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性的氨基酸序列的多肽，(b)由在优选低，更优选低-中，更优选中等，甚至更优选中-高，最优选高或甚至最优选非常高严格条件下与下述杂交的多核苷酸编码的多肽：(i)SEQ ID
NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)编码SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的cDNA序列，或
(i)或(ii)的互补链，其中所述变体具有糖氧化酶活性。

[0262] 核酸构建体

[0263] 本发明还涉及包含编码本发明的糖氧化酶变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中
在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

[0264] 可以用许多方式操作编码本发明的糖氧化酶变体的分离的多核苷酸以供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。
使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

[0265] 调控序列可以是适当的启动子序列，其由表达多核苷酸的宿主细胞识别。启动子序列含有介导变体糖氧化酶的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显
示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

[0266] 用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶
基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂
肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆
菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因
(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，
1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以
及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于
Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

[0267] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉
(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑
曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、
曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片
镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)
胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木
霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内
切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi
启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合
体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

[0268] 在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油
醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋
白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos
等，1992，Yeast 8：423-488描述。

[0269] 调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码变体糖氧化酶的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主
细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

[0270] 对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶
样蛋白酶。

[0271] 对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它
终止子由Romanos等，1992，见上描述。

[0272] 调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体糖氧化酶的多核苷酸的5’末端。可以将在所选
宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

[0273] 对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

[0274] 对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油
醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

[0275] 调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多肽编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

[0276] 对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

[0277] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellular Biology 15：5983-5990描述。

[0278] 调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体糖氧化酶的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区与编码分泌的变体糖氧化酶的编码区的区段一起天然地连
接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码区为外源的信号肽编码区。
外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号
肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体糖氧化酶的分泌。然而，指导表达
的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。

[0279] 对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

[0280] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列描述于Romanos等，1992，见上。

[0281] 调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于变体糖氧化酶氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶
原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽
而转化为成熟活性多肽。可以从酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝
霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

[0282] 当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽区的位置紧接着(next to)多肽的氨基末端，并且使信号肽区的位置紧接着前肽区的氨基末端。

[0283] 同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节变体糖氧化酶的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在
而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是
那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节系统包括在氨甲蝶呤(methotrexate)
存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基
因。在这些情况下，编码变体糖氧化酶的多核苷酸与调节序列可操作地连接。

[0284] 表达载体

[0285] 本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明编码变体糖氧化酶的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。上述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起
以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许
在这些位点插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中
插入所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体来表达多核苷酸。在制备表达载体的
过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连
接。

[0286] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿
主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

[0287] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完
整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

[0288] 本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

[0289] 对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨
甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移
酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)
(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯
甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构
巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar
基因。

[0290] 本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

[0291] 为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸
序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精
确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选
400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同
一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序
列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

[0292] 为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发
挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

[0293] 用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

[0294] 在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene98：61-67；Cullen等，1987，NucleicAcids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

[0295] 可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加糖氧化酶变体的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿
主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择
剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含
有该多核苷酸的额外拷贝的细胞。

[0296] 用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知用于获得基本上纯的糖氧化酶变体的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

[0297] 宿主细胞

[0298] 本发明还涉及重组宿主细胞，其包含编码变体糖氧化酶多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于变体的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将
所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。宿主细胞的
选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

[0299] 宿主细胞可为任何可用于变体糖氧化酶的重组产生的细胞。宿主细胞亦可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

[0300] 在一个方面，所述宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门
(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The
Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

[0301] 在另一个方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目 (Endomycetales))、产担子酵
母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲
(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

[0302] 在另一个方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。

[0303] 在另一个方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉
氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母
(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母细胞(Saccharomyces oviformis)。在另一个方
面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个方面，酵母
宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

[0304] 在另一个方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形
式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专
性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进
行，而碳分解代谢可以是发酵的。

[0305] 在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌
属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属
(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属
(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、
新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、
青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属
(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

[0306] 在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus
japonicus)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger) 或
米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰
孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium
crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢
(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium
sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium
sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)
或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌
(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis
rivulosa、Ceriporiopsis subrufa或虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜
角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热
带金孢子菌 (Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium
inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium
queenslandicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖
菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola
lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、
粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌
(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)
或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

[0307] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和
Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和
WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于
Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，
Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

[0308] 产生方法

[0309] 本发明还涉及产生糖氧化酶变体的方法，其包括：(a)在适于所述变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)从培养基回收所述变体。

[0310] 在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生糖氧化酶变体的营养培养基中培养所述细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多
肽的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连
续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商
获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽
分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

[0311] 在另一个方面，不回收所述糖氧化酶变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

[0312] 可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测糖氧化酶变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用，酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法可用于确定如本文实施例中所述的多肽的活性。

[0313] 所得糖氧化酶变体可以通过本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

[0314] 本发明的糖氧化酶变体可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的糖氧化酶变体，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉
淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden
编，VCH Publishers，New York，1989)。

[0315] 组合物

[0316] 本发明还涉及包含本发明的变体糖氧化酶或具有糖氧化酶活性的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含此种变体或多肽。术语“富含”表明所述组合物的糖氧化酶活性以例如1.1的富集因子增加。

[0317] 所述组合物可包含本发明的多肽或变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素
过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。所述其他酶可通过例如属于曲霉属，优选棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛
曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus
foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、
黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)；镰孢属，优选杆孢状镰
孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium
crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢
(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium
sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝
孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)；腐质霉属，
优选特异腐质霉(Humicola insolens)或疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)；或木
霉属，优选哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长
枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉
(Trichoderma viride)的微生物产生。

[0318] 所述多肽组合物可依照本领域已知方法制备，且可为液体或干组合物的形式。举例而言，所述多肽组合物可为颗粒或微粒的形式。包含于组合物中的变体或多肽可依照本
领域已知方法稳定化。

[0319] 下文中给出本发明的变体或多肽组合物的优选用途。本发明的组合物的剂量和其他使用该组合物的条件可基于本领域已知方法确定。

[0320] 烘烤中的用途

[0321] 本发明的糖氧化酶可用于制备生面团、面包和蛋糕。因此，所述糖氧化酶可用于制备面包的工艺，包括将所述糖氧化酶添加至生面团的成分，揉和(knead)生面团并烘烤该生面团以制备面包。这可类似于美国专利号4,567,056或WO 99/53769完成。

[0322] 所述生面团一般为包含小麦粗粉(wheat meal)或小麦粉(wheat flour)和/或其他类型的粗粉、粉或淀粉如玉米粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦粉、燕麦粉、燕麦粗粉、大豆粉、高粱粗粉、高粱粉、稻米淀粉、稻米粉、马铃薯粗粉、马铃薯粉或马铃薯淀粉的面粉生面团(flour dough)。所述生面团可为新鲜的、冷冻的或par-baked(部分烘烤的)。

[0323] 所述生面团可为已膨松的生面团或待膨松的生面团。生面团可以以多种方式膨松，如通过添加化学膨松剂例如碳酸氢钠或通过添加膨松剂(发酵生面团)，但优选通过添
加合适的酵母培养物，如酿酒酵母(面包酵母)，例如商业上可获得的酿酒酵母菌株来膨松
生面团。

[0324] 所述生面团还可包含其他常规生面团成分，例如：蛋白质如奶或奶粉，谷蛋白和大豆；蛋(全蛋、蛋黄或蛋白)；起酥油如粒状油脂(granulated fat or oil)；氧化剂如抗坏血酸、溴化钾、碘化钾、偶氮二酰胺(ADA)或过硫酸铵；还原剂如L-半胱氨酸；糖；盐如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。所述生面团可进一步包含乳化剂如甘油一酯或甘油二酯，甘油一酯或甘油二酯的二酰基酒石酸酯，脂肪酸的糖酯，脂肪酸的聚甘油酯，甘油一酯的乳酸酯，甘油一酯的乙酸酯，聚氧乙烯硬脂酸酯，磷脂，卵磷脂和溶血卵磷脂。

[0325] 所述生面团可为面食制品(pasta)生面团，优选从硬质小麦粉或类似品质的面粉制备。当用于制备面食制品和面条时，糖氧化酶可导致谷蛋白结构的加强，并因此提供了生面团粘性的减少，生面团强度的增加和具有改善的组织的生面团产品。

[0326] 本发明的工艺可用于任何类型的从生面团制备的烘烤产物，可为软性或脆性的，可为白色、浅色或深色类型。实例为面包(特别是白面包、全麦面包或黑麦面包)，通常为枕形面包(loaf)或小白面包/填馅卷(roll)的形状，还有法式棍(baguette)型面包、皮塔
(pita)面包、未经发酵的玉米饼(tortilla)、蛋糕、薄烤饼(pancake)、饼干、曲奇饼、脆皮松饼(muffin)、大馅饼皮(pie crust)、黑麦面包干(crisp bread)、馒头(steamed bread)、比萨饼(pizza)等。

[0327] 该工艺可用于制备油炸的(fried)生面团或蒸制的(steamed)的生面团产品(例如馒头)。

[0328] 本发明进一步涉及生面团和/或从生面团制得的烘烤产品的预混物，例如面粉组合物形式的预混物，其中所述预混物包含所述糖氧化酶和任选地其他如上所详明的其他
酶，或由这些酶组成。所述预混物可通过将相关的酶与合适的载体如面粉、淀粉、糖或盐混合来制备。所述预混物可含有其他生面团改善和/或面包改善添加剂，例如任何上文提及
的添加剂，包括酶。

[0329] 所述糖氧化酶可作为生面团和/或面包改善添加剂以颗粒状或团聚的粉末形式提供。所述生面团和/或面包改善添加剂优选具有狭窄的粒度分布，其中超过95％(按重
量计)颗粒在25至500μm的范围。

[0330] 颗粒和团聚的粉末可通过常规方法制备，例如通过将淀粉酶喷洒于流动床制粒机之上。所述载体可由具有合适粒度的颗粒核心组成。所述载体可为可溶的或不可溶的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)，糖醇(如山梨醇)、淀粉、稻米、玉米糁(corn
grit)或大豆。

[0331] 其他工业应用

[0332] 本发明的糖氧化酶可以以有效量用于例如个人护理产品如牙膏(特别是当需要使牙齿增白时)、漱口剂、假牙清洁剂(denture cleaner)、液体肥皂、皮肤护理乳膏和洗剂，毛发护理和身体护理制剂，和用于清洁隐形眼镜的溶液，以充当抗菌剂。

[0333] 还在另一个方面，本发明的糖氧化酶可用于将在还原端具有葡萄糖残基的寡糖氧化为相应的酸，例如，从乳糖产生乳糖酸，如描述于例如美国专利号6,916,496，美国专利号
7,186,427，WO 2006/028929和WO 2005/104859，其通过提述并入本文。生成的LBA可用于
产生食物和饮料产品，例如乳制品，如乳酪、乳、酸奶和冰激淋。LBA可通过将生成的LBA直接添加至食物或饮料产品或成分或通过在所述食物或饮料产品或成分中原位生成LBA来
生成。在该方面的一个实施方案中，所述糖氧化酶具有在低pH(至少pH 3.5或更低)改善
的稳定性。还在该方面的另一个实施方案中，所述糖氧化酶对碱性试剂和条件如氢氧化钠
和其他用于维持pH的缓冲剂具有改善的稳定性。在该方面的另一个实施方案中，所述糖氧
化酶具有对氧较低的Km。还在该方面的另一个实施方案中，所述糖氧化酶在H2O2存在下具
有改善的稳定性。然而，在本发明的该方面中，过氧化氢酶的添加可用于减少H2O2的存在。

[0334] 所述糖氧化酶还可用作分析试剂，例如以确定给定样品中存在的还原糖的量，或可将该酶固定并插入电极中以提供淀粉或纤维素水解的持续测量。

[0335] 植物

[0336] 本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，其经编码本发明的多肽或变体糖氧化酶的多核苷酸转化，从而以可回收的量表达和产生所述变体或多肽。所述变体或
多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组变体或多肽的植物或植物部
分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质
(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

[0337] 转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾
属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧
草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

[0338] 双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)
植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)
和紧密相关的模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

[0339] 植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮
(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、
质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

[0340] 同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

[0341] 表达本发明的变体或多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明的变体或多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖
为转基因植物或植物细胞。

[0342] 便利地，表达构建体是包含编码本发明的变体或多肽的核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列与在选择的植物或植物部分中表达该核酸序列所需的适当的调节序列可操
作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有
用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的
DNA引入方法)。

[0343] 调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达变体或多肽而确定。例如，编码本发明的变体或多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

[0344] 对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen 等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织
(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组
织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启
动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of
Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)
的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO
91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动
子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，
Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，
Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

[0345] 启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的多核苷酸之间。Xu等，
1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

[0346] 选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

[0347] 将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、
粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。

[0348] 目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，
1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法是用粒
子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育
中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，
1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：
667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，
1993，PlantMolecular Biology 21：415-428所描述的。

[0349] 转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选
择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异
性地切除选择基因。

[0350] 本发明还涉及产生本发明的变体或多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生变体或多肽的条件下培养包含核酸序列的转基因植物或植物细胞，所述核酸序列编码本发明具
有糖氧化酶活性的变体或多肽；和(b)回收所述变体或多肽。

[0351] 通过如下实施例进一步描述本发明，不应将所述实施例理解为限制本发明的范围。

[0352] 材料和方法

[0353] 4AA-TOPS测定(用于确定糖氧化酶活性的方法)

[0354] 测定在96孔微滴定板中进行。将170μl预混物(0.05M乙酸(盐)/磷酸(盐)/硼酸(盐)，pH 6中的1.5mM N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺(N-ethyl-N-sulfopropyl-m-
toluidine，TOPS)，0.6mM 4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)和5mM乳糖(或纤
维二糖))与20μl过氧化物酶(0.2kPOXU/g)混合，并通过添加10μl适当稀释的氧化酶
溶液来起始反应。使用来自Molecular Devices的即用的Vmax微滴定板在550nm处测量
吸收作为时间的函数，而取吸收中线性增加的斜率作为活性。

[0355] 实施例

[0356] 实施例1：底物特异性

[0357] 对于糖氧化酶的底物特异性可在微滴定板中在环境温度通过以下述顺序混合来确定：

[0358] 50μl 0.4/0.4M磷酸(盐)/柠檬酸(盐)缓冲液(pH 6)，

[0359] 50μl底物(360mM)，

[0360] 50μl 21.6mM 3-二甲基氨基苯甲酸(Dimethylaminobenzoic acid，DMAB)，

[0361] 50μl 1mM 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(3-Methyl-2-benzothiazolinonehydrazone，MBTH)，

[0362] 50μl 75μg/ml重构的灰盖鬼伞过氧化物酶(rec.Coprinus cinereusperoxidase，rCiP)，和

[0363] 50μl糖氧化酶。

[0364] 在595nm处测量吸光度至少3分钟，每分钟吸光度的增加可用作相对活性的量度。

[0365] 实施例2：结合常数，Km

[0366] 稳态动力学可通过改变糖底物的浓度并通过4AA-TOPS测定法确定糖氧化酶的活性来进行。可假定简单的Michaelis-Menten动力学，尽管反应并非简单的单底物-单产物
机理。

[0367] 可根据Lineweaver-Burke作图获得动力学常数，假定简单的Michaelis-Menten动力学(尽管这是比较差的假定)以获得对于多种底物的表观“Km”和“Vm”值。

[0368] 实施例3：pH和温度活性概貌

[0369] 在pH范围内的糖氧化酶活性可在微板中在环境温度使用如上实施例1中所述的方法确定，但将缓冲液调整至测试的pH；在反应混合物中测量pH。

[0370] 对于糖氧化酶的温度活性概貌可通过将缓冲液和底物在玻璃试管中混合，并在多种温度(30-80℃)预温育至少5分钟来确定：

[0371] 150μl 0.4/0.4M磷酸(盐)/柠檬酸(盐)，pH 6，

[0372] 150μl 180mM麦芽糖，和

[0373] 150μl氧化酶稀释液。

[0374] 通过添加氧化酶起始反应，并可将样品在合适的温度在恒温浴中温育。在5分钟之后，应将样品置于冰上，并可通过添加450μl DMAB∶MBTH∶rCiP(1∶1∶1)(以如实
施例1中的各自浓度)来确定H2O2的形成，而590nm处的吸光度的增加可在10秒之后在HP
8452A 二极管阵列分光光度计(Hewlett-Packard)上测量。

[0375] 实施例4：通过DSC测量热稳定性

[0376] 热稳定性可通过DSC如下所述进行测量：使用来自Pharmacia的NAP-5柱将糖氧化酶样品脱盐入0.1M MES，pH 6。将样品(含有6.5mg/ml氧化酶)加载至VP-DSC装置
(MicroCal)上，并以90℃/h的扫描速率进行20至90℃的线性扫描。

[0377] 实施例5：温度稳定性

[0378] 糖氧化酶的温度稳定性可通过将糖氧化酶在pH 6在变化的温度预温育1小时然后通过4AA-TOPS测定法测量残余活性来测量。在高温温育的样品与在室温温育的样品之
间的残余活性的比例可用作对于氧化酶的温度稳定性的量度。

[0379] 实施例6：pH稳定性

[0380] 糖氧化酶的pH-稳定性可通过将糖氧化酶在40℃在变化的pH温育2小时然后通过4AA-TOPS测定法测量残余活性来测量。

[0381] 实施例7：糖氧化酶变体的克隆和表达

[0382] 白小羊蹄菌糖氧化酶(野生型)的克隆描述于Xu等“A novel carbohydrate：acceptor oxidoreductase from Microdochium nivale”，Eur.J.Biochem.(2001)
vol.268，1136-1142页。随后将克隆的基因作为BamHI-AflII片段转入pENI2516(参见WO
2004/069872的实施例2)以供在米曲霉中表达。在PCR反应中使用质粒DNA作为模板。正
向引物的序列为5’CTGAGGATCCACCatgcgttctgcatttatcttggcc 3’(SEQ ID NO：3)，而反向引物的序列为5’Caggctgtccgccctgtcaaataacttaagacctggt 3’(SEQ ID NO：4)。将来自
FINNZYMES的Phusion DNA聚合酶用于PCR。

[0383] PCR混合物：

[0384] 0.5μl模板DNA(20ng/μl)

[0385] 0.5μl正向引物

[0386] 0.5μl反向引物

[0387] 0.5μl Phusion聚合酶

[0388] 4μl 2.5mM dNTP

[0389] 10μl Phusion HF缓冲液

[0390] 15μl甜菜碱

[0391] 19μl水

[0392] PCR循环：

[0393] 步骤1：98℃30秒

[0394] 步骤2：98℃10秒；67℃30秒；72℃45秒；重复25次

[0395] 步骤3：72℃10分钟

[0396] 步骤4：维持在4℃

[0397] PCR反应导致在琼脂糖凝胶上可见大约1553碱基对大小的单一条带。通过Qiagen的QIAquick Gel Extraction Kit将条带从凝胶切出。随后对回收的DNA在37℃进行限制
性酶切3小时。

[0398] 10μl DNA

[0399] 2μl NEBuffer 2

[0400] 2μl 10x BSA

[0401] 1μl BamHI

[0402] 1μl AflII

[0403] 4μl水

[0404] 将凝胶清洁的(gel-cleaned)DNA作为BamHI-AflII片段连接入pENI2516以构建MnCOx-wt。将所得的质粒首先转化入大肠杆菌菌株TOP10，并对插入物测序以确证其核苷酸序列。随后将质粒转化入米曲霉菌株ToC1512以供表达。

[0405] 培养转化的米曲霉菌株ToC1512(描述于WO 2005/070962，实施例11)以供氧化酶的表达。通常，用来自储藏于-80℃的50％甘油中的储液的孢子接种100mL的YP培养基。
将起子培养物(starter culture)在带隔板的250mL烧瓶中在37℃和180rpm生长3-4日。
然后使用二十mL这种培养物接种在2L具有隔板的烧瓶中添加了2％麦芽糖的500mL YP培
养基。将烧瓶置于180rpm的定轨振荡器中，并在37℃生长4-5日，然后收获。使用描述的
测定法每日监视培养液中的酶活性。具有正确分子量的活性酶的产生通过测定法和粗培养
液的SDS-PAGE分析来阐明。

[0406] 实施例8：白小羊蹄菌的定点诱变

[0407] 基于实施例7中所述的白小羊蹄菌氧化酶表达载体MnCOx-wt来构建所有变体。用于构建的突变引物总结于表1。通过用于定点诱变的常用的基于PCR的技术导入突变。

[0408] 表1

[0409]

[0410] 将所得的质粒转化入感受态TOP10大肠杆菌细胞，分离，并通过测序验证插入。然后将质粒转化入米曲霉菌株ToC1512以供表达。

[0411] 变体的温度稳定性

[0412] 通过将发酵上清在室温和在69℃温育1小时来衡量变体的温度稳定性。然后如下所述确定上清的残余活性，并将高温和室温温育样品之间的比例用作变体温度稳定性的量
度。

[0413] 使用糖的氧化分析产生的氧化酶变体的酶活性(并与野生型比较)。然后在与来自灰盖鬼伞的过氧化物酶的偶联测定中检测生成的过氧化氢。所有的测定在Nunc 96孔板
中进行，并在来自Molecular Devices的SpectraMax 384 plus UV-Vis分光光度计读板器
中测量吸光度变化。

[0414] 在糖氧化测定中，将10μl氧化酶酶溶液和20μl过氧化物酶(0.2kPOXU/g)与170μl的50mM硼酸(盐)/磷酸(盐)/乙酸(盐)缓冲液pH 6.0中的0.6mM 4-氨基安
替比林，1.5mM N-乙基-N-磺丙基-间甲苯胺和5mM乳糖(或纤维二糖)反应。对550nm
处吸光度的增加进行5分钟的监测，并将发展曲线(progress curve)的斜率用于计算反应
的起始速率。

[0415] 来自用乳糖和纤维二糖的活性测定的结果示于表3。在69℃温育1小时之后在样品中剩余的活性计算为在相同的但置于室温(RT)1小时的样品中剩余的活性的百分比。

[0416] 表3

[0417]

[0418] 变体的高pH稳定性

[0419] 通过将发酵上清在pH 6、7、8和9温育1小时来衡量变体在高pH的稳定性。将发酵上清在50mM硼酸(盐)/乙酸(盐)/磷酸(盐)缓冲液中稀释10倍，并在室温温育一
小时。如上在“变体的温度稳定性”中所述使用10μl样品和使用纤维二糖作为底物确定
残余活性。

[0420] 来自活性测定法的结果示于表4，其中在给定pH温育之后的残余活性表示为在室温在pH 6温育1小时之后测得的活性的百分比。

[0421] 表4

[0422]取代 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
野生型 100 83 65 61
D15N 100 82 96 98
K188R 100 76 79 73
K201R 100 93 97 81

[0423] 附录1

[0424]

[0425]

[0426]

[0427]

[0428]

[0429]

[0430]

[0431]

[0432]

[0433]

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[0486]

[0487]

[0488]

[0489]

[0490]

[0491]

[0492]

[0493] 结束

标题	发布/更新时间	阅读量
多元醇氧化酶	2020-05-11	800
黄嘌呤氧化酶抑制剂	2020-05-13	715
果糖基胺氧化酶	2020-05-11	254
糖氧化酶	2020-05-11	832
一种氧化酶及其应用	2020-05-12	26
尿酸氧化酶	2020-05-11	78
低脂氧化酶1大麦	2020-05-13	638
一种氧化酶及其应用	2020-05-11	717
一种氧化酶及其应用	2020-05-12	428
一种氧化酶及其应用	2020-05-13	499

糖氧化酶

糖氧化酶

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